Introduction

TP surrenalectomie [Tapez le sous-titre du document] [Tapez le résumé du document ici. Il s'agit généralement d'une courte synthèse du document. Tapez le résumé du document ici. Il s'agit généralement d'une courte synthèse du document.] Simonnet Jean Chateigner Aurélien

Introduction Les glandes surrénales, situées dans la partie postérieure des reins, sont des glandes endocrines impliquées dans différents phénomènes. Anatomiquement, on distingue deux parties qui correspondent en fait à deux glandes distinctes. La partie extérieure constitue la corticosurrénale et la partie intérieure est la médullosurrénale. Ces deux parties sécrètent des hormones différentes, d’une part des stéroïdes, et d’autre part des catécholamines. On va donc tenter de déterminer le rôle des sécrétions de cette glande sur l’organisme, en déterminant les conséquences de l’ablation de ces glandes, chez la souris, sur des paramètres biologiques et métaboliques (métabolisme glucidique). On corrèlera les résultats, relatifs à la variation de poids des souris et à l’activité du métabolisme glucidique, avec l’action des différentes hormones sécrétées par la surrénale pour déterminer les molécules impliquées dans les variations observées. On expliquera les effets cellulaires et moléculaires sur les tissus cibles.

Matériel et méthode On va créer 3 lots de souris : les surrénalectomisées, les « opérées à blanc » ou « Sham » et les souris témoins. Les surrénalectomisées (S) sont les souris « test », et on va comparer les résultats obtenus pour ce lot avec les souris Témoins (T), qui ne sont pas opérées du tout, et avec les Sham (Sh), qui subissent les mêmes opérations chirurgicales, à la différence que les surrénales ne sont pas retirées. L’utilisation de ce dernier lot de souris permet de montrer les conséquences d’un simple geste invasif similaire à l’opération effectuée sur les souris S, pour reproduire ce que l’on appelle communément le stress de l’opération : on élimine des variables pour la comparaison des lots. Le rôle des sécrétions de la surrénale pourra être en partie apprécié de cette façon (on ne testera pas tout les paramètres physiologiques sur lesquels ces sécrétions jouent un rôle).

Manipulations pré-opératoires Avant l’opération (pour les animaux opérés ou non), il faut peser l’animal, pour être capable d’observer la variation de poids 15 jours après l’opération. La pesée se fait simplement, en déposant la souris dans une boite posée sur une balance tarée (balance adaptée à ce type de mesure, car l’animal bougeant sans cesse, une balance « normale » ne pourrait pas se stabiliser à une valeur précise). L’animal passant alors son temps à renifler la boite, sa pesée se fait facilement.

Opération Cette opération, assez délicate à effectuer car les reins sont des organes essentiels au bon fonctionnement de l’organisme et qui ne doivent pas être lésés lors de la manipulation, s’effectue sous anesthésie générale de la souris à l’isoflurane. Le but de cette anesthésie est d’abaisser la conscience de l’animal, d’arrêter la douleur (effet antalgique) et d’entrainer une myorelaxation. En effet, ceci est essentiel pour un bon déroulement de l’opération (l’animal ne bouge pas et ne souffre pas). De plus, la myorelaxation apporte du confort à l’expérimentateur. On utilise un anesthésique gazeux, administré grâce à un compresseur et une série de tuyaux : l’isoflurane. C’est un gaz halogéné, qui permet une induction anesthésique rapide : on place la souris dans une chambre d’anesthésie où le gaz est apporté. Une fois la narcose induite, on transfère l’animal sur une plaque d’opération comportant une arrivée de gaz s’apparentant à un masque, adapté à la souris. L’anesthésie est donc maintenue grâce à ce système, durant toute l’opération (le système employé permet une récupération du gaz, de ce fait l’expérimentateur n’est pas exposé).

