Cellules Souches Leucémiques Immunophénotypage et Ciblage

Cellules Souches Leucémiques Immunophénotypage et

Ciblage thérapeuthique François Vergez INSERM, U1037, Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse Laboratoire d’Immunologie, CHU Rangueil, Toulouse

8 avril 2014

Leucémies aiguës myéloïdes •

Maladies hétérogènes avec des grandes variations dans les réponses thérapeutiques, la survenue de rechute et la survie globale, selon les facteurs pronostiques tels que l’âge, la cytogénétiques et les anomalies moléculaires.

Age Juliusson, Blood 2008

Cytogénétique Mrozek, Hematology, 2006

Mutations Schlenk et al, NEJM 2008

Bases moléculaires des LAM Type II mutations

Type I mutations FLT3- ITD FLT3-TKD (Asp835) c-Kit (Exon 8) c-Kit (Asp 816) N-RAS K-Ras c-fms PTPN11 NF1 C-Cbl

CBFb-MYH11 AML1-ETO Tel-AML1 PML-RARa NPM1c CEBPA NUP98-HoxA9 PU-1 AML1 AML1-AMP19

Blocage de maturation Autorenouvellement

LAM

Voies de signalisation PI3K/Akt mTORC1 NF-kB SFKs MAPK

Prolifération cellulaire Avantage de survie

Cellule Souche Leucémique: le dogme

Clevers, Nat Med 2011

CD34+ CD38+ Phénotype « progéniteurs engagés»

Souris NOD/SCID CD34+ CD38Phénotype « Cellules souches normales »

Bonnet et al, Nat Med 1997

Le dogme des CSL en 1997

CD34+CD38-

CD34+CD38• Prise de greffe en NOD/SCID • Reproduit la maladie initiale (prolifération, différenciation) • Est à l’origine de prise de greffe après transplantations sériées (autorenouvellement) • Fréquence variable: 0.2 à 100/106 cellules mononuclées

Bonnet et al, Nat Med 1997

CD34+CD38- vs CD34+CD38+

Souris NSG NOD/SCID/IL-2Rγcnull

Ishikawa, Nat Biotech, 2007

Les CD34+CD38- se localisent sur la zone endostéale

Ishikawa, Nat Biotech, 2007

….ou elles sont en G0 et protégées de la CTx CD34+CD38-

CD34+CD38+ CD34-CD38+

Chimiosensibilité

Ishikawa, Nat Biotech, 2007

CD34+38-123+ >15% est corrélé à une mauvaise réponse

Age

0.08

NS

WBC

0.89

NS

Karyotype

0.02

*

CD34+

0.81

NS

CD123+

0.88

NS

CD34+38-123+

0.03

*

FLT3-ITD

0.90

NS

NPM1c

0.49

NS

100

complete response rate (%)

p (Chi square test)

80 60 40

86%

65%

< 15%

>15%

20 0

CD34+CD38-CD123+

analyse multivariée: CD34+CD38-CD123+>15%: OR: 0.33 (CI, 0.11-0.97) Vergez, Haematologica 2011

CD34+38-123+>1% prédit une mauvaise survie sans maladie p (log rank test) 0.12

NS

WBC

0.54

NS

Karyotype

0.26

NS

CD34+

0.89

NS

CD123+

0.29

NS

1%: RR: 0.27 (CI, 0.13-0.55) Vergez, Haematologica 2011

CD34+38-123+>1% prédit une mauvaise survie globale

p (log rank test) 0.009

**

WBC

0.42

NS

Karyotype

0.03

*

CD34+

0.91

NS

CD123+

0.16

NS

1%: RR: 0.24 (CI, 0.12-0.49) caryotype Vergez, Haematologica 2011

Définition • 2 propriétés fondamentales: – Autorenouvellement

– Capacité à générer des progéniteurs plus matures hautement proliférant aboutissant à des cellules différenciées constituant le tissu cancéreux hétérogène • Rare au sein du tissu cancéreux • Non engagées • Quiescentes • Capacité proliférative illimitée • Microenvironnement (« niche » tumorale) • Chimiorésistantes Reya et al, Nature 2000 Clarke et al, Cancer Res 2006

Cellule Souche Leucémique: quelle origine?

