Konzepte der Immunologie für Naturwissenschaftler (MOLIM-S1)
SS 2007
Humorale Immunität (Antikörper – Methoden & Anwendungen)
Prof. Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie an der Medizinischen Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum Tel.: 09131-8535912 E-Mail:
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HUMORALE IMMUNITÄT SS 2005
Thema 2: Antikörper - Anwendungen • Ak/Ag-Reaktionen • Gewinnung spezifischer AK • Anwendungen – Diagnostik & Forschung • Anwendungen – Therapie
Prof. Dr. Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie an der Medizinischen Klinik III
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Antikörper sind bifunktional
VH CH1 VL CL CH2 CH3
•
Variable Region der H- und L-Kette definiert die Spezifität
•
Konstante Region der H-Kette bestimmt die biochemischen und biologischen Eigenschaften (Effektorfunktion)
3
Antikörper – Antigenreaktionen Hypervariable (HV) Regionen (oder CDRs) der H- und L-Kette bilden das Paratop
Epitop – Bindungsstelle im Ag Paratop – Bindungsstelle im AK
HV3 (CDR3)
HV1 (CDR1)
HV2 (CDR2)
Aus Janeway: Immunobiology 4
Wechselwirkungen
Wasserstoffbindungen
Brückenbildung zwischen Sauerstoff- oder Stickstoffatomen von Antigen und Antikörper (Ag-O - H - O-Ak oder Ag-N - H - N-Ak)
Elektrostatische Kräfte
entstehen, wenn sich positive und negative freie Ladungen auf Antigen und Antikörper gegenüber liegen
Van der Waals-Kräfte
resultieren aus der Interaktion zwischen Elektronenwolken (Dipole)
Hydrophobe Wechselwirkungen
basieren auf einer Verdrängung von WasserMolekülen durch apolare, hydrophobe Gruppen (aromatische Aminosäuren). Diese Bindungsart kann bis zu 50% der Bindungskräfte ausmachen.
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Nieder- und hochaffine Antikörper Anziehungskräfte wirken nur über sehr kleine Distanzen
Antigenbindungsstelle des Antikörpers
Antigenbindungsstelle des Antikörpers
Epitop des Antigens B Epitop des Antigens B
kD = 10-8 Mol-1
kD = 10-5 Mol-1
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Antigene – Definitionen und Struktur Antigen (Antikörper generierend) Jede Substanz, die an einen Antigenrezeptor bindet. Antigenrezeptoren sind Immunglobuline und T-Zellrezeptoren
B-Zell-Epitope Konformationsepitop
Lineares Epitop
NeoEpitop
Immunogen Substanz, die nach Injektion oder Infektion eine Antikörperantwort auslöst • Gut: Proteine und Kohlenhydrate • Schwach: DNA, Lipide, kurze Polypeptide • Negativ: Aminosäuren, Haptene
Hapten (Halbantigen) Kleines chemisch synthetisiertes Molekül, das an Rezeptor bindet, alleine aber keine Immunantwort auslöst. Immunogen nach Kopplung an Trägerprotein
Epitop bzw. immunogene Determinante Der Bereich eines Immunogens, der mit dem Antikörper interagiert (bei Proteinen: 6-8 Aminosäurereste)
Aus: Kuby, Immunology
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B-Zell-Antigene - Einteilung •
Nach Herkunft Natürlich (Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, bakt. Toxine, Zellen) Synthetisch (Haptene, Polypeptide)
•
Nach chemischen Gesichtspunkten
•
Proteine Kohlenhydrate Nukleinsäuren Konjugierte Proteine (Hapten-Protein) Polypeptide Lipide
Nach genetischer Beziehung zwischen Spender und Empfänger
Autoantigen Isoantigen Alloantigen Xenoantigen
-
aus dem zu immunisierenden Individuum aus einem genetisch identischen (syngenen) Spender (Inzuchtmäuse) aus einem nichtverwandeten Spender derselben Spezies (Bl6, Balb/c) aus einem Spender einer anderen Spezies 8
Vergleich von B-Zell- und T-Zellepitopen
TZR
Aus Janeway
MHC I
BZR
Antigenprozessierung und -präsentation
MHC II
Ag
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Affinität und Avidität AFFINITÄT • Maß für die Stärke der Wechselwirkung zwischen einer Ag-Bindungsstelle (Paratop) auf dem AK und einem Epitop auf dem Antigen • Gute Affinität: ka = 10-8 - 10-10 M-1 • Mittlere Affinität: ka = 10-5 - 10-7 M-1
AVIDITÄT • Maß für die Stärke, mit der ein bivalenter Antikörper an ein intaktes polyvalentes Antigen (z.B. Bakterien und Viren) bindet • Größer als Affinität
http://www-immuno.path.cam.ac.uk/~immuno/part1/ lec06/lec6_97.html