L’anesthésique utilisé permet un réveil rapide de l’animal. Au bout d’environ 30 minutes, il est possible de juger si l’animal est rétabli ou non. S’il souffre, l’euthanasie est inévitable. Le dosage d’isoflurane employé permet de préserver les centres nerveux végétatifs, nécessaires à la survie de l’animal, notamment une préservation des centres de la respiration. Précautions à prendre lors des manipulations : Les expériences pratiquées sont des expériences avec réveil, et donc les manipulations ne se font pas dans les mêmes conditions qu’en cas d’euthanasie en fin d’opération. Il faut ici respecter des consignes d’hygiène plus strictes, bien désinfecter les zones à risque, et utiliser une poudre antiseptique avant de refermer. Toutes ces consignes sont à suivre dans le but du réveil de l’animal, et d’éviter toute complication. De même, par exemple, il vaut mieux couper la peau de façon nette, de sorte qu’il est plus facile de suturer en fin d’opération. Déroulement de l’opération : On doit donc retirer les surrénales aux souris, après avoir réalisé une ouverture du plan musculaire juste en dessous des côtes, dans la partie dorsale (droite ou gauche). Les côtes sont un très bon repère, et une incision au bon endroit donne directement accès aux glandes, qui sont d’une coloration légèrement plus rouge que la graisse les entourant. On doit prendre des précautions pour ne pas léser les reins lors de l’opération, car ceux-ci dont très fragiles, et une manipulation non précautionneuse entrainerait un disfonctionnement des reins, qui n’assureraient plus leur rôle de nettoyage du sang, ce qui entrainerait la mort de l’animal. Pour les shams, on effectue les mêmes gestes, sans retirer les surrénales.

Mesure Quinze jours après l’opération, on réalise des prélèvements qui vont nous permettre d’apprécier les conséquences de la surrénalectomie. On réalise les mesures pour les souris opérées, les shams et les témoins. On commence par peser l’animal, on observera la variation de poids causée par cette opération. On réalise ensuite une perfusion intracardiaque de sang (méthode la plus rapide pour un prélèvement sanguin de cet importance sur la souris, mais pas des plus évidentes, réalisée par le professeur), sur la souris anesthésiée à l’isoflurane, qui nous permettra de mesurer la glycémie. Directement après avoir prélevé, on dilue au 10ème l’échantillon sanguin, pour éviter toute coagulation ou hémolyse. Pour ce faire, on prélève 100µL de sang que l’on place dans 900µl de sérum physiologique. On centrifuge ensuite (3000 t/min à 15°C pendant 5min) pour récupérer un surnageant de plasma sanguin (ici c’est du plasma et non du sérum car c’est du sang non coagulé) dilué 10 fois. C’est dans ce surnageant que le glucose sanguin est présent. On lit l’absorbance à 505nm. On réalise des solutions de glucose à diverses concentrations, entre 1 et 0 g/L, puis on fait réagir le Trinder, dans les mêmes conditions que précédemment. On mesure ensuite l’absorbance de chaque solution à 505nm. On réalise donc une courbe de l’absorbance en fonction de la concentration en glucose (courbe étalon). On pourra ainsi déterminer la glycémie. On prélève le foie après sacrifice de la souris. On place une certaine quantité de celui-ci dans de l’acide perchlorique (HClO4), à raison de 5µl par mg. On prend environ 500mg de foie dans un souci d’économie de solution. La solution est ensuite passée au sonicateur, pour broyer les tissus. L’action de l’acide perchlorique ainsi que la sonication vont permettre une libération des contenus cellulaires. notament le glucose, le glycogène et les protéines. On dilue par moitié cette solution avec du tampon

acétate pour rétablir un pH plus ou moins neutre, pour permettre ensuite les différents dosages (réactions doivent se faire à un pH particulier). Pour le dosage du glucose hépatique, on prend de l’homogénat dans un tube Eppendorf que l’on centrifuge. On récupère le surnageant pour doser le glucose. On utilise la même méthode de dosage que pour la glycémie. Pour le glycogène hépatique, on réalise un protocole relativement similaire, qui diffère juste par la digestion par l’amyloglucosidase. L’action de cette enzyme va permettre une dégradation du glycogène en glucose. On pourra ensuite doser le glucose total présent (toujours en utilisant la même méthode), dans la solution, qui correspond alors au glycogène dégradé en glucose et au glucose déjà présent dans la cellule. On aura ensuite seulement à soustraire à cette valeur, le taux de glucose hépatique. On réalise ensuite un dosage des protéines par la méthode utilisant le réactif de Bradford (lecture d’absorbance à 595 nm), et on pourra alors ramener les valeurs des précédents dosages par rapport au taux de protéines. Ceci permet de pouvoir comparer les résultats entre eux par la suite, car le taux de protéine évalue la quantité de tissu et de cellules.

