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UE2 – BIOPATHOLOGIE Georges Date : 21/09/2016 Promo : P2 2016/2017

Plage horaire : 14-16h Enseignant : A. Georges

Ronéistes : CHANE-LAI Caroline PAYET Audrey

MARQUEURS BIOLOGIQUES DES CANCERS Dépistage et Suivi I) 1) 2) 3)

Histoire naturelle et Marqueurs de prédisposition Histoire naturelle des cancers Quels marqueurs des cancers ? Marqueurs de prédisposition

II) MT circulants (MT= Marqueurs tumoraux) 1) 2) 3)

Qualités théoriques des MT Origines des MT Les méthodes de dosage au laboratoire = Immunodosages

III) Lecture d’un résultat IV) Principaux MT utilisés V) Applications à la clinique 1) 2) 3) 4)

Dépistage Diagnostic Evaluation du traitement Cinétique

VI) Quelques exemples 1) 2) 3)

1

PSA et prostate (PSA=Antigène Prostatique spécifique) CA15.3 et sein Tg et CDT (Thyroglobuline et Cancer Différencié de la Thyroïde)

I. Histoire naturelle et marqueurs de prédisposition Schéma à apprendre

On considère que le dosage de MT (= marqueurs tumoraux) est proportionnel à la quantité de tissus cancéreux. Dans la maladie cancer, il y a plusieurs étapes : 1) Etape muette = stade infraclinique A ce stade, la maladie est silencieuse (on ne peut pas la dépister, pas de symptômes). C’est le temps qui s’écoule entre la naissance d’une première cellule transformée (ATTENTION : pas encore tumoral à cette transformation mais dysplasique) et le moment où elle devient cancéreuse. Un certain nombre de facteurs cancérogènes ( ces derniers pouvant être soit initiateurs, soit promoteur) vont agir sur une cellule qui présente une condition cancéreuse éventuelle, créer une lésion précancéreuse et la transformer par la suite en cellule cancéreuse. A ce stade le médecin peut passer complètement à côté du diagnostic. 2)

Phase clinique

Lorsqu’on peut dépister ce cancer, on peut considérer qu'un certains nombre de cellules sont devenues tumorales: C’est là qu’on utilise les MT (l’idéal c’est que ce MT soit présent dès le début de cette phase car plus on dépiste tôt, mieux on peut traiter.) Selon le nombre de ces cellules tumorales présentes, la maladie sera parlante cliniquement, biologiquement, sur les techniques d’imagerie. On a également une phase préclinique où il n’y a pas de symptômes mais où on peut dépister. Dans la phase clinique, il y a des symptômes ( les premiers symptômes apparaissent à un gramme de tumeur) et le patient évoluera vers le décès si le nombre de cellule tumorale est trop important mais également si pas de thérapeutique, ou thérapeutique non efficace. L'évolution de la maladie va être déterminée par le nombre de cellules tumorales restées dans l'organisme. Cette phase clinique se déroule lorsque le cancer devient invasif. Voici donc l’évolution d’un cancer du stade pré-cancer à un stade de cancer avéré (invasif) jusqu’au décès éventuellement par évolution spontanée de la maladie. Ce qui est intéressant c'est de pouvoir dépister un cancer à la limite entre le stade infraclinique et le stade clinique. L'idéal est donc de le dépister avant l'apparition des premiers signes cliniques. Cela est parfois 2

possible, notamment avec les dépistages systématiques qui concernent par exemple le cancer du sein (avec la mammographie).

1) Histoire naturelle des cancers Voici les différentes étapes du cancer :  Stade infraclinique (initiation, promotion, progression…) Ce stade est caractérisé par une absence de symptôme et il est d'une durée variable. Exemple : Dans certains cancers du sein, cette étape dure 5 ans environ (avant le début de la maladie). On a des prédispositions cellulaires qui sont influencées par des facteurs environnementaux et des modes de vie, qui vont déclarer le cancer. Cependant on ne le sait pas et on n’a pas de moyens de le mettre en évidence. 

Dépistage et diagnostique

Certains marqueurs, pas forcément biologique, ainsi que les techniques d'imagerie permettent de dépister le cancer avec une assez bonne fiabilité. Cependant, les marqueurs tumoraux sont peu utilisés au stade de dépistage. Ce qui est regrettable car si on pouvait tous les utiliser, ce serait facilitant puisqu’on pourrait agir sur la maladie à des stades très précoces. Le diagnostic d'un cancer se fait après un prélèvement, après une biopsie, après une ponction, avec une mise en évidence des cellules qui sont des cellules dissuasives, qui sont des cellules pathologiques. Si les premiers symptômes apparaissent ou s’il y a un diagnostic positif, on établit un bilan diagnostique et un bilan d’extension, qui vont permettre de déterminer la gravité de la maladie (qui fait souvent appel à des techniques d’imagerie (traditionnelle, scintigraphie…) avec l’aide des MT : Éléments de pronostic de la maladie -

Élément prédictif de réponse à la thérapie (évolution de la maladie)



L’ensemble de ces éléments conditionnera le traitement (chirurgical, radiothérapie, chimiothérapie, hormonothérapie). On va déterminer un traitement le plus adapté possible 

Traitement – Evaluation du traitement

Le traitement privilégié du cancer est la chirurgie. Mais après une chirurgie, ou même lorsque la chirurgie est impossible, il est important de mesurer l'efficacité du traitement. L'évaluation de l'efficacité du traitement se fera grâce à des dosages de marqueurs. Et ces dosages vont permettre de déterminer s'il est utile de continuer le traitement ou s'il faut le changer. 

