Aromatizantes

PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE AROMATIZANTES INDICE: 1.−MICROORGANISMOS IMPLICADOS EN LA PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE AROMATIZANTES. 1a.− Productores de compuestos azufrados Brevibacterium sp. 1b.− Productores de pirazinas Pseudomonas sp. Corinobacterias sp. Strectococcus sp. 1c.− Productores de terpenos Streptomyces sp. Distintas especies de levaduras: Cándida, Torulopsis, etc. 1 d.− Productores de maltosa Lactobacillus sp. 1 e.− Productores de diacetilos Leuconostoc sp. 1 f.− Microorganismos enzimáticos Aspergillus sp. 2.− PROCESOS INDUSTRIALES PARA LA OBTENCION DE AROMAS A PARTIR DE MICROORGANISMOS. 2 a.− Procesos para la obtención de compuestos azufrados 2 b.− Procesos para la obtención de pirazinas: Tetrametilpirazina 2 c.− Procesos para la obtención de terpenos: Mentol 2 d.− Procesos para la obtención de lactonas 2 e.− Procesos para la obtención de esteres

1

2 f.− Procesos para la obtención de otros compuestos: Malta y Diacetil. 2 g.− Procesos para la obtención de enzimas microbianas. 3.−APLICACIÓN DE LOS DISTINTOS COMPUESTOS QUIMICOS EN LA INDUSTRIA DE LOS AROMATIZANTES. 3 a.− Utilización de las pirazinas y derivados. 3 b.− Utilización de los compuestos azufrados. 3 c.− Utilización de los alcoholes. 3 d.− Utilización de los terpenos. 3 e.− Utilización de las lactonas. 3 f.− Utilización de los esteres. 3 g.− Causas de los olores defectuosos y su eliminación. 3 h.− Utilización de las enzimas microbianas. AGRADECIMIENTOS Nuestro agradecimiento mas sincero a: *Departamento de Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca. *Departamento de Microbiología y Genética de la Universidad Complutense de Madrid. *Departamento de Nutrición y Bromatologia de la Universidad de Salamanca. *Departamento de Fisiología y Farmacología de la Universidad de Granada. A todos ellos muchas gracias por su colaboración y ayuda desinteresada, sobre todo, en tareas de investigación y documentación, ya que sin su apoyo este trabajo no se podría haber llevado a cabo. Gracias. PRODUCCIOÓN INDUSTRIAL DE AROMATIZANTES INTRODUCCIÒN AROMA: Percepción que hace difícil su descripción, ya que cada individuo reacciona de una forma individual. Es el resultado de una interacción entre un numero mas o menos elevado de moléculas y una mucosa. Es tan importante que nos va a determinar nuestra alimentación, el aroma nos abre o nos cierra el apetito, nos ayuda a cumplir un tratamiento farmacologico, especialmente en formulaciones destinadas a pediatría y a geriatría. Actualmente se le da mucha importancia a los aromatizantes, debido al culto que se da al buen olor: detergentes con aroma primaveral, champús multifrutas, inciensos, velas, etc. 2

Según él articulo 13 del Tratado de Asunción, él articulo 10 de la Decisión Nº4/91 del Consejo del Mercado Común y la Recomendación Nº36/93 del Subgrupo de Trabajo Nº3: *ADITIVOS AROMATIZANTES/ SABORIZANTES: Son las sustancias o mezclas de sustancias con propiedades aromáticas y/o sàpidas capaces de conferir o reforzar el aroma y/o sabor de los alimentos. Se excluyen de esta definición; los productos que confieran exclusivamente sabor dulce, salado o ácido, o aquellos productos normalmente consumidos como tales con o sin reconstitución. *CLASIFICACION: AROMATIZANTES / SABORIZANTES NATURALES: Aquellos obtenidos exclusivamente mediante métodos físicos, microbiologicos o enzimáticos, a partir de materias primas aromatizante / saborizantes naturales. Se entiende por materia prima aromatizante / saborizantes naturales los productos de origen animal o vegetal normalmente utilizados en la alimentación humana que contenga sustancias odoríferas y/o sàpidas, ya sea en su estado natural o después de un tratamiento adecuado. Se engloban aquí: aceites esenciales, extractos, bálsamos, oleorresinas, etc. AROMATIZANTES / SABORIZANTES SINTETICOS: Aquellos compuestos químicamente definidos obtenidos por procesos químicos, tanto los que son idénticos a compuestos naturales o los artificiales, (no identificados en productos naturales de origen animal o vegetal) Las fuentes de obtención de materia primas para la producción de aromatizantes es muy variada: −naturales: vegetal (extractos); animal (grasas), −sintéticos. Sometiendo a estas materias primas a procesos químicos, físicos, enzimáticos o microbiologicos. Nos centraremos en los procesos microbiologicos que presentan importancia: *Aromas secundarios a partir de fermentaciones alcohólicas y maduración de quesos. *Producción biotecnologica de aromas tradicionales en menor tiempo que las fermentaciones habituales. *Síntesis de novo de compuestos volátiles procedentes de cultivos adecuados de microorganismos. *Transformación de moléculas complejas en aromatizantes por vía microbiana. MULTIPLICIDAD TEORICA DE LAS ETAPAS QUE CONDUCEN A LOS AROMAS Cada etapa variará en función del pH, de la salinidad, del potencial redox, del contenido de agua y de la temperatura, entre otros parámetros. LOS PRIMEROS ENZIMAS O MICROORGANISMOS DEL PROCESO. LOS SEGUNDOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN EL PROCESO. REACCIONES QUÍMICAS O USO DE 3

OTROS MICROORGANISMOS. MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN LA PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE AROMATIZANTES Los procesos industriales que usan microorganismos para la obtención de aromas y saborizantes son muy amplios. Estos microorganismos producen diversos compuestos que son los que darán las propiedades aromáticas que buscamos. A continuación exponemos una tabla con todos los compuestos que intervienen en la formación de los aromas, asi como los microorganismos que los producen: COMPUESTOS −Alcoholes. −Compuestos azufrados. −Pirazinas. −Terpenos: Mentol Utilización de microorganismos para separar isómeros ópticos. −Lactonas. −Ésteres. −Maltosas −Otros compuestos flavónicos para separar sabores: −Diacetilos −Microorganismos productores de enzimas para aumentar el sabor y aroma. • Soja. • Vainillina. • Cítricos. TABLA

Brevibacterium −B. linens Pseudomonas

Compuestos azufrados Pirazinas

−P. Aeruginosa Corynobacterium −C. Glutamicum y C. Mutans 4

Streptococcus −S. lactis Streptomyces Aerobacter Cándida Arthrobacter Bacillus Nocardia Trichoderma Torulopsis Pseudomonas Geotrichum

Terpenos

−G. Candidum. Rhodotorula Mycobacterium Rhizopus Hansenula −Sarcina lutea. Saccharomyces −S.. cerevisiae Trichoderma

Lactonas

−T. viride Sporobolomyces −S. odorus Pseudomonas −P. Fragi Streptococcus

Ésteres

−S. Lactis subesp diacety Lactobacillus OTROS COMPUESTOS Streptococcus

Maltosa

−S. Lactis subesp maltigenes 5

Lactobacillus −L. Maltaromicus. Leuconostoc −L. dextranicum −L. Citrovorum Diacetilos Streptococcus −S. Lacti subesp diacetylactis −S. cremonis MICROORGANISMOS ENZIMÁTICOS PARA AUMENTAR LOS SABORES Aspergillus Lactobacillus

Soja Vainillina

− L. Bulgaricus Aspergillus −A. Niger Cítricos Arthrobacter −A. Globiformis Los microorganismos utilizados en los procesos de obtención de aromas, serán: *HONGOS *LEVADURAS *BACTERIAS HONGOS: responsables de alterar productos alimenticios y también de crear de un escaso a un rico valor alimenticio a un alimento escaso en sustratos, convirtiéndolo en alimento rico en elementos asimiladores de agradable sabor, aroma o sabroso condimento. Su uso es en la quesería, charcutería, comidas exóticas de Africa o Extremo Oriente. LEVADURAS: hongos unicelulares durante todo o parte de su ciclo biológico. Son microorganismos muy heterogéneos, existen unos 60 géneros que engloban a mas de 500 especies. Se clasifican sobre la base de procesos o productos donde se utilizan: *Levaduras de panadería o productos de panificación. *Levaduras de cervecería y cervezas. *Levaduras de vinificación y vinos. 6