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Avidität (eine weitere Erklärung) “Natürliche Antigene, wie beispielsweise Viren oder Bakterien besitzen viele gleiche AntigenDeterminanten auf ihrer Oberfläche. Wenn ein multivalentes Antigen sich mit mehr als einer Fab-Region des Antikörpers verbindet, ist die entstehende Bindungsenergie beträchtlich grösser als die Summe der beteiligten Einzelbindungen, da sämtliche Ag-Ak Bindungen gleichzeitig aufgebrochen werden müssen, wenn Ag und Ak sich wieder trennen sollen. Falls eine Fab-Stelle loslässt, ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine andere FabRegion des Ak gerade gebunden ist, recht gross, was die Bindungsstärke mehr als nur verdoppelt. Die Kraft, die ein solcher multivalentes Ag mit einem multivalenten Ak bindet nennt man Avidität, sie ist, wie in der Abbildung dargestellt zwischen 103 und 107 mal stärker als die entsprechende Affinität. Unter physiologischen Bedingungen spielt die Avidität eine wichtigere Rolle, im Labor findet jedoch die Affinität häufiger Verwendung”. Quelle: leider verloren gegangen 11
Gewinnung spezifischer Antikörper Immunisierung von Labortieren mit Antigenen Polyklonale Antiseren Heterogenes Gemisch von Antikörper, die verschiedene Epitope auf dem Immunogen erkennen Immunisieren von Tieren mit Antigen in komplettem Freunds Adjuvans [besteht aus Mineralöl (→ Depotwirkung) und abgetöteten Tuberkelbazillen→(unspezifische Aktivierung von DZ u. MF)]
Immunisierungen (Boosts)
werden
mehrmals
wiederholt
Monoklonale Antikörper homogener Antikörper, der nur ein Epitop auf dem Immunogen erkennt Immunisierung von Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen oder (Mensch) Generierung von Hybridomen 12
Hybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler Antikörper (Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984)
Milz-B HGPRT + Ig+ sterblich
Myelom
PEG
HGPRT Igunsterblich
Aminopterin blockiert De Novo Purin- und Pyrimidinsynthese De Novo
Salvage Pathway Thymidin
Hypoxanthin
B-Zell/Myelom-Hybrid HAT-Medium: Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin
Aminopterin
Ig+ HGPRT + unsterblich
Thymidinkinase (TK+)
HypoxanthinGuaninPhosphoribosyltransferase (HGPRT+)
Nukleotide
Aus Kuby
DNA, RNA 13
Antikörper gegen Immunglobuline Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert. BALB/c
BALB/c
C57Bl/6
Anti-isotypische AK
Anti-allotypische AK
Anti-idiotypische AK
(gegen Epitope in C-Regionen der H- und L-Kette)
(gegen ein bestimmtes Epitop In C-Region)
(gegen Epitope in V-Regionen der H- und L-Kette)
Gegen verschiedene AK-Klassen (iso)
Gegen verschiedene Formen eines bestimmten AK (allo)
Gegen eine bestimmte (private= idio) Form eines AK
Die konstante Region der mH-Kette aus einer BALB/c-Maus (weiß) und einer C57Bl/6-Maus (schwarz) unterscheidet sich in einer Aminosäure verschiedene Allotypen codiert durch Varianten desselben Gens bzw. Allels)
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Aus Janeway: Immunobiology
Antikörperphagen
B-Zellen aus immunisiertem oder nicht-immuninisiertem Tier
Klonierung in Phagenvektor
PhagenantikörperBücherei
Isolierung durch Panning
Isolierung von VH und VL-DNA-Fragmenten aus B-Zellen mittels PCR
Klonierung der VH- und VL-Fragmente in Bakteriophagen-Vektoren
Transformation in E.coli
Isolierung spezifischer Antikörperphagen mittels Affinitätschromatographie oder ‚Panning‘ an immobilisiertem Antigen 15
Pepsinverdau
F(ab’)2
Rekombinant in E.coli, Hefe und Insekten- bzw. Säugetierzellen
Papainverdau
Fab
Bispezifischer IgG-Antikörper
Rekombinante Manipulation
CH3
Natürlich vorkommender, monospezifischer IgG-Antikörper
CH2
Antikörper und Antikörper (Ak)-Fragmente
Fd
scFv
(Fragment of Domains)
(Single-chain Fragment of Varibale regions)
Diabody 16
Humanisierte Maus-Antikörper Murine VH-Region
Muriner Ak
Chimärer Ak
Humaner Ak
Humanisierter, chimärer Ak
Sequenzen des Paratops (Hypervaribale Region = CDR) im humanen Ak werden rekombinant durch entsprechende Sequenzen aus Maus-Ak ersetzt
Chimäre - feuerspeiendes Ungeheuer aus der griechischen Mythologie mit dem Kopf eines Löwen, dem Körper einer Ziege und dem Schwanz eines Drachen.