Surveillance

C'est la phase qu'on espère la plus longue possible. La surveillance de la maladie se fait grâce à des dosages de marqueurs ou grâce à l'imagerie. C'est dans cette phase de surveillance de la maladie (après une rémission non complète) que l'on va utiliser le plus ces dosages de marqueurs : pour déceler une récidive ou une réascension. 2)

Quels marqueurs des cancers ?  Marqueurs tissulaires exprimés directement au niveau de la tumeur (pour les laboratoires d’histologie et cytologie/ laboratoire d'anatomo-pathologie). C'est grâce à ces marqueurs que l'on va diagnostiquer et typer la tumeur. Ces marqueurs tissulaires peuvent être : - Génomiques (ADN tumoral)

3

- Immunohistochimiques (comme des récepteurs hormonaux) - Cytosoliques : récepteurs hormonaux au niveau du cytosol. Utiles dans le cancer du sein car selon la présence ou non de ces récepteurs hormonaux, la patiente disposera de 2 types de thérapeutiques différentes.  Marqueurs génomiques de l’individu Gènes de prédisposition (recherchés dans les laboratoires par des techniques de biologie moléculaire) 

Marqueurs exprimés et sécrétés par la tumeur (LES PLUS COURANTS) Ils deviennent des marqueurs circulants (sériques, même s’ils ne sont pas seulement appréhendés dans le sérum) que l’on va doser avec des techniques simples que l’on peut utiliser en routine dans des laboratoires de biologie médicale de ville ou hospitalier. On peut également les appeler biomarqueurs. 3)

Marqueurs de prédisposition

Ils déterminent des facteurs de risque (en terme statistique). Si on met en évidence tel gène chez un cas index ou de manière fortuite après une enquête génétique d’un apparenté de cas index, cela augmentera le risque d’un individu de développer un cancer. - Entre 5 et 10% des cancers sont des formes héréditaires. - Mais a contrario, dans les cancers du sein, côlon, prostate, l'hérédité est plus forte (ils sont héréditaires dans 10% des cas). - On sait que la transmission d’un gène altéré va entraîner un risque de cancer élevé de 50 à 70% (pour les risques les plus importants). Différence entre anomalie somatique et anomalie constitutionnelle à savoir. Anomalie somatique : limitée aux cellules tumorales, non transmissible. Anomalie constitutionnelle : touche toutes les cellules, y compris les gamètes, donc transmissible (à la descendance). Pour qu’une personne présente un marqueur de prédisposition, il faudra qu’il ait une anomalie constitutionnelle génétique qui lui aurait été transmise par un apparenté. NB : Les marqueurs de pré-disposition sont des marqueurs génomiques. A)

Démarche diagnostique des formes héréditaires

C’est-à-dire qu’on présente un risque statistique plus important que la population générale de développer un cancer dès lors que l’on présente une mutation ou anomalie d’un gène). Elle présente 3 étapes : Confirmer une prédisposition héréditaire chez une personne atteinte de cancer Identifier la mutation prédisposante Prise en charge adaptée du patient

B) Confirmer la prédisposition à un cancer héréditaire Plusieurs critères permettent de supposer qu’un cancer est héréditaire : Sur des caractères histologiques ou génomiques de la tumeur Exemple : Cancer colique (instabilité des microsatellites) - Cancer médullaire de la thyroïde (gène Ret) 4

Sur des critères purement génétiques Lorsqu’on voit un nombre de cas similaires d’une même branche d’hérédité, on envoie le patient chez le médecin généticien pour rechercher certaines prédispositions génétiques. Sur des critères communs aux formes avec prédispositions héréditaires Par exemple la multifocalité (c’est lorsqu’un cancer a plusieurs foyers de localisation dans le même organe) C’est aussi la précocité de l’âge de survenue : cancers coliques HNPCC = cancer héréditaire du côlon survenant avant 40 ans (mutation des gènes MMR)

C) Identifier la mutation On cherche à identifier la présence ou l'absence des mutations les plus communes (exemple : Ret pour le cancer médullaire de la thyroïde). Chez une personne atteinte (cas index) Si la mutation est retrouvée, on va la rechercher chez les apparentés (les apparentés sont les descendants mais aussi les ascendants).  Probabilité de 50% de retrouver cette mutation chez les apparentés au premier degré (enfant, fratrie) car transmissible de manière automatique par les gamètes. Pour identifier cette mutation, on peut le faire par : - Séquençage direct du gène (quand on peut trouver un séquenceur) - Par des méthodes d’amplification de type PCR = recherche délétion partielle ou totale d’un gène Ces maladies à transmission et prédisposition génétiques ont une prise en charge particulière parce que les patients sont orientés, vus en consultation pluridisciplinaire avec un médecin qui va prendre en charge la tumeur, mais également un médecin généticien et un laboratoire qui va faire des recherches de mutations susceptibles d’affirmer que tel ou tel individu de la branche familiale est atteint.

