Перевод письменный 15000 знаков аспирантки Чернышовой по

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Кафедра иностранных языков ПИСЬМЕННЫЙ ПЕРЕВОД с немецкого языка на русский оригинального текста по специальности объемом 15000 печатных знаков Text:

Immunmodulation durch orale Applikation von Antigen kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln

Quelle:

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr.rer. nat.

Текст:

Иммуномодуляция при пероральном введении антигена кодирования наночастиц хитозан-ДНК

Источник:

Факультет естественных наук, Эрланген-Нюрнбергский Университет им. Александра Фридриха для получения докторской степени доктора естественных наук Выполнил: аспирант кафедры ТВВМ по специальности 02.00.06 высокомолекулярные соединения Чернышова Екатерина Борисовна Проверил: к.п.н, доцент каф. иностранных языков Чечет Т.И.

Волгоград 2015

Immunmodulation durch orale Applikation von Antigen kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von Katja Goldmann aus Kulmbach

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung:

16.04.2012

Vorsitzender der Promotionskommission:

Prof. Dr. Rainer Fink

Erstberichterstatter:

Prof. Dr. Thomas Winkler

Zweitberichterstatter:

PD Dr. Bernd Spriewald

1. Einleitung

1.1 Selbsttoleranz Eine der Hauptaufgaben des humanen Immunsystems ist es den Körper vor Krankheitserregern zu schützen. Neben dieser schützenden Immunantwort stellen jedoch auch Mechanismen, die den Körper vor überschießenden oder fehlerhaften Immunreaktionen gegenüber körpereigenen Strukturen schützen, eine zentrale Funktion

des

Immunsystems

dar

[1].

Eine

Fehlfunktion

dieser

Regulationsmechanismen kann zu Allergien oder Autoimmunerkrankungen führen [2]. Die Toleranz des Immunsystems gegenüber körpereigenen Antigenen wird als Selbsttoleranz bezeichnet [3]. Neben der negativen Selektion im Thymus durch die der größte Teil autoreaktiver T-Zellen eliminiert wird (zentrale Toleranz) [4, 5] stellt die periphere Toleranz einen entscheidenden Mechanismus der Selbsttoleranz dar. Hierbei führt der Kontakt von T-Zellen in der Peripherie mit hohen Mengen ihres Antigens oder ohne kostimulierende Signale zur Anergie oder Deletion der TZellen [6, 7]. Anerge T-Zellen können von ihrem Antigen nicht mehr aktiviert werden [8]. Deletion mündet in einer Fas-vermittelten Apoptose der T-Zellen [9]. Neben Anergie und Deletion autoreaktiver T-Zellen spielt auch die Bildung regulatorischer T-Zellen für die Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz eine wichtige Rolle [10]. Regulatorische T-Zellen können die Aktivität von autoreaktiven TZellen unterdrücken [11]. Darüber hinaus sind sie in der Lage auch die humorale Immunantwort zu regulieren [12].

1.2 Orale Toleranz 1.2.1 Das Darmimmunsystem Das Immunsystem des Darms ist das Größte und das Komplexeste im menschlichen Körper. Das Darm assoziierte lymphatische Gewebe (GALT: gut associated lymphoid tissue) besteht aus einer Vielzahl von Immunzellen, die über

das Epithelium und die Lamina Propria der Darmmukosa verteilt sind, aber auch aus organisierten immunologischen Kompartimenten wie den Payer’schen Plaques (PP) und den mesenterischen Lymphknoten (MLK) [13]. Das

Darmimmunsystem

steht

vor

der

Herausforderung

einerseits

auf

aufgenommene Pathogene mit einer schützenden Immunantwort zu reagieren, aber andererseits die natürliche Bakterienflora und harmlose Nahrungsmittelantigene zu tolerieren. Dementsprechend gibt es 3 Hauptstrategien mit denen das Immunsystems des Darms auf oral administrierte Antigene reagieren kann: eine lokale IgA Sekretion, eine protektive Immunantwort und die Induktion immunologischer Toleranz [14]. Da harmlose Nahrungsmittelproteine und die natürliche Bakterienflora die Hauptantigenlast des Darms darstellen, reagiert das Darmimmunsystem auf oral aufgenommene Antigene für gewöhnlich mit einer systemischen Unempfindlichkeit (Toleranz). Die spezifische Suppression der zellulären und/oder humoralen Immunantwort gegenüber einem Antigen durch vorherige Aufnahme des Antigens über die orale Route wird als orale Toleranz bezeichnet. Hierbei stellt der Darm eine natürliche anti-inflammatorische Umgebung dar, in der Antigene in einer tolerogenen Weise präsentiert werden. Bakterien und Nahrungsmittelantigene stellen aufgrund ihres kontinuierlichen Kontakts zur Darmmukosa eine Grenze zwischen fremden und körpereigenen Antigenen dar. Somit kann die orale Toleranz auch als eine Form der peripheren Toleranz betrachtet werden [14]. Orale Toleranz kann insbesondere für lösliche Antigene induziert werden [15, 16]. Dabei ist die Toleranzinduktion am effektivsten, wenn das Antigen allein und nicht zusammen mit anderen Antigenen in einem Antigengemisch appliziert wird [17]. In zahlreichen Studien konnte im Tiermodell das Phänomen der oralen Toleranz für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis, Typ-1 Diabetes und Myasthenia gravis sowie in Transplantationsabstoßungsmodellen erfolgreich genutzt werden [18-24]. Weitere klinische Studien haben gezeigt dass auch im humanen System orale Toleranz induziert werden kann [25]. Allerdings sind Anzahl und Umfang der humanen