*Levaduras de destilación y licores. *Levaduras alimenticias. *Productos derivados de levaduras. *Etanol. Son productos de creciente interés en el campo de la alimentación por su aportación en el aspecto nutritivo y aromático. Se clasifican en dos grandes grupos: Ascomicetos (ascosporogenos) y Denteromicetos (esporogenos). Por su morfología se dividen en redondeadas u ojivales (redondas por un extremo y puntiagudas por el otro). Su tamaño oscila entre 1−10micras de ancho y 2−3micras de largo. Reproducción sexuada y/o vegetativa. Con respecto a su citología podemos ver que tienen organulos citoplàsmaticos diferenciados: Retículo endoplásmatico y Mitocondrias, estas ultimas con ADN; ARN y enzimas para la replicación de los nucleoticos como ARN polimerasa, además de los enzimas necesarios para la respiración celular. Vemos aminoácidos libres en vacuolas, pared celular rígida, membrana citoplasmatica de tres capas: lípidos, fosfolìpidos y proteínas. COMPUESTOS AZUFRADOS Gen. Brevibacterium Bacteria acido − glutámica, gran positiva, no esporulada e inmóvil y formadora de colonias. Requieren biotina y eritrocitos a 30ºc. Muchas cepas pueden utilizar acido láctico, etanol, glucosa, etc., para la producción de ácido glutámico. Con acido miso−diaminopimalico en su pared, importante para la clasificación, con arabinosa, galactosa y acido micolico. Su forma alargada cambia a forma de V cuando hay una división repentina, espontanea. Cuando son cultivadas en un medio rico no es observable su remarcado pleomorfismo. No obstante lo normal es que la elongacion, crecimiento y división, ocurran frecuentemente cuando la bacteria esta en medio con bajas concentraciones de biotina o con un antibiótico. La especie más importante es: Brevibacterium linens. PIRAZINAS Fam. Pseudomonaceas. Gen. Pseudomonas y Gen. Xanthomonas Gen Pseudomonas Bacterias con forma alargada, gram negativo, no producen esporulación, con una micra de diámetro aproximado y entre 1.5−5 micras de longitud. No rodeadas por una vaina que las envuelve. Normalmente no son móviles, aunque a veces tienen un único y gran flagelo polar para moverse, en otras ocasiones presentan un flagelo lateral que produce un movimiento de corta longitud de honda. Él nùmero y tipo de flagelo, es importante para la clasificación y taxonomía.

7

Son aerobias, pero hay veces en las que pueden usar nitrato como adaptación final a condiciones anaerobias. Muchas especies acumulan poli−beta−hidroxibutirato (PHB), como reserva de carbono en gránulos. Pueden producir una variedad de pigmentos. No crecen a pH de 4.5 o menores. Presentan oxidasa tanto positiva como negativa, y catalasa positiva. Quimiorganotrofas, algunas pueden vivir de forma autotrofa usando solamente CO2 y H2 como fuentes de energía. Suelen estar de forma individual o en parejas, y en menos ocasiones formando colonias. Pseudomonas aeruginosa: sufre alteraciones por etilendiaminotetracetato. Productores de pigmentos fluorescentes como pioreidina y pigmentos derivados como la piocianina de tono azul. Gen. Corinobacterias Parecidas a las Brevibacterias. Son Gram positivas, de forma alargada e inmóviles. Necesitan un medio rico y una temperatura de 30ºC. Las especies más importantes son: C.glutamicum y C. mutans. Gen. Streptococcus Bacterias lácticas en forma de cocos o bastoncillos. Son Catalasa negativo. Sintetizan ATP en fermentaciones lácticas de glucidos: HOMOFERMENTATIVOS: acido láctico como único producto final HETEROFERMENTATIVOS: además de acido láctico, tienen etanol acetato, dióxido de carbono como producto final. Son aerotolerables, poco sensibles al dióxido de carbono por su actividad Superoxido dismutasa. Necesitan factores de crecimiento tales como: Vitamina B, aminoácidos, pépticos, bases puricas y pirimidinicas. Toleran los pH ácidos, es decir, de 5 o menos. Son utilizadas en la conservación de alimentos: lácticos, cárnicos, vegetales fermentados, etc. Aunque también crean problemas en la industria por producir sabores amargos en productos como: vinos, cervezas, carnes, zumos de frutas, etc. Streptococcus lactis: Es una de las especies importantes en el campo de los aromatizantes. Sus pruebas y resultados bioquímicos son: ADN positivo, dióxido de carbono positivo, acetoina positiva, etc. Crecen en cultivos con una temperatura entre 10−40ºC y con un pH de 9.2. Utilizan dextrinas, maltosa, trealosa, xilosa, etc. entre otros glucidos para su fermentación. TERPENOS Gen. Streptomyces Son hongos aerobios con preferencia por suelos húmedos. Forman esporas en condiciones bajas de humedad, suelos secos. Se agrupan en dos categorías basadas en el pH de su crecimiento: *Streptomyces acidófilos: pH=3.5−6.5. Con pH optimo de 5 *Streptomyces neutrófilos: pH=5−9.0. Con pH optimo de 7

8

Muchos crecen a temperaturas entre 50−60ºC, siendo: Termòfilos o mesófilos termotolerantes, según la temperatura de crecimiento, aunque no se distinguen muy bien entre sí. Pueden o no formar rizosporas. Algunos son fitopatogenos. Poseen un ultraestructura celular procariota típica de bacterias Gram positivas, ya que presenta Peptidoglucano en su pared celular. Sus esporas son resistentes a lisozinas debido a la pared que presentan. También tienen Glicocalix. Membrana citoplasmatica con unidades estructurales definidas. Mesosomas asociados a la membrana citoplasmatica. Con núcleo central. Ribosomas numerosos por todo el citoplasma. Formadores de esporas: Esporogenesis. Otras especies de hongos importantes desde el punto de vista, de la obtención industrial de aromatizantes, son: Absidia sp. , Trichoderma sp., y Rhizopus sp. En la obtención industrial de terpenos también se emplean algunas levaduras, entre las que destacan: Rhodotorula sp., Torulopsis sp., Cándida sp., (importante para la producción industrial de alimentos), Hansenula sp., (con un numero variante de cromosomas). LACTONAS Fam. Saccharomyceae. Saccharomyces arenside Levaduras que no asimilan nitratos. Esporulan con una fuente de carbono no fermentable, concentración mínima de nitratos y buena aireación: Medio McClary. No utilizan Rafinosa. Utilizan la ruta de Embdem−Meyerhof−Parnas, para la oxidación de las hexosas. Reducen Acetaldehido en etanol como 95% de su glucolisis. Levadura diploides y esporógena. Forma células vegetativas diploides a partir de las ascosporas haploides. Trichoderma viride Se trata de un hongo con reproducción asexual. Englobados en Deuteromycota. Es un productor de antibióticos que forma colonias y produce pigmentos amarillos. ÉSTERES Son muchas las especies bacterianas implicadas en la obtención industrial de aromatizantes. Las mas importantes ya han sido mencionadas y descritas a lo largo de este trabajo, por tanto, nos limitaremos a nombrarlas, estas son: Pseudomona fragi Streptococcus lactis subsp. Diacetylactis Lactobacillus sp. Streptococcus cremonis. OTROS COMPUESTOS