Principaux cancers et gènes impliqués

D)      

Sein : BRCA1 (risque 65%) (exemple : Angélina Jolie) ; BRCA2 (50%) Ovaire : BRCA1 (30%), BRCA2 (11%) Côlon non polyposique : MLH1, MLH2, MSH6 (70%) K médullaire thyroïdien des NEM 2 (néoplasie endocrinienne multiple) : RET (> 90%) Rétinoblastome : Rb 1 (>90%) Mélanomes : P16, CDK4 (60%)

E)

Cancer médullaire de la thyroïde

Tout d'abord, il faut savoir qu'il existe deux grands types de cancer de la thyroïde : Cancer Médullaire de la Thyroïde (qui se forme à partir des cellules C, qui sécrètent un peptide -> la calcitonine, cette calcitonine est donc un marqueur du Cancer Médullaire de la Thyroïde.) Un dosage de calcitonine qui met en évidence une calcitonine élevée, c'est-à-dire au delà du seuil de discrimination, est en faveur du cancer médullaire de la thyroïde. Ce type de cancer est le moins fréquent des cancers de la thyroïde. NB : La calcitonine est un marqueur très orientant de CMT, alors que ce n'est pas le cas pour pas mal d'autres marqueurs biologiques. 5

-

Cancer Différencié de la Thyroïde, pour lequel le marqueur est la Thyroglobuline.

En ce qui concerne le CMT (Cancer Médullaire de la Thyroïde) : - Une enquête génétique devant tout cas de CMT chez un cas index et qu’on met en évidence une mutation du gène RET. Lorsqu’on fait le diagnostic histologique du CMT chez un cas index, on sait qu’il a potentiellement une forte composante génétique, donc le médecin va préconiser une enquête génétique et recherche de mutation du gène RET chez tous les apparentés du cas index (ascendants et descendants). -

Si présence de la mutation prédisposante chez un apparenté, ce dernier aura à peu près 100% de risque de CMT à 40ans

-

Dans ce cas, il sera préconisé une thyroïdectomie (ablation de la thyroïde) préventive dans le but d’éviter ce cancer médullaire à l’âge adulte. On fait de même chez l’enfant de 3 ans.

F)

Cancer sein – ovaire

Les mutations prédisposantes sont : BRCA1, BRCA2, qui sont des gènes relativement proches. Ces mutations exposent à un risque de 50 à 70% de cancer du sein  Surveillance accrue : clinique, radiologique  Prévention hormonale : ovariectomie en pré-ménopause  Mastectomie prophylactique sur sein controlatéral ou bilatéral prophylactique si la patiente est demandeuse. On attend que ces femmes porteuses de la mutation aient des enfants avant de leur proposer cette intervention.  Enquête familiale Ces mutations exposent aussi à 30% de risque ovarien  Ovariectomie prophylactique à partir de 40 ans, si la patiente est demandeuse.

II. Marqueurs tumoraux circulants (Témoins de la maladie cancéreuse ou « Biomarqueurs ») 1)

Qualités théoriques des MT

 Témoin précoce de la maladie Les marqueurs circulants permettent de détecter une tumeur avant l'imagerie conventionne et parfois, même avant les signes cliniques : ils permettent de détecter une tumeur à partir de 10^6 cellules alors que l'imagerie conventionnelle ne la détecte qu'à partir de 10^9 cellules et les signes cliniques qu'à partir de 10^12 cellules. Mais, il faut savoir qu'après les dosages, on aura les résultats d'imagerie qui vont venir se superposer aux résultats des dosages et qui vont permettre de distinguer ce qui est bénin de ce qui est malin.  Dosages biologiques = examens non invasifs et de faible coûts Paramètres facilement accessibles (liquides biologiques : sang (sérum), LCR (tumeur cérébrale : diffusion de ces marqueurs. Lorsqu’on met en évidence de l’AFP qui ne doit normalement pas être présent dans le LCR, on peut conclure que c’est en faveur d’un envahissement), liquide de ponction : pleurale, dans le cas de kystes : ovarien, du sein, pancréatique, thyroïdien…, liquide d’ascite comme lors d’un hépatocarcinome) Les conditions analytiques de dosages seront importants à savoir pour le biologiste dans ces différents sérum car les conditions ne seront pas les mêmes. Ils sont non opérateur dépendant 6

Question d'élève : Le prélèvement n'est-il quand même pas un peu invasif (aiguille, etc) ? Réponse : Oui c'est vrai que c'est invasif, simplement, je veux dire que ce n’est pas invasif comparé à la biopsie, à la ponction sternale.... 

