Analytik der Plasmaproteine

BAUSTEINE DES LEBENS

Vom Griechischen proteios – erstrangig → Wichtigkeit der Proteine. Ohne Proteine kein Leben. • Plasmaproteine – heterogenes Gemisch aus Proteinen, zwei Drittel davon Albumin.

Proteine und Proteide Einfache Proteine – nur AS Zusammengesetzte Proteine – AS + andere Stoffe = PROTEIDE Beispiele: • Glycoproteide: AS + KH (z.B. Lysozym der Tränenflüssigkeit) • Lipoproteide: AS + Fett (LDL) • Nukleoproteide: AS + Nukleinsäuren • Chromoproteide: AS + Farbstoffe (z.B. Hämoglobin)

Aufbau, Struktur der Proteine Aminosäuren: = Ampholyte Carboxylgruppe: saure Eigenschaften Aminogruppe: basische Eigenschaften Aminosäuren unterscheiden sich durch ihre Seitenketten (R).

Aminosäuren sind Zwitterionen Am isoelektrischen Punkt sind Proteine neutral, haben keine Nettoladung (Differenz aus + und – Ladung)

Denaturierung von Proteinen Hydrophobe Bindungen (Disulfidbrücken, Wasserstoffbrücken und Van der Waals-Kräfte) werden gelöst, Peptidkette liegt fast gestreckt vor, native Form nicht mehr vorhanden. biologische Funktion geht verloren. -Erwärmung über 40 Grad (Fieber) -pH-Veränderung durch Säuren/Laugen - Ultraschall - Strahlung - starkes Schütteln - organische Lösungsmittel (Alkohol)

Denaturierung von Proteinen Reversible (umkehrbar) Denaturierung, wenn die Primärstruktur noch vorhanden ist. Reversible Denaturierung durch: - Leichte pH-Verschiebung → pH Veränderung - Erwärmung → Abkühlung und Einstellen eines günstigen pH-Werts (Fieber über 42 Grad – Enzyme irreversibel zerstört)

Aufgaben der Proteine • Blutgerinnung: Antithrombin, Fibrinogen, Plasminogen • Enzyme: Alanin-Amino-Transferase ALAT, Aspartin-Amino-Transferase ASAT, GammaGutamyltranspeptidase GGT, Alkalische Phosphatase AP, Lactat-Dehydrogenase LDH,… • Immumabwehr: Komplementfaktoren C3, C4; Immunglobuline IgG, IgM, IgE, IgA.

Aufgaben der Proteine • Kolloidosmotischer Druck: Albumin. Mangel oder Verlust führt zu Ödemen (Bauchwasser) • pH-Pufferung: Hämoglobin • Proteaseinhibitoren: α1-Antitrypsin, α2Makroglobulin. • Signalvermittlung: Insulin

Aufgaben der Proteine • Transport: Albumin, Caeruloplasmin, Haptoglobin, Hämopexin Entzündungsreaktion: Akute-Phase Proteine wie CRP, Infektmarker wie Interleukin 6. • Ausgangsstoffe für Hormone (Insulin) und Neurotransmitter (Serotonin) • Sauerstofftransport: Hämoglobin, Myoglobin (02 Speicher im Muskel)

Proteine in der Diagnostik - Enzyme in Reagenzien zum Nachweis von Substraten in der Patientenprobe, - oder Proteine als Substrate zum Nachweis von Enzymen. - Markerproteine für verschieden Geschehen und Krankheiten im Körper: APP, Hämolyseparameter, Herz-KreislaufRisikomarker, Tumormarker

Wichtige Proteine/Proteingruppen ALBUMIN Wichtigstes Plasmaprotein mengenmässig: 60 % Albumin, 16% Ig, 24% Übrige; Syntheseort: Leber Transport von hydrophoben Substanzen: Fettsäuren, Bilirubin, Spurenelementen, Vitaminen, Hormone, Kationen (Ca2+, Mg2+) Aufrechterhaltung kolloidosmotischer Druck in den Gefässen.

Wichtige Proteine/Proteingruppen ALBUMIN Albuminmangel führt zu Ödemen, z. B. Bauchwasser = Aszites (zusammen mit portaler Hypertension)

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE Entzündungsreaktion nach Verletzungen oder Infektionen mit dem Ziel: • den Erreger zu eliminieren; die Gewebsschädigung zu begrenzen, • die Reparaturmechanismen in Gang zu setzen, • den Gesamtorganismus wieder zu einer normalen Funktion zu bringen.

