FcgRIIB a

Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt AG Nimmerjahn

Fc Rezeptoren (FcR)  Rezeptoren für Immunglobuline  Expression auf Immunzellen  Binden konstante Domäne der schweren Kette von Antikörpern  Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems

FcR Arten 

Für jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren



Fc Rezeptor für • • • • •

IgA  Fc a R IgG  Fc g R IgE  Fc e R IgM  Fc m R IgD  Fc d R



Maus  4 Gene für • • • •



FcgRI FcgRII FcgRIII FcgRIV

Mensch  8 Gene für • • •

FcgRI (A, B, C) FcgRII (A, B, C) FcgRIII (A, B)

Fc g Rezeptoren  Größte und am häufigsten vorkommende Gruppe von FcR  verschiedene Spezifität, Affinität, Struktur, Expression und biochem. Funktion

FcgRI

FcgRIIB

FcgRIII

FcgRIV

g2 a

g2 a

Mouse ITAM

g2 a

high affinity FcgRI

ITIM

a

low/medium affinity FcgRIIB

FcgRIIA

hFcgRIIIA

Human ITAM

g2 a

ITIM

a

a

g2 a

FcgR  Aktivierende FcgR • FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII

 Inhibierende FcgR • FcgRIIB

 werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert • Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen

 Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und inhibitorischen Signalweg  Schwellenwert für Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Stärke der Immunantwort bestimmt  Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert • Degranulation, Phagozytose, Antigen-Präsentation, antibodydependend cellular cytotoxity (ADCC)

Signalleitung FcgRI  Aktivierende FcgR benötigen für Signalleitung assozierte Adaptermoleküle ITAM  Adaptormolekül ist vom Zelltyp abhängig g2 a  Am häufigsten ‚common g chain‘  Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)

 Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) FcgRIIB  Braucht kein Adaptormolekül ITIM

a

Signalleitung aktivierender FcgR      

downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK)

cell activation -ADCC -Phagocytosis -Cytokine release -Oxidative burst

Src-family Kinase phosphoryliert ITAM SH2 Bindedomäne entsteht Syk bindet Signalkaskade wird eingeleitet Ras/Raf/MAP Kinase pathway wird aktiviert Kalzium abhängige Signalwege aktiviert

Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR 

 

Co-Ligation beider FcgR führt zu Phosphorylierung des ITIM vom FcgRIIB SHIP bindet an entstandene SH-2 Dömäne Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-γ)

Inhibitorischer FcgRIIB (CD32)  Größe: 40 kDa  Aufbau: • 2 extrazelluläre Domänen • 1 Transmembranregion • 1 cytoplasmatischer Schwanz

FcgRIIB ITIM

a

 geringe Affinität für monomeres IgG  hohe Avidität für Immunkomplexe  Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)  2 Isoformen • IIB-1 Signalwirkung • IIB-2  Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch

 Einziger FcR auf B-Zellen

FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen 

Co-Ligation mit: • Sich selbst  führt zu Apoptose • BCR  Verminderung des BCR Aktivierungssignal  anti-apoptotisches Signal    

Co-Ligation mit BCR führt zur Aktivierung der Kinase Lyn Lyn phosphoryliert ITIM des FcgRIIB Initiation des Signalwegs (SHIP) Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-g)

FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt  FcgRIIB setzt Schwellenwert für Aktivierung von B-Zellen  Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation  mögliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz  mögliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen

 FcgRIIB wichtig für B-Zell Toleranz  Untersuchung von Toleranz: Autoimmunanfällige Mausstämme (NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr) entwickeln spontan Autoimmunität (z.B. SLE)

FcgRIIB und Toleranz  Bolland und Ravetch 2000  Fcgr2b -/- Mäuse (Balb/C und C57.B6)

