Enzyme - Diagnostik

Serumenzyme Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation

Enzyme - Eigenschaften • Die Bestimmung von Enzymaktivitäten in Serum, Plasma oder Harn hat für die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen vorrangigen Stellenwert eingenommen. • Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering, wenn man sie in Konzentrationen angibt – z.B. ALAT (GPT) 100 µg/ Liter (Gesamteiweiß 60-80 g/l) • Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B. Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren – kommen in höheren Konzentrationen vor. • Enzyme gelangen meistens durch die Zellumsatz ins Blut.

Enzyme - Eigenschaften • Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut – z.B. Thrombin, Plasmin, Cholinesterase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Abfall der Aktivität im Blut. • Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drüsen – z.B. Pankreasamylase, -lipase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut. • Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle – z.B. LDH, GOT, GPT, CK - zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.

Enzyme - Eigenschaften • Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut sezeniert wird – z.B. CHE -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut sinkt. • Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber nicht ins Blut abgegeben wird – z.B. CK -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut steigt.

Enzyme - Eigenschaften • Einige Enzyme kommen als Isoenzyme vor – das heißt, dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor – z.B. Lactatdehydrogenase oder LDH, die als Tetramer in 5 verschiedenen Isoformen vorkommt. • Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das Herkunftsorgan herauszubekommen. • LDH-1 kommt überwiegend im Herzmuskel und Erythrozyten, LDH-5 dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor. • Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2 (LDH-3), HM3 (LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz; M=Muskel)

Serumenzyme – Diagnostisches Nützen • Das Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgänge im Körper widerspiegeln. Nicht nur die Geschwindigkeit des Anoder Absteigens eines Enzyms, sondern das Verhältnis von Enzymen zueinander, gibt zusätzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer Therapie. • Es gibt verschiedene Komponente der Enzymkinetik, die separat betrachtet werden müssen, um ein diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren.

Enzyme – Messung der Aktivität • Die Internationale Union für Biochemie (IUB) hat schon 1961 Empfehlungen für die optimierte Bestimmung von Enzymaktivitäten erarbeitet. • Die Bedingungen für diese optimierten Methoden sind: • Optimaler pH-Wert • Definierte Temperatur d.h. 37 °C • Optimale Substratkonzentration • Optimale Coenzymkonzentration • Optimale Konzentration an Aktivatoren

Enzyme – Messung der Aktivität

• Enzymaktivität wird in Einheiten/l (U/l) angegeben. • 1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivität, die pro Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1 µmol Substrat katalysiert. (Dies wird für Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen). • Die Messtemperatur ist 37 °C (definierte und validierte Referenzbereiche sind oft nur für 25 °C vorhanden!)

Enzyme - Nomenklatur • Die Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im „Enzyme Nomenclature“ [1972] sowie dem „Enzyme Handbook“ und seinen „Supplements“ (Springer-Verlag). • Die EC-Nummer hat 4 Komponente: • Stelle 1 definiert die Funktion – z.B. 1 = Oxidoreduktasen • Stelle 2 definiert die Donorgruppe – z.B. 1 = CH-OH • Stelle 3 definiert die Akzeptorgruppe – z.B. 1 = NAD(P) • Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe. • Beispiel: EC 1.1.1.71 = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase • Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)

Enzyme - Nomenklatur • Die Hauptgruppen von Enzymen sind: • 1.x.x.x – Oxidoreduktasen (z.B. GLDH: EC 1.4.1.3, LDH: EC 1.1.1.27) • 2.x.x.x – Transferasen (z.B. Gamma-GT: EC 2.3.2.2, ASAT/GOT: EC 2.6.1.1, ALAT/GPT: EC 2.6.1.2) • 3.x.x.x – Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase: EC 3.1.3.1, α-Amylase: EC 3.2.1.1, Lipase EC 3.1.1.3) • 4.x.x.x – Lyasen (z.B. Adenylatcyclase: EC 4.6.1.1) • 5.x.x.x – Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat Isomerase: EC 5.3.1.9) • 6.x.x.x – Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoffcarboxylase: EC 6.3.4.6)

Enzyme – Messung der Aktivität • In klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles automatisch geregelt. Die Temperierung der Messzelle findet automatisch statt. Das Gleiche gilt für das Pipettieren der Reagenzien, eventuelle Verdünnungen und Umrechnung der Ergebnisse. • Es gibt verschiedene Messmöglichkeiten: kontinuierliche Verfahren (Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt Messung) oder Endpunktverfahren.

Enzyme – Berechnung der Aktivität Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten -  • Die Konzentration der zumessenden Substanz in der Probe errechnet sich nach der Gleichung: • c = (ΔE / [ µmol * d]) • c = Konzentration der Substanz • ΔE = Extinktionsdifferenz zwischen Analysen- und Leerwert bzw. Extinktionsdifferenz durch Verbrauch oder Bildung von NAD(P)H • d = Schichtdicke der Kuvette in cm •  µmol = spezifischer mikromolare Extinktionskoeffizient

Enzyme – Berechnung der Aktivität • Die Enzymaktivität entspricht der Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt während der Messzeit (t). Meist wird bei einer Enzymaktivitätsbestimmung aus mehreren Messungen das durchschnittliche ΔΕ/Minute ermittelt. Von diesen Beobachtungen haben wir: • Volumenaktivität = Δc / t = ΔE / (t*  µmol *d) µmol/min * ml Messlösung • Δc = Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt • t = Messzeit in Minuten

Enzyme – Berechnung der Aktivität • Ein Substratumsatz von 1 µmol/min = 1U. Analog zur Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das Volumen der Messlösung und das Probenvolumen zu berücksichtigen. • Volumenaktivität = ΔE * V/ (t*  µmol *d * v) U/ml • V = Volumen der Messlösung • v = Volumen, das in dem Test eingesetzten Probe • Da man Ergebnisse meistens in U/l angibt, muss man mal mit dem Faktor 1000 multiplizieren. • Wird verdünntes Material eingesetzt, muss dies auch berücksichtigt werden.