Prélèvements répétés dans le temps -> suivi

Définition des marqueurs tumoraux circulants Pourquoi des marqueurs circulants ? Idéalement - Ils devraient être présents et exprimés uniquement lors de la transformation maligne de la cellule - Absents de la cellule normale - Ils devraient détecter un Ag spécifique de la tumeur En réalité - Les marqueurs tumoraux sont des Ag associés aux tumeurs - Ces Ag sont exprimés en quantité plus importante que dans la cellule normale : on cherche donc une augmentation de conentration physiologique. On a donc des marqueurs qui en réalité sont présents dans les tumeurs mais également dans les tissus sains, il faut donc prendre en compte les conditions physiologiques dans lesquelles le marqueur circulant apparaît, de ses valeurs mais surtout d'observer la cinétique des marqueurs (au lieu de prendre des valeurs isolées) pour avoir de bonnes analyses avec les marqueurs circulants. Le marqueur tumoral n’existe donc pas. Il faut faire la part des choses.

2) Marqueurs tumoraux Il y a plusieurs possibilités : - Production et réapparition d’une protéine dont la synthèse est normalement réprimée après la naissance, qu'on appelle Ag oncofoetaux Exemple: alphafoetoprotéine et antigène calino embryonnaire. - Nécrose cellulaire pouvant libérer dans la circulation des déterminants antigéniques partiels ou entiers - Sécrétion inappropriée d’une hormone ou d’une immunoglobuline (cette dernière est très sensible car concentration très fixe physiologiquement et ne doit pas trop augmenter, exemple : il y a augmentation d'une immunoglobuline monoclonale qui devient un marqueur du myélome ou il y a une augmentation dans certaines pathologies hématologiques.) - Production de protéines onco induites (accessibles aux techniques de dosage dans les liquides périphériques), c'est-à dire-que la maladie a entraîné la production de protéines qui normalement en situation physiologique n'existent pas. - Passage d’enzymes dans la circulation générale confinées normalement dans le tissu et qui passent dans le sang au-delà d’une certaine concentration. Exemple : le PSA existe à l'état physiologique dans le sérum, et lors d'un cancer de la prostate, avec notamment une effraction de la capsule, il se retrouve dans la circulation périphérique avec une concentration plus importante qu'en situation physiologique. Quelque soit les structures des MT on va pouvoir les doser avec des méthodes simples et reproductives.

3) Les méthodes de dosage au laboratoire = Immunodosages A)

Qu’est-ce qu’un immunodosage ?

Méthode aussi utilisée pour dosage d’hormones, stéroïde, etc…

7

Immunodosage : utilise le principe immunologique de la réaction antigène-anticorps (sans rien présager de l’activité biologique du marqueur que l’on va doser. Capacité de ce marqueur à produire une réaction immunologique mais ce n’est pas pour ça que le marqueur existant possède une activité biologique : bien comprendre la différence entre les capacités immunologique et l’action biologique d’un marqueur). Antigène : substance douée de la propriété de provoquer dans un organisme une réponse immunitaire, c'està-dire une production d'anti-corps contre elle-même.(tout ce qui va être en capacité de produire une réponse immunitaire sera potentiellement une molécule capable d’être dosée). Un antigène peut être un agent infectieux, viral, bactérien, un parasite… Anticorps : Après injection à un animal d’un agent immunogène, la réponse se traduit par la production d’Ac. Pour notre immunodosage : Antigène : correspond aux molécules à doser… (= les MT) à condition que l’on sache fabriquer les Ac contre ces Ag. Anticorps fabriqués : reconnaissent des sites/épitopes/déterminants antigéniques. Bien retenir : L’antigène est le marqueur tumoral qui est caractérisé par certains épitopes, déterminants contre lequel on a produit des Ac. Il va se produire une réaction Ag-Ac selon deux principes.

B) -

2 Principes d’immunodosages Dosage par compétition Dosage immunométrique à 2 sites ou dosage sandwich

Dans les deux cas il y a formation d'un complexe Ag-Ac que l'on va quantifier avec la mesure d'un signal de différentes sortes. L’intensité de la réaction va être déterminée par la mesure de ce signal.

a)

Dosage par compétition = dosage par défaut d'AC

Le dosage par compétition est un dosage historique, qui était autrefois utilisé pour de petits anti-gènes peu immunogènes. (Par exemple : stéroïdes, hormones thyroïdiennes, cortisol, androgènes...). Il s'applique peu 8

ou pas du tout aux marqueurs tumoraux puisque les marqueurs tumoraux sont de grosses molécules avec deux épitopes au moins, et plusieurs sites antigéniques contre lesquels il est facile d'obtenir des anti-corps. Les marqueurs tumoraux sont donc des molécules fortement immunogènes. La condition de ce dosage est le défaut d’Ac. C'est-à-dire qu’il va y avoir moins d’Ac que d’Ag. On utilise un Ag marqué. - L’Ac spécifique de notre antigène est fixé sur un tube. - On introduit l’Ag à doser (le triangle orange) et on introduit également un autre Ag qui lui ressemble beaucoup et marqué (bille bleue fixée sur le triangle blanc). - Il y a une compétition qui va s’exercer entre l’Ag à doser et l’Ag marqué analogue vis-à-vis de l’Ac, en sachant que la liaison se fait préférentiellement avec l'Ag à doser. - On va éliminer ce qui ne s’est pas fixé par une étape de lavage. - La courbe d’étalonnage (sur le format du schéma ci-dessus) qui est descendante nous montrera que le signal est inversement proportionnel à la concentration en Ag non marqué : la concentrtaion en antigène est donc inversement proportionnelle à la quantité de signal. Elle permet donc de mesurer le signal.  Plus il y a de triangles oranges qui va se fixer à l’Ac, moins il y a de place pour le triangle blanc (Ag qui est marqué) et moins il y aura de signal.