 Balb/C • Wie WT

 B6 • Erhöhte Sterberate • Entzündungen in Vielzahl von Organen • Erhöhter Proteingehalt im Urin • Glomerulonephritis • Nierenversagen

 genetischer Hintergrund ist sehr wichtig

Test auf anti-nucleäre AK   

Immunfluoreszenzfärbung von Hep-2 Zellen Inkubation mit Serum der Mäuse Detektion von gebundenem IgG mit FITC-anti-mouse IgG

 ELISA IgG AK gegen: • dsDNA • dsDNA mit Histon 1 • dsDNA mit Histon 2A und 2B

 Toleranzverlust in FcgRIIB-/-

Bolland und Ravetch 2000

Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB  McGaha et al. 2007  Retroviraler Vektor für Expression von FcgRIIB

Gewinnung von KM-Zellen aus autoimmunanfälligen und FcgRIIb-/- Mäusen

Fcgr2b

Kontrollvektor

Transduktion mit retroviralem Vektor

Rekonstitution bestrahlter Mäuse mit autologem tranduziertem KM FcgRIIB

Mock

Untersuchung der Mäuse Überlebensrate NZM2410

Indirekter Immunofluoreszenzassay ANA Reaktivität gegen fixierte HepG2 Zellen

Fcgr2b

Mock

ELISA

 Verbessertes Überleben  Weniger Auto-AK

McGaha et al.

Schlussfolgerung

 FcgRIIB ist wichtig für den Erhalt der Toleranz  Bei Fehlen des Rezeptors entsteht • IgG anti-DNA AK  Verlust von Toleranz

 Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB Levels  Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz

Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung

Wo genau reguliert er?

Keimzentrum (germinal center)  Induzierbare lymphoide Mikroumgebung  Entstehen durch Antwort auf T-abhängige Antigene  Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die Lymphorgane  AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculären dendritischen Zellen (FDC) präsentiert  Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region des BCR in GC-B-Zellen  Selektion von hoch affinen B Zell Varianten  Formation von Memory B Zellen

Keimzentrum  Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinität  muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig affinen B-Zellen unterscheiden  Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt stimuliert  Aufnahme von AG und Präsentation für Th Lymphozyten  Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR  Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion durch IC Interaktion

 FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen eliminieren

Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999

 Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen

Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen Facs Milzzellen

2.4G2  FcgRIIB K9.361 FcgRIIB B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen B220+IgD-GL7+  GC B-Zellen

Immunisiert mit NP-CGG Histologie 9 Tage nach Immun.

Histologie Milz

2.4G2  FcgRIIB GL7  GC

Chimäre Mäuse

• Bestrahlte IIB -/- Mäuse • Rekonstitution mit KM von IIB+/+ Mäusen  Färbung des IIB Rezeptors im GC nur bei B-Zellen

 FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen  reduzierter Schwellenwert für B-Zell Aktivierung

Rao et al. 2002

Verminderte FcgRIIB Expression in GC B-Zellen von autoimmunanfälligen Mäusen  

Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten Tieren Autoimmunanfällig (SLE) • •



NZB (NZB x NZW)F1

Nicht-anfällig •

NZW

 geringere Expression von FcgRIIB auf GC-B-Zellen in allen Mäusen  In autoimmunanfälligen Mäusen ist FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen geringer als bei nicht anfälligen Mäusen

Jiang et al. 1999

Zusammenfassung Rao et al./Jiang

 Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert  FcgRIIB Expression in Autoimmunanfällige Mausstämme noch geringer

Wirkmechanismus von FcgRIIB?

 Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinitätsreifung?  Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC?  Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?

