Recherche de QTL chez le poulet

Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

Génétique appliquée Sommaire I.

Délétions.......................................................................................................................................... 3 A.

II.

Localisation des gènes par les délétions ..................................................................................... 3 Inversions ........................................................................................................................................ 5

A. I.

Souches létales balancées ........................................................................................................... 5 Mutagenèse ..................................................................................................................................... 9

A. Mutagénèse réalisée pour trouver des mutations affectant le développement chez la drosophile............................................................................................................................................ 9 B.

Mutagénèse utilisant des éléments transposables chez la drosophile ..................................... 10

C.

Principe de la récupération d’un plasmide ............................................................................... 13

D.

Système enhancer trap ............................................................................................................. 13

E.

Système Gene trap .................................................................................................................... 14

F.

Systèmes permettant la surexpression des gènes .................................................................... 14

II.

Transgénèse................................................................................................................................... 17 A. Limite de l’utilisation de P : le transposon ne s’insère pas au hasard. Solution : utiliser de nouveaux transposons ...................................................................................................................... 17

III.

Clones mitotiques ...................................................................................................................... 17

A.

Production des crossing over mitotiques et mise en évidence de clones mitotiques .............. 17

B.

Souris ......................................................................................................................................... 19 1.

Mutagenèse ........................................................................................................................... 19

2.

Cellules ES et recombinaison................................................................................................. 21

3.

Utilisation des éléments transposables pour la mutagenèse chez la souris ......................... 26

C.

Mutagenèse chez le poisson zèbre Danio rerio......................................................................... 26

D.

Analyse génétique chez Caenorhabditis elegans ...................................................................... 28

I.

Histoire de l’interférence ARN ...................................................................................................... 31

II.

Définitions ..................................................................................................................................... 31

III.

Les publications ......................................................................................................................... 31

IV.

1999 : Le mécanisme ................................................................................................................. 32

V.

2000 : découverte de la machinerie .............................................................................................. 32

VI.

Importance de la découverte .................................................................................................... 32

VII.

RISC ............................................................................................................................................ 33

VIII.

Activation du siRNA ................................................................................................................... 33

1

Génétique appliquée IX.

D. Locker

Semestre 5

Méthodes pour produire le siRNA............................................................................................. 33

I.

Le polymorphisme des protéines : Séparation des protéines par électrophorèse ....................... 37

II.

RFLP ............................................................................................................................................... 38

III.

Les VNTR (Variable Number Tandem Repeats) ......................................................................... 42

IV.

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) ........................................................................ 45

V.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ....................................................................... 46

VI.

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ..................................................................................... 48

I.

Histoire .......................................................................................................................................... 51

II.

Principe de l’obtention des empreintes génétiques ..................................................................... 51

III.

Identification des restes des Romanoff..................................................................................... 54

IV.

Exemple de l’utilisation des tests ADN dans le cadre d’un crime – USA versus Raymond Jenkins 56

Recherche de QTL chez le poulet .......................................................................................................... 70 A.

Approche génétique : approche QTL ........................................................................................ 70

B.

Répertorier l’ensemble des gènes des régions QTL .................................................................. 71

C.

Choisir les bons candidats ......................................................................................................... 71

2

Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

Utilisation en génétique formelle des accidents chromosomiques I.

Délétions A.

Localisation des gènes par les délétions

La délétion est une perte de matériel génétique dans un segment AB, ou CD par exemple. Le chromosome diminue de taille. Il y a alors appariement avec formation d’une boucle. Si l’on met un chromosome normal en face d’un chromosome qui porte CD, toute mutation en face récessive s’exprime chez le diploïde. C’est ce qu’il se passe chez le male drosophile. On connaît l’espace parti au niveau de la délétion, donc si une mutation s’exprime après la délétion, ça veut dire qu’elle se localise entre les deux extrémités de la mutation.

Les travaux de Benzer : il a mis en place l’idée du triplet pour le code génétique. Il a aussi travaillé sur ces délétions. Le but de Benzer était d’avoir un maximum de mutants, et de les muter. RIIA1 x RIIA2 B P

RIIA1 RIIA2

distance A1 et A2 = R

2(𝑝𝑜𝑢𝑠𝑠𝑒 𝐾)=2 ×"+" 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

× 100

RII+ RIIA1 RIIA2

3

Génétique appliquée

D. Locker M1

Semestre 5

Gène RII

M2

Génome T4 Délétion 1

A

B

C

Délétion 2 Délétion 3 Croissance M1 x del1  K

–

–

M2

M1 x del2  K

+

–

M2

M1 x del3  K

+

–

M2

On peut déterminer la position de la délétion au nucléotide près. Ce qui est possible chez le bactériophage est possible chez l’homme. C’est avec cette technologie que l’on a localisé le gène de la dystrophie musculaire de Duchesne dans la région P17 du chromosome X.