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE Ablauf der Akute-Phase-Antwort

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE Gruppe von Proteinen, deren Konzentration im Plasma bei Entzündungen und Gewebsschäden um mehr als 25% ansteigt (APP), Konzentration der AAPP sinkt dabei. Sinn: APP sind regulatorisch am Entzündungs-u. Aufräumprozess beteiligt.

Funktion: • Lokalisation der Entzündung/Verhinderung der Ausbreitung • Unterstützung des Immunsystems Anstieg wird durch Mediatoren (TNFα, IL 6, Interferon-Gamma) aus Zellen der Immunabwehr stimuliert – Antwort auf eine Entzündung.

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE PROTEIN

ANSTIEG [PLASMA]

- CRP, SAA - α1-Antitripsin - Fibrinogen

bis zu 2000fach 2 – 5fach

- Caeruloplasmin - Komplementfaktoren C3/C4 - saures α-1-Glykoprotein - Haptoglobin

2fach

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE Diagnostischer Nutzen der APP: Diagnose und Therapieverlauf – Anstieg der Plasmakonzentration der APP korreliert mit dem Ausmass der Entzündung oder Gewebsschädigung. Wichtiger Anhaltspunkt für die Therapie: Halbwertszeit (HWZ): CRP = 6-8 h; saures α-1-Glykoprotein, Caeruloplasmin 2-3 Tage; Fibrinogen, Haptoglobin, α1-Antitrypsin = 4 Tage

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE Kriterien für einen guten Marker von Entzündungen (APP): • Anstieg bei jeder Entzündung, aber Differenzierung der Infekte möglich (viral, bakteriell) • deutlicher Anstieg im Vergleich zu Referenzbereich • kurze Halbwertszeit • rasche, automatisierbare Bestimmung • keine Beeinflussung durch andere Krankheiten oder Geschehen im Körper.

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE Proteine die zwar in der AP ansteigen aber obige Kriterien nicht ganz erfüllen: • Haptoglobin: Wird durch intravasale Hämolyse beeinflusst • Fibrinogen: Ist an der Gerinnung beteiligt und ist somit nicht entzündungsspezifisch

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE

CRP Heute das diagnostisch wichtigste APP. Interleukin 6 aus Makrophagen am Entzündungsort stimuliert CRP-Synthese in der Leber. CRP ist Teil des Immunsystems – opsoniert die Erreger – aktiviert so Komplementreaktion, die Phagozytose durch Makrophagen und stimuliert Leukozyten.

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE

CRP: • Schnelle Reaktionszeit: Anstieg nach 4-6 h deutlichster Anstieg aller APP; kurze Halbwertszeit ca. 6–8 h • Bestimmungen: Turbidi- oder nephelometrisch, innerhalb ½ Stunde. • CRP ist entzündungsspezifisch, im Gegensatz zu Temperaturmessung, Blutsenkung und Leukozytenzählung

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE CRP Referenzwert: < 3 mg/l Anstieg bis 2000fach – Maximumwerte nach 12 - 24 Stunden – bezeichnend für Art des Infekts: • < 10 mg/l: Erkältung, Schwangerschaft, Angina, Asthma, virale Infekte • 10 – 100 mg/l: Herzinfarkt, Bronchitis, Cystitis, Gicht, Pankreatitis, schwere virale Infekte • > 100 mg/l: Grössere Verletzungen, Sepsis (Blutvergiftung), postoperativ.

Wichtige Proteine/Proteingruppen AKUTE-PHASE-PROTEINE CRP BESTIMMUNGSINDIKATIONEN: - Diagnose, Therapiebeurteilung - HIV-Patienten – immungeschwächt, daher massiv gefährdet für Infekte - postoperative Komplikationen - rheumatische Erkrankungen - Frühzeitiger Blasensprung – zur Überwachung intrauteriner Infektionen

Wichtige Proteine/Proteingruppen ANTI-AKUTE-PHASE-PROTEINE Ihre Konzentration sinkt in der akuten Phase einer Entzündung: -

Präalbumin Albumin Transferrin

Wichtige Proteine/Proteingruppen WEITERE WICHTIGE MARKERPROTEINE Interleukin 6, Tumornekrosefaktor α Direkte Marker der Entzündung – freigesetzt aus Makrophagen am Entzündungsort (im Gegensatz zu zytokininduzierten APP). - Neugeborenensepsis: Unreife Leber – wenig/kein CRP Nachteil: HWZ 20 Min. zu kurz, aufwändige Bestimmung.