Modellsystem 3H9 Maus  Transgenes knock-in Modell für Anti-DNA exprimierende B-Zellen  Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt • Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus • Insertion im Igh Locus (IgMa Allel)

 Editierung der leichten Kette ist wichtig für den Erhalt von Toleranz  Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen autoreaktive AK  Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfügung weiterer Argininreste  DNA Bindung von AK meist über Arg-Reste • 3H9/56R  ein Arg Rest • 3H9/56R/76R  zwei Arg Reste

Modellsystem 3H9 Maus

Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivität der produzierten AK (je basischer  höhere Autoreaktivität)

Fukuyama et al. 2004

 Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Mäusen mit und ohne Fcgr2b Expression • Balb/C und C57.B6

 Untersuchung der Toleranzerhaltung

Spezifität des genetischen Hintergrundes  Balb/C Hintergrund: • Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R Allel wurde Toleranz in Balb/C Mäusen erhalten

 C57.B6 Hintergrund: • Höhere IgM und IgG Produktion bei 56R

ELISA IgM

Anti-DNA

IgG

Serum

C57.B6: 12 Wochen alt

Fukuyama et al.

Mechanismus zum Erhalt der Toleranz  Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstämmen • Vκ21D  Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunität der schweren Kette unterdrückt • Vκ38c  weniger effizient

Veränderte Benutzung von leichten Ketten in den Mausstämmen Unabhängig von FcgRIIB

Fukuyama et al.

FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion ELISA

Serum

 Fcgr2b Defizienz erhöht Anzahl von IgG anti-DNA

IgG

Anti-DNA

IgM

 durch erhöhtes Auftreten von IgG produzierenden Plasmazellen/Plasmablasten

Splenocyten Fukuyama et al.

IgG anti-DNA ist pathologisch Histologie der Niere 

C57.B6 Fcgr2b-/- entwickeln nach 6 Mo. starke Glomerulonephritis



Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche Pathologie wie pos. Kontrolle (Fcgr2b -/-) • • •

Glomerulonephritis Immun-Komplex Ablagerung Komplement C3 Ablagerung

Nach 9 Mo.

Fukuyama et al.

Zusammenfassung Fukuyama et al.  „Editing“ ist der primäre zentrale Mechanismus um autoreaktive B-Zellen in unschädliche B-Zellen umzuwandeln • Nutzung verschiedener leichter Ketten in unterschiedlichen Mausstämmen

 FcgRIIB Defizienz führt zu Produktion von IgG produzierenden Plasmablasten  negatives Feedback-Signal ist gestört Proliferation autoreaktiver Plasmazellen

Paul et al. 2007  Rolle von FcgRIIB in der peripheren B-Zell Toleranz  Prinzip: follicular exclusion • Ansammlung von autoreaktiven B-Zellen an der T-B Grenze von Milzfollikeln

 Hypothese: folliculare exclusion ist abhängig von normalem FcgRIIB signalling  Versuchsprinzip: 3H9 Mäuse defizient in FcgRIIB  wenn FcgRIIB an peripherer Toleranz und follicular exclusion beteiligt ist, sollte in 3H9FcgRIIB-/- Tieren ein Verlust der folliculärer Exclusion auftreten

Erhöhte Anzahl autoreaktiver B-Zellen in FcgRIIb -/Milz

Bei Paarung von 3H9 mit λ1 leichter Kette entsteht autoreaktiver AK  λ1 B-Zellen exprimieren transgenen IgMa Allotypen  FcgRIIb-/- Mäuse haben erhöhte Frequenz von λ1 B-Zellen  autoreaktive AK für weitere Nachweise 

Paul et al.

Verlust der follicular exclusion bei FcgRIIb Defizienz  Histologische Untersuchung der Milz

λ1 B Zellen B-Zell Zone T-Zell Zone

• 3H9FcgRIIB+/+B6 Mäuse: λ1 B Zellen an T-B Grenze von Milzfollikeln • 3H9FcgRIIB-/-B6 Mäuse: λ1 B Zellen in gesamten Follikel verteilt

• Stärkere Keimzentrumsaktivität in FcgRIIB-/- Mäusen • λ1 B-Zellen im Keimzentrum 100-fach

600-fach Paul et al.

Erhöhte Anzahl von Plasmazellen in 3H9RIIB-/- Tieren FACS

Milz B220: B-Zell Marker CD138: Marker für Plasmazellen

 ELISPOT





Kein Unterschied bei IgM antiDNA produzierenden B-Zellen 8x höhere Anzahl an IgG anti-DNA produzierenden B-Zellen in 3H9RIIB-/- Tieren Klassenwechsel der autoreaktiven B-Zellen hat stattgefunden

Anti-DNA Paul et al.

