Optische Pinzetten

Optische Pinzetten: die Kräfte des Lichts

Prof. Dr. Holger Kress Experimentalphysik I – Biologische Physik 40. Fortbildungsveranstaltung für Physiklehrer/innen 1. Oktober 2015

Was sind optische Pinzetten und wie funktionieren Sie?

Grundlagen und Funktionsweise optischer Pinzetten

Photonenimpuls

Photon besitzt einen Impuls Impuls eines sichtbaren Photons Spiegel Photon Zum Vergleich: Impuls eines PKW auf Autobahn = 1032 mal mehr als Photon!

Impuls p

Impuls nach Reflexion p‘

Impulsübertrag auf Spiegel Δp

Optische Kraft durch Impulsübertrag

Kraft auf Leinwand: Impulsänderung pro Zeit Laserpointer mit 1 mW Leistung  Kraft auf Leinwand

Optische Kräfte in fokussiertem Licht

1986: Entwicklung der ersten optischen Pinzette durch Arthur Ashkin und Steven Chu

Frei diffundierende Partikel Partikel mit 1µm und 350 nm Durchmesser

Partikel in optischer Pinzette

Charakterisierung und Kalibrierung optischer Pinzetten

Kalibrierung einer optischen Pinzette mit Videomikroskopie

Kalibrierung einer optischen Pinzette mit Interferometrie

Datenaufnahmerate mit Photodioden (QPD) > 1 MHz möglich Problem: Relation zwischen QPD-Signal (in Volt) und Partikelposition im Allgemeinen unbekannt. Lösung: Anwendung von statistischer Physik

Kalibrierung mit Interferometrie und Langevin-Methode Positionsignal-Histogram

Positionssignal

Harmonisches Potential:

Fluktuationsbreite

Kalibrationsfaktor

Autokorrelation

Fluktuationsbreite

Harmonisches Potential: Korrelationszeit

Kraftkonstante

Äquipartitionstheorem

Vergleich zwischen Theorie und Experiment

Kräfte in optischen Pinzetten: Theorie und Experiment

Theorie

Experiment & Theorie

Fourieroptik → Hochfokussierte polarisierte Felder Mie-Theorie → Lichtstreuung in fokussierten Feldern → Optische Kräfte für Partikel mit d ≈ λ

Rohrbach, PRL (2005)

Gradientenkraft

Streukraft

Interferometrische Partikeldetektion: Theorie und Experiment

Fourieroptik → Hochfokussierte polarisierte Felder Mie-Theorie → Lichtstreuung in fokussierten Feldern → Detektionsbereich für Partikel mit d ≈ λ

Experiment & Theorie

Axial detection range (μm)

Theorie

Kress et al. Phys. Rev. E (2005)

Experiment Calculation

Wozu kann man optische Pinzetten verwenden?

Aufbau einer Zelle

Alberts et. Al, Essential Cell Biology (2010)

Elementare Zellbestandteile: Proteine

• Ein wichtiger Bestandteil unserer Nahrung

• Moleküle, die u. a. biochemische Reaktionen katalysieren (Enzyme)

• Molekulare Maschinen

Harvard University/XVIVO

Anwendung in Einzelmoleküluntersuchungen an Proteinen

Molekulare Motoren sorgen für Transport in Zellen

Kinesin Motor und Mikrotubulus

Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)

Transportvorgänge in Nervenzellen

Modifiziert von Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)

Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Geschwindigkeit

Gemessene Geschwindigkeiten molekularer Motoren: Kinesin: 1-2 µm/s Myosin V: 0.2-0.4 µm/s

Alberts et al., Essential Cell Biology, 2010

Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Schrittweiten Schemazeichnung eines Aufbaus zur Messung der Schrittweiten eines molekularen Motors

Svoboda et. al, Nature (1993)

Experimenteller Aufbau für interferometrisches „Particle Tracking“

Rohrbach et. al, Rev. Sci. Instrum. (2003)

Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Schrittweiten

Direkte Schrittmessung

Funktion der „Paarweisen Distanzverteilung“

Svoboda et. al, Nature (1993)

Ergebnis: Kinesin hat Schrittweite von 8 nm!

Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Schrittweiten

Schrittweite 8 nm

Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)

Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Kraft

Messung der Kraft eines einzelnen Kinesin-Motors mit einer optischen Pinzette

Joshua Shaevitz, Stanford University

Steve Block Labor, Stanford University

→ Maximalkraft von Kinesin-Motoren:

5-8 pN

(also 5-8∙10-12 N)

RNA-Polymerase: Ein molekulare Motor für die Transkription von DNA

← Abstand zweier Basenpaare: 3.4 Å

Schrittweite 8 nm

Abbodanzieri et. al, Nature (2005)

RNA-Polymerase: Ein molekulare Motor mit einer Schrittweite von 3.7 ± 0.6 Å

Schrittweite 8 nm

Abbodanzieri et. al, Nature (2005)

Untersuchungen an einzelnen Zellen: Mechanik von Filopodien

Filopodien agieren als Fangarme in Fresszellen

Retraktion von Filopodien

Kress et al., PNAS (2007)