b)

Dosage immunométrique par excès d’Ac ou dosage sandwich

On utilise préférentiellement cette méthode pour le dosage des marqueurs tumoraux (grosses molécules qui sont des glycoprotéines avec multiples sites antigéniques : réaction avec plusieurs anticorps). Elle est utilisable pour tous les marqueurs tumoraux. Ce qui est mis en présence : - Dans un tube il y a un Ac fixé à celui-ci. - On met le sérum contenant l'Ag orange et on rajoute après incubation un Ac marqué (avec la bille bleue). - A ce moment, il y a formation d’un sandwich entre le triangle orange qui est pris en sandwich entre le premier anticorps et le deuxième anticorps marqué (ce qui n’est pas fixé va être éliminé). - L’intensité du signal mesuré va être directement proportionnelle à la concentration en Ag. 9

Plus il y aura d’Ag marqué qui sera lié, plus la concentration sera grande. Plus la concentration d’Ag sera grande et plus on aura de signal. A retenir: On a donc deux courbes ici radicalement différentes. La courbe immunométrique qui est toujours applicable aux marqueurs tumoraux, mais pas la technique par compétition. De plus, la courbe immunométrique a cette allure : plus il y a d'antigène, plus on va mesurer le signal.

C)

Marqueurs et technique de détection

Il y a 3 grandes catégories : Radioactifs Enzymatiques Luminescents Radioactifs (RIA et IRMA) - Historiquement, le premier (< 1980) - Méthodes de références et R&D - Contraintes réglementaires : iode 125 (gamma et X) (le plus utilisé en laboratoire) ou tritium (β-), limitation des déchets radioactifs : autorisation seulement à certains laboratoires de par la lourdeur réglementaire de la gestion des déchets et des circuits d'éléments radioactifs. - De plus en plus dans les laboratoires, ces techniques radioactives tendent à être abandonnées. - Mesure finale : Radioactivité (cpm) Enzymatiques (ELISA) - Scepticisme initial (1971) : réaction enzymatique post-réaction immunologique, grande amplification potentielle du signal - En fonction du dosage, enzyme portée par Ag ou Ac - Réaction enzymatique après la réaction immunologique grâce à l'ajout d'un substrat. - Mesure finale : Absorbance à une certaine longueur d’onde. On mesure la formation d’un chromogène. - Permet diminution de la quantité de molécules à doser Luminescence - Emission de lumière après apport d’énergie extérieure (unité = RLU) - Mesure finale : Chimiluminescence. Ce sont les méthodes les plus sensibles qui détectent les concentrations les plus basses. On mesure la formation d’un luminogène. - Technique le plus souvent automatisée et utilisée dans les laboratoires. E Technique la plus récente, plus sensible … et la plus utilisée également.

D)

Standardisation & calibration

Lorsqu’on met en œuvre un dosage au laboratoire pour rendre un résultat biologique, il y a 2 notions à comprendre : Standardisation d’un immunodosage : processus par lequel tous les dosages, de toutes les techniques, vont donner le même résultat. Donc l’utilisation d’un standard reconnu, international. Exemple : les fournisseurs vont développer une trousse qui considère qu'une milliunité sera dosé avec une technique, donc toutes les techniques apparenté vont doser une milliunité. (Il n’y a pas de méthode de référence pour la plupart des dosages, donc pas de standardisation des méthodes.  Défaut de reproductibilité (on peut avoir des différences qui peuvent aller jusqu'à 20%) et pas de possibilité de comparer des résultats entre des techniques différentes.Cela impose de suivre le patient toujours avec la même technique pour que le clinicien ne se demande pas si c'est différence de dosage à cause de la maladie qui a évolué ou à cause de la technique. 10

Calibration d’un immunodosage : étalonnage d’un signal avec des valeurs standards. On va comparer les valeurs de ce signal avec une courbe d’étalonnage, réalisée à partir des valeurs standards dont on connait les concentrations. Pour les marqueurs tumoraux, il faut toujours utiliser la même technique pour des dosages utilisés chez le même patient en raison de ce manque de standardisation des méthodes. E)

Variabilité biologique et analytiques :