9

MALTOSA Streptococcus lactis variedad maltigenes Lactobacillus maltoromicus Bacteria láctica, Gram positiva, pleomorfica, esporógena, inmóvil generalmente. Dan citocromo y catalasa negativos. Aerotolerables y glucidoliticas. Necesitan medios con Vitaminas, Aminoácidos y otros compuestos, para su crecimiento. No reducen el citrato ni producen pigmentos. Algunas especies producen mucus a partir de sacarosa. Su crecimiento se desarrolla en medios con un pH entre 4.5−6.4. Absorben galactosa y lactosa por la vía del Fosfo−enolpiruvato, dependiente de Fosfo−transferasa. Aparecen tres subgéneros: Thermobacterium (homofermentativo) Streptobacterium (homofermentativo) Betabacterium (heterofermentativo) DIACETILOS Leuconostoc dextranicum y Leuconostoc citrovorum Son bacterias lácticas, heterofermentativas que usan citrato como fuente de carbono. Como son bacterias lácticas presentan las mismas características que las citadas con anterioridad, es decir, son Gram positivas, pleomorficas, esporógenas y generalmente inmóviles. Streptococcus lactus subsp. diacetulactis Streptococcus cremonis. MICROORGANISMOS ENZIMÁTICOS UTILIZADOS PARA AUMENTAR SABORES. SOJA Aspergillus niger Es un hongo asexual. Presenta conidioforos como soporte de las esporas. Tiene micelio vegetativo, alargado hacia las hifas, situadas en lo alto, en la parte globosa, (vesículas multinucleosas). Tienen gran importancia los metabolitos secundarios y algunos de los primarios. En 1.971 se dividieron los metabolitos secundarios en distintas categorías, según su origen biosintetico: *Poliacetidos (terpenos y esteroides) *Derivados de ácidos carboxilicos *Derivados de ácidos grasos. *Derivados de aminoácidos *Metabolitos sin acetato. *Otros metabolitos. Utilizados para la fermentación de comidas orientales, como Koji. También aparecen como los responsables de la contaminación de alimentos, alfa−toxinas y mycotoxinas peligrosas, tanto para animales como para los 10

seres humanos. Algunos presentan acciones farmacologicas importantes. En el caso del Aspergillus niger, su uso esta vinculado con las fermentaciones en procesos alimenticios modernos, como productor de acido cítrico que adicionado a otros ácidos orgánicos, son utilizados en comidas manufacturadas. METABOLITOS DE Aspergillus sp. , USADOS EN PROCESOS ALIMENTICIOS. COMPUESTOS

ESPECIES

Ac. cítrico

A. niger

Ac. gluconico Ac.malico Ac. itaconico Ac. tartarico

A.niger A. sp. A. terreus, A. itaconicus A. niger, A.griseus

Alfa−amilasas

A. oryzae, A. niger

Glucosa oxidasas−catalasas

A. niger

Naringinasas Pectidasas Proteasas Manitol

A.niger A. niger A. oryzae A.candidus

USO Carnes, bebidas sin alcohol, caramelos, lácteos, etc. Postres, pan, refrescos, etc. Jamón, gelatinas, etc. Residuos contaminantes, etc. Bebidas carbonatadas, etc. Chocolate, levaduras industriales, etc. Productos de huevo, cervezas, vinos, mahonesas. Zumos de pomelo etc. Zumos de frutas, vino etc. Soja, carne tierna, pan. etc. Masas de pastelería, etc.

PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE AROMATIZANTES COMPUESTOS AZUFRADOS La producción de estos compuestos es muy limitada y tiene interés en el caso de los quesos como se puede observar él la siguiente tabla. La mayoría de estos aromas están formados por esteres de metanotiol y las transformaciones que sufren. El metanotiol se produce a partir de metionina proceso que es realizado por diferentes microorganismos, entre ellos el Brevibacterium linens, por la actividad dimetiolasa. Esta enzima solo es activa sobre metionina libre por lo tanto la producción de metanotiol va a depender de la tasa de proteolisis. Esto se vio confirmado por la edición de metionina libre a cuajada de quesería y se observo que incremento la producción de metanotiol. Compuestos azufrados a partir de metanotiol: PIRAZINAS Los aromas resultantes de las pirazinas pueden ser tanto agradables como desagradables, y por citar algunos ejemplos de aromas producidos por las pirazinas son: alimentos fermentados, japoneses, vinagre, sake, cerveza y el chocolate. En el caso del chocolate la formación de pirazinas esta relacionado con la temperatura. Hay estudios que relaciona la formación de pirazinas al aumento de temperatura en las cuales un grupo carbonilo (reducción azúcar) y una amina se condensan. Las pirazinas también se pueden encontrar en los quesos: Parmesano, Gruyere y los quesos fundidos. 11

Ahora vamos a profundizar en algunas pirazinas en concreto: • Tetrametilpirazina • 2−metoxi−isopropilpirazina La Tetrametilpirazina se aisló en 1.962 en cultivos de Bacillus subtillis, pero en 1.967 Demain, también la aisló de cultivos de Corynebacterium glutamicum. Para ello se necesitaba unos precursores: leucina, isoleucina, valina y pantotenato. Estos precursores los obtienen por mutación de una enzima común: reducto−isomeras, en la ruta de la valina y la isoleucina. PIRAZINAS 2−metoxi−3−isopropil 2−metoxi−3−secbutil 2−metoxi−3−isobutil 2−metoxi−3−isopropil−5−metil 2,6−dimetoxi−3−isopropil−5−metil

POSIBLES PRECURSORES Valina + glioxal Isoleucina + glioxal Leucina + glioxal Valina + piruvaldehido Valina + piruvato

Debido a esta mutación vamos a obtener un acumulo de acetona con lo cual aumenta la producción de Tetrametilpirazina ya que según Adechi y sus colaboradores, (1.964), este se formaba a partir de dos moles de acetoina y dos moles de amonio. Siguiendo este mismo proceso para la formación de Tetrametilpirazina se obtienen mutaciones en la reducto−isomeras de E. Coli. Otro proceso será bloqueando la deshidrogenasa láctica de Strep. lactus. El caso del 2−metoxi−3−isopropilpirazina, es un compuesto responsable del olor a patata mohosa. La producción de este compuesto la obtuvo: *Miller y colaboradores en 1.972 de Pseudomonas perolens *Morgan y colaboradores en 1.972 de Ps. Taetrolens También sé aisló de Streptococcus lactus, que producen el aroma a quemado o cocido de algunos productos lácteos. Otros microorganismos que producen esta pirazina liberando otros compuestos serian: *Penicillium camenbertii −−−−− −−−− −−−−−− −− también produciría estireno *Pseudomonas fluorescens−−−−−− −− −−−−−−−−−−libera acido butirico y ácidos de cadena media de 6 a 10 carbonos, que originan el sabor rancio o jabón. *Ps. fragi −−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−− produce esteres de ácido butirico y resultantes de la lipolisis responsables del aroma afrutado en productos alimenticios. La síntesis de estas pirazinas según Murray, 1.970, supuso que la síntesis del 2−metoxi−3−isopropilpirazina se asemejaba a lo que hacia las plantas, condensación de 2−aminoacidos y 1,2−dicarbonilos. TERPENOS

12

Constituye los mayores responsables de las características de olor y flavor de los aceites esenciales. Estructuralmente son esqueletos hidrocarbonados formados por una unidad de isopreno (2−metil−1,3−butadiona), con estructuras que pueden ser cadenas cerradas, abiertas, saturado e insaturado. Los terpenos son fácilmente oxidables y en el proceso se liberan los flavores. Tienen interés particular los aromas producidos por el hongo Ceratocystis. La síntesis de terpenos se produce en la ruta del mevalonato, el primer monoterpeno que se forma es el geraniol, va disminuyendo su formación y empieza a aumentar la formación de los otros monoterpenos. También se ha aislado monoterpenos del hongo Trametes odorata y varias especies de Phellinus. Los aromas producidos por los terpenos esta mas relacionados con olores de plantas que con flavores de comida. Drawert y Bartos en 1.978 aislaron cultivos de la levadura Kluyveromuces lactus, los monoterpenos, citronelol, linelol y geraniol. MENTOL: Compuesto aislado de plantas del genero Menta, se utiliza por su flavor a menta y su efecto refrescante. Según Croteaun (1.980), el mentol se produce por maduración del aceite esencial, es decir, en la formación. Los aceites esenciales esta formado por 2−mentona que en un proceso metabólico es convertida en 2−metol. Este paso esta catalizado por dos hidrogenasas diferentes dando dos productos: l−mentol y d−neomentol. La maduración del aceite depende de las condiciones de crecimiento que requiera la planta. El aislamiento de microorganismos que contenga la deshidrogenasa que cataliza la reaccion de 2−mentona a l−mentol es un mecanismo alternativo en la producción del mentol natural. Otro mecanismo de producción de mentol es a partir de la hidrogenación del timol, compuesto que representa el 50 % del aceite esencial del Thymus vulgaris. En la hidrogenación del timol se forman cuatro isómeros: dl−mentol, dl−isomentol, dl−neomentol y dl−isoneomentol. Los enzimas microbianas permiten la separación de estos isómeros y lo hacen mediante sus esterasas que hidrolizan metilester a l−mentol. Estos procesos lo realiza: Absidia hyolospora, Bacillus subtillis subvariedad niger, Getrichun candidum y dos especies de Trichoderma, transforman mas menos metilacetato formiato, propionato, miristitato a mentol e isomentol. Estos compuestos se separan de sus isómeros por cromatografía. Hay una patente japonesa que utiliza cultivos de Gleophyllum o Schizophyllum, para la hidrólisis selectiva de esteres carboxilicos para producir 2−mentol. El mentol y sus esteres son insolubles en agua por lo que para obtener l−mentol se utiliza medios hidrofobicos. Existe otro mecanismo descrito por Omata y sus colaboradores en 1.981, demostró la hidrólisis estereoselctiva del dl−metilsuccinato llevada a cabo por Rhodotorula minuta var. Texensis, para dar l−mentol Otros microorganismos que se da también este proceso son: Trichoderma, Nocardia, Mycobacterium, Bacillus, Rhizopus, Cándida, Streptomyces, Aerobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Gibberelle, entre otros microorganismos. LACTONAS 13