Résultats Nous avons exclu beaucoup de résultats de notre étude, et de par leur nombre important, nous nous devons de donner quelques explications. Pour 3 raisons diverses, on a clairement 3 types de résultats à exclure :   

Le taux de glucose hépatique est faiblement inférieur au taux de glycogène hépatique : c’est le cas pour le Témoin 1, les Sham 2 et 5 et les surrénalectomisés 3, 6 et 7. Le taux de glucose hépatique est égal au taux de glycogène hépatique : c’est le cas du Sham 4 et du surrénalectomisé 4. Le taux de glucose hépatique est supérieur au taux de glycogène hépatique : c’est le cas du Sham 3 et du surrénalectomisé 5.

Chez les témoins dont on conserve les résultats (témoins 2 et 3), on trouve un rapport glycogène intracellulaire/glucose intracellulaire moyen de 10 pour les cellules hépatiques. Cela s’explique par le fait que la souris a normalement des réserves de glycogène dans les cellules de son foie, qui servent à pallier à un manque ; ainsi, le taux de glucose présent dans la cellule, et qui va sortir ou être stocké, est nécessairement largement inférieur. Ce rapport n’est pas respecté pour un bon nombre de souris, d’où leur exclusion. Tous ces cas sont dus à une erreur principale lors des manipulations : dans l’un des groupes d’expérimentateurs, on a utilisé deux fois la même solution, et non une fois celle de glucose et une fois celle de glycogène dégradé. C’est pour cette raison que l’on n’obtient pas de différence significative pour certains résultats.

Témoin 2 Témoin 3 Moyenne Sham 1 Sham 6 Moyenne Surrénalectomisé 1 Surrénalectomisé 2 Moyenne

Glycémie Glucose hépatique Glycogène hépatique Poids avant Poids après 1,25 133 1050 28,4 26,7 1,25 92 1105 26,6 21,5 1,25 112,5 1077,5 27,5 24,1 0,85 60 820 35,6 33,7 1,28 263 1879 24,6 25,8 1,065 161,5 1349,5 30,1 29,75 0,85 19 88 28,2 22,3 0,85 39 190 29,5 22,7 0,85 29 139 28,85 22,5

Synthèse des résultats Globalement, on observe donc une très nette diminution du glycogène et du glucose hépatique, une glycémie qui ne varie pas significativement. On observe également une perte de poids relativement importante pour les surrénalectomisées mais pas pour les shams et les témoins

Discussion Notons tout d’abord que la perte de poids observée chez les souris opérées est bien due à l’ablation des surrénales car les shams ne voient pas leur poids varier significativement, ce qui montre bien que ce n’est pas le stress opératoire qui cause la variation de poids. Les variations de glucose et de glycogène hépatique sont également significatives pour les mêmes raisons. Le retrait de la surrénale provoque une chute brutale de la concentration tous les composés qu’elle synthétise. La corticosurrénale comporte différentes couches qui sont chacune responsables de synthèses de différentes hormones stéroïdes. La zone appelée zone glomérulée sécrète les minéralocorticoïdes. La couche fasciculée et la zone réticulée sont elles responsables de la synthèse de glucocorticoïdes, et d’une partie des stéroïdes sexuels synthétisés par le corps (la plus grande partie étant synthétisée par les gonades).Toutes ces hormones dérivent bien entendu du cholestérol. Leur caractère hydrophobe fait que ces hormones agissent sur les tissus cibles via des récepteurs dit « cytosolique et/ou nucléaire », et vont alors moduler l’expression génique. La médullosurrénale est responsable de la synthèse de catécholamines, l’adrénaline (80% des hormones synthétisées) et de la Noradrénaline (20%). De ces deux hormones, l’adrénaline possède l’effet le plus marqué.

Comme on le voit sur le schéma ci-dessus, chez l’homme, on trouve du tissu corticosurrénalien ou médullosurrénalien à différents endroits (pas seulement au niveau de la surrénale). Notons que l’homme ne peut pas vivre sans surrénale, alors que la souris survie. On peut penser que la souris possède proportionnellement plus de tissu surrénalien « diffus » que l’homme, ce qui lui permet de survivre sans sa surrénale.