Diskrete Schritte in linearer Retraktion

Schrittweitenhistogram

Aktinfilamente sind notwendig für Retraktion → Aktinfilament-basierter Kraftgenerator mit Schrittweite von 36 nm

Kress et al., PNAS (2007)

Kraft-Geschwindigkeits-Relation der Retraktion

Verfügbare freie Energie pro Motorschritt:

Maximale Kraft eines einzelnen Motors:

fit parameter: d = 4.6 ± 0.4 nm

Kress et al., PNAS (2007)

Thermodynamisches Modell für mehrere molekulare Motoren: • Kraft-abhängige Einzelmotor-Kinetik wird durch erweitertes Einzustandsmodell beschrieben • Mehrere Motoren teilen sich die Zugkraft gleichmäßig auf

Einschub zu holographischen optischen Pinzetten

Von Einzelstrahlpinzetten zu Mehrstrahlpinzetten

1µm Silicapartikel Mehrere Fallen 1µm Silicapartikel Objektiv

Phasenmaske

Chapin et al. (2006)

Hologramm Laser Dufresne, et al (1998, 2001)

1998: Entwickliung der ersten holographischen optischen Pinzetten durch David Grier und Eric Dufresne

Holographische optische Pinzetten

Aktueller Aufbau an der Uni Bayreuth (Konrad Berghoff, Steve Keller, Adal Sabri, Wolfgang Groß und Lisa Gebhardt)

Untersuchung einzelner Zellen: Raum-zeitlich flexible chemische Stimulierung

Kontrolle über die chemische Mikroumgebung von einzelnen Zellen Immunzelle (Neutrophile) und Bakterium Hypothese: Kurzreichweitiger positiver und langreichweitiger negativer Rückkopplungskreis

By David Rogers (Vanderbilt University) 1950s, 16 mm camera

Weiner, Curr. Opin. Cell. Biol. 2002

Welches sind die charakteristischen Längen- und Zeitskalen? → Flexible raum-zeitliche Zellstimulierung nötig!

Flexible Zellstimulierung mit optisch gefangenene Mikroquellen

Mikroquellen: Struktur und Wirkstoff-Abgabeverhalten

Material: PLGA (Polymer)

Kontrollierte Wirkstoffabgabe eingeschlossener Chemikalien (Lockstoff fMLP)

bead concentration: 1 mg/ml

Konzentrationsprofil um einzelnes Mikropartikel

Kress et al., Nature Methods (2009)

→ Gradient auf der Längenskala einer Zelle:

Zellreaktionen auf flexible partikel-basierte Stimulierung

Ein anziehendes Partikel (welches den Lockstoff fMLP absondert)

Kress et al., Nature Methods (2009)

Zwei repulsive Partikel (welche den Aktin-Inhibitor Cytochalasin absondern)

Untersuchung einzelner Zellen: Zelluläre Entscheidungsfindung

Zelluläre Entscheidungsfindung

Aktuelles M.Sc. Projekt von Adal Sabri mit Unterstützung durch Konrad Berghoff, Steve Keller und Kathrin Weidner-Hertrampf

Phagozytose: Einverleibung von Partikeln

Monica Hagedorn, 2005

Mayer-Scholl et al., PLoS Pathogens 2005

Aufnahme von zwei Partikeln: Getrennt oder gemeinsam?

Getrennte Internalisierung zweier Partikel

Gemeinsame Internalisierung zweier Partikel

Getrennte Aufnahme von zwei Partikeln

Gemeinsame Aufnahme von zwei Partikeln

Entscheidungsverhalten der Zelle hängt vom Partikelabstand ab

Partikel

⌀ = 2 µm

… was kann man noch so alles mit optischen Pinzetten machen?

Vrije Universiteit Amsterdam

Danksagung

Doktoranden Konrad Berghoff Wolfgang Groß Steve Keller Herbst 2014

Master StudentInnen Tim Klaußner Silvie Krizova Adal Sabri Christina Zahn Bachelor Studenten Stefan Conrad Christopher Greve Veit Mengling TechnikerInnen Pamela Anger Andrea Hanold Ralf Pihan Kathrin WeidnerHertrampf

Konrad Steve

Adal Lisa

Wolfgang Philipp

Christina Andrea Kathrin

Tim

Margot

Holger

Alumni Philipp Dorscht Manuel Eisentraut Lisa Gebhardt Michael Schukalski

Literatur: Erste Beschreibung einer optischen Pinzette

Literatur: Erste Beschreibung einer holographischen optischen Pinzette

Literatur: Übersichtsartikel (Reviews) zu optischen Pinzetten

Literatur: Praktische Anleitungen zu optischen Pinzetten

Zusammenfassung

• Grundlagen und Funktionsweise optischer Pinzetten • Charakterisierung und Kalibrierung optischer Pinzetten • Vergleich zwischen Theorie und Experiment • Einzelmoleküluntersuchungen an Proteinen – Kinesin-Motor – RNA-Polymerase

• Untersuchungen an einzelnen Zellen – Mechanik von Filopodien – Einschub zu holographischen optischen Pinzetten – Raum-zeitlich flexible chemische Stimulierung von Zellen – Zelluläre Entscheidungsfindung

• Literaturempfehlungen