Les variations biologiques: -Variations intra-individuelles: Les patients présentent des variétés biologiques : au sein d'un même individu, certaines conditions physiologiques peuvent entraîner des concentrations variables d'un marqueur. -Variation interindividuel : Même si les patients présentent la même pathologie, on ne peut les mettre sur un pied d'égalité car ils ne vont pas présenter la même évolution de la maladie ou la même élévation des marqueurs tumoraux. La variabilité analytique: C'est la variabilité que l'on peut avoir en dehors de la standardisation, mais aussi en fonction de la standardisation, ou encore en fonction des conditions de mise en oeuvre des kits. C'est aussi ce qui conditionne les variabilités inter-techniques. Il ya 3 causes principales à cette variabilité inter-technique: -Hétérogénéité moléculaire du marqueur: Exemple: L'HCG est le marqueur de la grossesse. Cette hormone peut avoir des variants de glycosylation. Toutes les techniques ne peuvent mettre en évidence ces variants car ils sont incapables d'être détectés par certains anticorps qui sont utilisés dans certains troubles. -La qualité et la spécificité des anticorps Le fournisseur d'anticorps préconisé est SANTOCORPS. Il faudrait que les dosages soient étalonnés vis à vis d'une structure moléculaire particulière. -Problème techniques Ils peuvent être faciles à mettre en évidence ou au contraire compliqués. On peut rencontrer des problèmes techniques en fonction de la conservation des prélèvements et de la prise en charge des échantillons. On peut rencontrer également des problèmes de prescriptions inappropriées pas les cliniciens. -Effet crochet Lorsque l'on dose un marqueur qui est en concentration très élevée, donc lorsqu'on arrive en haut de la gamme d'étalonnage, on se retrouve en saturation des anticorps : c'est-à-dire que tous les anticorps sont utilisés, mais il reste de l'AG à mesurer. On va donc avoir une mesure de la concentration inférieure à la concentration réelle. On va devoir réaliser une dilution pour mesurer la concentration réelle. -Effet des anticorps endogènes: Ces anticorps sont présents dans le sérum des patients et ils vont interférer dans le dosage. Lors du dosage sandwich, les anticorps endogènes vont entrer en compétition avec les anticorps marqués que l'on introduit. Exemples d'anticorps endogènes: AC anti-thyroglobuline ou AC anti-immunoglobuline. Cela peut entrainer des résultats faussement élevés ou faussement abaissés. 11

On retrouve cet effet dans des contextes particuliers que sont les pathologies auto-immunes, ou lors de production importante d'anticorps lors d'une réaction immunitaire, ou après injection d'anticorps : des immunoglobulines ou après la mise en oeuvre de certaines immunoscintigraphies par exemple. III.

Lecture d’un résultat du dosage d’un MT

Après avoir fait le dosage, on estime qu'on a un résultat fiable (maîtrise de la technique au laboratoire, spécificité connue, on sait qu'elle est standardisée ou pas, que si elle semblait très élevée on a fait une dilution) rendu dans l'unité de dosage du MT. Il ne s'agit pas de comparer la valeur de ce marqueur à un intervalle de référence (pas comme glycémie par ex. ou hormone thyroïdienne): la lecture d'un résultat de dosage d'un MT est conditionnée par la spécificité et la sensibilité du MT. Puis on va faire un compromis entre spécificité et sensibilité vis à vis d'une localisation donnée, d'une maladie donnée, afin de choisir un seuil de discrimination. Les qualités théoriques d’un MT sont : - La spécificité : c'est lorsque l’on met en évidence un marqueur et qu'on peut le rattacher à quelque chose de très précis. La synthèse du marqueur n'est assurée que par les cellules cancéreuses : la spécificité de la maladie cancéreuse permet le diagnostic bénin/malin (présence d’un marqueur = tumeur maligne ; absence = bénigne), la spécificité d’un organe permet de localiser la tumeur primitive, ou alors il y a la spécificité d'une localisation métastatique. Donc une spécificité forte est une absence de faux positif, ou une forte probabilité d’un test négatif si le sujet est sain. Sp =VN / (VN+FP) - La sensibilité : nécessite un dosage très fin pour détecter les valeurs très basses et une sécrétion de la tumeur suffisante pour être détectable. Ainsi si on la mesure dans des concentrations basses, au-delà d'un certain seuil, cela veut dire qu’on est en présence de la maladie cancéreuse. Une sensibilité forte sera une absence de faux négatif. C’est la probabilité d’un test positif si le sujet est malade. Se = VP / (VP+FN) Les valeurs de sensibilité et de spécificité sont valables pour tous les tests, pas seulement les tests biologiques. - La valeur prédictive positive d’un marqueur : c’est la probabilité de présenter la maladie si le test est positif. VPP = VP/ (VP+FP) - La valeur prédictive négative : c’est la probabilité de ne pas être malade si le test est négatif. VPN=VN/ (VN+FN) Ces chiffres vont définir la qualité théorique d’un marqueur tumoral en sachant qu’il y a toujours une balance entre la sensibilité et la spécificité d’un test, il faut qu’il y ait un coût équilibré. Il est rare qu’un test ait une bonne VPP et une bonne VPN ; en général, une seule des valeurs prédictives est bonne et pas l’autre. Toute méthode diagnostique parfaite et idéale (schéma ci-contre avec barre rouge qui correspond au test) comprendrait 2 modes de réponse distincts (sans chevauchement) : + chez malades et uniquement - chez sains et uniquement Mais il n’existe aucune méthode qui ait une discrimination diagnostique des 2 modes de réponse. 12

On a plutôt ça, la population des sains d’un côté et celle des malades de l’autre. Il y a nécessité d'un seuil de décision (= limite arbitraire) : c'est la valeur seuil (ou cut-off ou seuil de discrimination), qui penchera plus à droite ou à gauche selon le test. Dans le cas de MT, on n'a pas de valeur normale ou de valeur de référence comme pour d'autres marqueurs biologiques, mais un seuil de discrimination. Ce seuil sépare les résultats positifs des négatifs et non les sujets malades des sujets sains.