Studien bislang sehr gering. So führte die Behandlung von rheumatischer Arthritis mit Collagen zu einem signifikanten Ansprechen [26, 27]. Auch im Bereich Nahrungsmittelallergien konnten Erfolge erzielt werden [28, 29]. In anderen Studien führte die orale Applikation des Antigens (Insulin, Myelin) für die Behandlung von Diabetes oder Multiple Sklerose bislang zu keinem signifikanten Effekt [30, 31].

1.2.2 Mechanismen der oralen Toleranz Die Mechanismen der oralen Toleranz sind sehr komplex und noch nicht vollständig aufgeklärt. Bislang ist sich die Literatur jedoch einig, dass es sich um einen T-Zell abhängigen Prozess handelt [14]. Es existieren 2 Hauptmechanismen über die orale Toleranz vermittelt werden kann, erstens über klonale Anergie oder Deletion von Antigen-spezifischen T-Zellen und zweitens über die Induktion von regulatorischen TZellen. Welcher dieser Mechanismen abläuft hängt hauptsächlich von der Dosis des Antigens ab [32], allerdings schließen sich die beiden Formen der Toleranzinduktion nicht aus sondern greifen häufig ineinander [14]. Eine hohe Antigendosis (Hochdosistoleranz) führt aufgrund einer hohen Menge präsentierten Antigens ohne kostimulierende Signale zur Anergie oder einer in Apoptose resultierenden Deletion von Antigen-spezifischen T-Zellen im Darm, gefolgt von einer systemischen Antigenpräsentation nachdem das Antigen den Darm passiert hat [33-36]. Eine niedrige Antigendosis (Niedrigdosistoleranz) führt dagegen eher zur Bildung von Antigen-spezifischen regulatorischen T-Zellen [37]. Darm assozierte

antigenpräsentierende

Zellen

(APC),

vermutlich

spezialisierte

dendritische Zellen (DC) aus der Lamina Propria, nehmen das Antigen auf, transportieren es zu den mesenterischen Lymphknoten (MLK) und präsentieren es naiven T-Zellen [38]. Diese Präsentation resultiert in der Induktion von Antigenspezifischen

regulatorischen

T-Zellen.

Die

induzierten

T-Zellen

wirken

systemisch, indem sie zu weiteren Lymphorganen migrieren und dort die Bildung von Antigen-spezifischen Effektor-T-Zellen inhibieren.

Auf der Suche nach dem Phänotyp der regulatorischen T-Zellen konnte in frühen Studien die Bildung von TGF-beta produzierenden regulatorischen CD8*T-Zellen nach Fütterung von Myelin basischen Protein (MBP) in einem Rattenmodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) demonstriert werden [39]. In weiteren Studien wurde ebenfalls die Induktion von regulatorischen CD8*TZellen nach oraler Antigen Administration nachgewiesen [40-42]. Allerdings konnte durch die Depletion von CD8*T-Zellen die Induktion oraler Toleranz im Tiermodell nicht verhindert werden [43-45]. Dies deutet daraufhin, dass regulatorische CD8*T-Zellen zwar in einzelne Prozesse der oralen Toleranz involviert sein können, nicht aber unerlässlich dafür sind. Bei der Untersuchung regulatorischer NKT-Zellen und ihrem Einfluss auf die Induktion oraler Toleranz wurden widersprüchliche Beobachtungen gemacht. Nachdem in einigen Modellen ihre Beteiligung an den regulatorischen Prozessen der oralen Toleranz aufgezeigt wurde [46, 47], demonstrierte Ishimitsu et al., dass in NKT-Zell defizienten Mäusen orale Toleranz normal induziert warden konnte [48]. Im Gegensatz zu den NKT-Zellen erscheint die Rolle der γδ-T-Zellen klarer [49, 50]. So verhindert ihre Depletion im Mausmodell die erfolgreiche Toleranzinduktion gegenüber Ovalbumin (OVA) [50]. Hierbei scheinen intraepitheliale γδ-T-Zellen in die Induktion von regulatorischen CD4*CD25*T-Zellen nach oraler Antigen Administration involviert zu sein [51]. Die

Population,

die

am

deutlichsten

mit

der

Induktion

der

oralen

Toleranzinduktion in Zusammenhang gebracht wird, sind regulatorische CD4*TZellen. So wurde in zahlreichen Depletions- und Transferexperimenten nachgewiesen, dass CD4*T-Zellen unerlässlich für die Induktion bzw. den Transfer der oralen Toleranz sind [43, 44, 52]. Die in die orale Toleranz involvierten, regulatorischen CD4*T-Zellen lassen sich in 3 Subgruppen einteilen: CD4*CD25*T-Zellen (Tregs), Th3-T-Zellen und Tr1-TZellen [53]. Die im Thymus gereiften CD4*CD25*T-Zellen (Tregs) sind in der Lage über Zell-Zell-Kontakt

oder

anti-inflammatorische

Zytokine

die

Aktivierung,

Proliferation und Effektorfunktion anderer Immunzellen zu supprimieren [11, 12].

