Masspektrometri

Masspektrometri

682.0

683.0

684.0

m/z

Margareta Ramström Jonsson Föreläsning 07-03-23

Uppbyggnad, MS

Jonkälla

Molekyler joniseras Ex. Elektrospray, MALDI

Massanalysator

Jonerna separeras med avseende på massa och laddning. Ex. Quadrupole, time-offlight, FTICR

Detektor

Massa-överladdning detekteras

Jonisering

- Både katjoner och anjoner kan bildas! - Katjoner är vanligast. Exempel

[M+H+] [M+Na+]

Joniseringstekniker

Vid analys av biomolekyler är det nödvändigt att använda milda joniseringstekniker! Elektrospray och MALDI !

Jonisering med elektrospray

•Sker vid atmosfärstryck. • Positiv elektrospray är vanligast för proteiner och peptider => positivt laddade joner analyseras. •Provet löses i t.ex. 50:50 H2O: organiskt lösningsmedel + låg andel syra, t.ex. ättiksyra (HAc). •Provmolekylerna är positivt laddade redan i lösningen.

Sample

Electrospray ionization

MS inlet

(Positive electrospray)

En högspänning läggs mellan spraykapillären och MS, vanligen 2-3 kV. En ”taylorkon” bildas och vätskan delas i små droppar. Lösningsmedlet evaporerar, laddningsrepulsionen ökar och dropparna spricker till ännu mindre enheter, och slutligen formas ”nakna” joner.

Exempel

Elektrosprayspektrum av myoglobin

21+ 20+

HHM 1:1000 in 5% ACN, 1% HOAc Ronny_050701_001 29 (2.501) Cm (26:34)

22+

100

23+

808.180

848.547

19+ 893.139

18+ 942.712

771.480

17+ 998.153

24+

TOF MS ES+ 6.64e3

738.006

16+ 1060.438

707.336

1131.119

25+

%

26+

15+ 14+ 1211.822

679.075

653.020 976.937

0 600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

1150

1200

1250

m/z

Myoglobin, Mw=16952.6 Da OBS! I elektrospray blir större molekyler multipelladdade. Går att kombinera med instrument med begränsat m/z-område. För att beräkna molekylvikten ur spektret måste vi göra en DEKONVOLERING. Finns oftast inbyggd i mjukvaran som styr masspektrometern.

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Prov

Matris Provet blandas med en matris => Läggs på en MALDI-target. Matrisen – en liten organisk molekyl som absorberar starkt i UV-området Prov + matris kristalliserar på target innan denna sätts in i masspektrometern.

Vanliga MALDI-matriser

Kommer ni att använda på lab.

MALDI, forts. laser Intorkning +

H+ Proton transfer

Desorption

•Provet beskjuts med laser •Matrisen absorberar laserljus •Energiöverföring sker •Provmolekylerna joniseras

MALDI-spektrum av myoglobin Voyager Spec #1=>MC=>MC=>SM9[BP = 5737.0, 2566]

16952.10

100

1224.8

90

80

% Intensity

Intensitet

70

60

50

40

30

20

17162.57 10

0 12754

14644

16534

18424 Mass (m/z)

m/z

Peptider – oftast bara enkelladdade joner Proteiner – enkel- och ev. dubbelladdade.

20314

0 22204

MALDI eller elektrospray? För biomolekyler är ofta båda ett bra val.

MALDI

Elektrospray

•God känslighet •”High throughput” •Mer tolerant mot salter •Lättolkade spektrum

•Kan kopplas on-line till LC och CE •God känslighet, speciellt om nanospray används •Man får generellt sett bättre massnoggrannhet även för stora molekyler.

Massanalysatorer Uppgift: Att separera jonerna map m/z, så att de sedan kan räknas av detektorn. Utnyttjar joners egenskaper i elektriska och/eller magnetiska fält.

Exempel på vanliga analysatorer: •Quadrupole •Magnetisk eller elektrisk sektor •Time-of-flight (ToF) •Jonfälla (ion trap) •Fourier-transform-joncyklotronresonans MS (FTICR)

Viktiga begrepp Massnoggrannhet- Hur noggrant kan massan bestämmas? Upplösning- Förmåga att separera toppar med närliggande massor. Detektionsgräns- Den minsta mängd analyt som ger signal

Quadrupole

Scannas

Instrumentet scannas

För varje steg når joner av exakt ett m/z detektorn

Konstant fält

Quadrupole MS • Relativt långsamt instrument • Begränsad massnoggrannhet • Lätt att kalibrera • Robust, relativt billigt • Används ofta i MS/MS-experiment

Time-of-flight (ToF) Flygrör

+

+ 20 kV

d Då jonen lämnar det elektriska fältet W = mv2/2= qV där v=hastigheten, m=massan, q=laddning, V=potentialskillnad Flygtiden genom röret (Använder ni i labkursen)

t =d/v

För att förbättra upplösningen i ToF används en reflektor = en ”jonspegel”. I reflektorn byter jonerna riktning pga ett elektriskt fält. Beroende av initial rörelseenergi rör sig jonerna olika långt in i fältet innan de vänder. Kompenserar för små skillnader i kinetisk energi, initial position och tidpunkt då jonerna bildades.