Ce schéma présente 3 (ou 4 ?) zones et 4 modes de réponses possibles, il faudra donc en tenir compte lorsque l'on interprète les résultats. Donc les capacités d'un MT sont définies par sa spécificité, sa sensibilité et le seuil de discrimination choisit pour une maladie.

Quelle va être l’influence d’un seuil sur la sensibilité et la spécificité ? Nous prendrons l’exemple du PSA dans le cancer de la prostate. En augmentant le seuil : (S1→S2) - on diminue le nombre de FP (pointillé) : on augmente la spécificité - on augmente les FN (grisé) : on diminue la sensibilité Comment va-t-on choisir ce seuil ? • Si le bénéfice du traitement pour le malade est important alors que le préjudice est faible pour le non malade traité par erreur (FP) : choix de seuil bas (sensibilité forte) On se dit qu’il vaut mieux traiter qqn malade, quitte à traiter quelques personnes non malades

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• Si résultats thérapeutiques modérés, avec peu d'agents efficaces pour traiter la maladie et/ou TTT agressif : choix de seuil haut (spécificité forte) On se dit qu'il faut être sûr de traiter les personnes vraiment malades Les M.T. : l’idéal et la réalité • En majorité : bonne sensibilité, leur valeur augmente assez vite dès lors qu’il y a la maladie cancéreuse. • Mais spécificité médiocre : – Retrouvés chez sujets sains (pour certains) en situation physiologique – Retrouvés lors de pathologies bénignes C'est ce que le clinicien va devoir gérer lorsqu’il reçoit une valeur de MT augmentée : faut-il y accorder une importance sachant que la spécificité est médiocre ? Cela nécessite une prescription bien ciblée. Dans des situations connues par le clinicien il faudra éviter de surutiliser ces marqueurs qui finalement ne donnent pas d'information très utilisable dans beaucoup de situation.

IV.

Principaux MT utilisés

Schéma un peu mnémotechnique avec les différentes localisations dans les différentes parties du corps :

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Catalogue de MT de plusieurs cancers selon les organes touchés : à retenir

-

Thyroïde : production de 3 marqueurs :

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-

ACE (parfois utilisé en association avec le CA15-3)

Pancréas : CA19-9 : marqueur de choix dans ce cas. Endomètre et ovaire : CA125 (marqueur de choix) ACE AFP CA19-9

Col de l’utérus : SCC Testicules (plusieurs marqueurs selon le type de cancer testiculaire)

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HCG : surtout la sous unité β libre mais aussi la totale (permet de classer les cancers selon leur pronostic) αlpha foeto protéine LDH

Prostate : PSA: marqueur de choix dans ce cas Colon et rectum

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CA15-3 (marqueur de choix du cancer du sein)

Estomac : ACE

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Thyroglobuline (produite par le follicule thyroïdien, pas par le même type cellulaire que la calcitonine) : cancer différencié de la thyroïde Remarque: Ne pas confondre cancer médullaire et cancer différencié de la thyroïde. Ce sont deux entités histologiques, cliniques complètement différentes sur le pronostic de la maladie, avec des prises en charges et des marqueurs tumoraux différents => Calcitonine pour CMT et Thyroglobuline pour CDT. Cependant la Thyroglobuline n'est pas un marqueur utilisable pour le dépistage ou le diagnostic d'un cancer car son taux peut être élevé ou bas dans le cas d'un cancer.

Sein (très courant)

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ACE : cancer médullaire de la thyroïde

Œsophage : SCC ( squamous cell carcinoma) : un marqueur épithélial

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Calcitonine (produite par les cellules C de la thyroïde) : cancer médullaire thyroïde

ACE

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Foie : αlpha foeto protéine : le principal Poumon (cancer qui reste grave, pour lequel il y a peu de traitements notamment dans certains types comme l'adénocarcinome ; il y a différentes entités histologiques dans le cancer du poumon objectivées par différents marqueurs selon le type de cancer - car pas tous utilisables selon le type)

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CA19-9 (seul ou associé à l’ACE)

SCC (squamous cell carcinoma) ACE CYFRA21-1 NSE : une énolase spécifique sous une forme particulière lors d’un cancer du poumon.