Sie exprimieren den Transkriptionsfaktor forkhead-box-p3 (Foxp3), der für die Entwicklung und die Funktion der Tregs entscheidend ist, konstitutiv [54-56]. Eine Mutation im Foxp3-Gen löst beim Menschen die Autoimmunkrankheit IPEX (immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) aus [57]. Neben den im Thymus gereiften Tregs können CD4*CD25*T-Zellen auch in der Peripherie aus naiven CD4*T-Zellen induziert werden. Dieser Prozess wird durch TGF-beta, das die Expression von Foxp3 induzieren kann, ausgelöst [58, 59]. Die so entstandenen CD4*CD25*T-Zellen sind in der Lage, die Aktivierung anderer CD4*T-Zellen zu unterdrücken. Eine weitere regulatorische Population sind die Th3-T-Zellen. Th3-TZellen werden aus naiven CD4*T-Zellen induziert und exprimieren hohe Mengen TGF-beta, sowie geringe Mengen Interleukin-10 (IL-10) und Interleukin-4 (IL-4) [37, 60]. Ihre suppressive Aktivität vermitteln sie über diese Zytokine. Das von den Th3-T-Zellen sezernierte TGF-beta fördert wiederum

die

Differenzierung

von

naiven

CD4*T-Zellen

zu

Foxp3*CD4*CD25*T-Zellen im Darm [61]. Retinolsäure, die von intestialen dentritischen Zellen (DC) produziert wird, fördert ebenfalls die Umwandlung von naiven T-Zellen in Foxp3*CD4*CD25*Tregs [62]. Tr1-T-Zellen supprimieren ähnlich wie Th3-T-Zellen über die Bildung eines anti-inflammatorischen Zytokins [63]. Im Fall der Tr1–T-Zellen handelt es sich dabei um Interleukin-10 (IL-10). Alle diese T-Zell Subpopulationen scheinen in die regulatorischen Prozesse der oralen Toleranz involviert zu sein, allerdings ist noch weitgehend unklar, welche Rolle die einzelnen Subgruppen bezügliche der Induktion und Aufrechterhaltung der lokalen und/oder systemischen Toleranz übernehmen [53]. Die hier aufgeführten regulatorischen T-Zellen teilen sich jedoch eine Gemeinsamkeit, sie werden zwar Antigen-spezifisch aktiviert, können jedoch aufgrund ihres Wirkmechanismus über anti-inflammatorische Zytokine und/oder Zell-Zell-Kontakt auch die Immunantwort gegenüber einem anderen unabhängigen Antigen, das zum gleichen Zeitpunkt und in räumlichem Zusammenhang dem Immunsystem präsentiert wird, supprimieren. So konnte in verschiedenen Tiermodellen nachgewiesen werden, dass die orale Vorbehandlung mit einem

Antigen zur Suppression der Immunantwort gegen ein zweites unabhängiges Antigen führte, wenn eine Mischung aus beiden Antigenen für die Immunisierung verwendet wurde [64-66]. Dieses Phänomen wird als „Bystander-Suppression“ bezeichnet. Der Vorteil hierbei liegt im Hinblick auf eine therapeutische Anwendung darin, dass bei mehreren krankheitsinduzierenden Antigenen die Toleranzinduktion gegenüber nur einem dieser Antigene ausreicht, um im Zielorgan auch eine Immunsuppression gegenüber den restlichen Antigenen herbeizuführen. Dies ist sinnvoll, da häufig nicht alle krankheitsinduzierenden Antigene bekannt sind. So gelang es durch die orale Vorbehandlung mit Myelin basischem Protein (MBP) eine mit Proteolipidprotein

(PLP) induzierte

experimentelle Enzephalomyelits (EAE) im Mausmodell zu supprimieren [67].

1.3 Gentherapie mit Chitosan-DNA Nanopartikeln Gentherapie bezeichnet das Einfügen von Genen in Zellen eines Individuums zu therapeutischen Zwecken. Ziel dabei ist es defekte Gene in betroffenen Zellen auszuschalten und/oder durch fehlerfreie zu ersetzen, um dadurch hereditäre oder erworbene Gendefekte, Infektionskrankheiten oder Krebs zu behandeln. Um das genetische Material in die Zielzellen einzubringen, benötigt man einen Gencarrier. Diesbezüglich unterscheidet man zwischen viraler und nicht-viraler Gentherapie. Bei der viralen Gentherapie werden Viren (z.B. Adeno-, Herpes- oder Retroviren) als Gencarrier verwendet. Da das Einbringen von genetischem Material in Wirtszellen ein Teil des natürlichen Lebenszyklus von Viren ist, kann mit dieser Methode eine hohe Transfektionseffizienz erreicht werden. Allerdings birgt die Verwendung von Viren als Gencarrier auch Gefahren wie durch das Virus ausgelöste Mutationen oder Immunreaktionen des Körpers bis hin zu einem erhöhten Krebsrisiko. Aus diesem Grund nimmt die nicht-virale Gentherapie, eine weitaus sicherere Variante, wenngleich auch mit einer deutlich geringeren Transfektionseffizienz [68], eine zunehmende Bedeutung im Bereich der Gentherapieforschung ein. Bei der nichtviralen Therapie wird das genetische Material neben physikalischen Verfahren vor allem mit Hilfe chemischer