Erhöhte Anzahl von anti-DNA-AK im Serum Serum Anti-DNA

 3H9FcgRIIB-/- Mäuse: • Höhere Anzahl an IgG und IgM anti-DNA AK

 Alle Beobachtungen waren Altersabhängig: • Junge 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (2 Monate alt) zeigten WT verhalten • Alte 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (9 Monate) zeigte IgG Anti-DNA

Paul et al.

Zusammenfassung Ergebnisse (Paul et al.)

 FcgRIIB ist notwendig um Zellen aus Keimzentrum auszuschließen  Klassenwechsel zu IgG wird dadurch verhindert Keine Plasmazellentwicklung von autoreaktiven B-Zellen

Zusammenfassung: Bedeutung von FcgRIIB  FcgRIIB hat wichtige Funktion in der peripheren Toleranz

 Ist innerhalb und außerhalb des Keimzentrums unterschiedlich exprimiert (Rao et al.)  In autoimmunanfälligen Mäusen im Keimzentrum noch schwächer exprimiert (Jiang et al.)  Reguliert Anzahl IgG produzierender Plasmazellen/-blasten  Verhindert das Einwandern autoreaktiver B-Zellen in die Milzfollikel (Paul et al.)

Unser Projekt

 Untersuchung der Funktion von humanem FcgRIIB bei der Toleranzerhaltung

FcgRIIB und Toleranz beim Menschen  systemischer Lupus Erythematodes (SLE) • hohe Anzahl von autoreaktiven IgG Antikörpern

 Allele Varianten von FcgRIIB • Ile232Thr  Assoziation in verschiedenen Asiatischen Bevölkerungen  keine Assoziation in Europäern

 Promoter Polymorphismus • in Europäern

 Verminderte Expression in memory B-Zellen • in SLE Patienten in der Afrikanisch-Amerikanischen Bevölkerung

 Hohe Heterogenität im Menschen  Genetischer Hintergrund ist sehr wichtig

 Mensch vs. Maus • FcgR von Maus und Mensch unterschiedlich • Bisher nur epidemiologische Assoziationen beim Menschen

 Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt  humanisierte Maus  Sind Ergebnisse aus Mausstudien auch für das menschliche Immunsystem gültig?

Versuchsaufbau Vorbereitung der hHSC: Promoter

GFP Reporter Gen

miRNA

n

Isolation

hHSC

Transduktion mit lentivirus kodierter miRNA

Vorbereitung der Mäuse: Bestrahlung

Neugeborenen Rag2-/NOD/SCID

Rekonstitution mit hHSC

Mäuse entwickeln menschliches Immunsystem

Untersuchung des Immunstatus  Gesundheitszustand • Überleben • Vitalität

 Veränderte B-Zell Antwort • • • • • •

Schwellenwert Antikörper-Affinität Veränderter Klassenwechsel anti-DNA AK antinucleäre AK anti-Chromatin AK

 Untersuchung des Auftretens von SLE • Entwicklung von Glomerulonephritis • Nierenfunktion • Proteingehalt im Urin • histologische Untersuchung der Leber

Derzeitige Arbeit  Klonierung von Fc g Rezeptoren (inhibitorisch and aktivierend), CD22 und CD72  Stabile Transfektion von CHO Zellen mir diesen Plasmiden  Zelllinien exprimieren diese Rezeptoren  Klonierung von miRNA/shRNA  Stabile Transfektion von CHO Zelllinien und primären B-Zellen FcgRIIB, CD22, CD72

Effektivitätstest der miRNA/shRNA (positive Kontrolle)

Aktivierende FcgR

miRNA/shRNA sollten keinen Einfluss auf diese haben (negative Kontrolle)

Vielen Dank für die Aufmerksamkeit