Son responsables de aromas agradables como: fruta, coco, caramelo, nueces. Los microorganismos pueden sintetizar lactonas ópticamente activas en el cual se requiere numerosos procesos sintéticos. Como ejemplo tenemos la producción de lactonas a partir de alfa−cetoàcidos que sugirió Boldingh y Taylor en 1.962, requiere seis pasos diferentes pero la misma conversión le pueden realizar los microorganismos. En 1.965, Muys y sus colaboradores demostró la conversión de ganma−delta−cetoacidos en lactonas ópticamente activas mientras que otros investigadores utilizaron alfa−beta−cetocacidos Levaduras como Cándida, genero Saccharomyces, mohos tales como Penicillun notatum, Closdosporium butyri y Cl. suaveolens y la bacteria Sarcina lutea fueron capaces de producir olores lactonicos cuando se incubaron con cetoàcidos. Algunos ejemplos de producción de aroma: COCO: cultivo de Trichoderma virude en medio dextrosa de patata. El compuesto responsable es el 6−pentil−purina, cuya síntesis química requiere siete reacciones como descubrió Nobuhena. FRUTA: responsable una levadura, Sporobolomyces odorus y el compuesto responsable es la ganma−decalactona que da un aroma intenso a melocotón. ESTERES Aromas que producen: pera, piña, frutas del bosque y manzana. La producción de estos aromas en cultivos de levaduras, mohos y bacterias se atribuye a la reacción de ácidos orgánicos con etanol según Omelienski en 1.923 Percira y Morgan en 1.958, identificaron etil−butirato, etilisovalerato y etil−hexanoato como los principales esteres del aroma afrutado producido por cultivos de Pseudomonas fragi. Ellos postularon que estos microorganismos producían ácidos tras la lipolisis. El etanol que los esterifica es producido por la bacteria de acido láctico y lo hace mediante las esterasas producidas por la Pseudomonas. Se confirmo esta hipótesis cuando se aíslo etil−butirato y etil−hexanoato en el queso Cheddar, pasteurización de la leche, (de ahí que surja el aroma en cultivos de leche calentados y posteriormente refrigerados). OTROS COMPONENTES MALTA. El microorganismo responsable del flavor y aroma de la leche es un organismo láctico, Streptococcus lactis variedad maltigenes. El compuesto responsable fuer determinado por Jackson y Morgan en 1.954 y es el 3−metilbutanal. Miller y colaboradores en 1.974 aíslan una cepa de Lactobacillus maltoromicus capaz de producir 2−metilpropanal y 3−metilbutanal. Estos compuestos son los responsables del flavor a malta en la fermentación de la masa del pan. DIACETILOS Se trata de 2,3−butanodiona, es el responsable del flavor mantecoso en la fermentación de productos como la mantequilla y la leche agria. También es responsable del olor desagradable en el vino y zumos cítricos. Los microorganismos que se pueden utilizar son Leuconostoc dextronicum, L. Citrovorum y Streptococcus lactis subesp. Diacetylactis, (Mizino y Jezeski, 1.961). La ruta, del citrato constituyente de la leche entra en la 14

célula por la citrato permesa. Una vez dentro se hidroliza dando acetato y oxalacetato el cual sé descarboixila a piruvato. El exceso de piruvato dentro de la célula permite la formación de diacetil, (Harvey y Collins 1.963) Hay dos caminos: *Piruvato + Pirofosfato tiamina Acetaldehido que condensa con acetil−coA y enzimáticamente es transformado a diacetil. *Condensación del Acetaldehido con otra molécula de piruvato para formar acetolactato por la acetolactato sintasa. Este alfa− acetolactato en condiciones de óxido−reducción es oxidado a diacetil y en condiciones anaerobias a acetoina. MICROORGANISMOS ENZIMATICOS No solo se puede utilizar los microorganismos para el control de a los aromas sino también los enzimas que producen. Ejemplo: Método aceleración de la producción de aromas de quesos. LIPASAS Aumenta el aroma de los quesos italianos. *Queso azul: lipasa exógena, libera los ácidos grasos que permiten que Penicillium roquefortii, los ataque y libere gran cantidad de metilcetonas, característicos del aroma de estos quesos. También hay lipasas microbianas que pueden utilizarse para fabricar nuevos productos que se usan como aditivos alimentarios, según Jolly y Kosikowsky en 1.975: PRODUCTO CON AROMA LIPASA MICROBIANA ROQUEFORT (48HORAS 20ºC) (SALSAS, MAHONESAS...) PROTEASAS Se usa, por ejemplo, añadiéndola a la leche de quesería, aunque presenta problemas como: Amargor, perdida de rendimiento, etc. Hay perceptivas de control de la aceleración en la producción de aroma con mezclas enzimáticas porque disminuye los inconvenientes anteriores pues permite disminuir las cantidades de proteasas adicionadas. Otra posibilidad de utilizar los encimas para la produccion de aromas y de evitar su perdida durante la fabricación del producto alimentario es la Encapsulaciòn: *Microcapsulas de lípidos *Liposomas

15

Asi los aromas se pueden producir in situ durante la maduración o el almacenamiento. Como ejemplo: Células de Streptococcus lactis subsp. diacetylactis para la producción de diacetil y acetoina. También células de Ps. Putida o Breubacterium linens para la producción de metanotiol. Las ventajas de los liposomas son que tienen dimensiones estandarizadas lo que asegura un reparto homogéneo. *Liberación progresiva de la protejas de los liposomas y de esta forma evita él acumulo de peptidos amargo. *Soybean: sus proteínas son tratadas con enzimas proteoliticos aislados de Aspergillus para recuperar su aroma. También aislando carboxipeptidasa de Aspergillus podemos eliminar el olor amargo que la enzima descompone el C−terminal del aminoácido. *Vainillina: la enzima producida por Lactobacillus bulgaricus aumenta el flavor de vainilla en su extracto. Es utilizado en el yoghurt. *Productos cítricos: la enzima naringenasa aislada de Aspergillus niger y de Coniella diplodiella se utiliza para hidrolizar el 7−rhamnosido−beta−glucosido−4,5,7−trihidroxiflavona principal compuesto responsable de dar amargor a la naranja. APLICACIONES DE LA PRODUCCION INDUSTRIAL DE AROMATIZANTES. El control y producción de aromas avanza cada día, permitiendo la concepción de nuevas técnicas y/o mejoras. Muchos son los productos alimenticios que deben sus aromas a los microorganismos, los que llevan a cabo distintas fases metabólicas durante la producción de los distintos alimentos. Los aromas de estos productos se deben a moléculas químicas de muy diversa naturaleza procedentes del metabolismo microbiano. Las aplicaciones de los microorganismos en la producción de aromas, es muy amplia, ya que abarca muchos campos, no solo el alimenticio que es en el que esta basado este trabajo, sino también en tecnología farmacéutica, piensos animales, productos de limpieza e higiene, etc. Actualmente, las investigaciones se centran en la genética de los microorganismos en busca de nuevas técnicas para la producción de estos aromas. La genética, nos permite estabilizar las propiedades metabólicas de las distintas cepas, asi como modificar el genoma para llevar a cabo una determinada reacción, evitar el ataque por parte de los bacteriofagos de las cepas industriales, etc. Uno de los ejemplos más claros de la evolución de la industria en este tema, son las ciclodextrinas, que encapsulan aromas y evitan asi su perdida, pueden convertirse en un excelente punto de partida para futuras técnicas en este campo, hoy en día en desarrollo. Aunque el tema de los olores y sabores, puede pasar casi desapercibido en nuestras vidas, es muy importante en muchisimos aspectos y determina conductas, sensaciones, etc. Esto la industria lo sabe, y, por tanto, se invierten grandes cantidades de dinero, en la investigación, en la producción y en la aplicación de los aromas en distintos artículos de diversa índole. El control insuficiente de la calidad microbiología, la aparición de reacciones químicas espontaneas o un tratamiento tecnológico equivocado pueden llevarnos a la obtención de aromas o sabores defectuosos e incluso desagradables para nosotros. Los microorganismos son utilizados en muchos procesos de producción de alimentos, tales como: quesos, vinos, cerveza, embutidos, etc. El control de su calidad, se hace muy importante, ya que determinara las propiedades organolepticas de los distintos artículos que influyen directamente en la compraventa de los mismos. 16