Transportsysteme wie Liposomen, kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren in die Zielzelle eingebracht. Ein erfolgversprechendes kationisches Polymer für die nicht-virale Gentherapie ist Chitosan [69]. Chitosan, die deacetylierte Form von Chitin, ist ein langes positiv geladenes Polymer. Es ist nichttoxisch, biodegradierbar, gering immunogen und wird - aufgrund seiner Fähigkeit Lipide zu binden - bereits als Diätetikum klinisch eingesetzt [70-72]. Chitosan kann durch Koazervation seiner positiv geladenen Aminogruppen mit den negative geladenen Phosphatgruppen von DNA Nanopartikel bilden und in dieser Form als Gencarrier eingesetzt werden. Als DNA Molekül wird dabei meist ein Plasmid als Expressionsvektor verwendet. In in vitro Studien konnte die Aufnahme von Chitosan-DNA Nanopartikel in unterschiedlichen Zelllinien und die daran anschließende Expression des Zielgens demonstriert werden [73]. Darüber hinaus sind Nanopartikel, aufgrund ihrer Stabilität während der Magen-Passage und ihren mukosal-adhäsiven Eigenschaften, auch für den in vivo Einsatz als orale Gencarrier geeignet [74-77]. So führte die orale Applikation der Nanopartikel an Mäuse zur Genexpression im Magen und Dünndarm. Überdies konnte die Plasmid-DNA nach oraler Verabreichung der Nanopartikel auch systemisch in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden [78]. Die Fütterung von Gerinnungsfaktor VIII kodierenden Nanopartikeln an Hämophilie A Mäuse resultierte in einem Anstieg der Faktor VIII Konzentration im Plasma und einer deutlichen phänotypischen Verbesserung [78, 79]. Eine weitere therapeutische Anwendung im Bereich der Gensubstitution fanden Chitosan-DNA Nanopartikeln, die für das Gen des murinen Erythropoietins (mEPO) kodierten. Erythropoietin fördert die Bildung von Erythrocyten und wird zur Anämie Behandlung bei Dialysepatienten oder nach Chemotherapien eingesetzt. Nach der oralen Applikation von mEPO kodierenden Nanopartikeln an Mäuse wurde ein signifikanter Anstieg der Hämatokrit-Werte im Serum nachgewiesen [74]. Weiterhin führte die gastrointestinale Administration von Insulin kodierenden Nanopartikeln in diabetischen Ratten zu einem Anstieg des Plasma Insulins und signifikant verminderten Blutglucosespiegeln [80, 81]. Neben den Anwendungsmöglichkeiten der Nanopartikel im Bereich der

Gensubstitution konnten auch Erfolge im Bereich der Immunmodulation mit Nanopartikeln sowohl hinsichtlich Immunstimulation als auch Toleranzinduktion erzielt

werden.

So

konnte

durch

die

intranasale

Verabreichung

von

Pneumokokken-Oberflächenantigen A kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln an Balb/c-Mäuse ein Impfschutz gegenüber der nasopharyngealen Kolonisierung mit Streptococcus pneumoniae hergestellt werden [82]. In einer weiteren Studie konnte durch pulmonale Verabreichung von Nanopartikeln, die für 8 verschiedene HLA-A*0201-restriktierte

T-Zell-Epitope

von

Mycobacterium

tuberculosis

kodierten, in HLA-A2 transgenen Mäusen eine Immunisierung gegen die Bakterien

induziert

werden

[83].

Im

Bereich

der

immunologischen

Toleranzinduktion konnte Roy et. al durch orale Gabe von Chitosan-DNA Nanopartikeln, die für das dominante Erdnuss-Allergen Arah2 kodierten, die Produktion von sekretorischem IgA und Serum IgG2 steigern, die Bildung von IgE unterdrücken und somit das Risiko eines anaphylaktischen Schocks der Mäuse reduzieren [77]. Auf ähnliche Weise führte die Behandlung von Mäusen mit für das Hausstaubmilben-Allergen Der p 2 kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln zu einer verstärkten IFN-γ Bildung im Serum, wodurch die für eine allergische Reaktion entscheidende IgE-Antwort unterdrückt werden konnte [74, 84]. Aufgrund dieser erfolgreichen Anwendungen der Nanopartikel im Bereich der Immunmodulation war es das Ziel dieser Arbeit die orale Gentherapie für eine Toleranzinduktion gegenüber bekannten Antigenen zu nutzen, um dadurch Autoimmunerkrankungen oder Transplantatabstoßung behandeln zu können.