Serumenzyme - Herkunft • Sekretionsenzyme – Cholinesterasen • Reaktion: Acylcholin + H2O  Cholin + R.COOH • Es gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre Acetyl(thio)cholinesterase (AChE) (2 Typen bekannt) und die Pseudocholinesterasen (CHE) (Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere Acylcholine sowie Thiocholine spalten. • Die Bestimmung von AChE hat – im Gegensatz zur CHE– so gut wie keine klinische Bedeutung. Die CHE biologische Halbwertzeit im Serum beträgt ca. 10 Tage.

Cholinesterase – diagnostisches Nutzen • Aktivitätsänderungen bei der Cholinesterase: • Erhöhung bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frühform der alkoholischen Leberschädigung), funktionelle Hyperbilirubinämie, Hypertriglyceridämie, Adipositas, Diabetes mellitus. • Erniedrigung bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin, Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6 Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikämie, Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva, Malignome, Anämien)

Weitere Serumenzyme – Beispiele und diagnostische Anwendung in der Gerinnung • Andere Enzyme mit Aktivität im Plasma sind die, die mit der Blutgerinnung zu tun haben. Hierzu gehören u.a. Urokinase, Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) und Thrombin sowie die überwiegende Zahl der Gerinnungsfaktoren, die je in einer inaktiven Form vorliegen, die während des Gerinnungsprozesses stufenweise aktiviert werden. • Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern ihre biologische Aktivität im Form von „globalen“ Tests, wie der Quick-Wert [auch Thromboplastinzeit, TPZ oder Prothrombinzeit genannt]. Hier werden eine Verminderung der Faktoren II, V, VII, X sowie Vitamin-K und Fibrinogen erfasst. Der Quick-Wert wird u.a. zur Kontrolle einer Cumarin-Derivat Antikoagulantientherapie angewendet. Die Werte werden normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben (Normal: 70-130%).

Serumenzyme – als Globalteste in der Gerinnung • Andere Globalteste (mit ähnlichen Abkürzungen!) sind: • Partielle Thromboplastinzeit [PTT] und aktivierte partielle Thromboplastinzeit [aPTT] – Prüft die Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I). Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMWKininogen durch den Zusatz von Oberflächenaktivatoren, wie Kaolin. • Plasma Thrombinzeit [PTZ] – Die PTZ wird eingesetzt, um ein Fibrinogenmangel zu prüfen.

Enzyme – Messung der Aktivität Kinetisch-Optischer Test - IFCC Methode • Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Serum. • Reaktion: Lactat + NAD+  Pyruvat + NADH + H+ • Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das Entstehen des Coenzyms NADH bei 339 nm im Spektralphotometer. • Als Substrat dient Lactat. • Im Prinzip kann man die Reaktion in die entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im Überschuss haben und einen anderen pHWert einstellen. • NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form • NADH – NAD reduzierte Form

Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion • Die Bestimmung des ASAT (GOT) im Serum • ASAT – Aspartat-Amino-Transferase • GOT – Glutamat-Oxalacetat-Transaminase • • • •

Reaktion: Enzym ASAT/GOT L-Aspartat + α-Oxoglutarat  L-Glutamat + Oxalacetat Indikatorreaktion: Enzym/Malatdehydrogenase Oxalacetat + NADH + H+  Malat – NAD+

• Messprinzip – Abnahme der Extinktion bei 334 nm (Oxydation des NADH)

Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfsund Indikatorreaktion • Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum: • • • • • •

Reaktion: Enzym Creatinkinase Creatinphosphat + ADP  Creatin + ATP Hilfsreaktion: Enzym Hexokinase ATP + D-Glucose  ADP + D-Glucose-6-Phosphat Indikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenase G-6-P + NADP+  6-Phosphogluconat + NADPH + H+

• Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm (Reduktion des NADP zu NADPH)

IFCC Methode – Creatin Kinase • • • • • • • • •

Messbedingungen für die CK Temperatur: 37,0 °C ± 0,1 °C Wellenlänge: 339 nm ± 1 nm Bandbreite:  2 nm Lichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm ± 0,01 mm Inkubationszeit: 180 s Verzögerungszeit: 120 s Messinterval: 120 s Anzahl der Messpunkte: mindestens 6

Enzyme – Messung der Aktivität Verfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren Lichtes • Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum: • Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP)  pNP + PO4 • pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10 • Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH 9,8 unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm) • Kontinuierliche (kinetische) Messung • Als Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 benötigt • EDTA- bzw. Citratplasma können, wegen ihrer komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden.

Enzyme - Diagnostik • GPT / ALAT • Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt • GPT ist überwiegend im Zytoplasma der Leberparenchymzellen zu finden. • Wichtigster Leberzellnekroseparameter • in kleinen Mengen auch in der Niere, Herz- und Skelettmuskulatur • Störungen – Stark lipämische Seren können nicht analysiert werden. • Referenzbereiche: (37 °C) – m: