Outils enzymatiques en techniques de biologie moléculaire

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Semestre 4

Techniques en biologie moléculaire I.

Introduction

Technique nécessaires dans toute la bio Permet d’avoir une bonne connaissance du génome. DNA Transcription rRNA

mRNA tRNA Ribosome

Traduction Protéine Techniques de plus en plus pointues. On verra les principales. Ces connaissances permettent un progrès dans la recherche fondamentale, en bio et en médecine.

A.    

Composition et structure des génomes Structure des gènes Fonctionnement des gènes (régulation) Fonction des gènes

B.     

II.

Recherche fondamentale

Recherche appliquée

Biomédical Production de molécules à intérêt Thérapeutique Forensique Biotechnologies

Rappels simples

L’ADN est une molécule double brin, en hélice, maintenue par des liaisons hydrogènes. Elle a une capacité de réplication semi conservative. Ceci produit 2 molécules identiques à la parentale. Cette capacité de réplication est à la base de toutes les techniques de biologie moléculaire. L’ARN est composé d’un seul brin, la plupart du temps, mais on peut le trouver sous la forme de double brin.

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Schémas dessin de base des acides nucléiques et des 5 bases azotées. La synthèse de l’ADN se fait toujours dans le sens 5’-3’.Toutes les polymérases fonctionnent dans ce sens. Ne pas oublier d’indiquer la polarité des molécules quand on écrit une séquence d’ADN. Schémas appariement de bases. La distance entre 2 bases est de 0,34 nm. Il y a 10 paires de bases pour un pas d’hélice (hélice B). 330 Dalton = masse moléculaire d’un nucléotide. 660 Dalton = masse moléculaire d’une paire de bases. Pas de A avec un C ou un T avec un G car il faut une taille bien spéciale pour l’hélice. Il faut donc une base purique avec une base pyrimidique. L’ADN est double brin, mais il peut être simple brin. Un ADN simple brin ou un ARN peut former des structures spécifiques de façon locale, dans le cas ou deux séquences complémentaires se suivent, et sont séparées par une partie qui ne s’apparie pas : Structure en tige-boucle. Possibilité de circulariser la molécule. Ces molécules circulaires ont une structure particulière. En effet, à cause des tensions, les molécules deviennent surenroulées. Un cercle circulaire ouvert est possible si un des deux brins est coupé. Il existe donc 3 formes principales : forme linéaire, forme circulaire surenroulée (fermée), forme circulaire relâchée (ouverte).

III.

Les propriétés physicochimiques de l’ADN A.

La viscosité des solutions d’ADN

Elle n’a pas tellement d’intérêt pour l’étude fondamentale, mais elle a un intérêt pour la manipulation. Les molécules d’ADN sont extrêmement visqueuses. L’ADN linéaire est plus visqueux que l’ADN circulaire. L’absorption UV maximale est à 260 nm pour l’ADN, comme pour l’ARN. Pour l’ADN double brin, la densité optique à 260 nm vaut 1, et donne 50 μg/mL pour une cuve de 1cm. Pour l’ARN, la densité optique à 260 nm vaut 1, et donne 40 μg/mL. Si un ADN double brin devient simple brin (qui se comporte comme un ARN), on le verra sur l’absorption.

B.

Les charges de l’ADN

L’ADN fortement chargé, c’est un polyanion très chargé. Il est possible de faire de l’électrophorèse sur un gel. La migration se sous l’effet d’un champ électrique de la cathode vers l’anode.

C.

La dénaturation

La dénaturation, et la renaturation sont la deuxième grande propriété de l’ADN, à la base de toutes les techniques. Si on chauffe une molécule d’ADN, on élimine les liaisons hydrogène, et donc l’ADN double brin devient simple brin.

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Densité optique

Double brin

séparation

20°C

simple brin

90°C

100°C température

On détermine la température de fusion : T°m La température de fusion T°m est une spécificité d’une molécule d’ADN donnée : plus la molécule est longue, plus elle a de liaisons, et donc plus elle est stable, et plus elle est dure à dénaturer. Dans le cas de 2 ADN identiques, plus un ADN est riche en GC, plus il va être stable. Des bases complémentaires peuvent se renaturer, à condition de refroidir lentement. On peut définir l’hybridation/renaturation, qui dépend aussi du nombre de liaisons hydrogènes. On peut déterminer TH, qui est la température d’hybridation. C’est la température optimale de renaturation, à laquelle la renaturation se fait le plus vite. Elle est inférieure de 15-20°C à T°m pour de longues molécules (>100nt), et de 5°C pour des molécules de 20 nucléotides. +

5’ 3’

5’

5’ 5’ 5’

renaturation

5’ 3’

3’ 5’ Dénaturation

3’ 3’

sonde 3’ 3’ 3’

hybridation

3’ 5’

5’

5’ 3’

3’

3’ 5’

5’

Pour avoir de l’hybridation, le critère essentiel est la complémentarité. La concentration relative des produits est le facteur favorisant la renaturation ou l’hybridation. L’hybridation permet de repérer les appariements, grâce à la notion de sonde, en marquant la sonde avec un composé fluorescent, ou un

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marquage radioactif. On peut faire des hybrides ADN-ADN, mais aussi des ADN-ARN (stabilité +), et ARN-ARN (stabilité ++).

D.

Réplication

La réplication utilise la DNA polymérase, qui est capable de copier de l’ADN, et elles ont besoin d’ADN matrice, ce sont donc des DNA polymérases DNA dépendantes. Il faut une amorce 3’OH pour pouvoir commencer la réplication. Un ADN nu ne peut pas être la matrice de la synthèse d’un autre brin. Il faut une amorce pour pouvoir commencer la réplication. C’est un oligonucléotide, une courte séquence d’ADN qui a de la complémentarité avec l’ADN matrice. On peut donc hybrider par complémentarité l’amorce sur la matrice. On a donc une séquence 3’OH libre, qui permet de répliquer. Une DNA polymérase ne peut pas fonctionner s’il n’y a pas d’amorce. L’hybridation est liée à la température. La température est donc le principal facteur de toutes les techniques de biologie moléculaire. A 99% les DNA polymérases sont DNA dépendantes. Il existe quelques cas particuliers.

E.

Le gène Région codante ATG

Stop ORF

5’ 3’

3’ 5’

Promoteur

AUG

5’

Stop

3’

M Brin transcrit = brin codant = brin -

brin non transcrit = brin non codant =brin +

ORF = Open Reading Frame AUG n’est jamais au début de l’ARN 1. Cadre de lecture 5’ ACGCCGACTACGCAT 3’

2. Clonage Au sein d’une population d’ADN : 1. Repérer la séquence particulière (gène)

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2. Isoler le gène 3. Amplifier le gène : insérer le gène dans un vecteur (qui est capable de s’auto-répliquer)

IV.

Méthodes d’analyse A.

Extraction d’acides nucléiques

Cellule/tissus

phénol/chloroforme

centrifugation

Phase aqueuse Interphase Phase organique

Le phénol dénature les protéines qui précipitent dans l’interphase. Le phénol et le chloroforme sont assez toxiques. On peut faire un précipité dans le fond du tube en ajoutant 2 volumes d’éthanol, 150 mM de NaCl, pour un volume de mélange. L’absorption à 260 nm et à 280 nm doit être mesurée, car les protéines absorbent à 280 nm. Ensuite, il faut faire le rapport 260/280, qui vaut 2 pour un ADN pur.

B.

Electrophorèse

Supports : gel d’agarose ou gel de polyacrylamide. L’électrophorèse permet d’évaluer la présence et la taille de l’ADN : plus la taille est grande, plus la migration sera faible. La migration sur gel d’agarose dépend de la structure, la plus rapide sera la molécule d’ADN circulaire ouverte, ensuite ce sera la forme linéaire, et la plus lente sera la forme circulaire fermée. Pour de tout petits ADN ou ARN, la vitesse dépend de la composition en bases. Le gel de polyacrylamide est utilisé pour le séquençage.

V.

Outils enzymatiques en techniques de biologie moléculaire A.

Les enzymes de restriction

Elles coupent l’ADN double brin, et sont généralement inefficace sur l’ADN simple brin ou l’ARN. Elle coupe en un site de restriction, spécifique de chaque enzyme. Ce sont des endonucléases. Les sites de restriction sont en général de 4 à 6 paires de bases. Les sites de restriction sont en général des palindromes. Fréquence de coupure par les enzymes de restriction. Les enzymes de restrictions sont utilisées généralement pour le clonage. On coupe le génome en petits morceaux, et on se pose la question de savoir la taille moyenne des morceaux. Fréquence de coupure 5’ GATC ¼¼¼¼

3’ coupe enzyme de restriction

¼ 4= 1/256 ¼ 6= 1/4096

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B.

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Origine

Micro-organismes. La bactérie crée l’enzyme de restriction. Si un site de restriction est présent sur le virus, son ADN sera dégradé. C’est un moyen de défense de la bactérie. Wiki : On pense que le rôle physiologique est de procurer aux micro-organismes une défense contre les ADN exogènes (notamment contre les bactériophages); il s'agirait d'un système immunitaire primaire.

C.

Nomenclature

EcoRI : E  genre co  espèce R  souche RYB I  première souche extraite

D.

Isoschizomères

Enzyme de restriction extraites d’organismes différents mais reconnaissant la même séquence. Wiki : Enzyme de restriction reconnaissant la même séquence-cible qu'une autre enzyme de restriction.

E.

Les différents types de coupures

Une enzyme peut couper l’ADN de 2 manières différentes. Le premier type de coupe est la coupure franche, c'est-à-dire que les deux brins seront coupés au même endroit, avant ou après des bases appariées. Le deuxième type de coupe est la coupure à extrémités débordantes (à bouts collants), l’enzyme coupe en décalé sur l’ADN, en reconnaissant la même séquence sur chaque brin. L’ADN ne reste pas apparié, les 2 brins se séparent. Il faut distinguer les coupures 3’ débordantes / 5’ rentrantes des 5’ débordantes / 3’ rentrantes. Il y a 3 catégories d’enzymes. Les enzymes de type 2, qui ont un site de reconnaissance, et coupe sur ce site. Les enzymes de type 1 et 3 se fixent à un endroit et coupent plus loin. Wiki : Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de coupure, il est possible de distinguer trois types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une séquence d'ADN spécifique et coupent en un endroit aléatoire, en général assez éloigné du site reconnu. Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifique et coupent en un endroit spécifique de cette séquence.

F.

La méthylation de l’ADN

L’ADN doit être méthylé par les méthylases. Elle reconnaît une séquence spéciale (AAGCTT), et la méthyle. Si une enzyme de restriction coupe cette séquence, et qu’elle est méthylée, elle ne la coupera pas. La méthylase est utile pour protéger l’ADN de ses propres enzymes de restriction. Cependant, l’ADN des virus n’est pas méthylé, et donc il sera coupé.

G.

Utilisation des enzymes de restriction

Permet de manipuler de l’ADN, c’est l’étape essentielle pour le clonage d’un gène. Sans enzyme de restriction, pas de clonage. Permet aussi de faire la cartographie de restriction. La cartographie de

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restriction permet de positionner les sites de restriction. Techniquement c’est simple : on prend un ADN, on rajoute une enzyme de restriction, et on effectue une électrophorèse, qui permet de positionner les sites. On peut faire une carte pour un ADN assez restreint. Exemple : on considère un ADN circulaire, de forme surenroulée NT A B C B+C NT : non traité A : pas d’enzyme de restriction B : 1 fragment linéaire, migration moins rapide C : 2 coupes, la taille de 2 fragments est égale au fragment B B+C Schéma 1

H.

Intérêt

1. Spécificité Par définition, une enzyme de restriction est spécifique d’une séquence d’ADN donné. Permet de repérer si des ADN peuvent avoir des séquences communes. Schéma 2 2. Manipulation Le séquençage a tellement pris d’importance que l’on a l’information sur la séquence très rapidement. On donne la séquence à un logiciel, et il nous donne les sites de restriction. 3.

Autres enzymes

a) DNase I Enzyme coupant l’ADN : DNase I (endonucléase). Permet d’introduire un groupement radioactif dans l’ADN, et d’étudier l’interaction ADN-protéine : on prend de l’ADN, et on le chauffe. On obtient des fragments de taille différente suivant l’endroit de coupure de la DNase I. On fait ensuite une électrophorèse en gel de polyacrylamide. Puis on fait une autoradiographie. On peut en déduire que la DNase a une affinité avec l’ADN, et déterminer les positions des sites de restriction. b) Nucléase S1 C’est une exonucléase. Elle ne coupe que les ADN simple brins. Si on a un ADN partiellement double brin, et qui a les extrémités débordantes simples brin. En traitant la molécule par la S1, la dégradation ne se fera que sur les parties simples brins, pour produire des ADN parfaitement coupés. Elles fonctionnent aussi sur des hybrides ADN/ARN. c) Exonucléase III Wiki : L'exonucléase est une nucléase, une enzyme qui coupe l'ADN ou l'ARN à partir d'une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens : 5' vers 3' ou l'inverse. Par exemple, l'exonucléase III fonctionne à partir de l'extrémité 3' (sauf si celle ci est protubérante). Cette enzyme catalyse l'hydrolyse séquentielle des nucléotides d'un ADN double brin dans le sens 3'5'. Elle libère des monodesoxynucléotides à partir de l'extrémité 3'd'un ADN bicaténaire. Elle est

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inactive sur ADN simple brin. Elle agit sur des ADN double brins obtenus par coupure franche avec des enzymes de restriction ou sur ADN double brin dont les extrémités 3'(OH) sont en retrait. d) Ligase La ligature se fait avec des ligases, qui recollent les morceaux d’ADN coupés. C’est une enzyme capable de refaire une liaison phosphodiester 5’-3’. On peut associer n'importe quel type d’ADN, elle ne s’occupe pas de la séquence, du moment qu’elle a des extrémités 5’ et 3’. Dans le cas de séquences à extrémités débordantes, la ligase peut recoller des extrémités complémentaires. Elle a besoin d’ATP. Wiki : En biochimie, une ligase est une enzyme qui catalyse la jonction de deux molécules ("ligation" ou « coller entre elles ») par de nouvelles liaisons covalentes avec hydrolyse concomitante de l'ATP ou d'autres molécules similaires. Elles sont classées EC 6 dans la classification EC. De nombreuses ligases sont connues sous le nom de « synthases » ou « synthétases » vu qu'elles synthétisent de nouvelles molécules. Dans les laboratoires de biologie moléculaire, une des ligases les plus utilisées est l'ADN ligase. On l'utilise pour interconnecter des fragments d'ADN. e) Phosphatase Elles éliminent les extrémités phosphates en 5’, et elles les transforment donc en groupement OH. L’ADN a alors une extrémité 3’OH et une extrémité 5’OH. Ceci empêche de lier des ADN. Ce qui permet de marquer radioactivement. La kinase fait l’inverse. f) DNA polymérase DNA dépendante Enzyme recopiant l’ADN. On compte l’ADN polymérase I. Wiki : http://fr.wikipedia.org/wiki/ADN_polym%C3%A9rase g) DNA polymérase RNA dépendante Transcriptase inverse. Rétrovirus. ADNc (enzyme de la transcriptase inverse), c’est une copie (c) de l’ARNm. Schéma 3 Protocole :   

VI.

RNase H : élimine l’ARN dans les hybrides ARN/ADN. E. coli DNA polymérase I : synthétise l’ADN à partir de l’ARN amorce. E. coli DNA ligase : reforme les liaisons phosphodiester rompues.

Les plasmides

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/outilsbm/html/plasmide.htm http://www.univ-tours.fr/genet/gen001300_fichiers/CHAP5D/GEN05D1EC35.HTM http://cgdc3.igmors.u-psud.fr/microbiologie/rappelplasmides.html http://www.techno-science.net/?onglet=glossaire&definition=1034 Manque début de cours Un plasmide est un vecteur de clonage. Dans les molécules d’ADN, on insère une molécule d’intérêt. C’est le moyen le plus facile de propager de l’ADN. On utilise alors une enzyme restriction. Propriétés générales des plasmides : les petits fragments d’ADN circulaire présent dans la cellule bactérienne. Leur réplication est indépendante du génôme et cycle cellulaire de la bactérie. La taille est de 4 à 7

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kb. Il se réplique dans des espèces particulières de bactéries. Résistance à Ab. Pour expérimentateur, c’est essentiel. Un plasmide ne se développe que dans une espèce de bactéries, pas dans une autre. Le premier qui a été trouvé est pBR322. Il a une région très importante pour qu’il puisse se multiplier, c’est la région Ori. C’est une séquence d’ADN qui permet l’initiation de la réplication. Les gènes nécessaires à la réplication sont portés par le gène, pas par le plasmide. pBR322 porte 2 gènes de résistance : AmpR et TcR. Si on associe un insert à ce plasmide, on aura moyen de sélectionner le plasmide. Sans plasmide, il n’y aurait pas eu de biologie moléculaire. D’un point de vue expérimental, le but est d’insérer une amorce d’ADN. Voir schéma 1 On veut « rendre les cellules compétentes ». On les place dans CaCl2 qui permet à l’ADN de rentrer facilement dans une cellule. Il y a un faible taux de réussite. Une cellule bactérienne ne peut être transformée que par une molécule de plasmide. C’est une restriction à la sur transformation. Sans ça, il n’y aurait pas de clonage. Les molécules d’ADN linéaire ne transforment que très peu par rapport à l’ADN circulaire. Quand on fait une ligation, on a un mélange de produits (plasmide, insert, plasmide + insert), et le seul que l’on utilise c’est celui avec l’insert et le nouveau plasmide. Phénotypiquement, on ne distingue pas le plasmide seul du plasmide avec insert. Cependant, on veut faire la distinction. Il a donc fallu une grande évolution technologique, pour faciliter le travail de l’expérimentateur.

A.

Gènes de sélection

pBR322 : 2 gènes : Amp et Tc. Pour pouvoir les distinguer, on utilise la propriété des 2 gènes de résistance. On va couper les plasmides par une enzyme qui coupe par exemple un site de restriction dans le gène de Tc. On ne peut mettre qu’un seul antibiotique sur une boite de pétri. Schéma 2 Les gènes Tc n’est alors plus efficace pour une partie de la population, qui va mourir en présence de l’antibiotique. On prend une colonie que l’on repique. On va ensemencer le repiquage d’une cellule sur une première boite quadrillée qui contient de l’Ampicilline, et sur l’autre boite quadrillée qui contient de la tétracycline. On peut alors trouver sur les boites soit une résistance, soit une sensibilité. Si on trouve une sensibilité, on a trouvé le caractère qui nous intéresse, et donc la molécule recherchée. On a essayé de faire évoluer cette technique trop lourde et contraignante. On remplace le gène Tc par un gène qui code pour la β-galactosidase. Ce gène est appelé lac Z. Le principe est le même. On insert le fragment dans le gène β-galactosidase. On met alors sur le milieu de culture un substrat (β-galactoside) appelé X gal. Il va être utilisé par l’enzyme. L’avantage, c’est qu’on peut utiliser le X gal en présence d’Ampicilline. Son intérêt, est que quand il réagit (que le gène n’est pas coupé), il va donner une couleur bleue à la bactérie. On ne va donc garder que les colonies blanches. On appelle cela la culture blanc-bleu. La dernière évolution est de remplacer le gène β-galactosidase par un gène toxique. Ce gène tue la cellule quand il est exprimé. Si l’on intègre un ADN dans ce gène, seules les bactéries résistantes à l’Amp et qui ont le gène toxique coupé peuvent survivre, les autres sont tuées soit par Amp, soit par le gène toxique.

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B.

Semestre 4

Autres caractéristique

Pour ouvrir le plasmide, on utilise des sites de restriction. La caractéristique est la suivante : plus il y a de sites d’enzymes de restriction, plus le plasmide est facile à cloner. L’expérimentateur aura plusieurs choix pour couper le plasmide. Ces enzymes groupées sur le plasmide le sont dans une zone appelée MCS (multiple cloning site). On veut ensuite extraire le plasmide de la bactérie : à partir d’une cellule bactérienne qui contient le plasmide on fait une lyse, qui libère l’ADN, puis on fait une dénaturation à la soude, qui dénature l’ADN, et le petit plasmide va rester circulaire. On fait une précipitation, et on aura notre plasmide en solution. Il existe 2 catégories de plasmide : 1. Les vecteurs de clonage Molécules de plasmide utilisées pour cloner et pérenniser un ADN, pour amplifier celui-ci. Dans nos expériences précédentes, on n’a fait qu’amplifier l’ADN, l’insert était silencieux. 2. Les vecteurs d’expression Ils permettent l’expression du gène que l’on a incorporé dans le plasmide. Ils doivent avoir une particularité supplémentaire par rapport aux vecteurs de clonage. On doit l’insérer en aval d’une séquence promoteur. De cette manière, le promoteur va être reconnu par l’ARN polymérase, et va produire les protéines correspondant au gène intégré. Le promoteur est dit inductible, l’expérimentateur peut à loisir commander la production de la protéine. En générale, l’inducteur est de l’IPTG, qui permet à la bactérie de produire l’ARN et la protéine. Ca permet aussi de produire des protéines toxiques. A coté de ces vecteurs procaryotes, on a pu produire des vecteurs eucaryotes. Le principe est le même. L’intérêt est de faire fonctionner un gène dans une cellule eucaryote. On extrait le plasmide que l’on réintroduit dans des cellules eucaryotes. C’est la transfection. Le promoteur est différent, il est capable de fonctionner dans une cellule eucaryote. Le promoteur eucaryote va pouvoir fonctionner. On peut étudier la fonction des gènes. Une fois que la protéine est produite, il faut la purifier. Pour cela, on rajoute à l’insert une petite séquence d’ADN, qui va représenter un tag. Par exemple, on rajoute à la cellule 6 histidines, en fin. On fait passer ce lysa bactérien sur une colonne de nickel, qui retient uniquement la queue de 6 histidines.

C.

Stratégie de clonage

On va coller 2 molécules d’ADN. On a une enzyme qui intervient : la ligase. On va d’abord devoir découper l’ADN avec des enzymes de restriction. D’un point de vue pratique, on va d’abord préparer l’insert, découpé par 2 sites EcoRI

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Semestre 4 EcoRI

EcoRI EcoRI + EcoRI + EcoRI électrophorèse EcoRI

EcoRI

élution

Ligation

Schéma 3 Supposons que le plasmide n’ait pas de site EcoRI : Schéma 4 Conclusions du schéma 4 : impossibilité de faire les liaisons AC et GT. On parle alors d’incompatibilité. Quelques fois, l’expérimentateur n’a pas le choix. Si l’on fait la stratégie précédente, c’est impossible. On peut utiliser la propriété qui dit que si les extrémités 3’ et 5’ sont proches, elles peuvent se coller, dans le cas de coupures à bouts francs. Si l’on a incompatibilité, il faut transformer les sites de restrictions, en les passants d’extrémités collantes à extrémités franches. Pour transformer une extrémité à bouts collants en extrémités à bouts francs, on utilise la nucléase S1. Elle coupe les nucléotides en trop. On peut aussi utiliser la DNA polymérase, qui comble les vides. Schéma 5 Le problème, c’est que l’on obtient un plasmide avec un insert, mais on n’a plus de site de restriction, ni BamHI, ni EcorRI. Si l’on traite par la DNA polymérase, le site de restriction n’y est plus non plus. Donc quand on transforme un site de restriction, en général, on le perd. La question est donc « comment préserver au moins un des 2 sites ? ». La démarche est simple : l’insert qui porte EcoRI, on va lui mettre une DNA polymérase. Le plasmide qui porte BamHI, on le coupe par S1. Ceci conserve le site EcoRI. Si l’on veut garder BamHI, il faut inverser les ajouts (BamHI  DNA poly ; EcoRI  S1). Les isoschizomères sont les enzymes de restriction différentes qui reconnaissent le même site de restriction. Par exemple : KpnI et Acc56I

GGTACC CCATGG

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D.

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Efficacité  Ligation

facilement éliminée : pas de résistance

On traite le plasmide par la phosphatase alcaline. Il va avoir alors 2 extrémités OH en 5’ et 3’. La ligase fait une liaison phosphodiester, mais vu qu’il n’y a plus de phosphate, elle ne peut pas. On empêche donc le plasmide de se refermer. La ligase va faire une liaison phosphodiester. Il n’y a pas de sens d’intégration de l’ADN.

VII. Sondes nucléotidiques Sonde : ADN/ARN Une sonde sert à repérer des fragments de gène spécifiques. La réaction entre sonde et cible est une hybridation. La sonde soit être marquée soit radioactivement, soit par fluorescence. Une sonde peut avoir 2 grandes utilisations : caractériser la structure des gènes (en combinaison avec la cartographie de restriction), cribler de banques d’ADN (cibler un gène spécifique). L’ADN doit être simple brin si on l’utilise comme sonde. Il faut donc d’abord dénaturer un ADN double brin pour pouvoir l’utiliser comme sonde. Nous ne parlerons ici que de sondes à ADN. Il y a 2 catégories de sondes à ADN, qui dépendent de l’utilisation que l’on veut en faire : les sondes oligonucléotidiques (jusqu’à 30-40 bases, très petites séquences, fabriquées par synthèse chimique), et les sondes à ADN (fragments de gènes ou gènes entiers, pas de limite de taille). L’hybridation repose sur la température. Les sondes sont plus facilement manipulables quand elles sont longues. Comment introduit-on un marquage dans une sonde ?

A.

La technique de marquage

Il faut pouvoir repérer la sonde associée à la cible. Il faut utiliser un isotope. On parle de marquage chaud quand on introduit un marquage radioactif. Le marqueur le plus utilisé est le phosphore 32 (32P), qui émet des rayons β- dures. Ce sont des rayons puissants, mais arrêtables par quelques millimètres de plastique. Il est facilement détectable. La période est de 14 jours. C’est un avantage et un inconvénient, avantage parce qu’il est facile d’éliminer la radioactivité (au bout d’un an, il n’y a plus de radioactivité). On cherche à les remplacer par des marqueurs froids, des marqueurs fluorescents, mais l’appareillage est couteux, et c’est moins facilement détectable.

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B.

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Les différents types de marquage

1. Les sondes oligonucléotides Ce sont des petites séquences d’ADN, réalisées par synthèse chimique, la synthèse de ces sondes est très simple, fabriquée par des sociétés spécialisées, par des ordinateurs. Les extrémités sont des OH. On peut alors facilement introduire un phosphate radioactif, puisque l’ADN est déphosphorilé. On ajoute donc des dATP marquées au 32P sur le P γ, et le phosphore est transféré sur l’extrémité 5’. 2. Il y a 2 techniques :

Les sondes à ADN

a) Nick translation ou « déplacement de brèches » Cette technique nécessite d’utiliser un ADN double brin pour le marquage. On utilise de la DNase I pour faire des brèches. On travaille à température basse, de 0 à 4°C. Ensuite on fait agir une autre enzyme : la Klenow polymérase, qui va dégrader l’ADN présent dans les brèches en le remplaçant par d’autres bases. On utilise souvent du dCTP ou du dATP pour introduire de la radioactivité, et ici, le phosphore radioactif est l’α. On obtient alors un ADN radioactif sur ses 2 brins. Avant d’utiliser cet ADN comme sonde, il faut le dénaturer par la chaleur. On fait bouillir la sonde à 100°C. L’ADN s’ouvre, et on peut l’utiliser. b) Random priming ou l’amorçage au hasard. Elle est plus robuste et plus facile à utiliser. C’est la plus utilisée. Elle repose également sur l’action d’une polymérase, mais il n’y a pas de DNase. On part encore d’un ADN double brin que l’on dénature préalablement (100°C) pour le rendre simple brin. Cet ADN va être mis en présence d’oligonucléotides de synthèse, qui font en général 6 bases. Ces oligonucléotides représentent toutes les combinaisons possibles. C’est un mélange de 4096 molécules différentes. Cette séquence sert donc d’amorce, et donc on va pouvoir commencer la synthèse d’ADN. Si l’on met un nucléotide radioactif, on va intégrer la radioactivité, le plus souvent par des dCTP ou des dATP. Si l’on compare les 2 méthodes, on pourrait par exemple faire des marquages des extrémités. Cependant, on ne le fait pas sur des fragments longs, car on a une meilleure sensibilité en incorporant de la radioactivité tout le long plutôt qu’aux extrémités. On cherche à avoir la meilleure sensibilité possible, on appelle cela l’activité spécifique d’une sonde, c’est la quantité de radioactivité incorporée par unité de masse. Fixation sur gel, dans des colonnes de sepharose/sepharolex. Ca permet de séparer l’ADN radioactif des nucléotides qui n’ont pas été incorporés. On dépose donc les fragments et on récolte les molécules. Ce sont les molécules d’ADN qui sortent les premiers, dans le cas d’une colonne à exclusion, parce que les nucléotides sont retenus dans des billes, alors que l’ADN passe à coté. On mesure l’activité, qui présente 2 pics, l’un pour la sortie d’ADN, l’autre pour la sortie de nucléotides. Le problème que présentent ces 2 techniques est lié à la séparation des 2 brins. En effet, en hybridant les brins d’ADN, ils peuvent s’apparier de nouveau, ce qui diminue la sensibilité et l’efficacité de ces sondes. Les sondes à ARN sont beaucoup plus efficaces.

C.

La cartographie génomique

On appelle la technique de cartographie génomique la technique de Southern. On cherche à faire la carte de restriction d’un gène, directement à partir d’une carte génomique. On fait une carte de

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Semestre 4

restriction pour connaître la structure d’un gène, localiser les introns et les exons, localiser les séquences régulatrices, mettre en évidence le polymorphisme qui peut être lié à des mutations ponctuelles, des délétions, des re-manipulations… Si l’on pouvait faire ça sur tous les gènes sans les cloner, ce serait un énorme gain. Pour le faire, il faut prendre une cellule, en extraire l’ADN génomique, et prendre un gène d’intérêt. On fait la cartographie de cette région directement sur l’ADN sans avoir à l’isoler. On applique des enzymes de restriction qui découpent en fragments. On fait ensuite une électrophorèse qui permet de déterminer des tailles de fragments. On peut utiliser cette technique sur un plasmide, mais pas sur un génome complet. On a des problèmes de : 1. Sensibilité On prend un ADN génomique (3 milliards de paires de bases), la sensibilité au Bromure d’éthidium n’est pas assez forte pour permettre de visualiser la séquence d’ADN donnée. 2. Nombre de fragments obtenus Si l’on prend une enzyme de restriction dont le site a 6 paires de bases, on aura une taille moyenne des fragments de 4 kilo bases, et l’ordre de grandeur sera d’environ 1 million de fragments différents. On en aura parmi eux 1 ou quelques uns qui correspondront à ce que l’on cherche. Cependant, si l’on met sur gel ce million de fragments, la taille moyenne est de 4 kilo bases, on aura par exemple des variations d’une base, et donc en électrophorèse, on n’aura pas de bandes spécifiques, mais une trainée, qui contient le fragment du gène qui nous intéresse. Mr Southern a eu une bonne idée, il voulait repérer de manière spécifique le fragment que l’on cherche. Pour cela, on va hybrider l’ADN avec un fragment radioactif, ce qui va nous permettre de retrouver les bandes de la séquence d’intérêt, en ré-augmentant la sensibilité de la méthode.     

3. Le principe de la méthode On prend une cellule On extrait l’ADN génomique On fait agir les enzymes de restriction On fait une électrophorèse en gel d’agarose On fait réagir en incorporant des sondes radioactives.

Il y a 2 problèmes physiques qui vont se poser. On travail en général autour de 65°C. Cependant, physiquement, l’ADN est en gel d’agarose. Et si l’on fait chauffer l’agarose, il va se disperser. Donc l’ADN va sortir du gel. De plus, l’hybridation dans les conditions précédemment décrites ne peut pas avoir lieu. En effet, la sonde est une molécule simple brin, qui s’apparie sur l’ADN par complémentarité. Or l’ADN du gel est double brin. Donc la sonde ne peut pas s’apparier. Il faut donc le dénaturer. Si l’on dénature l’ADN, on va pouvoir l’hybrider. Il faut donc le chauffer. Mais l’agarose va fondre. Donc avant de faire l’hybridation, il faut le dénaturer, de manière chimique, en le traitant à la soude. Pour que l’ADN ne parte pas, on va remplacer le support de l’ADN, l’agarose, qui est mou, sur un support solide. C’est ce qu’on appelle un transfert. C’est la base de la technique de Southern. On va transférer cet ADN sur une membrane en nitrocellulose, ou en nylon chargé. On met sur ce support un papier absorbant qui trempe dans une solution de transfert. Au dessus de ce gel, en contact avec le gel, on met une membrane de nylon, qui épouse la forme. Au dessus, on met du papier absorbant, avec un poids dessus.

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Techniques en bio mol BH 04

Semestre 4

Le transfert est une hybridation. Une fois qu’on a obtenu l’ADN sur la membrane, on colle un film par-dessus, et en faisant une autoradiographie, on n’obtient qu’une bande, correspondant à notre fragment. Le principe de la pré-hybridation est de bloquer les sites non spécifiques. On prend par exemple un ADN de poisson, on sature la membrane, de façon à ce qu’il ne reste que le site correspondant à ce que l’on cherche. Pour l’expérimentateur, on cherche à avoir l’expérimentation la plus rapide. On va donc se mettre dans les conditions où l’expérience sera la plus rapide. Pour cela, il faut connaître les compositions en bases (longueur, %GC), le pourcentage d’homologie (appariements, complémentarité). Tout cela intervient su le T°m. Le premier critère d’hybridation est la concentration en sonde. Plus la sonde va être concentrée, plus la réaction va être rapide. D’un point de vue pratique, la concentration en sonde est toujours faible, et donc la vitesse d’hybridation va être faible. La conséquence est que si l’on travaillait dans ces conditions, il faudrait plusieurs jours pour faire une réaction. La nucléation, c’est quand la sonde va venir s’hybrider, sur une partie. Si le reste de la sonde n’est pas complémentaire, on ne va pas pouvoir étendre la nucléation. Si la température augmente, la partie son appariée fond. La sonde ne va se fixer définitivement que si tout est complémentaire. Ce processus, plus il va être rapide, plus le processus d’hybridation va être rapide. Les chaines d’ADN on plutôt tendance à se repousser qu’à s’apparier. Ce phénomène contrebalancé est défavorisé par les bases chargées négativement sur la sonde et sur le brin. On va donc contrebalancer les charges négatives, ce qui va favoriser la nucléation. On doit donc augmenter la concentration en sel NaCl, ce qui neutralise les charges phosphates, et donc contrebalance les charges négatives. C’est un processus en fermeture éclair. L’effet positif sur la vitesse a un effet négatif sur l’hybridation, car l’augmentation de la concentration en sel diminue la spécificité. Une sonde est spécifique de sa cible. La sonde doit s’hybrider à un endroit et à un seul. En ajoutant le sel, on va autoriser la sonde à s’hybrider à des endroits non complémentaires. On perd de la spécificité. On va faire apparaître des signaux anormaux. On dit qu’on est en faible stringence. On va donc diminuer le T°m de la sonde. On veut maintenant éliminer les mauvais hybrides. 4. Procédure du lavage Pour faire ce lavage, on va diminuer la concentration en sel. On va donc repasser dans une condition en forte stringence. Le T°m de ces mauvais hybrides est faible. On va repasser au dessus du T°m. T°m = 81,5 + 16,6 (log NaCl) + 0,41 (%GC) - 500/L – ½ (100-h) L : longueur de la sonde 5.

A

h : % homologie

La technique de Southern

A

2kb

A

3kb

A

1,5kb

A

4kb

A

5kb

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Semestre 4

Pour un individu malade, si on élimine le 4ème A, on n’aura qu’un seul fragment détecté :

5,5

4

1,5

On peut dire que l’individu est homozygote, puisqu’il a 2 copies identiques. Dans les cellules cancéreuses, le gène est recopié de nombreuses fois. Si le gène est amplifié :

6. La technique de Northern On prend une cellule, on extrait les ARNm, et on fait une électrophorèse :

28S 18S

Sonde ADN Transfert par membrane Nylon +

Autoradiographie

4S

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Techniques en bio mol BH 04 7.

Semestre 4

Banques d’ADN

a) Clonage des gènes L’objectif d’un clonage, qui correspond au fait que l’on veuille isoler un gène, et donc l’isoler de son contexte génomique et de l’amplifier, afin d’en obtenir des quantités importantes, pour étudier sa structure, ou en faire un outil de biologie. Le clonage passe par différentes étapes, qui correspondent à la création de banques d’ADN. 3.102 pb 3kb

ADNg

découpage : on obtient un mélange de fragments

On construit ensuite la banque d’ADN, en mélangeant les fragments avec un vecteur, et on va obtenir une collection de vecteurs, et un des vecteurs contient le gène d’intérêt. Une banque d’ADN est une collection de fragments qui recouvrent l’ensemble du génome. On fait ensuite un criblage de la banque, qui fait appel à l’utilisation des sondes. On repère quelle bactérie possède le bon fragment b) Construction de la banque Elle est obtenue par découpage de l’ADN génomique (ADNg). Ce sont des Banques d’ADN génomique. Il existe un autre type de banques, les banques d’expressions, mais elles ne nous intéressent pas ici. Le découpage de l’ADN. Ensuite, le scientifique se pose la question de la quantité de travail à faire. En effet, si l’on découpe en plus petites parties, il y a plus de fragments à analyser. En effet, si l’on fait des fragments de 3kb, il y aura 106 fragments à analyser. Si l’on en fait de 30kb, on n’aura plus que 105 fragments à analyser. Il se pose donc un problème de taille. Ensuite, on se demande quel type de vecteur utiliser, puisqu’il fait varier la taille aussi. La première contrainte est d’avoir la plus grande taille possible pour limiter le travail, mais le vecteur marque une taille maximale. On prend donc des fragments de 10 à 30kb. N = [Ln (1 – p)] / [Ln (1 – T/G)] 10 kb 20 kb 30 kb

p : probabilité I : taille des fragments G : taille du génome 1,6.106 0,8.106 0,5.106

1ère notion ? 2ème notion : Le meilleur moyen de découper 1 ADN est de prendre une enzyme de restriction qui va reconnaître la partie à couper.

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Techniques en bio mol BH 04 E

E

E

Semestre 4 E

E

On veut une taille de 10kb. On a 3 enzymes :   

E4 = 256pb E6 = 4096pb E8 = 65536pb

En utilisant E4, on est sûr de couper au hasard, même si la taille n’est pas très bonne.

VIII. Vecteurs A.

Plasmides

On prend les fragments et les vecteurs, on fait une ligation. On obtient différents types de vecteurs. On les met dans E. Coli. On en fait des colonies. E. Coli peut être transformé en plasmides. Mais là, on a un mélange de plasmides, et la transformation est relativement faible. La re-transformation est d’autant plus faible que la taille est forte. L’efficacité de transformation d’un plasmide est donc très faible. Les plasmides qui font 15kb, ils vont être mal transformés. Le problème des plasmides est que leur capacité de transformation est faible. 10kb est la taille limite de transformation d’un plasmide. On les a donc peu utilisés en pratique.

B.

Bactériophage λ

Le bactériophage λ infecte E. Coli, il est tempéré, c'est-à-dire qu’il a une phase lytique et une phase lysogénique. Une fois qu’il a infecté, il fait une lyse. Une plage de lyse apparaît, qui résulte d’une infection bactérienne. Tapis bactérien

Plage de lyse

Le virus s’intègre dans le chromosome.

ADN linéaire = 50kb COS

complémentaires

COS

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Techniques en bio mol BH 04

Semestre 4

Réplication Phase précoce

Phase tardive : Réplication cercle roulant :

COS

COS

COS

COS

COS

Protéines virales

ADN viral Si on prend l’ARN viral, il va être divisé en 3 tiers. La partie centrale sert uniquement pour la phase lysogénique (intégration et développement du virus). Donc si l’on élimine cette séquence, ça ne va pas empêcher la phase lytique. On élimine la partie centrale, et on la remplace par d’autres fragments. On les mets avec des protéines virales, et on le mélange. On dépose la solution de phage, et chaque partie est remplie de phages.

C.

Les cosmides

Taille dans fragment peu importante, technique lourde. Différence avec avantages dans plasmides et phages (mais même comportement). Ils se comportent comme un phage dans les premières étapes, et comme un plasmide dans les dernières. La structure de la molécule de cosmide est simple :

cos

cos

cos

E + Protéine de phage E

ori

AMP

cos

E

E ori

AMP

cos

AmpR Ori

40kb

Ligation Les deux conditions sont : la présence de séquence cos, et que la taille entre les 2 séquences cos sont compatibles avec la taille du génome d’un phage λ. L’intérêt est que la séquence de cosmide entre 5

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Semestre 4

et 10 kb est suffisante, donc on va pouvoir insérer au minimum 40 kb de génome étranger. L’ensemble des virions correspond à l’ensemble du gène. On a donc un mélange de virion, et on le met en contact avec des bactéries :

cos cos

Le cycle se referme.

cos Amp Ori Elles présentent de grands avantages, donc on en trouve un grand nombre dans le commerce. Il existe de nombreux autres vecteurs, comme par exemple les YAC (yeast artificial chromosome). Ce sont des chromosomes modifiés de levure, et on les utilise pour séquencer les génomes.

IX.

Le criblage

C’est l’étape la plus importante. On utilise des sondes, qui doivent être complémentaires avec les séquences recherchées. Cependant, on veut repérer un gène, parce qu’on ne le connais pas. Or on ne connaît pas sa séquence, donc on ne connais pas la séquence de la sonde. Il y a 2 moyens de s’en sortir, on utilise 2 types de sondes :



Les sondes-gènes orthologues

Un gène orthologue est un gène identique dans des espèces différentes. Or les gènes orthologues sont relativement proches, donc les séquences sont très conservées. On peut donc les utiliser comme sonde.



Des informations sur la protéine

Si l’on a des informations sur la protéine, on peut essayer de faire une sonde nucléique. On réalise donc un criblage. Mettons que l’on est dans une bande de cosmides. On obtient des colonies, sélectionnées sur la base de résistance à l’antibiotique. Chaque colonie possède une partie du gène différente. On va

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Techniques en bio mol BH 04

Semestre 4

cependant devoir changer de support. Pour cela on va faire une réplique, en prenant un morceau de tissus en velours que l’on appose sur la boite en exerçant une certaine pression. Les colonies vont venir se coller, elles se détachent de la boite. Ensuite, on appose ce velours sur une boite, puis sur une autre. On obtient alors de nouvelles colonies, images de la première. Puis sur une des 2 boites, on dépose une membrane en nitrocellulose ou en nylon, qui épouse parfaitement la forme de la boite. Une fois que l’on a retiré cette membrane, les cellules sont collées à la membrane. Ensuite, on va devoir ouvrir les cellules, en les traitant au SDS qui lyse les membranes, et donc l’ADN va se fixer sur la membrane, qui a de l’affinité pour l’ADN. On va en plus mettre de la soude, pour dénaturer l’ADN. On fait ensuite une autoradiographie, puis on place le film sur la boite mère, et on peut ainsi repérer les cellules d’intérêt. Si l’on a une banque de phages, le principe est presque le même, mais on n’aura pas de colonies, mais des plages de lyse (trous remplis de phages). Chaque plage de lyse correspond à 1 ADN. On remet donc le velours, et on va les répliquer sur un tapis bactérien, et on obtient une copie.



Comment faire une sonde à partir d’une séquence protéique ?

Lorsque l’on a isolé la protéine, on a déterminé une séquence protéique complète ou totale. On veut déterminer une séquence nucléique à partir d’une séquence protéique. On utilise pour cela le code génétique. Cependant, le code est dégénéré. On peut donc déterminer une séquence, mais elle n’est pas parfaite. Or la notion sonde cible repose sur une définition parfaite. La sonde sera toujours un oligonucléotide, parce que l’on sait les synthétiser chimiquement facilement. La première question à se poser est : quelle doit être la taille de la sonde ? Il faut que la sonde soit spécifique, et ne pas s’hybrider n’importe où. Donc la taille doit être suffisante pour ne pas s’hybrider partout. Plus on augmente la taille, plus on augmente la spécificité. On va s’arrêter quand on va être sûre qu’une séquence donnée ne va pas être trouvée au hasard sur le génome. Donc quand la probabilité sera supérieure à la taille. On calcule P0, qui est la probabilité de trouver une séquence : P0 = (f/z)(a+t) x (1 – f/z)(c+g)

f = fréquence en AT

Q = P0 x ZN

N = taille du génome

n=a+t+c+g

n= Q= 10 4700 12 280 14 16 16 1 18 0,06 20 4.10-3 Donc la taille moyenne des fragments est de 20. On a donc besoin d’une séquence d’au moins 7 acides aminés. Cependant, avec 7 acides aminés, on n’est pas certains de notre séquence. En effet, les acides aminés peuvent avoir plusieurs séquences. Pour ceux qui n’ont qu’un seul codon, il n’y a pas de problème. Mais on en a qui en on 2, 4 voire 6. Donc avec une séquence en acides aminés, on ne peut être sûr de notre séquence. Et seule la séquence parfaite va se fixer. Supposons que l’on ait 7 acides aminés, et on veut en déduire 7 nucléotides. On suppose que chaque acide aminé ait 4 codons. Donc il faut en faire 46 (6 20 nucléotides, c’est 4x6+2. Or le dernier, ne changeant que sur son dernier nucléotides, il ne compte pas). Donc sur les 46 = 4096 séquences, il n’y en a qu’une qui

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Semestre 4

fonctionne. Si par chance on a 4 acides aminés avec 4 codons, et 2 avec 2 codons. On obtient donc 1024 séquences. On fait donc un cocktail de sondes qui contient obligatoirement la bonne séquence.

X.

Banques génomiques

Une banque d’expression correspond à une banque des ARN de cellules. On part d’une cellule, on extrait les ARNm. On obtient une collection d’ADNc, on leur met des vecteurs, et on en fait des banques. Les ADNc sont des copies des gènes. Le gène contient des exons, des introns, et des portions régulatrices. Les ADNc n’ont que les exons. Cependant, les ADNc sont spécifiques. Il faut donc choisir où l’on prend les gènes. Le génome est identique dans toutes les cellules, à quelques exceptions près, donc on devrait pouvoir prendre n'importe quelle cellule pour faire des banques. Si l’on veut faire une banque humaine, on utilise des cellules placentaires (gratuit, grosses quantités, frais).

XI.

L’ultracentrifugation

Elles permettent d’obtenir des ADN de qualité. Il y en a 2 types : l’une est basée sur un gradient de saccharose (gradient discontinu de saccharose en couches), la séparation se fait suivant la taille des molécules ; l’autre est basée sur un gradient de chlorure de césium, la séparation se fait suivant la densité des molécules, c’est un gradient continu (on prend un tube dans lequel on met l’ADN en présence de chlorure de césium, et on mélange, l’ADN se distribue dans tout le tube. Après centrifugation, on obtient un gradient, et l’ADN se place à l’endroit où il y a la même densité). On fait une culture d’E. Coli sur un milieu en présence de phosphore 32, et donc on obtient une culture marquée. On fait de même avec de l’azote 15 (non radioactif, apporte une densité supérieure). On prend 100 µg d’ADN de la première solution, et on les met d’un coté en gradient de saccharose, et de l’autre sur un gradient de chlorure de césium. On fait les centrifugations, puis on perce un trou au fond des tubes, et on obtient des fractions, sur lesquelles on compte la radioactivité (CPM). Saccharose 1h Cpm

Saccharose 48h Bas du tube

Haut du tube Fraction Chlorure de césium 1h

Chlorure de césium 48h

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On fait ensuite un mélange des deux, on refait les gradients, et on refait la même expérience : 1h

Chlorure de césium 48h

Il faut, pour voir la 2ème expérience, superposer l’absorbance. Ensuite, on mélange les 2, on chauffe à 100°C, puis on diminue lentement la température, puis on fait des gradients. Chlorure de césium 48h

A

B

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