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Anwendungen von Antikörper in Forschung und klinischer Diagnose o Nachweis und Quantifizieren löslicher Moleküle o Nachweis intrazellulärer und membrangebundener Proteine auf Einzelzellniveau o Nachweis und Quantifizierung von Zellpopulationen innerhalb einer Zellsuspension o Nachweis sezernierender Zellen o Anreicherung und Isolierung definierter Zellpopulationen o Proteinreinigung und Untersuchung von Proteinkomplexen o Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen
18
Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle In Lösung: Heidelberger Titrationskurve
Antikörper-Konzentration
Antigen-Konzentration
Menge der Ak-Ag-Komplexe
Aus Janeway: Immunobiology 19
Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony Prinzip:
Beispiel:
Antigen und Antiserum werden in Vertiefungen in der Agarmatrix pipettiert Antigen
Antikörper
Agarmatrix
Ag1 und Ag 3 haben keine gemeinsamen Epiotope, i.e., sie sind verschiedenen
Präzipitatslinie Anfärben Ag1 und Ag 2 besitzen identische Epiotope
Aus Janeway: Immunobiology 20
Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini) Präzipitationsring Ak
Ag
Ag Ak
Durchmesser
• Quantitativer Nachweis von Antigenen (z.B. Serum IgG) • Antikörper wird in Agar eingegossen • Antigen wird in Vertiefung gegeben Diffusion des Antigens • Äquivalenzpunkt => Präzipitation • Durchmesser des Präzipitationsrings ~ Konzentration • Mitführen eines Ag-Standard
• Bestimmung der Ag-Konzentration aus Eichkurve 21
Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Qualitativer und quantitativer Nachweis löslicher Moleküle
direkt
mit spez. AK
„capture“
indirekt
Enzym
Antigen H H O
N H
H2O2
2 H2O O
N H
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Übliche Enzyme
Alkalische Phosphatase (AP) O-
O-
+ H2O
O
O
P
N+
O
OH
+
N+
O
O-
O-
O
P
OH
O-
OOH-
gelb
farblos
Meerrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase = HRP)
H H
O
N
O
farblos
N
H
H
H2O2
2 H2O
Konjugiertes P-Elektronensystem ➙ farbig
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Schwangerschaftsnachweis durch Agglutinationsinhibition HCG • human chorionic gonadotropin Humanes Chorion-Gonadotropin • Schwangerschaftshormon • Wird zuerst von Blastozyste, dann von Plazenta gebildet • Kann bereits 6-15 Tage nach der Befruchtung im Urin nachgewiesen werden • Verantwortlich für morgentliches Erbrechen
Kein HCG Im Urin
HCG Im Urin
nicht schwanger
schwanger Aus Janeway
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Blutgruppennachweis durch Hämagglutinationsreaktion
Agglutination: Verklumpung korpuskulärer Bestandteile durch Anti-körper
Aus Janeway 25
Nachweis von Antigenen in und auf Zellen
Photoimmunfluoreszenz
Durchflusszytometrie Analyse eines Antigens auf Einzelzellbasis
26
Photoimmunfluoreszenz + AK
Fluorochrom
Aus Janeway: Immunobiology
AK
Zelle
+ irrelevanter AK
(FITC)
27
Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellen z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz
Granularität
Aus Janeway, Immunobiology
FITC-anti-CD4
PE-anti-CD8
Grün
(Düse)
Rot
Zellgöße
Granularität
Photozellen
Zellgöße
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Durchflusszytometrie und FACS
FACS steht für Fluorescence activated cell sorting und beschreibt ein Verfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Der Ausdruck "FACS" ist eine geschützte Handelsmarke der Firma Becton Dickinson. Der Name ist eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung vorgenommen wird, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von Zellen Die allgemeine Bezeichnung des Verfahrens lautet Durchflusszytometrie. Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahlpassiert.