Bonnet et al, Nat Med 1997

MOZ-TIF2 Modèle murin C57BL/6-Ly5.2 5-FU

Oncogènes BCR-ABL MOZ-TIF2*

* LAM

avec inv(8)(p11q13)

CSL: lineage, cKithigh, Sca-1-, CD34+, FcRII+ = GMP

Huntly et al, Cancer Cell 2004

MOZ-TIF2

Huntly et al, Cancer Cell 2004

MLL-ENL

Modèle murin C57BL/6-Ly5.2 pMSCV/IRES-GFP

LAM avec t(11;19)(q23;p13.3)

Cozzio et al, Genes & Dev, 2003

Remise en cause du phénotype et de l’origine des CSL

•

Modèles murins – – –

MOZ/TIF2 , inv(8)(p11q13), Huntly et al, Cancer Cell 2004 MLL/ENL, t(11;19)(q23;p13.3), Cozzio et al, Genes & Dev, 2003 MLL-AF9, t(9;11) (p22; q23), Krivtsov et al, Nature 2006

–

Les CSL peuvent dériver des progéniteurs engagés (CMP, GMP) après acquisition de propriétés d’autorenouvellement

NOD/SCID/IL-2Rcnull vs NOD/SCID *No mature T or B cells *Dysfunction of macrophages and dendritic cells *No NK activity *Complement deficiency (C5) *No incidence of lymphoma  Long lived

Absence of NK activity

Shultz et al., J.I. 2005

Xénogreffes de LAM dans les NOD/SCID/IL-2Rcnull

CD34+CD38+

Lin-

Specimen_AML325.fcsÉQ2: +, +

Specimen_AML325.fcsÉDAPI- subset

10

3

10

2

80.3

5

104

10

3

10

2

0

0 1.75 0.1

Lin-CD34-CD38-

10

CD123

4

9.45



10

10

5

0

8.48 2

101

3

10 100 10 10

4

10001 10 0

Stem cell-like Lin-CD34+CD38-

5

0

10

2

CMP-like CD45RA-

3

10 10 CD45RA

4

10

5

GMP-like CD45RA+

Sarry, JCI 2011

Chaque sous fraction récapitule la diversité du phénotype leucémique

Après transplantation

SSC

SSC

Avant transplantation

4.76

95.4

1.4

Lineage

0.19

10

2



3

82.2

0.96

CD38

10

5

104

CD38

104

10

0

10

3

10

2

0 0

10

2

10 10 CD34 3

4

10

5

5

10

4

10

3

10

2

85.8

1.06

16.7 0

0.17 10

2

CD34 3

10 10

4

10

5

10

5

10

4

90.1

4.96

10

3

10

2

0

0

0 15

10

: CD38

84.8

Lindim

Linneg

Specimen_001_SA20 sort325 (4) - BM 2328.fcsÉLin- subset Specimen_001_SA20 sort325 (4) - BM 2328.fcsÉLinlo subset

CD38

5

Specimen_AML325.fcsÉLinlo subset

: CD38 CD38

10

Lineage

Lindim

Linneg

Specimen_AML325.fcsÉLin- subset

94.8

13

0.14 0

10

2

10 10 CD34 : CD34 3

4

10

5

4.61 0

0.3 10

2

CD34 3

4

10 10 : CD34

10

5

Sarry, JCI 2011

Les CSL de LAM dans les NSG adultes

•

Rares: 1 sur 150.000 à 4 millions

•

Phénotypiquement hétérogène …..mais toujours enrichies dans les CD34+CD38-

•

Récapitulent la diversité phénotypique de l’échantillon primaire

•

Hiérarchie phénotypique ≠ CSH normales

•

Cellule d’origine?

Sarry, JCI 2011

Plusieurs origines pour les CSL

Goardon, Cancer Cell 2011

Plusieurs origines pour les CSL

Goardon, Cancer Cell 2011

Remise en cause du phénotype et de l’origine des CSL

•

•

Modèles murins – – –

MOZ/TIF2 , inv(8)(p11q13), Huntly et al, Cancer Cell 2004 MLL/ENL, t(11;19)(q23;p13.3), Cozzio et al, Genes & Dev, 2003 MLL-AF9, t(9;11) (p22; q23), Krivtsov et al, Nature 2006

–

Les CSL peuvent dériver des progéniteurs engagés (CMP, GMP) après acquisition de propriétés d’autorenouvellement

Xénogreffes NOD/SCID et NSG – – –

Anti-CD38, NPM1c, Taussig et al, Blood 2008; Blood 2010 Goardon et al, Cancer Cell 2011 Souris NSG, Sarry et al, JCI 2011

–

Les CSL ne sont pas contenues uniquement dans la sous fraction CD34+ CD38-

Les CSL en 2014 Fréquence des CSL

CD34+CD38-

CD34+/- CD38+

CD34+CD38-

CD34+CD38+

MLL-ENL t(11;19)(q23;p13.3) MOZ-TIF2 inv(8)(p11q13) MLL-AF9 t(9;11) (p22; q23)

CD34-CD38+

Adapté de Jeffrey M. Rosen, et al, Science, 2009

Cellule Souche Leucémique: d’autres marqueurs?