1.4 Transplantatabstoßung

1.4.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) und die allogene Immunantwort Eines der Hauptprobleme bei der allogenen Transplantation ist eine starke Immunantwort des Empfängers gegenüber dem fremden Spendergewebe. Ursächlich

dafür

sind

hauptsächlich

Unterschiede

im

Haupthistokompatibiltätskomplex (MHC) von Spender und Empfänger. Der MHC bezeichnet eine Gruppe von Genen, die beim Menschen auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert sind [3]. Als Genprodukt entstehen Proteinkomplexe auf der Zelloberfläche, die für die Immunantwort eine entscheidende Rolle spielen. Diese Proteinkomplexe binden Antigenfragmente und präsentieren sie spezifischen TZellen.

Die

Präsentation

der

Antigenfragmente

in

Kombination

mit

kostimulierenden Signalen führt zur Aktivierung der für das Antigenfragment spezifischen T-Zellen. Nach einer Transplantation wird das MHC des Spenders selbst als Fremd-Antigen erkannt und eine starke Immunantwort ausgelöst. Die Alloantigenerkennung kann hierbei direkt oder indirekt erfolgen [85, 86]. Bei der direkten Erkennung reagieren die T-Zellen auf vollständige MHC-Moleküle, die auf der Zelloberfläche von Spenderzellen oder -gewebe exprimiert werden. Da ca. 1-10% aller T-Zellen eines Individuums alloreaktiv sind, d.h. auf fremde MHCMoleküle direkt reagieren, erfolgt dadurch eine heftige Immunreaktion in der frühen postoperativen Phase [3, 87]. Bei der indirekten Erkennung werden allogene

MHC-Moleküle

von

antigenpräsentierenden

Zellen

(APC)

des

Empfängers aufgenommen und als Antigenfragmente auf Empfänger-MHCMolekülen präsentiert [88, 89]. Diese Form der Abstoßung dominiert häufig in der späteren Phase der Abstoßung [87]. Sowohl die indirekte als auch die direkte Präsentation können zur Abstoßung führen [86].

Иммуномодуляция при пероральном введении антигена кодирования наночастиц хитозан-ДНК Факультет естественных наук Эрланген-Нюрнбергский университет им. Александра Фридриха для получения степени доктора естественных наук представлен Катей Голдманн из Кульмбаха

Диссертация утверждена факультетом естественных наук Эрланген-Нюрнбергского университета им. Фридриха-Александра Дата рассмотрения:

16.04.2012

Председатель аттестатионной комиссии:

Проф. д. Райнер Финк

Первый докладчик:

Проф. д. Томас Винклер

Второй докладчик:

Д. д. Бернд Шпривальд

1.

Введение

1.1

Аутопереносимость

Одной из главных задач человеческой иммунной системы является защита организма от патогенов. Наряду с этим защитную иммунную реакцию обеспечивают

также

механизмы,

которые

защищают

организм

от

превышенной или нарушенной иммунной реакции по отношению к эндогенным структурам, центральная функция иммунной системы [1]. Сбой этих

регуляторных

механизмов

может

привести

к

аллергии

или

аутоиммунным заболеваниям [2]. Переносимость иммунной системы против эндогенных антигенов называется аутопереносимость [3]. Наряду с этим негативная селекция в тимусе благодаря большой части аутореактивных Т-клеток устраняется (центральная переносимость) [4,5], представляя собой периферическую переносимость важного

механизма

аутопереносимости.

Здесь

контакт

Т-клеток

на

периферии с большим количеством их антигенов или без костимуляторных сигналов приводит к анергии или делеции Т-клеток [6,7]. Анергия Т-клеток может уже не активироваться со своими антигенами [8]. Делеция приводит к Fas-опосредованному апоптозу Т-клеток. Наряду с этим анергия и делеция аутореактивных Т-клеток играет важную роль в образовании регулирующих Т-клеток для поддержания аутопереносимости [10]. Регулирующие Т-клетки могут подавлять активность аутореактивных Т-клеток [11]. Кроме этого они в состоянии также регулировать гуморальную иммунную реакцию [12]. 1.2 Оральная толерантность 1.2.1 Кишечная иммунная система Иммунная система кишечника является крупнейшей и наиболее сложной в человеческом организме. Кишечник – ассоциированная лимфоидная ткань (кишечник лимфоидной ткани), состоит из множества иммунных клеток,

которые распределены по всему эпителию и собственной пластинке слизистой

оболочки

иммунологических

кишечника,

отсеков,

таких

а как

также

из

пейеровы

организованных бляшки

(ПБ)

и

мезентериальные лимфатические узлы (МЛУ) [13]. Перед кишечной иммунной системой стоит задача, с одной стороны, чтобы защитная иммунная реакция реагировала на патогенные микроорганизмы, а также с другой стороны, мирилась с естественной бактериальной флорой и безвредными пищевыми антигенами. Соответственно, существуют три основные стратегии, с которыми иммунная система кишечника может реагировать на пероральный ввод антигенов: местная секреция IgA, защитный иммунный ответ и индукция иммунологической переносимости [14]. Поскольку безвредные белки пищевых продуктов и естественная бактериальная флора являются основными антигенами нагрузки кишечника, кишечная иммунная система реагирует на патогенные антигены перорально, как правило, с системным иммунитетом (переносимость). Специфическое подавление клеточной и / или гуморальной иммунной реакции антигеном по предварительному поглощению антигена пероральным путем известно как оральная

переносимость.