Wichtige Proteine/Proteingruppen WEITERE WICHTIGE MARKERPROTEINE PROCALCITONIN Selektiv für systemische Infektionen durch Bakterien, Pilze, Protozoen; steigt 2 h nach Kontakt an– reagiert nicht auf Vireninfekte, Abstossungsreaktionen und Neoplasien – GEEIGNET ZUR ABGRENZUNG VIRALER/BAKT. INFEKTE – ERGÄNZEND ZU CRP GRANULOZYTEN-ELASTASE Freigesetzt aus neutrophilen GZ und Endothelzellen im entzündetem und nekrotisierendem Gewebe, während der Phagozytose. HWZ 1 h – Ansprechen auf Therapie lässt sich schnell erkennen - ERGÄNZUNG ZU CRP

Wichtige Proteine/Proteingruppen WEITERE WICHTIGE MARKERPROTEINE NEOPTERIN Aktivität unspezifischer Abwehr (Komplement, Monozyten) - Screening von Blutspenden (HIV, CMV) - HIV-Patienten – Anstieg vor AK-Nachweis bei Infektion Therapiebeurteilung: Invers proportional zu Abnahme T-HelferZellen - Transplantationen: Prognose für Komplikationen, erspart Biopsien HAPTOGLOBIN/HÄMOPEXIN - Transportproteine – tiefe Konzentration zeigt intravasale Hämolyse an; Hämopexin hat tiefere Detektionsgrenze

Wichtige Proteine/Proteingruppen MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF

Grundlegend für Herz-Kreislauferkrankungen → Atherosklerose: Gefässchädigung durch Risikofaktoren – Einlagerung von LDL – Makrophagen phagozytieren – Schaumzellen – Plaquesbildung – Gefäss verengt, verhärtet – Verschluss/Ablösung Thrombus – Embolie oder Myokardinfarkt.

Wichtige Proteine/Proteingruppen MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF • • • • • •

hs-CRP Homocystein Mikroalbumin Natriuretische Peptide BNP und ANP Lipoprotein (a) (siehe Skript: Lipide) Myoglobin, Troponin, CK-MB (siehe Skript: Enzyme - MKI-Diagnostik)

Wichtige Proteine/Proteingruppen MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF

Wichtige Proteine/Proteingruppen MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF hs-CRP: CRP mit sensitiver Nachweismethode (Latexpartikel verstärkt) bestimmt, Referenzwert < 1 mg/l. Zeigt zwischen 1 – 3 mg/l eine beginnende Atherosklerose an.

Wichtige Proteine/Proteingruppen MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF HOMOCYSTEIN Aminosäure – Zwischenprodukt bei der Umwandlung (Methylierung) von Methionin in andere AS

Wichtige Proteine/Proteingruppen MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF HOMOCYSTEIN Wirkt bei Plasmakonzentrationen von > 12 μmol/l zusammen mit LDL in einem oxidativen Prozess gefässchädigend → eigenständiger Risikofaktor kardiovaskulärer Erkrankungen. - Genetisch bedingte Enzymdefekte im Homocysteinstoffwechsel - Mangel an Vitaminen B12, B6, Folsäure - Niereninsuffizienz oder Medikamenteninterferenz

Wichtige Proteine/Proteingruppen MARKERPROEINE HERZ/KREISLAUF NATRIURETISCHE PEPTIDE BNP/ANP (brain natriuretic peptid/atrial natriuretic peptid): Ausgeschüttet aus den Herzmuskelzellen bei Erhöhung des Blutvolumens, bei hohem BD. Wirken vermindernd auf das Blutvolumen. Erhöhte Werte – Zeichen einer Herzinsuffizienz. Guter Prognosemarker bei bestehender Herzinsuffizienz.