Tête et cou : SCC dans certains cas

Les antigènes tumoraux (surtout utilisés pour le pronostic et le suivi) les plus importants et les plus souvent utilisés :

Les protéines oncofoetales sont ici ACE et AFP. CA= carbohydrate antigène

Alphafoetoprotéine (AFP) dans le carcinome hépatocellulaire (CHC), éventuellement transformation d’une cyphose en cancer du foie et Tumeur Germinale Non Séminomateuse (TGNS) -

CYFRA 21-1 dans le cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC)

SCC (Squamous Cell Carcinoma) dans les cancers ORL (notamment au niveau de la marge de l’œsophage)

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

Les hormones

HCG (Hormone Chorionique Gonadotrope) dans les tumeurs germinales et peut servir dans dépistage et diagnostic (hormone de la grossesse chez la femme) -

Thyroglobuline qui est un marqueur du cancer différencié de la thyroïde (CDT). Ça ne sert pas dans le dépistage et diagnostic.

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Chromogranine A est un marqueur de tumeurs NeuroEndocrines (NE) pour dépistage ou diagnostic, une des rares à pouvoir le faire. 

Les enzymes LDH (marqueur de lyse musculaire) utilisé dans les tumeurs germinales, cancer bronchiques à petites cellules (CBPC), lymphomes PSA (Antigène Prostatique Spécifique) dans l’adénocarcinome de la prostate pour le dépistage individuel NSE (Neuronal Specific Enolase) marqueur du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) (dont le rôle reste encore à préciser) et tumeur neuroendocrine (NE) pour diagnostic et dépistage. On voit que ce n’est pas au diagnostic ni au dépistage qu’on utilise le plus les MT circulants.

Nous allons nous attarder sur certains marqueurs dont on entendra parler tout au long de nos études. Ils sont, pour certains, très ubiquitaires mais surtout très prescrits. A)

Antigène carcino-embryonnaire (ACE)

C’est une glycoprotéine oncofoetale avec plusieurs sites antigéniques d’où une différence dans les trousses de dosage. Normalement, l’ACE n’est plus synthétisé après la naissance. 17

C’est un marqueur très élevé dans beaucoup de cancers (ubiquitaire) : - Cancer sein - Cancers digestifs - Cancers ovariens et utérins - CMT (associé alors au dosage de la calcitonine) - Autres : bronche, vessie  Pas de spécificité d’organe Mais il n’a pas de valeur diagnostique car il existe de nombreux Faux Positifs (valeur élevée au-dessus du seuil de discrimination alors qu’on n’est pas face à un cancer) pour ce marqueur comme : Tabagisme Alcoolisme chronique Pathologies inflammatoires digestives : pancréatites (la plupart d’origine infectieuse), hépatites (notamment virales) et rectocolite hémorragique Valeur pronostique importante : cancer du sein, côlon Marqueur dont on va se servir pour la surveillance thérapeutique et la détection de récidive. Tant que pas de réascension, on maîtrise la maladie, si réascension, on fait un diagnostic de rechute. Donc : pas de valeur diagnostique mais valeur de pronostic et de surveillance.

B)

L’alphafoetoprotéine (AFP)

C’est également une glycoprotéine oncofoetale produite par le fœtus (foie, sac vitellin, tractus digestif). Sa valeur va diminuer dès la naissance et on considère qu’à un an environ, l’enfant aura une valeur identique à celle de l’adulte (4) les patients présentant un cancer de la prostate , avec 100% de sensibilité ; en deçà (< 4) les patients atteints de pathologies bénignes (hyperplasies, adénomes) avec 100% de spécificité. En réalité, au-delà de 4 on a des cancers de la prostate mais on a aussi des gens qui n’ont pas de cancer de prostate : 70% de FP. Mais on a aussi 20% de FN qui auront véritablement un cancer qui ont une valeur inférieure à 4. Donc pour la communauté médicale, on remet en question ce seuil de 4, et dès lors qu’on est au-dessus de 2ng, les cliniciens commencent à être un petit peu vigilants, notamment selon l’âge du patient pour ces valeurs de PSA qui commencent à s’élever.

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Cela signifie que les performances du PSA pour le cancer de la prostate au seuil de 3ng correspondent à une sensibilité de 59% (pas terrible) et une spécificité de 87%. Avec des seuils différents on peut faire varier les performances de ce paramètre pour l'aide au diagnostic des cancers. Par contre, à 5ng, on a une sensibilité de 33% (ce qui signifie qu’on va en laisser passer) mais on a une spécificité de 95%. Donc ceux qu’on va trouver, on est quasiment sur que qu’il s’agit de cancers (mais on va en laisser passer plein). En revanche ici on va en screener beaucoup, mais on en aura qu’à 87% qui auront véritablement un cancer. On a un seuil de 4 pour le PSA, si on augmente le seuil à 6, on va diminuer le nombre de faux positifs (FP), il y aura plus de patients qui seront malades et on augmente la spécificité. En revanche, on augmente aussi les faux négatifs (FN) car des patients seront malades mais auront des valeurs qui ne seront pas détectées. Cela va donc diminuer la sensibilité. Il y aura toujours un équilibre entre spécificité et sensibilité qui permet de retenir un seuil pour un marqueur dans une localisation donnée. - PSA : (VPP) = 30 % (pas très élevé), ce qui signifie que parmi les personnes qui ont un PSA total > 4 ng/ml, 3 sur 10 ont un cancer de la prostate et 7 sur 10 n’ont pas de cancer de la prostate - Le PSA a une excellente VPN pour un PSA