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL

Kikushige, Cell Stem Cell 2010

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL

Jordan, Leukemia 2000 Récepteur de l’IL3

CD123

LAM 18/18 – NBM 0/5 Greffe NOD/SCID CD34+CD123+: 3/3 CD34+CD123-: 0/3 Taussig, Blood 2005 Expression du CD123 sur les CSH

CSL

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL

CD123

CLL-1

Van Rhenen, Blood 2007 C-type Lectin-Like Molecule-1 LAM 77/89 (87%) Greffe NOD/SCID CD34+CLL-1+: 3/3

CSL

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL

CD123

CLL-1

CSL

CD96 Hosen, PNAS 2007 Ly T/NK activés LAM 19/29 (66%) – NBM 5% Greffe NOD/SCID CD96+: 4/5 CD96-: 1/5

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL

CD123

CSL

Saito, Sci Transl Med 2010 CD32: FCGR2 LAM 21/61 (34%) Greffe NOD/SCID: Het

CD32

CD25: IL2RA LAM 15/61 (25%) Greffe NOD/SCID CD34+CD38-CD25+: 4/4

CLL-1

CD25

CD96

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL

CD123

Jan, PNAS 2011 T Cell Immunoglobulin mucin-3 LyT LAM 20/22 (91%) NBM 0/8 Greffe NOD/SCID: CD34+TIM3+: 25/26 CD34+TIM3-: 4/14

CLL-1

TIM-3

CSL CD32 CD25

CD96

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL Stroopinsky, Cancer Res 2013 MUC-1 LAM CD34+ 20/20 LAM CD34- 6/6

CD227

CD44

Greffe NSG CD34+227+ 4/4 CD34+227- 2/5 CD34-227+ 1/1 CD34-227+ 0/1

Jin, Nat Med 2006 Adhésion cellulaire et transduction des signaux LAM 8/8 Greffe NOD/SCID Inhibée par Ac anti-CD44

CSL

Zhi, Cancer Letters 2010 CD325: N-Cadherin CD202b: Tie2

CD325

Augmentation du taux de CD34+CD38-CD123+CD325+ CD34+CD38-CD123+CD202b+ post chimiothérapie

CD202b

CD184 Fiegl, Blood 2009 CD184: CXCR4 Expression augmente en hypoxie

Antigènes de surface préférentiellement exprimés sur les CSL

CD91 Majeti, Cell 2009 Ligand SIRPa « ne me mange pas »

LAM 6/8

Signal prophagocytaire

CD47

LAM 13/13 Greffe NOD/SCID CD34+CD38-CD47+: 3/3

Chao, Sci Transl Med 2010 calréticuline

CSL

Cellule Souche Leucémique: ciblage thérapeutique

Des pistes pour cibler les CSL

•

Immunothérapie anti-CSL

•

Quiescence

•

Inhiber les acteurs de l’hypoxie (HIF1a)

Les LSC résident dans la fraction TIM3+

Kikushige, Cell Stem Cell 2010

Kikushige, Cell Stem Cell 2010

Anticorps anti-TIM3: ATIK2 TIM3 (T cell immunoglobulin mucin-3)

Anticorps murin IgG2 anti-TIM3

•

• • •

Induit CDC et ADCC N’affecte pas l’hématopoïèse normale Dépletion des monocytes TIM3+

•

Bloque la prise de greffe des LAM en NOD/SCID (NK+) Réduit la masse tumorale et cible les CSL en NRG (NK-)

Expression dans l’HP normale – –

•

(+) Monocytes, sous fraction NK (-) CD34+CD38-, progéniteurs (sauf CFU-M), B, T, neutrophiles

Expression dans l’HP leucémique – – – –

M0-M7 sauf M3 (+++) CD34+CD38(++) CD34+ CD38+ (+) CD34-

•

Kikushige, Cell Stem Cell 2010

L’anticorps anti-CD47 induit la phagocytose des cellules leucémiques mais pas des CD34+ normales

Majeti, Cell 2009

Activité anti-CSL de l’anticorps anti-CD47 2nd receveur

IgG contrôle

Anti-CD47 Majeti, Cell 2009

CSL vs CSH: le signal « mange moi »

Majeti, Oncogene 2010

Modèle d’immunothérapie anti-CSL

Majeti, Oncogene 2010

Parthenolide Ida/Proteasome -i

NF-kB/Stress oxydatif

Anticorps monoclonaux

PI3K-i TORC-i Metformine

CD47 TIM3 CD123 CD44 CLL-1

PI3-K/Akt

HIF1α

SDF1/CXCR4

Echynomycine

Plerixafor