Como se ha expuesto a lo largo de este trabajo, es durante los procesos de producción de los alimentos, cuando se utilizan los microorganismos, (alimentos fermentados), y también durante los que se corrigen los malos olores y sabores, no solo producidos por estos microorganismos, sino también por causas de manipulación indebida, uso de mecanismos tecnológicos inapropiados, almacenamiento, etc. Los microorganismos esta directamente relacionas con los malos olores de muchos productos, como quesos, embutidos, vino, etc., y no solo son causantes de los aromas agradables, ya que estos últimos se consiguen con un control adecuado. Los microorganismos producen aromas, por que durante las fases metabólicas que realizan en los procesos donde están implicados, eliminan diversas moléculas químicas, las cuales presenta características organolepticas propias, reacciones secundarias con otros compuestos o interacciones adecuadas que llevan a la obtención del aroma deseado. Son muchas las moléculas químicas obtenidas a partir de microorganismos, pero nosotros destacaremos las más relevantes desde el punto de vista alimenticio. PIRAZINAS. Compuestos heterociclicos aromáticos de seis átomos, dos de los cuales son de nitrógeno. Según los sustituyentes que presenten tendrán un umbral de percepción determinado, ya que son estos los causantes de numerosas reacciones químicas con la mucosa olfativa, y también a los que se debe la diversidad de esteroisomeros que como tales presenta propiedades distintas. Él numero, la naturaleza y la posición de los radicales, son los responsables de la calidad y de la intensidad del olor, originado por este tipo de compuestos. Las cepas de microorganismos encargadas de la producción de pirazinas con el fin de obtener aromatizantes es muy variada, como por ejemplo: cepas de Streptococcus sp. Corynebacterium sp. En ocasiones, las pirazinas se encuentran relacionadas con olores desagradables, tales como distintas especies de Pseudomonas, causantes del olor a patata mohosa. Podemos aislar pirazinas y distintos derivados en alimentos como: sake, cerveza, productos cárnicos, algunos vegetales crudos, (pimientos, guisantes, etc.), granos de café, cacao, etc. Como podemos comprobar son muchos los alimentos que deben su aroma a estos compuestos. Se sabe que muchas patentes sobre aromas presentan pirazinas en sus formulas registradas. El conocimiento de que los compuestos pirazinicos interaccionan con la mucosa olfativa de una manera determinada, nos permite aplicar estas moleculas en la producción de distintos articulos, o su eliminacion en aquellos en que su olor no sea agradable o deseado. Esto ocurre también con otras muchas moleculas químicas. Asi, observando las formulas químicas de los distintos compuestos, podremos conocer con cierta garantia de éxito el aroma que tendran para el usuario, y resolver los problemas que estos aromas pueden traer consigo. En el siguiente cuadro, se esquematiza la utilizacion de las pirazinas en este campo de los aromas, es decir, se resume los distintos olores que causan las pirazinas y sus derivados, asi como su utilizacion en distintos productos alimenticios. PIRAZINAS Y DERIVADOS ORIGEN: Sintesis quimica, extraccion vegetal y microorganismos.

17

** Presentan numerosos umbrales de percepciòn, según los racicales que presenten en su molécula. Tienen un olor caracteristico a tostado y a nuez, aproximadamente. ** Se localizan en numerosos alimentos proporcionandoles el aroma caracteristico, además de otras propiedades. Como ejemplo de estos productos cotidianos hemos de resaltar: QUESOS: Los quesos fundidos y el queso parmesano. VEGETALES CRUDOS: Guisantes, pimientos, granos de café, cacao, e incluso en las nueces, a las cuales le dan ese olor tan caracteristico. PRODUCTOS CARNICOS. ALIMENTOS JAPONESES FERMENTADOS. PRODUCTOS COCIDOS Y/O TOSTADOS. OTROS PRODUCTOS: Vinagre, chocolate, sake, cerveza, etc. **En otros muchos articulos son derivados de pirazina los causantes del aroma, esto ocurre por ejemplo: 2−metoxi−3−metilpirazina−−−−−−PALOMITAS DE MAIZ tetrametilpirazina−−−−−−−−−−−−−−−PICANTES 2−metoxi−3−isopropilpirazina OLOR A TIERRA, PATATAS 2−metil−6−etoxipirazin−−−−−−−−−−PIÑA AMERICANA 2,5−dimetilpirazina−−−−−−−−−−−−−−NUECES, HIERBA 2−metoxi−3−metilpirazina−−−−−−−PATATAS ** Las pirazinas y los compuestos derivados, aparecen formando parte de numerosos aromas conocidos. También pueden ser causa de olores desagradables produccidos normalmente por el mal estado

18

del alimento y la proliferaccion de diferentes cepas de bacterias. Pseudomonas sp= OLOR A MOHO DE LAS PATATAS. COMPUESTOS AZUFRADOS No se conoce con certeza, la participación de los distintos tioles en la producción de aromas, aunque se sabe que aparecen en muchos productos alimenticios. Se sabe que algunos esteres de metanotiol intervienen en el aroma de quesos tan conocidos como, Pont−I'Evêque. En la tabla siguiente tenemos ejemplos de los distintos compuestos azufrados encontrados formando parte del olor característico de algunos alimentos. TABLA SOBRE COMPUESTOS AZUFRADOS Naturaleza, umbral de detección de algunos compuestos azufrados encontrados en distintos quesos y el olor característico que proporcionan. COMPUESTOS AZUFRADOS 2−3−ditia−pentano 2−4−ditia−pentano 2−3−4−tritia−pentano S−metil−tioacetato S−metil−tiopropanoato S−metil−tiobutirato S−metil−tio−3−metil−butirato S−metil−tio−2−metil−butirato

UMBRAL DE DETECCION 6.0 60.0 0.1 5.0 100.0 200.0 100.0 no determinado

OLOR ajo ajo queso muy madurado coliflor cocida queso cebolleta afrutado fresa silvestre

ALCOHOLES Los alcoholes están presentes en numerosos aromas, destacando en distintos tipos y clases de quesos, además de en productos no alimenticios. Son los alcoholes insaturados los más importantes en estos aromas, sobre los que resalta en 1−octen−3−ol, presente en muchos quesos de pasta blanda y también en la corteza del queso conocido con el nombre de Beaufort. En una mezcla de metilcetonas, alcoholes secundarios, queso fundido y el 1−octen−3−ol, obtenemos el aroma y el sabor característicos del queso Camembert maduro. Este compuesto, 1−octen−3−ol, es un alcohol insaturado que produce un olor fungico desagradable semejante al del champiñón fresco, cuando se encuentra en abundancia. TERPENOS Los terpenos, son los principales componentes de olores y flavores de los aceites esenciales y/u otros compuestos volátiles. Se trata de hidrocarburos formados sobre la base del isopreno.

19

La mayoría de los terpenos son de origen vegetal, y se obtienen por distintos procesos de extracción a partir de materia prima vegetal, recogida en determinas condiciones. Algunas especies de microorganismos intervienen en los procesos de extracción, separación de isómeros, etc., de estos compuestos Actualmente existen numerosos estudios e investigaciones encaminadas a buscar la manera de que estas u otras especies microbianas puedan producir compuestos terpenicos con las mismas propiedades que los conocidos de origen vegetal. Sensaciones atribuidas a distintos terpenos TERPENOS CITRONELLOL GERANIOL LINALOOL NEROL ALFA−TERPINEOL

SENSACION Frescor, amargor, rosal, etc. Dulce, olor a rosas Floral, dulce, frescor, cítrico, etc. Dulce, floral, ligeramente amargo. Dulce, floral, frutas en disolución.