Analytik der Plasmaproteine

Siehe Labortechnik

Analytik der Plasmaproteine GESAMTPROTEIN BESTIMMUNGSINDIKATION GESAMTPROTEIN: - Ergänzungsuntersuchung Serumelektrophorese - Störungen im Wasserhaushalt - Nachweis Dysproteinämie - Verlaufskontrolle z.B. Leber- NierenDarmerkrankungen

Analytik der Plasmaproteine GESAMTPROTEIN Biuret-Methode Gesamtprotein Präanalytik: Patient sollte liegen, keine schwere Muskelarbeit vorher → 10 % höhere Werte. Testprinzip: Protein und Kupfer-II-Ionen bilden in alkalischer Lösung blau-violette Komplexe – Voraussetzung: 2 Peptidbindungen (Tripeptid). Intensität der Farbentwicklung ist proportional Peptidbindungen – damit Proteinkonzentration. Anreicherung: Denaturierung und Ausfällung zur Proteinbestimmung: Liquorprotein, Urinprotein

Analytik der Plasmaproteine IMMUNOLOGISCH: NEPHELOTURBIDIMETRIE Nephelo- und Turbidimetrie

Analytik der Plasmaproteine IMMUNOLOGISCH: ELISA

Analytik der Plasmaproteine IMMUNOLOGISCH: KOMPETITIVER TEST AG

AK

Analytik der Plasmaproteine IMMUNOLOGISCHE PRINZIPIEN

Analytik der Plasmaproteine IMMUNOLOGISCH: RIA

Analytik der Plasmaproteine IMMUNOLOGISCH: MIKROPARTIKELENZYMIMMUNOASSAY MEIA Herzparameter: Troponin, CK-MB, Hormone, Tumormarker. Prinzip: Sandwich-Immunoassay – spezifische, monoklonale AK liegen an Mikropartikel gebunden im Reagenz vor:

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Prinzip: Unterschiedlich schnelle und weite Wanderung von in Lösung befindlichen Proteinen auf einer Folie im elektrischen Feld. Aufgrund unterschiedlicher Ladung werden Plasmaproteine in Fraktionen aufgetrennt. Trennmedium – Pufferlösung mit konstantem pH-Wert.

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Warum wandern die Proteine? Proteine besitzen freie Amino- und Carboxylgruppen Saurer pH-Wert → Proteine positiv geladen Alkalischer pH-Wert → Proteine negativ geladen IEP → Proteine neutral

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Warum wandern die Proteine? Nettoladung: Differenz von positiver und negativer Ladung → Voraussetzung für Wanderung. Am IEP keine Wanderung IEP von: - Albumin: bei pH 4.6 - Alpha-Globuline: bei pH 4.8 - Beta-Globuline: bei pH 5.2 - Gamma-Globuline: bei pH 6.4

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE

Puffer-pH 8.6 - Proteine liegen als Anionen (-) vor und wandern zur Anode (+Pol). Albumin grösste Nettoladung (IEP 4.6) - Wanderung am schnellsten und weitesten

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE INDIKATIONEN FÜR DIE DURCHFÜHRUNG: -

Erkennen der Ursache bei Dysproteinämien Proteinverluste Erkennen und Verlaufbeurteilungen bei Paraproteinämien (Plasmazellerkrankungen)

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Die Nettoladung ist für Geschwindigkeit entscheidend

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Je kleiner das Teilchen desto schneller

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Völlig verschiedene Stoffe können gleich schnell wandern (in Bezug auf Grösse und Ladung)

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Durchführung der Zellulose-Acetat-Elektrophorese

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Färbung und Auswertung: Färbung mit Ponceau-Rot – Folie transparent Auswertung mit Densitometer Gesamtprotein als Ausgangswert

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE •

Albuminfraktion: –

•

Alpha-1-Fraktion (Alpha-1-Globulin): – – –

•

Hämopexin Transferrin Beta-Lipoprotein (LDL) Komplement

Am Übergang von Beta zu Gamma: – –

•

prä-Beta-Lipoprotein (VLDL/Triglyzeride)

Beta-Fraktion (Beta-Globulin): – – – –

•

Alpha-2-Makroglobulin Coeruloplasmin Haptoglobin

Alpha-2-Fraktion bzw. Übergang von Alpha-2 zu Beta: –

•

alpha-1-Lipoprotein (HDL) alpha-1-Glykoprotein alpha-1-Antitrypsin

Alpha-2-Fraktion (Alpha-2-Globulin): – – –

•

Albumin,

Antikörper der Klasse IgA Fibrinogen (nur bei der Plasmaeiweiß-Elektrophorese)