Effet des glucocorticoïdes Figure 1 : Molécule de cortisol : On reconnait le noyau de base du cholestérol, dont la chaine à 27 atomes de carbones est tronquée, en une chaine possédant 21 carbones, hydroxylée en C14, C17 et en C21.

Notons d’abord l’effet qu’engendrera le manque de glucocorticostéroïdes. On parlera du cortisol, qui est l’hormone de ce type majoritairement synthétisée. Bien que cette hormone joue essentiellement un rôle sur le métabolisme glucidique, comme son nom l’indique (et aussi lipidique). Elle se fixe, au niveau des cellules cibles sur des récepteur GR (Glucocorticoid réceptor). Ceux-ci sont associés sous forme d’hétérodimère (dans le cytoplasme ou le noyau, les recherches de ces dernières années remettent parfois en cause certaines considérations relatives à l’emplacement précis de ces récepteurs) avec des protéines de choc thermique, qui sont déplacées par fixation du cortisol, et permettent alors au complexe ligand-récepteur de s’activer en formant un complexe homodimérique (ligand-récepteur)2. Ce complexe va ensuite agir sur des séquences appelées GRE (Glucocorticoid Response Element) de l’ADN, et va permettre l’expression génique.

Figure 2 : Action de l’Hormone agissant sur son récepteur et jouant alors le rôle de facteur de transcription. On voit ici l'hormone stéroïde (H) qui se fixe sur son récepteur et déplace alors la protéine de choc thermique (Hsp90). Le complexe homodimérique (Hormone-Récepteur)² est ensuite transloqué dans le noyau où il agit sur des séquences HRE, au niveau des gène cibles, ce qui va induire la transcription de ceux-ci, ce qui abouti à la synthèse d’une protéine.

Figure 3 : Mise en évidence de réponse primaire et de réponse secondaire aux hormones. Le complexe active des gènes qui vont synthétiser des protéines (réponse primaire) qui vont ensuite aller activer ou réprimer d'autres gènes (réponse secondaire.

Grâce au cortisol, on aura une activation de la transcription de gènes codant pour des enzymes intervenant dans le métabolisme glucidique, ce qui va permettre un déplacement de l’équilibre de certaines réactions dans le sens voulu. Ici, les concentrations en cortisol n’étant plus aussi importantes, on aura un déplacement de l’équilibre moins important, voir un renversement. Le cortisol permet la synthèse d’enzymes nécessaires à la néoglucogenèse, synthèse de glucose à partir de composés non glucidiques (glycérol et acides aminés), et d’enzymes responsables de la synthèse de glycogènes. Les pools de ces enzymes sont donc plus importants en présence de cortisol. Il permet également un rôle plus périphérique, en permettant la synthèse d’enzymes impliquées dans la lipolyse, au niveau du tissu adipeux, et dans la protéolyse, au niveau des cellules musculaires. Ceci favorisera la néoglucogenèse hépatique : certains des métabolites engendrés au niveau de ces tissus, que sont des acides aminés et le glycérol, vont ensuite rejoindre le foie pour servir à la néoglucogenèse. Le cortisol vise donc à utiliser des stocks non glucidiques pour la synthèse d’énergie dans le but d’économiser le glucose, et permet également un stockage rapide du glucose dans le cas ou il viendrait à manquer. Ici la déplétion en cortisol engendre un taux faible des enzymes, dont il régule la synthèse, dans la cellule hépatique ainsi que dans les cellules adipeuses et musculaires, ce qui ralentit la branche du métabolisme dans laquelle l’enzyme est impliquée. Il ne faut pas oublier que cette régulation par le cortisol est un effet à long terme, et que les enzymes dont il permet la synthèse, ou les voies métaboliques qu’il favorise, subissent une régulation à court terme qui est notamment dirigée par l’insuline, l’adrénaline ou encore le glucagon. Cette régulation consiste en l’activation d’enzymes, déjà présentes à l’état latent dans la cellule. Lors, d’une hyperglycémie (juste après un repas par exemple), l’insuline est sécrétée par le pancréas et permet la régulation vers le bas de la glycémie et un stockage du glucose sous différentes formes. Elle va notamment permettre l’activation du pool de glycogène synthétase présent dans la cellule (notamment la cellule hépatique) et engendrer le stockage sous forme de glycogène. En l’absence de cortisol, le taux en cet enzyme étant très faible, la synthèse de glycogène se fera moins rapidement et on aura donc une synthèse plus faible, ce qui est montré par la concentration très faible en glycogène hépatique. Lors d’une hypoglycémie, le glucagon est sécrété et permet une régulation vers le haut de la glycémie, en activant le catabolisme des stocks énergétiques. Il va bien sûr permettre la glycogénolyse, libérant du glucose, et va activer la néoglucogenèse au niveau du foie, qui va redonner également du glucose. Le cortisol étant absent, certains des enzymes impliqués dans la néoglucogenèse présentent un taux moins important, ce qui va constituer un frein pour celle-ci, expliquant notamment le faible taux de glucose présent dans le foie. De plus, le glucagon active la lipolyse, mais dans notre cas, les enzymes nécessaires à cette réaction sont également présents à très faible taux, ce qui engendre alors une faible utilisation des stocks du tissu adipeux. Remarquons que le manque de glycérol engendré par la faible lipolyse, qui permet normalement la néoglucogenèse hépatique, ne peut pas être compensé par la protéolyse musculaire, qui, elle aussi, est inhibée par le manque de cortisol. Notons que l’insuline activant la lipolyse lors d’une hyperglycémie, on a donc un déséquilibre entre synthèse et dégradation de triglycéride, ce qui engendre une augmentation du stockage de graisse, ce qui est contredit par les résultats obtenus où l’on constate une baisse de poids significative.