LACTONAS Las lactonas son potentes compuestos usados en la industria aromática, aunque en la actualidad su producción se lleva a cabo por síntesis químicas, principalmente, pero también existen distintos procesos de producción de lactonas usando como materia prima diversas cepas de microorganismos. Las lactonas han sido aisladas de una gran variedad de alimentos y se las ha asociado al aroma de muchos de ellos, tales como frutas, mantequillas, dulces, coco, nueces, etc. ESTERES Los esteres producidos por microorganismos son los responsables del aroma afrutado en cultivos lácteos cuando existen bajas temperaturas y condiciones adecuadas para el desarrollo de estas cepas. Ya en el siglo pasado, aparecieron microorganismos responsables de la producción de aromas en distintas frutas, tales como: piñas, manzanas, fresas, peras, etc., los cuales se debían a los esteres ocasionados por el metabolismos de estos microorganismos al presentar reacciones entre ácidos orgánicos y etanol en alguna de sus vías metabólicas. A mediados del siglo XX, se descubrieron distintos esteres responsables de los aromas afrutados de los cultivos lácteos. Estos esteres se le otorgaron a Pseudomonas fragi. La adicción de etanol en cultivos de numerosas especies microbianas, ha evolucionado hasta la obtención de esteres, los cuales proporcionan algún aroma característico según la especie utilizada en el cultivo. También se han aislado esteres como el etil−butirato o el etil−hexanoato, de algunos tipos de quesos, de la leche pasteurizada, además de en numerosas frutas. DIACETIL Este compuesto, aparece en numerosas formulas de mantequillas, cremas lácticas y otros productos derivados de la leche.

20

Es responsable de muchos aromas conocidos y se atribuye al metabolismo de los microorganismos que aparecen en la producción o maduración de estos artículos lácticos, ya que como todos sabemos, los productos lácticos usan microorganismos como materia prima importante en sus procesos de obtención. El diacetil es también el causante de aromas defectuosos y desagradables de distintos alimentos, como zumos de frutas, vino, quesos etc. OLORES DESAGRADABLES Normalmente los olores defectuosos de los productos fermentados proceden de un control insuficiente de la calidad microbiología, aunque en ocasiones son las reacciones químicas espontaneas o los tratamientos tecnológicos equivocados, los que llevan a obtener estos aromas desagradables. Como ejemplo de estos casos tenemos el sabor amargo que aparece en muchos quesos, tras un tiempo de almacenamiento o en el mismo proceso de elaboración. Cepas de Pseudomonas sp. , que causan olor de patata mohosa, o las cepas de algunas especies de Streptococcus que provocan el olor a cocido o quemado en algunos productos lácteos. *Pseudomonas fluorescens−−−−−−−−−−−−− sabor a jabón o rancio *Pseudomonas fragi−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− molesto sabor afrutado en productos lácteos. Nos centraremos un poco mas en la descripción del sabor amargo. Un sabor bastante molesto y desagradable, que se suele asociar con productos en mal estado o con deficiencias en su elaboración, y que se debe a múltiples causas, elaboración defectuosa, contaminación con cepas bacterianas, almacenamiento indebido, etc., en aquellos artículos alimenticios que sabemos no han de presentar este sabor amargo. SABOR AMARGO ***Productos de soja tratados con proteasas que producen este sabor. Para impedirlo se usan proteínas carboxipeptidasa de Aspergillus sp. También sirve esta especie de hongo para la eliminación del sabor amargo en los zumos cítricos, principalmente en el de pomelo. ***Los quesos por la acción proteolitica, la maduración, etc., pueden dar este desagradable sabor amargo, debido a los peptidos que presentan y que se han desarrollado por estas causas. Para evitar su aparición existen diversos procesos como por ejemplo: − Aumento de temperatura de cocción de la leche durante la fabricación para que disminuya el cuajo. Si la temperatura la elevamos antes de la fabricación ocurre lo contrario, es decir, que aumenta el cuajo y con él los peptidos causantes del sabor amargo. − Si aumentamos la concentración de sal, se disminuye el amargor. No solo los peptidos amargos producidos por los enzimas coagulantes durante el proceso de elaboración del queso, son los únicos causantes de este sabor, ya que existen cepas lácticas con proteasas en su membrana que dan este tipo de sabor, aunque otras bacterias de este tipo sirven para combatir el aroma y sabor amargo de estos quesos por que hidrolizan las proteínas que lo originan. MECANISMOS DE APARICION DEL SABOR AMARGO EN LOS QUESOS PARA LA CASEINA

21

ENZIMA COAGULANTE FERMENTOS, CEPAS AMARGAS

FERMENTOS PROTEASAS DE LA LECHE, ENZIMA COAGUALANTE PEPTIDOS DE ALTO PESO MOLECUAR, NO AMARGOS ENZIMA COAGULANTE PEPTIDOS DE BAJO PESO MOLECULAR, NO AMARGOS FERMENTOS, CEPAS NO AMARGAS.

ENZIMA COAGULANTE PEPTIDOS DE BAJO PESO MOLECULAR, AMARGOS FERMENTOS CEPAS NO AMARGAS PEPTIDOS DE MUY BAJO PESO MOLECULAR FERMENTOS Y AMINOACIDOS NO AMARGOS ENZIMAS MICROBIANOS

No solo se usan los microorganismos para el control y producción de aromas, sino también los distintos enzimas que producen son utilizados con este fin. Se utilizan los microorganismos como fabricas de enzimas con distintas utilidades, como acelerar procesos de maduración en quesería, proporcionar aromas diversos y característicos, etc. Casi todas las clases de enzimas se pueden utilizar en la industria de la producción de aromas y sabores, aunque cada una de ellas presentara un determinado mecanismo de elaboración, un aroma característico, una etapa de uso adecuada y unas propiedades concretas que hemos de conocer antes de su utilización. LIPASAS Usadas para aumentar el sabor de los quesos italianos, porque liberan ácidos grasos importantes en la composición de estos quesos. En otros casos, estos ácidos grasos liberados por estos enzimas microbianas actúan como sustrato metabólico de los microorganismos empleados en la fermentación y se consigue asi el aroma deseado. También estos enzimas se usan para la producción de aditivos alimenticios. ***QUESOS DE PATA AZUL: Penicillium roquefortii, que atacan a los ácidos grasos liberados por las lipasas exógenas, dando metilcetonas que dan el olor característico de este tipo de quesos. ***QUESOS CHEDDAR: Se acelera su proceso de maduración con lipasas microbianas de diverso origen. ***ADITIVOS ALIMENTICIOS: Lipasas utilizadas en su fabricación. Por ejemplo: −−Nata o materia grasa de origen vegetal que se incuba con lipasas microbianas, esporas de Penicillium roquefortii y un fermento láctico, con una temperatura aproximada de 20 grados, durante 48 horas y con agitación mas o menos constante. Se desarrolla asi el aroma roquefort. Después se mezcla, pasteuriza y se almacena. Es un método también utilizado en la elaboración de salsas, aliños o mahonesas. La composición aproximada que obtendremos será: 16% de proteínas 45% de agua 18% de materia grasa