Gamma-Fraktion (Gamma-Globuline): –

Antikörper der Klasse IgG und IgM

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Normale Elektrophorese Albumin 60% Alpha1-Globuline 4% Alpha2-Globuline 8% Beta-Globuline 12 % Gamma-Globuline 16%

Analytik der Plasmaproteine SERUMELEKTROPHORESE Elektrophoresenmuster a. Normale Elektrophorese b. Akute Entzündung c. Chronische Entzündung d. Leberzirrhose e. Multiples Myelom f. Antikörpermangelsyndrom g. Nephrotisches Syndrom

Analytik der Plasmaproteine IMMUNFIXATIONSELEKTROPHORESE

Negative (normale; links) und positive (pathologische, rechts) Immunfixations-Elektrophorese. Als positiv gilt eine Immunfixation bei Nachweis klar abgegrenzter Banden (Pfeile). Im vorliegenden Fall existiert ein Paraprotein vom Typ IgG Lambda

Analytik der Plasmaproteine SDS-PAGE

Auftrennung aufgrund Molekülgrösse

Analytik der Plasmaproteine ISOELEKTRISCHE FOKKUSIERUNG Auftrennung der Proteine aufgrund ihres IEP längs einem stabilen pH-Gradienten Liquorproteinuntersuchung

Analytik der Plasmaproteine KAPILLARELEKTROPHORESE

Analytik der Plasmaproteine KAPILLAREKTROPHORESE Der elektroosmotische Fluss (EOF)

Die positiven Teilchen im Puffer verursachen einen Fluss in Richtung Minus-Pol, den EOF

Analytik der Plasmaproteine KAPILLAREKTROPHORESE Puffer gefüllte Glaskapillare 30 – 100 cm lang Ø 25 – 100 μm. Spannung von 30 000 V. Vorteile gegenüber herkömmlicher EP: - keine Anfärbung - wenig Probenmaterial (< 10 nl) - automatisierbar - gute Auflösung - Ergebnisse nach wenigen Minuten

Analytik der Plasmaproteine ISOELEKTRISCHE FOKKUSIERUNG

Zur Liquorproeindiagnostik – Auftrennung aufgrund IEP

DYSPROTEINÄMIEN Störung der Plasmaprotein-Zusammensetzung Vermehrung, Verminderung, Neuauftreten (pathologisch) von Plasmaproteinen . IMMER Verminderung von Albumin oder Zu/Abnahme von Ig (Vermehrung Albumin kommt nicht vor). Normale Verteilung der Plasmaproteine: Referenzwert 66-83 g/l • • •

60% Albumin 16% Immunglobuline (Ig) 24% übrige Plasmaproteine

DYSPROTEINÄMIEN ECHTE HYPERPROTEINÄMIE (> 90 g/l) - Plasmazellerkrankung: Erhöhte Ig-Synthese (monokl.) - Ig-Zunahme infolge Infekt (Tuberkulose, Leberzirrhose) vorübergehend, bei erheblicher Ig-Zunahme; verzögerter Albuminabnahme.

ECHTE HYPOPROTEINÄMIE (< 40 g/l): Kennzeichen: Ödeme und Ergüsse. - Verminderung Albumin- oder Ig-Synthese - Proteinverlust über Niere (Albumin) oder Darm bei Colitis (alle Proteine sind gleichermassen vermindert). - Malabsorbtionssyndrom, Antikörpermangel (AIDS)

DYSPROTEINÄMIEN Pseudoproteinämien Störungen im Wasserhaushalt – mit Gesamtproteinbestimmung nicht zu erkennen: Zusätzlich Ergebnisse von Hämatokrit und Serumelektrophorese. PSEUDOHYPERPROTEINÄMIE Erbrechen, Durchfall, Dursten Hämatokrit, Gesamtprotein sind (scheinbar) erhöht – Wasser im Gefässystem fehlt PSEUDOHYPOPROTEINÄMIE: Verdünnungshypoproteinämie Starker Blutverlust – proteinarmes Gewebswasser strömt in Blutgefässe, Ende Schwangerschaft. Hämatokrit, Gesamtprotein (scheinbar) vermindert – Wasser im Gefässystem nimmt zu

DYSPROTEINÄMIEN