Jämförelse Reflektor ToF Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Linjär ToF

2000

3000

2500

1500

2000

1500 1000

1000

500

500

0 420

2440

2460

2480

2500

0

2520

m /z

40

2445

2450

2455

2460

2465

Samma peptid. Reflektormode ger betydligt bättre upplösning.

2470

2475

2480

2485

m /z

ToF MS är ett snabbt instrument. - Både elektrospray och MALDI kan användas som jonkälla - Bra val om man vill koppla snabba separationstekniker on-line till masspektrometern - I princip obegränsat massområde - Ger hög upplösning i reflector mode

Fourier-transform-joncyklotron-resonans (FTICR) MS Magnet, 9.4 T

B Electrospray Hexapole

Ion optics

Analyzer cell

Skimmer

Capillary

Cyclotron Motion v

B

Lorentz force F

F = q(v x B) fc=qB/2!m

•Ultrahög upplösning (resolving power >106) •Hög massnoggrannhet (subppm) •Hög känslighet 682.0

683.0

684.0

m/z

Excitation och detektion

•Ett par excitationsplattor: Joner i resonans med excitationsfrekvensen absorberar energi och kommer att cirkulera i bana med större radie. Alla joner med samma m/z rör sig koherent. •Ett par detektorplattor: Detekterar strömmen som den koherenta rörelsen ger upphov till. OBS! I en FTICR sker masseparation och detektion på samma plats – i cellen!

Bra val om man vill analysera -Komplexa prover -Behöver hög massnoggrannhet -De flesta grupper jobbar med ESI- FTICR MS, men möjlighet att jonisera med MALDI finns också.

Numera även mycket vanligt med hybridinstrument - Idé: Kombinera de bästa egenskaperna hos två instrument. Ett vanlig exempel är Quadrupole-Time-of-Flight (q-TOF) - Bra tandem-MS-möjligheter i ett TOF-instrument!

Detektorer Generell princip: Jonerna når ytan på detektorn

Elektronöverföring sker

Elektrisk ström

Signal till datorn som omvandlar till masspektrum

Bilden: Princip för elektronmultiplikator

Tolkning av masspekta Isotopfördelning i ett spektrum med god upplösning

Monoisotopisk massa 1:a isotoptoppen

2:a isotoptoppen

682.0

683.0

(Från FTICR)

684.0

m/z

( 12C " 98,9%, 13C " 1,1% => Vi får olika teoretiska massor beroende av isotopsammansättningen => Isotoptoppar)

I spektrum med hög upplösning kan vi lätt avgöra vilken laddning jonen har, och därmed molekylmassan.

M+H+

M+3H+

M+2H+

M+4H+

Tandem MS, peptidfragmentering Ger info om sekvensen, peptidens uppbyggnad.

a1

b1

c1

O

O

H2N - CH – C – NH – CH – C - R1

R2 xn-1 yn-1

zn-1

Fragmenten kallas a, b och c respektive x, y och z beroende på var fragmenteringen sker och vilken ände som joniseras.

HUR DÅ?

Exempel Fragmentering i quadrupole Q1

Val av precursorjon

Q2

Kollisionscell. Jonerna kolliderar med gasmolekyler

Q3

Scannas. Ett massspektrum registreras

CID - collision induced dissociation (ovan) Här dominerar fragmentering av peptidbindning, dvs vi får b- och y-fragment! CID kan genereras i de flesta masspektrometrar på olika sätt. Andra sätt att fragmentera kan vara genom att beskjuta provmolekylerna med fotoner (laser) eller elektroner.

Aminosyrornas massor (i peptidkedjan)

Klipp in tabellen från kursboken.

Skillnaden mellan två närliggande fragment ger massan på den aminosyra som skiljer.

V

b-fragments

A

Q

L

y-fragments

E

L

G G G

G G G

L

b7

[M+2H]2+

y11

b11

y12

b8

b9

b6

b10

y13

y14

y15 b12 b13

600

800

1000

1200

1400

b14 b15 y17

1600

y19 b18

1800

m/z

Vi räknar ett exempel!

Traditionell Proteomics 2D PAGE ryggmärgsvätska •Separera proteiner på gel •Färga in •Lokalisera spottar av intresse •Skär ut gelbit •Digerera proteinet med hjälp av ett enzym (trypsin) •Kör MS på resulterande peptider •Databassökning

Figure from Kim et al. Stroke 2003:24,2835-2841

Trypsin klyver specifikt C-terminalt om lysin (K) och arginin (R). Myoglobin GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKS EDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYL EFISECIIQVLQSKHP GDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG

(Leta upp klyvningssajterna!)

Viktigt att definiera klyvningsförhållandena, t.ex. reducera cysteinbryggor.