22

2% de sal añadida ph aproximado de 5.7−5.8 Como podemos ver, las lipasas, son utilizadas en muchos procesos, para la obtención de distintos compuestos alimenticios, asi como para proporcionar el aroma característico de los diversos quesos. Estas enzimas también se utilizan en la industria cosmética por sus propiedades en este campo. Las enzimas usadas en esta industria, en muchos de los casos, también provienen de microorganismos tratados adecuadamente para conseguir la calidad y las características mas apropiadas dentro de cada producto. Los procesos con enzimas, y sobre todo con lipasa, son numerosos y cada día se buscan mayores aplicaciones de estas proteínas microbianas, en muchos campos, y no solo en el cosmético o en el alimenticio. PROTEASAS Desde el punto de vista de la utilización de estas enzimas en la industria quesera esta aun en estudio, y existen algunos aspectos dudosos sobre su uso, sus propiedades, sus ventajas y también sobre los posibles problemas que se le pueden atribuir al uso de estas proteínas, ya que proporcionan en ocasiones ciertos sabores amargos. Actualmente, se busca la manera de que estas enzimas sirvan para aumentar la velocidad de procesos de obtención de aromas por la interacción de las proteasas con otros enzimas o con distintas cepas de bacterias lácticas. Las perspectivas hoy en día, están puestas sobre el control de las mezclas de diversos enzimas, del mismo o distinto origen microbiano, mas o menos purificados con anterioridad. PROCESOS DE ENCAPSULACION DE SISTEMAS EXOGENOS DE TIPO ENZIMATICO; Microcapsulas de lípidos o Lisosomas. Las Microcapsulas o los Lisosomas sirven para originar in situ el aroma deseado durante la producción, maduración, etc. del articulo. Se han ensayado microcapsulas, con distintas especies para producir diversos aromas, y los estudios en este campo, continúan y avanzan cada día. Los lisosomas pueden ser importantes para la quesería, ya que evitarían perdidas en el rendimiento de estas industrias. Además, las proteasas encerradas en lisosomas, se liberan poco a poco y asi se pueden evitar los acumulos de peptidos amargos. Estos liposomas se comportan de forma semejante a los microorganismos utilizados en estos procesos de producción, aunque el más mínimo movimiento del equilibrio entre los distintos compuestos que originan el aroma y el sabor, pueden llevarnos a la obtención de flavores defectuosos y desagradables. Las enzimas microbianas son muy utilizadas para obtener aromas en procesos de producción de distintos alimentos, y también para eliminar sabores desagradables. Actualmente la línea básica de investigación se centra en los enzimas, en su aislamiento, su utilidad, etc. En las frutas y vegetales frescos se eliminan enzimas para evitar malos aromas y estas mismas proteínas sirven como precursores para obtener aromas de otros alimentos. Los enzimas microbianas pueden originar aromas frescos en procesos de obtención de distintos productos. Cepas de Lactobacillus bulgaricus, producen cepas que aumentan la concentración del sabor a vainilla, de los extractos vegetales que presenta vainillina. Este hecho se utiliza en la producción de yoghurt y otros alimentos 23

similares. Los frutos cítricos presentan compuestos amargos. Algunos enzimas aislados de Coniella diplodiella, sirven para eliminar parte de este amargor en los productos obtenidos en base de estas frutas, reduciendo su pH sin alterar los demás componentes nutritivos que presentan. Por tanto, los enzimas aislados de microorganismos tienen un futuro prometedor dentro de la industria de producción de aromas y saborizantes. PIRAZINAS Y DERIVADOS ORIGEN: Sintesis quimica, extraccion vegetal y microorganismos. ** Presentan numerosos umbrales de percepciòn, según los racicales que presenten en su molécula. Tienen un olor caracteristico a tostado y a nuez, aproximadamente. ** Se localizan en numerosos alimentos proporcionandoles el aroma caracteristico, además de otras propiedades. Como ejemplo de estos productos cotidianos hemos de resaltar: QUESOS: Los quesos fundidos y el queso parmesano. VEGETALES CRUDOS: Guisantes, pimientos, granos de café, cacao, e incluso en las nueces, a las cuales le dan ese olor tan caracteristico. PRODUCTOS CARNICOS. ALIMENTOS JAPONESES FERMENTADOS. PRODUCTOS COCIDOS Y/O TOSTADOS. OTROS PRODUCTOS: Vinagre, chocolate, sake, cerveza, etc. **En otros muchos articulos son derivados de pirazina los causantes del aroma, esto ocurre por ejemplo: 2−metoxi−3−metilpirazina−−−−−−PALOMITAS DE MAIZ. Tetrametilpirazina−−−−−−−−−−−−−−−PICANTES. 2−metoxi−3−isopropilpirazina OLOR A TIERRA, PATATAS. 24

2−metil−6−etoxipirazin−−−−−−−−−−PIÑA AMERICANA. 2,5−dimetilpirazina−−−−−−−−−−−−−−NUECES, HIERBA. 2−metoxi−3−metilpirazina−−−−−−−PATATAS. ** Las pirazinas y los compuestos derivados, aparecen formando parte de numerosos aromas conocidos. También pueden ser causa de olores desagradables produccidos normalmente por el mal estado del alimento y la proliferaccion de diferentes cepas de bacterias. COMPUESTOS AZUFRADOS Naturaleza, umbral de detección de algunos compuestos azufrados encontrados en distintos quesos y el olor característico que proporcionan. COMPUESTOS AZUFRADOS 2−3−ditia−pentano 2−4−ditia−pentano 2−3−4−tritia−pentano S−metil−tioacetato S−metil−tiopropanoato S−metil−tiobutirato S−metil−tio−3−metil−butirato S−metil−tio−2−metil−butirato

UMBRAL DE DETECCION 6.0 60.0 0.1 5.0 100.0 200.0 100.0 no determinado

OLOR ajo ajo queso muy madurado coliflor cocida queso cebolleta afrutado fresa silvestre

OLORES DESAGRADABLES Normalmente los olores defectuosos de los productos fermentados proceden de un control insuficiente de la calidad microbiología, aunque en ocasiones son las reacciones químicas espontaneas o los tratamientos tecnológicos equivocados, los que llevan a obtener estos aromas desagradables. Como ejemplo de estos casos tenemos el sabor amargo que aparece en muchos quesos, tras un tiempo de almacenamiento o en el mismo proceso de elaboración. Cepas de Pseudomonas sp. , que causan olor de patata mohosa, o las cepas de algunas especies de Streptococcus que provocan el olor a cocido o quemado en algunos productos lácteos. *Pseudomonas fluorescens−−−−−−−−−−−−− sabor a jabón o rancio *Pseudomonas fragi−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− molesto sabor afrutado en productos lácteos. MECANISMOS DE APARICION DEL SABOR AMARGO EN LOS QUESOS PARA LA CASEINA ENZIMA COAGULANTE

FERMENTOS PROTEASAS DE LA LECHE, ENZIMA COAGUALANTE 25

FERMENTOS, CEPAS AMARGAS

PEPTIDOS DE ALTO PESO MOLECUAR, NO AMARGOS ENZIMA COAGULANTE PEPTIDOS DE BAJO PESO MOLECULAR, NO AMARGOS FERMENTOS, CEPAS NO AMARGAS.

ENZIMA COAGULANTE PEPTIDOS DE BAJO PESO MOLECULAR, AMARGOS FERMENTOS CEPAS NO AMARGAS PEPTIDOS DE MUY BAJO PESO MOLECULAR FERMENTOS Y AA' NO AMARGOS SABOR AMARGO

***Productos de soja tratados con proteasas que producen este sabor. Para impedirlo se usan proteínas carboxipeptidasa de Aspergillus sp. También sirve esta especie de hongo para la eliminación del sabor amargo en los zumos cítricos, principalmente en el de pomelo. ***Los quesos por la acción proteolitica, la maduración, etc., pueden dar este desagradable sabor amargo, debido a los peptidos que presentan y que se han desarrollado por estas causas. Para evitar su aparición existen diversos procesos como por ejemplo: − Aumento de temperatura de cocción de la leche durante la fabricación para que disminuya el cuajo. Si la temperatura la elevamos antes de la fabricación ocurre lo contrario, es decir, que aumenta el cuajo y con él los peptidos causantes del sabor amargo. − Si aumentamos la concentración de sal, se disminuye el amargor. No solo los peptidos amargos producidos por los enzimas coagulantes durante el proceso de elaboración del queso, son los únicos causantes de este sabor, ya que existen cepas lácticas con proteasas en su membrana que dan este tipo de sabor, aunque otras bacterias de este tipo sirven para combatir el aroma y sabor amargo de estos quesos por que hidrolizan las proteínas que lo originan **Sabores defectuosos del vino y de algunos zumos de frutas causados por moléculas de diacetil, producidas como consecuencia del metabolismo bacteriano. ENZIMAS MICROBIANOS LIPASAS Aumentan el aroma de los quesos italianos donde los ácidos grasos libres son importantes para su sabor característico. ***QUESOS DE PATA AZUL: Penicillium roquefortii, que atacan a los ácidos grasos liberados por las lipasas exógenas, dando metilcetonas que dan el olor característico de este tipo de quesos. ***QUESOS CHEDDAR: Se acelera su proceso de maduración con lipasas microbianas de diverso origen. ***ADITIVOS ALIMENTICIOS: Lipasas utilizadas en su fabricación. Por ejemplo: −−Nata o materia grasa de origen vegetal que se incuba con lipasas microbianas, esporas de Penicillium roquefortii y un fermento láctico, con una temperatura aproximada de 20 grados, durante 48 horas y con agitación mas o menos constante. Se desarrolla asi el aroma roquefort. Después se mezcla, pasteuriza y se almacena. 26