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Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellen z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz
200
PE anti-CD4 100
50
0 0
10
Rot Granularität Zellgöße
2
10 FL2-H
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10 FL1-H
3
10
4
10
Fluoreszenzintensität = FI ()
Dotplots
Grün
1
10
FI (PE anti-CD4)
Aus Janeway, Immunobiology
PE-anti-CD4
100
50
0
FITC-anti-CD8
FITC anti-CD8
150
Count
Zellzahl Count
150
Histogramm
200
FI (FITC anti-CD8) 30
Quantitativer Nachweis sezernierender Zellen
Jerne-Plaque-Assay Durchflusszytometrie Elispot-Assay Bestimmung der Frequenz sezernierender Zellen
31
Hemolytischer (Jerne) Plaque Assay (N. Jerne, A. Nordin & C. Henry) Bestimmung der Frequenz AK-sezernierender Plasmazellen in einer Milzzellkultur
Plasmazelle
SRBC:sheep red blood cells PFC: plaque-forming units Aus Kuby, 4th edition
32
Nachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-Technik Bestimmung der Frequenz Zytokin-sezernierender Milzzellen vor und nach Stimulierung
Aus Janeway 4th edition
-
+
Animation unter: http://www.elispot-analyzers.de/english/elispot-animation.html 33
Durchflusszytometrischer Nachweis sezernierender Zellen Beispiel: Nachweis Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (Assay nach Milteny Biotech)
PE
•
Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen
•
Zellen werden stimuliert IFN-g wird sezerniert und von IFN-g-Catch abgefangen
•
Gebundenes IFN-g wird mit Fluorochrom -konjugierten (PE) anti- IFN-g -Ak inkubiert
•
Zellen können durchflusszytometrisch analysiert
•
Alternativ können Zellen mit magnetisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN-g sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden
(PE anti-IFNγ)
34
Isolierung definierter Zellpopulationen
Durchflusszytometrsiche Methode (FACS)
Magnetische Methode (MACS)
Sortierung von Zellen anhand von Oberflächenproteinen
Aus Janeway: Immunobiology 35
Anreicherung sezernierter Zellen mittels der FACS- oder MACS-Technik Beispiel: Anreicherung Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (nach der FACS/MACS-Methode von Milteny Biotech) Magnetisierbare anti-PE-AK
• Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen • Zellen werden stimuliert IFN-g wird sezerniert und von IFN-g-Catch abgefangen • Gebundenes IFN-g wird mit Fluorochrom -konjugierten (PE) anti- IFN-g -Ak inkubiert • Zellen können durchflusszytometrisch analysiert • und gleichzeitig durchflusszytometrisch sortiert werden • Alternativ können Zellen mit magnetisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN-g sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden
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Proteinaufreinigung und Analyse von Proteinkomplexen Aufreinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie
Aus Janeway: Immunobiology 37
Immunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter Polypeptide 1. Zellkultur-Überstand 2. Zell-Lysat St
Metabolische Markierung IgM-produzierende Zellen
1
2
kD 200 97
m
66 45
31
Anti-mH-Ak
k
Autoradio- oder Fluorogramm
Aus Janeway: Immunobiology 38
Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer kombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalyse Versuch: Untersuchung des Einflusses einer IgL-Kette auf die Interaktion einer IgH-Kette mit dem Chaperon BiP Zelllysate aus H+ und H+L+ Plasmalinie mHL mH
Zelllinie
Elektrophorese
IP: anti-IgH antiIgH (1)
Elektrotransfer
antiBiP (2) SDS-Polyacylamidgel
IgH Enzymkonjugierte Sekundärantikörper
BiP
Membran
39
Anwendungen von AK in der Therapie
o Immundefizienz o Entzündung
o Autoimmunität o Infektion o Krebs
40
Modifizierte Antikörper als Virus- bzwTumortherapeutika Tumor- oder HIV-infizierte Zelle
Tumorantigen oder Virales Hüllprotein
kill
Immunotoxin oder
TZR
KillerT-Zelle
nativer AK kill
Bispezifischer Antikörper
Toxin/ Isotop
Retuximab Anti-CD20 AK (B-Lymphome) (http://www.prolife.de/ aktuelles/38.html)
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Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 4. Transport zytotoxischer Substanzen 3. Komplementabhängige zell-vermittelte Zytotoxizität (CDC)
5. Blockieren
2. Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC)
Promotionsvortrag 2007 Dr. Michael Schwemmlein FAU Lehrstuhl für Genetik
1. Signalisieren 42
Katalytische Antikörper (Abzyme) (Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986)
Conventional Antibody Binds antigen but does not cleave
Is "used" up during reaction
Catalytic Antibody Binds antigen and cleaves it Is regenerated after reaction
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Periodatoxidation von p-Nitro-Toluol-methyl-Sulfid zu Sulfoxid
Instabiler Übergangszustand
Hapten (Stabiles Analog zum Übergangszustand)
Aminophosphonsäure
L.C.Hsieh-Wilson, P.G.Schultz, and R.C.Stevens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5363-5367 (1996).
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Enzymatische Spaltung und Inaktivierung von Kokain (Landy and coworkers, New York 1993)
H C 3
O
O
N
OCH 3 O
H 3C
N
O
O
OCH 3 O
H 3C
O N
HO
OCH 3
OH
O
+
C HO
HO
Cocaine (active)
Unstable Transition State
Cleavage Products (inactive)
O H C 3
N
OCH 3 O
O
P HO
Stable Transition State Analog
45