Tänkbara tryptiska peptider (myoglobin) 1

397.2563

397.5010

48

50

0

(K) HLK (S)

1

407.2658

407.5368

32

34

0

(R) LFK (G)

1

409.2087

409.4655

43

45

0

(K) FDK (F)

1

456.3186

456.6098

99

102

0

(K) IPVK (Y)

1

650.3150

650.7138

148

153

0

(K) ELGFQG (-)

1

662.3361

662.7223

57

62

0

(K) ASEDLK (K)

1

738.2980

738.7965

51

56

0

(K) SEDEMK (A)

1

748.4357

748.9062

134

139

0

(K) ALELFR (K)

1

754.2929

754.7959

51

56

0

(K)SEDEMK(A)

1

828.3562

828.9251

141

147

0

(K) DMASNYK (E)

1

844.3511

844.9245

141

147

0

(K)DMASNYK(E)

1

910.4634

911.0088

35

42

0

(K) GHPETLEK (F)

1

1350.8109

1351.6426

64

77

0

(K) HGATVLTALGGILK (K)

1

1515.6651

1516.6425

119

133

0

(K) HPGDFGADAQGAMNK (A)

1

1531.6600

1532.6419

119

133

0

(K)HPGDFGADAQGAMNK(A)

1

1632.8709

1633.8566

17

31

0

(K) VEADIPGHGQEVLIR (L)

1

1800.9285

1802.0530

1

16

0

(-) GLSDGEWQLVLNVWGK (V)

1

1853.9622

1855.0766

80

96

0

(K) GHHEAEIKPLAQSHATK (H)

1

1970.0309

1971.3381

103

118

0

(K) YLEFISECIIQVLQSK (H)

1Met-ox

1Met-ox

1Met-ox

Intens. [a.u.]

Exempel: Enzymatiskt digerat, serum albumin

Elektrospray

MALDI

4000

3000

2000

1000

0

500

700

900

1100

1300

1500

1700 m/z

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

Man får komplexa spektra. Elektrosprayspektret något mer komplext än MALDIspektret. Då man använder elektrospray är det även vanligt att analysera med HPLC-MS.

m /z

Databassökningar

(Exempel på program)

Info från gel

Klistra in massorna här! Välj tolerans beroende på MS-metod

http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe

Man får en lista på tänkbara proteiner rankade i ordning efter vilken som är troligast.

Information om vilka peptider som matchade de experimentella massorna, var i proteinsekvensen dessa befinner sig och mätfelet.

Alternativa metoder ”Shot-gun” eller ”bottom-up” proteomics •Klyv proteinerna mha ett enzym •Separera peptiderna (LC, CE eller separation i flera dimensioner) •Detektion med MS eller MS/MS •Databassökningar Liquid chromatography Enzymatic digestion

MS or MS/MS Proteins

Peptides

Ryggmärgsvätska, klyvt med trypsin. (LC-MS)

tid

m/z Fördelar:

Man slipper gel-steget, problem med pI och hydrofobicitet Flera peptider från samma protein Lätt att automatisera

Svårigheter:

Komplext mönster Peptiderna från ett protein eluerar vid olika tider Många sökmotorer är konstruerade för analys av gelband

Kvantitativ proteomics

Sample A

Sample B

Label with a light marker

Label with a heavy marker

Jämför koncentrationer i två prover. Flera gelfria metoder bygger på kemisk inmärkning

Combine the samples

I masspektret ser man signaler i par. Den relativa intensiteten ger relativ koncentration. Mass spectrometry

Relative quantification

Exempel

ICAT

Affinity tag

Linker

Reactive group

•Länkdelen innehåller 1H eller deuterium 2H på X-positionerna. Skillnad i massa mellan tung och lätt markör blir 8 Da. •Reaktiva gruppen märker in cysteiner. •En biotin-tag för isolering av inmärkta peptider.

Att tänka på vid provpreparering Proverna måste vara lösta i för joniseringstekniken lämpliga lösningsmedel. Salter stör joniseringen. Kontaminanter från laboranten bör undvikas. Handskar på! (Vanligt: keratin från hud, polyetylenglykol (PEG) från t.ex. hudkrämer).

Vilka mängder är lämpliga att jobba med? MALDI • Lämplig mängd peptid på MALDI-target är 1 pmol (10-12 mol). • Man laddar ca 1 µL av varje prov. • För proteiner behövs något större mängd, beroende på molekylens storlek. Electrospray • Vid direktinfusion är en lämplig provkoncentration 1µM. • Nanospray har drastiskt ökat känsligheten i elektrosprayinstrument. Låga flöden ca 10nL/min används. Provåtgången är mycket låg. •Kopplingar av olika separationstekniker till masspektrometern ökar känsligheten. Provets komplexitet minskar, varje komponent koncentreras. Rekord: 30 zeptomol (10-21 mol) av proteiner i storleksordningen 8 to 20 kDa har detekterats i en specialpreparerad FTICR MS.