Es un método también utilizado en la elaboración de salsas, aliños o mahonesas. PROTEASAS **Acelerar procesos de obtención de aromas por interacción con otros enzimas o con distintas cepas de microorganismos. **Encapsulaciòn en microcapsulas de lípidos o lisosomas para generar in situ, los aromas. Evitan la perdida de rendimiento en la industria quesera por que se eliminan poco a poco y asi no se acumulan peptidos amargos. Su comportamiento es semejante al del microorganismo usado durante el proceso de elaboración del queso. **El inconveniente que presentan los lisosomas es que la mínima perdida del equilibrio entre las sustancias aromatizantes y saborizantes, pueden llevarnos a flavores defectuosos. **Enzimas de Lactobacillus bulgaricus Aumentar la concentración de sabor a vainilla, en los extractos vegetales que tienen vainillina. **Enzimas de Coniella diplodiella Eliminar parte del amargor en los productos obtenidos a base de frutas cítricas, sin alterar otros compuestos nutritivos. MULTIPLICIDAD TEORICA DE LAS ETAPAS QUE CONDUCEN A LOS AROMAS Cada etapa variará en función del pH, de la salinidad, del potencial redox, del contenido de agua y de la temperatura, entre otros parámetros. LOS PRIMEROS ENZIMAS O MICROORGANISMOS DEL PROCESO. LOS SEGUNDOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN EL PROCESO. REACCIONES QUÍMICAS O USO DE OTROS MICROORGANISMOS. COMPUESTOS IMPLICADOS EN EL AROMA: Alcoholes Cetonas Fenoles Aldehidos Lactonas Aminas Acidos Heterociclos aromáticos Aminoácidos Hidrocarburos terpenicos Peptidos Hidrocarburos bencenicos Compuestos azufrados.

27

POSIBLES PRECURSORES DE PIRAZINAS PIRAZINAS 2−metoxi−3−isopropil 2−metoxi−3−secbutil 2−metoxi−3−isobutil 2−metoxi−3−isopropil−5−metil 2,6−dimetoxi−3−isopropil−5−metil

POSIBLES PRECURSORES Valina + glioxal Isoleucina + glioxal Leucina + glioxal Valina + piruvaldehido Valina + piruvato

Compuestos azufrados a partir de metanotiol: . VIA METABOLICA PARA OBTENER MENTOL L−MENTOL L−MENTIL DH(50%) (40%) E 1 ACETATO 1−MENTONA DH (50%) D−NEOMENTOL D−NEOMENTIL (5%) E 2 GLUCOSIDO E 1−−−−− ACETIL TRANSFERASA E 2−−−−− GLUCOSIL TRANFERASA COMPUESTOS −Alcoholes. −Compuestos azufrados. −Pirazinas. −Terpenos: Menthol Utilización de microorganismos para separar isómeros ópticos. −Lactonas. −Ésteres. −Maltosas −Otros compuestos flavónicos para separar sabores: −Diacetilos

28

−Microorganismos productores de enzimas para aumentar el sabor y aroma. • Soja. • Vainillina. • Cítricos. TABLA

Brevibacterium

Compuestos azufrados

−B. linens Pseudomonas −P. Aeruginosa Corynobacterium Pirazinas −C. Glutamicum y C. Mutans Streptococcus −S. lactis Streptomyces Aerobacter Candida Arthrobacter Bacillus Nocardia Trychoderma Torulopsis Pseudomonas Geotrichum

Terpenos

−G. Candidum. Rhodotorula Mycobacterium Rhizopus Hansenula −Sarcina lútea.

Lactonas

Sacharomyces −S.. cerevisiae Trychoderma

29

−T. viride Sporobolomyces −S. odorus Pseudomonas −P. Fragi Streptococcus

Ésteres

−S. Lactis subesp diacety Lactobacillus OTROS COMPUESTOS Streptococcus −S. Lactis subesp maltigenes Maltosa Lactobacillus −L. Maltaromicus. Leuconostoc −L. dextranicum −L. Citrovorum Diacetilos Streptococcus −S. Lacti subesp diacetylactis −S. cremonis MICROORGANISMOS ENZIMATICOS PARA AUMENTAR LOS SABORES Aspergillus Lactobacillus

Soja Vainillina

− L. Bulgaricus Aspergillus −A. Niger Cítricos Arthrobacter −A. Globiformis METABOLITOS DE Aspergillus sp., USADOS EN PROCESOS ALIMENTICIOS. 30

COMPUESTOS

ESPECIES

Ac. citrico

A. niger

Ac. gluconico Ac.malico Ac. itaconico Ac. tartarico

A.niger A. sp. A. terreus, A. itaconicus A. niger, A.griseus

Alfa−amilasas

A. oryzae, A. niger

Glucosa oxidasas−catalasas

A. niger

Naringinasas Pectidasas

A.niger A. niger

USO Carnes, bebidas sin alcohol, caramelos, lácteos, etc. Postres, pan, refrescos, etc. Jamón, gelatinas, etc. Residuos contaminantes, etc. Bebidas carbonatadas, etc. Chocolate, levaduras industriales, etc. Productos de huevo, cervezas, vinos, mahonesas. Zumos de pomelo etc. Zumos de frutas, vino etc.

BIBLIOGRAFIA *ADVANCES IN APPLIED MICROBIOLOGY, VOLUME 29 Production of Flavor Compounds by Microorganisms G. M. KEMPLER, Nabisco Brands, INC., Wilton, Connnecticut. *Microbiología Alimentaria. El control de los flavores ED: Acribia S.A. M. Desmazeaud, J. Adda *El maravilloso mundo de los aromas. Discurso de León Villanúa *http//www.intr.net/mercosur/res4693.htm * Microbiología alimentaria II Alimentos fermentados ED: Acribia S.A. C.M. Bourgeois J.P. Larpent *Biology of Industrial microorganisms 31

ED: De Benjamin − Cummings Co.−NC A.L. Demain N.A. Solomon 1 47 PROTEINAS, LIPIDOS O AZUCARES QUE ACTUAN DE SUSTRATO. AMINOACIDOS, ACIDOS GRASOS O COMPUESTOS CARBONILICOS. DERIVADOS DE LOS COMPUESTOS ANTERIORES. PRODUCTOS CON AROMA. CH3SH o CH4SO CH3−S−S−CH3 (disulfuro de dimetilo) Reacciones de condensación CH3 −S−S−S−CH3 (2−3−4−tritiapentano) 2 CH3−SH + H−CHO CH3−S−CH2−S−CH3 (2−4−diatiapentano) Reacciones de adicción CH3−SH + R−COOH CH3−S−CO−R (metil− esteres) Reacciones de Tioesterificacion. *EJEMPLOS DE FORMACION DE COMPUESTOS AROMATICOS AZUFRADOS ENCONTRADOS EN LOS QUESOS A PARTIR DE METANOTIOL. l−mentol l−mentol acetato (40%) Acetiltransferasa (10%) Dehidrogenasa (50%) 1−Mentona Deshidrogenasa d−neomentol d−Neomentil glucosido (5%) glucosil (45%) 32

tansferasa LECHE DESCREMADA CON UN 45−50% MATERIA SECA POR ULTRAFILTRACIÓN CH3SH o CH4SO CH3−S−S−CH3 (disulfuro de dimetilo) Reacciones de condensación CH3 −S−S−S−CH3 (2−3−4−tritiapentano) 2 CH3−SH + H−CHO CH3−S−CH2−S−CH3 (2−4−diatiapentano) Reacciones de adicción CH3−SH + R−COOH CH3−S−CO−R (metil− esteres) Reacciones de Tioesterificacion. *EJEMPLOS DE FORMACION DE COMPUESTOS AROMATICOS AZUFRADOS ENCONTRADOS EN LOS QUESOS A PARTIR DE METANOTIOL. PRODUCTOS CON AROMA. DERIVADOS DE LOS COMPUESTOS ANTERIORES. AMINOACIDOS, ACIDOS GRASOS O COMPUESTOS CARBONILICOS. PROTEINAS, LIPIDOS O AZUCARES QUE ACTUAN DE SUSTRATO.

33