В

связи

с

этим

кишечник

обеспечивает

натуральную противовоспалительную окружающую среду, представленную антигенами толерогенным способом. Бактерии и пищевые антигены обеспечивают из-за их непрерывного контакта в слизистой оболочке кишечника границы между посторонними и собственными антигенами. Таким образом, оральную переносимость можно рассматривать как форму периферической переносимости [14]. Оральная переносимость может быть индуцирована, в частности, для растворимых антигенов [15,16]. Это толерантная индукция является наиболее эффективной, когда антиген вводят отдельно, а не с другими антигенами в антигенной смеси [17]. В многочисленных исследованиях может быть с успехом использован на животных

моделях

феномен

оральной

переносимости

для

лечения

аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз, ревматоидный

артрит, сахарный диабет 1 типа и миастения и в моделях трансплантацииотторжения [18-24]. Дальнейшие клинические исследования показали, что человеческая система оральной переносимости может быть индуцирована [25]. Тем не менее, число и масштабы человеческих исследований были очень низкими. Таким образом, лечение ревматоидного артрита с коллагеном приводит к существенной ответной реакции [26,27]. В области аллергии на еду были достигнуты успехи [28,29]. В других исследованиях перорального введения антигена (инсулин, миелин) для лечения диабета или рассеянного склероза до сих пор не приведен никакой значительный эффект [30,31]. 1.2.2 Механизмы оральной переносимости Механизмы оральной переносимости являются очень сложными и не полностью поняты. До сих пор, однако, в литературных источниках согласны, что речь идет о зависимом процессе Т-клеток [14]. Могут опосредовано существовать два основных механизма со стороны оральной переносимости, во-первых, через клональную анергию или делецию антигенспецифических Т-клеток и, во-вторых, через индукцию регуляторных Тклеток. Какой из этих механизмов возникает, главным образом, зависит от дозы антигена [32], хотя включает в себя обе формы переносимой индукции, но рассматриваются отдельно друг от друга [14]. Высокие дозы антигена (высокая доза переносимости) приводит в результате к высокому количеству представленного антигена без костимуляторных сигналов к анергии или апоптозу

в

результате

делеции

антиген-специфических

Т-клеток

в

кишечнике, с последующим системным антигенным представлением после того, как антиген прошел через кишечник [33-36]. Низкая доза антигена (низкая доза переносимости), тем не менее, приводит к образованию антигенспецифических регуляторных Т-клеток [37]. Связанные кишечные антигенпредставляющие клетки (АПК), предположительно специализируются на дендритных клетках (ДК) из собственной пластинки, берут антиген, транспортируют его в мезентериальные лимфатические узлы (МЛК) и

представляют «наивные» (значение: такие клетки, которые еще не вступали в процесс

распознавания

чужеродных

антигенов)

Т-клетки

[38].

Это

представление приводит к индукции антиген-специфических регуляторных Т-клеток. Индуцированные Т-клетки действуют системно, путем миграции в другие лимфоидные органы и там ингибируют образование антигенспецифических эффекторных Т-клеток. Поиск по фенотипу регуляторных Т-клеток можно продемонстрировать в начале исследования образований TGF-бета-продуцирующих регуляторных CD8·Т-клеток после питания основным белком миелином крысиной модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [39]. В других исследованиях была обнаружена также индукция регуляторных CD8·Тклеток после перорального введения антигена [40-42]. Тем не менее, не может быть предотвращена делеция CD8·Т-клеток индукцией оральной переносимости в животной модели [43-45]. Это говорит о том, что регуляторные CD8·Т-клетки действительно могут быть вовлечены в отдельные процессы оральной переносимости, но не обязательно. При изучении регуляторных NKT-клеток и их влияния на индукцию оральной переносимости были сделаны противоречивые наблюдения. После того, как в некоторых моделях было показано их участие в процессе регулирования оральной толерантности [46,47], Ишимитсу и др. продемонстрировали, что в NKT-клетках дефицитных мышей оральная переносимость может быть нормально индуцирована [48]. В отличие от NKT-клеток роль γδ-Т-клеток является более четкой [49,50]. Таким образом, их исчерпание в крысиной модели предотвращает успешную индукцию переносимости к овальбумину [50]. В связи с этим интраэпителиальные γδ-Т-клетки, по-видимому, участвуют

в

индукции

регуляторных

CD4·CD25·T-клеток

после

перорального введения антигена [51]. Популяции, которые четко приводят индукцию с оральной переносимой индукцией в связь, являются регуляторными CD4·T-клетками. Это было показано в многочисленных экспериментах обеднения и переноса, в которых