Le cortisol possède également un rôle sur le maintient des volumes extracellulaires, du même type que celui des minéralocorticoïdes, mais moins marqué que ceux-ci. Cette des hormones telle que l’aldostérone n’est pas à négliger et pourrait même expliquer la perte de poids.

Effet des minéralocorticoïdes Figure 4 : Molécule d'aldostérone. Comme pour le cortisol, on reconnait la base du cholestérol, tronquée en une chaine à 21 carbones, hydroxylée en C14, C18 et C21.

Le plus important est l’aldostérone, qui joue sur l’équilibre hydrique de l’organisme. Cette hormone agit sur la diurèse, et permet sa réduction. Il agit sur le rein, plus exactement au niveau du tube contourné distal (TCD), où elle induit une réabsorption, dite facultative, des ions sodium (Na+), et donc de l’eau. Elle contrôle également les déperditions hydriques au niveau des cellules des glandes sudoripares, du colon ou encore des glandes salivaires. Partout, elle permet une rétention de l’eau. En son absence, il parait évident que les rétentions hydriques seront moins importantes, et que cette perte d’eau pourra provoquer une perte de poids. On expliquerait alors la perte de poids, induite par la surrénalectomie, par cette perte hydrique. Cependant, notons que les minéralocorticoïdes ne sont pas les seules hormones contrôlant l’équilibre hydrique de l’organisme ; on trouve également l’ADH, secrétée par l’hypophyse postérieure en cas d’hypotension qui permet une réabsorption de l’eau au niveau du TCD également. La perte d’eau engendrée par le manque de minéralocorticoïdes provoque une hypotension, qui doit normalement être rétablie par l’ADH. Cette hypothèse émise quant à la perte de poids due à une éventuelle perte hydrique est donc à relativiser, mais semble être la plus appropriée.

Effet des catécholamines L’adrénaline est sécrété par la médullosurrénale dans le cas d’une réponse de fuite ou d’attaque, quand l’animal doit réagir vite face à son environnement. Il est certain que les catécholamines agissent sur les différents métabolismes, en jouant un rôle à court terme similaire au glucagon en activant la lipolyse ou encore la glycogénolyse hépatique et musculaire, sollicitant les réserves énergétiques de l’organisme pour répondre plus efficacement (à cela s’ajoute la réponse du système nerveux sympathique). Celle-ci n’est normalement sécrétée qu’à des moments de stress, on ne peut donc pas imputer un des effets observé au manque d’adrénaline, car elle engendre une régulation à très court terme et très brève.