Cyril Iaconelli (UMR PAM) : Le cas problématique des bactéries

Cyril Iaconelli – Doctorant Directeurs de thèse : Pr Patrick Gervais/ Pr Laurent Beney .

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Introduction au projet F.PARIS

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Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS

Production de biomasse

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-

Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse

Stabilisation et conservation

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Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif

Introduction au projet F.PARIS

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Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS

Production de biomasse

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Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse

Stabilisation et conservation

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Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif

Surface du tractus digestif 200-300 m2 1014 bactéries

(10x plus que de cellules humaines)

20 000 x

Jusqu’à1000 espèces différentes au sein d’un même individu Rôles multiples :      4

Détoxification Digestibilité de fibres Production de vitamines Prévalence à l’obésité Action sur le système immunitaire…

Vit B9

Vit K

• Une des bactéries les plus abondantes du colon humain • Souche strictement négative

anaérobie

et

Colon : 1010 à 1012 bactéries/g

gram

• Productrice de butyrate, formate, lactate et CO2 • F.prausnitzii (et son surnageant) ont un effet anti-inflammatoire important • Moins abondante chez des patients atteints par des maladies intestinales chroniques

Sélectionner,

produire et conserver une souche F.prausnitzii pour réduire les symptômes de patients atteints de maladies intestinales chroniques. 5

Duncan S. et al 2002 Growth requirements and fermentation products of Fusobacterium prausnitzii, and a proposal to reclassify it as Faecalibacterium prausnitzii gen. nov., comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, 2141–2146 Sokol H. et al. 2008. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proceedings of the National Academy of Sciences 105(43):16731-16736

Étude clinique : - Production Production à

d ’un batch pour

l’échelle

l’étude

Optimisation des

industrielle :

- Recrutement

process :

- Scale-up

- Management de

- Croissance - Conservation sous

Étude préclinique : - Dossier Novel Food - Statut GRAS - Tests toxicologiques

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Sélection de la

forme sèche et/ou

« meilleure » souche :

liquide

- Effets anti-

- Stabilité (viabilité et

inflammatoires

vitalité) dans le temps

- Croissance et aptitude à être stabilisée - Implantation dans la

flore intestinale

l’étude

Sélection des souches : -

Isolation des souches Évaluation des effets antiinflammatoires (avant et après stabilisation) Évaluation des différents taux de croissance Colonisation du tractus digestif Résistance au passage dans le tractus digestif …

-

Toxicité et dossier Novel Food : -

Étude toxicologique Production d’acide gras à chaine courte Activités enzymatiques Resistance aux antibiotiques Transfert de gène Preuves cliniques …

-

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Conditions de culture et stabilisation : -

Optimisation de la production de biomasse - Optimisation de sa stabilisation (forme sèche ou liquide) - Encapsulation protégeant la souche et permettant sa libération au niveau du colon - …

Scale-up et industrialisation : -

Constitution d’un milieu industriel - Optimisation du process (production et stabilisation) aux conditions industrielles - Constituition de la formule finale - …

Introduction au projet F.PARIS

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Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS

Production de biomasse

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Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse

Stabilisation et conservation

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Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif

Préparation d’une cryobanque

Culture en tube (ml)

Culture en Schott (~100ml)

Gestion de l’anaérobie Optimisation de la formulation

Conservation

Culture en fermenteur (L)

Centrifugation et récolte Optimisation du procédé

Récupération de la poudre

Lyophilisation de la crème

Equipement de production :

Equipement de stabilisation et de conservation :

Enceinte anaérobie Lyophilisateur

Fermenteur 5 litres (anaerobe ready)

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Lit fluidisé

Enceinte pilote de séchage à HR contrôlée

Anaérobie stricte

Bactérie commensale du colon

Reproduire en laboratoire les conditions (composition en nutriments, composition gazeuse) favorables à sa croissance

Compositions gazeuse

UFC.ml-1 (à 20h)

N2(85%)-H2(5%)CO2(10%)

1.5 108

N2(95%)-H2(5%)

5.6 107

CO2

1 108

N2 11

Croissance

Composition qualitatives et quantitatives en nutriments Atmosphère gazeuses

Ajout de micronutriments

Milieu de laboratoire

Milieu industriel développé

Volume

10mL

2L

DO (600nm)