CD4·T-клетки

необходимы

для

индукции

или

передачи

оральной

переносимости [43,44,52]. Они участвуют в оральной переносимости, регуляторные CD4·Т-клетки могут быть разделены на три подгруппы: CD4·CD25·T-клетки (Tregs), Th3-Т-клетки и Tr1-Т-клетки [53]. В вилочковой железе (тимусе) зрелые CD4·CD25·T-клетки (Tregs) подавляют активацию, пролиферацию и эффекторную функцию других иммунных клеток в положении межклеточного контакта или противовоспалительных цитокинов [11, 12]. Они выражают транскрипционный фактор forkhead-box-p3 (Foxp3) (это аббревиатура, означающая белок, вовлеченный в иммунные реакции), который имеет решающее значение для развития и функционирования регуляторных Т-клеток конститутивно [54-56]. Мутация в Foxp3-гене вызывает у людей аутоиммунное заболевание IPEX (иммунное нарушение регуляции полиэндокринопатийный энтеропатийный синдром Х-хромосомы) [57]. В дополнение в тимусе зрелые Tregs могут индуцировать CD4·CD25·Tклетки

на

периферию

из

«наивных»

CD4·T-клеток.

Этот

процесс

инициируется TGF-бета, которые могут индуцировать экспрессию из Foxp3 [58,59]. Полученные CD4·CD25·T-клетки способны подавлять активацию других CD4·T-клеток. Другой регуляторной популяцией являются Th3-Тклетки.

Th3-Т-клетки

индуцируются

от

«наивных»

CD4·T-клеток

и

выражают высокие уровни TGF-бета, а также небольшие количества Интерлейкин-10 (IL-10) и Интерлейкин-4 (IL-4) [37,60]. Свою подавляющую активность

они

сообщают

через

эти

цитокины.

Из

Th3-Т-клеток

секретируется TGF-бета, что, в свою очередь, способствует дифференциации из «наивных» CD4·T-клеток Foxp3·CD4·CD25·T-клеток в кишечнике [61]. Ретиноевая кислота, которую получают из интестиалированных дендритных клеток (ДК), также способствует превращению «наивных» Т-клеток в Foxp3·CD4·CD25·Tregs [62]. Tr1-Т-клетки подавляют также Th3T-Т-клетки через образование противовоспалительного цитокина [63]. В случае Tr1-Тклеток они включают в себя Интерлейкин-10 (IL-10). Все эти Т-клеткисубпопулиции, по-видимому, принимают участие в регуляторном процессе

оральной переносимости, по-прежнему, в значительной степени, является неясным какую роль отдельные подгруппы связанной индукции и поддержанием местной и/или системной переносимости берут на себя [53]. Тем не менее, перечисленные здесь регуляторные Т-клетки имеют одну общую черту, они действительно активируют специфический антиген, но могут также подавлять из-за их механизма действия на анти-воспалительные цитокины и/или межклеточный контакт иммунный ответ по отношению к другому независимому антигену, который представлен в то же самое время иммунной системой в пространственном контексте. Таким образом, можно продемонстрировать на различных животных моделях, что пероральная предварительная обработка антигена приводит к подавлению иммунного ответа против второго независимого антигена, когда используется смесь двух антигенов для иммунизации на различных животных моделях [64-66]. Это явление известно как «подавление наблюдателя». Преимуществом в связи с этим с точки зрения терапевтического применения является то, что в нескольких вызывающих болезнь антигенах переносимая индукция только одного из этих антигенов является достаточной, чтобы вызвать в органемишени иммуносупрессию и в отношении остальных антигенов. Это полезно, потому что часто не знают всех вызывающих болезнь антигенов. Это позволило при пероральной предварительной обработке основного белка миелина (MBP) c протеолипидным белком (PLP) подавить индуцированный экспериментально энцефаломиелит на мышиной модели [67]. 1.3 Генная терапия с наночастицами хитозан-ДНК Генная терапия относится к установке генов в клетки индивидуума в терапевтических целях. Цель заключается в том, чтобы устранить и/или безошибочно заменить дефектные гены в пораженных клетках, тем самым вылечить наследственные или приобретенные генетические дефекты, инфекционные заболевания или рак. Для того чтобы ввести генетический материал в клетки-мишени, нужен ген-носитель. В связи с этим, различают

вирусную и невирусную генную терапию. В вирусной генной терапии в качестве гена-носителя используются вирусы (например, аденовирус, герпес, или ретровирус). Поскольку введение генетического материала в клеткихозяева является частью естественного жизненного цикла вирусов, может быть достигнута с помощью этого метода высокая трансфекционная эффективность. Тем не менее, использование вирусов как гена-носителя таит опасность, например, вирус запускает мутации или иммунные реакции организма с повышенным риском рака. По этой причине, невирусная генная терапия, как более безопасный вариант, хотя и с существенно меньшей трансфекционной эффективностью [68], принимает все большие значение в области исследований генной терапии. В невирусной терапии генетический материал вводится в клетки-мишени в основном физическими методама, особенно с помощью химических транспортных систем, таких как липосомы, катионные липиды или катионные полимеры. Перспективным катионным полимером для невирусной генной терапии является хитозан [69]. Хитозан, деацетилированная форма хитина, длинный положительно заряженный полимер. Он нетоксичный, биоразлагаемый, низкоиммуногенный и – из-за его способности связываться с липидами – уже используется клинически в качестве диетического продукта [70-72]. Хитозан путем коацервации его положительно заряженных аминогрупп с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК может образовывать наночастицы и в таком виде использоваться как ген-носитель. Как ДНК молекулу, как правило, используют плазмиду, в качестве экспрессирующего вектора. Во внутренних исследованиях может быть продемонстрировано усвоение наночастиц хитозан-ДНК в различных клеточных линиях и последующее выражение гена-мишени

[73].