Inf. à 1

Sup. à 5

Dénombrement 108UFC/mL

Contraintes

Présence de farines animales

2 109 UFC/mL Exempt de farines animales

Introduction au projet F.PARIS

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Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS

Production de biomasse

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Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse

Stabilisation et conservation

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Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif

RNS O. ROS

Physiques Principales perturbations induites par le séchage

Diminution du volume, augmentation du rapport surface volume, déformation membranaire, Changement d’état (liquide  verre solide), cristallisation, transitions de phase des lipides

Chimiques

Cinétique de séchage, osmoprotectants, adjuvants vitrifiants, antioxydants

Antioxydants, atmosphère

Stress oxydant, augmentation intracellulaire en soluté, stimulation du métabolisme

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Viabilité

50%

50%

40%

40%

30%

30%

20%

20% 10%

10%

0%

0% PBS

Tréhalose

Tréhalose + Proline

Inuline

Séchage en couche mince de la souche

Mise au point d’un procédé de séchage pilote permettant de sélectionner les protectants. 15

PBS

Tréhalose

Tréhalose + Proline

Séchage par lyophilisation

Avantages :  Rapide  Simple  Faible volume à produire  Homogénéité avec les résultats de lyophilisation

60%

25%

40%

Viabilité(%)

Viabilité

50%

0%

0% Trehalose(5%)

Glycerol(1%)

Concentration en tréhalose

30%

30%

20% 10%

pH:4.85% Trehalose pH:6.410% Trehalose Tréhalose 5%(1/1) + PBS

Viabilité

Viabilité

Trehalose(5%)

50% viabilité

pH du milieu de lyophilisation

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Glycerol(1%)

Cinétique de congélation

4% viabilité

0%

1°C/min

20%

LYBHI-4°C LYBHI-25°C LYBHI-37°C PBS-25°C Condition de réhydratation

Condition de réhydratation

2°C/min

20% 10% 0% 2,50% 5% 10% 20% Concentration en tréhalose

Composition des différents tampons (recommandé par la pharmacopée européenne) NaCl HCl KH2PO4

30 min – 37°C Témoin

Sels NaOH Pepsine Pancréatine biliaires Pectinase

Mortalité totale dans l’estomac

Estomac pH 1,8 Jéjunum proximal pH 6,4 Jéjunum distal pH 6,8

Sensible aux sels biliaires

Iléum distal pH 7,4 Côlon pH 6

0

5

Viabilité (Log10 UFC/ml)

La bactérie présente une forte sensibilité à l’acidité stomacale ainsi qu’aux sels biliaires. La conception d’une gélule gastro-résistante est indispensable. 17

Encapsulation

Stabilisation

Ingestion Production de la bactérie

F.prausnitzii

Conditions Colonisation dans le colon : stressante  Action sur les maladies intestinales chroniques

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Estomac : pH 1.8 + pepsine + O2 (Au moins 30min) Petit intestin : pH 6.4 – 6.8 Sels biliaires (5 – 10 h) Gros intestin : pH 7.2 – 7.4 18

Challenges

Initialement

Production

108 CFU/mL

Aujourd’hui

Production de biomasse x4000

2L

10mL

Séchage

Survie après séchage

Survie x600

Préservation de la fonctionalité

Survie à l’état sec Aucune valeurs

Tested in-vitro

Survie après séchage

50%

0.1% Survie après stockage

2.109 CFU/mL

4 mois à 25°C

Modèle d'inflammation intestinal murin

Survie après stockage

10% Fonctionalité in-vivo des bactéries sèches

◦ L’équipe de l’INRA de Jouy-en-Josas : Sylvie Hudault, Sylvie Miquel, Rebeca Martin Rosique, Véronique Robert, Chantal Bridonneau, Florian Chain, Luis Bermudez, JeanMarc Chatel, Muriel Thomas, Philippe Langella ◦ Biovitis : Tony Pouply, Laurent Rios ◦ Merck Medication Familiale : Severine Le Roy, Stéphanie Courau, Pascal Molimard

◦ Welience : Alexandre Charriau, Élise Perrette, MariePierre Montaron ◦ UMR-PAM : Laurent Beney, Patrick Gervais

Merci de votre attention