Кроме

того,

наночастицы

пригодны

даже

для

использования снаружи в качестве перорального гена-носителя из-за их устойчивости при прохождении желудка и их слизисто-адгезионных свойств [74-77]. Таким образом, вводят перорально наночастицы в мышей для генной экспрессии в желудке и тонкой кишке. Кроме того, плазмидная ДНК может

быть обнаружена после перорального введения наночастиц системно в различные ткани [78]. Подача из фактора свертывания VIII гемофилии A мыши кодирующих наночастиц приводит к увеличению концентрации фактора VIII в плазме и к значительному фенотипическому улучшению [78,79]. Далее терапевтическое применение в области замещения гена найдены наночастицы хитозан-ДНК, которые кодируются геном мышиного эритропоэтина (mEPO). Эритропоэтин стимулирует образование красных кровяных клеток и используется для лечения анемии у диализных пациентов или после химиотерапии. После перорального введения в мышей mEPO кодированных наночастиц было обнаружено значительное увеличение значений гематокрита в сыворотке [74]. Кроме того, введение в желудочнокишечный тракт инсулин-кодированных наночастиц в диабетических крыс привело к повышению инсулина в плазме и к значительному снижению уровня глюкозы в крови [80, 81]. В дополнение к применению наночастиц в области замещения гена также могут быть достигнуты успехи в области иммуномодуляции с наночастицами как в плане иммунной стимуляции, так и переносимой индукции. Это может быть получено путем интраназального введения пневмококкового поверхностного антигена А кодированных наночастиц хитозан-ДНК в Balb/c-мышь с защитой от назофарингеального заселения Streptococcus pneumoniae [82]. В другом исследовании легочное введение наночастиц, которые кодируются для 8 различных HLA-A2·0201рестриктированных Т-эпитопных-клеток из палочки Коха, в HLA-A2 трансгенных мышах могло вызвать иммунизацию против бактерий [83]. В области иммунологической переносимой индукции Рой и др. смогли путем перорального введения наночастиц хитозан-ДНК, которые закодированы доминирующим арахисовым аллергеном Arah2, увеличить производство секреторных IgA и IgG2 в сыворотке, подавить образование IgE и, следовательно, уменьшить риск анафилактического шока у мышей [77]. Аналогичным образом обработка мышей клещевым аллергеном домашней пыли Derp2 кодированных наночастиц хитозан-ДНК привела к повышенному

образованию IFN-γ в сыворотке, в результате чего аллергическая реакция может быть подавлена решающим IgE-ответом [74,84]. Из-за этих успешных применениий наночастиц в области иммуномодуляции целью данной работы может являться оральная генная терапия для переносимой индукции по отношению к известным антигенам, таким образом, лечения аутоиммунных заболеваний или отторжения трансплантата. 1.4 Отторжение трансплантата 1.4.1 Главный комплекс гистосовместимости (MHC) и аллогенная иммунная реакция Одной из основных проблем аллогенной трансплантации является сильная иммунная реакция приемника по отношению к внешней донорской ткани. Причины

этого,

в

основном,

различия

в

главном

комплексе

гистосовместимости (МНС) донора и реципиента. МНС – это группа генов, локализованных в организме человека на коротком плече хромосомы 6 [3]. Как генный продукт возникают белковые комплексы на поверхности клеток, которые играют ключевую роль в иммунной реакции. Эти белковые комплексы

связывают

антигенные

фрагменты

и

представляют

их

специфическими Т-клетками. Представление антигенных фрагментов в комбинации с дополнительными стимулирующими сигналами приводит к активации

антигенных

трансплантации

фрагментов

главный

комплекс

специфических

Т-клеток.

гистосовместимости

После

донора

сам

признается в качестве чужеродного антигена и вызывает сильный иммунный ответ. Обнаружение аллоантигена может происходить прямо или косвенно [85,86]. В прямом обнаружении Т-клетки реагируют на целые МНСмолекулы, которые экспрессируются на клеточной поверхности клетокдоноров или тканей. Примерно 1-10% всех Т-клеток индивидуума являются аллореактивными, т.е. непосредственно реагируют на чужеродные MHCмолекулы,

ведущие

к

активной

иммунной

реакции

в

раннем

послеоперационном периоде [3, 87]. В косвенном методе регистрации

записываются аллогенные MHC-молекулы из антиген-представляющих клеток (АРС) реципиента и представляются в виде антигенных фрагментов на приемнике MHC-молекул [88-89]. Эта форма отказа органа часто доминирует в поздней стадии отторжения [87]. И прямое и косвенное обнаружение может привести к отторжению [86].