4

Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

Pour récupérer beaucoup de ||, on met en excès le chromosome normal. Pour éliminer les DNA verts. Ensuite, on met les DNA verts en excès, pour diminuer l’appariement en blanc. Toutes les manipulations sont corrélées au fait que l’on connaît parfaitement les délétions que l’on utilise. Les croisements ont eu lieu pour déterminer les bornes des délétions.

II.

Inversions

Même séquence d’ADN, mais pas dans le même ordre. Les inversions jouent le rôle d’inhibiteur de la recombinaison. Les produits de la recombinaison dans l’inversion sont complètement inviables.

A.

Souches létales balancées

Une souche a un chromosome avec une mutation létale, et sur l’autre chromosome une autre mutation létale récessive. Cy inversion L+ [CyL]

mv x

Cy+

L

m

// Voir « Les souches létales balancées » // Voir « exemple de l’utilisation des souches létales balancées… ». Plutôt que de compter, on utilise les souches létales balancées. La mutation est sur le chromosome 2 (première solution) : // voir diapo.

5

Génétique appliquée 

Cy

D. Locker

Semestre 5

m+

[Cy]

m+

L

x Cy+

[L]

m

m

L+

On ne peut pas obtenir d’individus qui ont à la fois les ailes relevées et les yeux marron. On peut localiser m par rapport à L. // Voir tableaux. On dispose généralement de souches létales balancées pour le 2 et sur le 3, on teste tout de suite si le marqueur est sur le 2 ou sur le 3. Donc en 2 générations de mouches, on peut avoir des localisations chromosomiques très rapides, sans avoir à compter de drosophiles. Du point de vue mutagenèse, pourquoi se sert-on de ces outils ? Supposez que vous recherchiez des mutations, sur le chromosome II, de façon spécifique. Avec le séquençage des génomes, on s’est aperçu que l’on avait peu de mutations. Donc on supposait que l’on avait saturé en mutation le génome, mais ce n’est pas vrai. C’est la même chose pour les phages. On ne sait pas à quoi servent les autres mutations. Il y a beaucoup de travaux qui consistent à saturer en mutations les chromosomes. Pour le faire au niveau des souches létales balancées, si l’on veut avoir des mutations sur le chromosome II de la drosophile : Femelle

II

II

II

II

male

Chez la drosophile on utilise l’EMS (éthylméthane sulfonate = méthyle les bases CH3 de la guanine, qui peut alors s’apparier avec C mais aussi avec T  transition de bases CG  AT). On traite alors soit les males, soit les femelles. On traite les males parce que la cible, d’une centaine d’ovocyte ou de plusieurs millions de spermatozoïdes, est plus large dans le cas des spermatozoïdes. De plus, si l’on pique les femelles, on les tue la plupart du temps. Chez la souris, on n’utilise pas l’EMS, mais l’éthyl nitroso Urée. On traite toujours des gamètes. En faisant manger à une mouche un agent mutagène, notre cible est les spermatozoïdes. On parle de générations, en mutagenèse. En G1, on retrouve des individus qui on ce type de structure :

Si la mutation est dominante, on la retrouve directement. Si elle est récessive, on ne la voit pas directement. 1 individu = 1 spermatozoïde. On va alors croiser notre individu en G1 avec un individu +/+. En G2 on obtient :

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Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

Le problème est qu’on ne peut déterminer les mutants, alors on fait une G3, et on obtient :

On retrouve cela chez la souris, mais on a une petite descendance. Il faut le faire avec de grandes descendances. Alors on utilise une souche létale balancée, qui nous permet de déterminer quel individu porte la mutation. En G1, se sont des croisements individuels, et donc en G2, je vais récupérer des individus, les mêmes que ceux-là, mais qui vont être multipliés. On en obtient n, et donc on peut les croiser entre eux, on obtient des croisements frère-sœur, dits « en vrac », et en G3, on regarde le phénotype, existe-t-il ou non ? Y a-t-il un développement particulier ? Chez tous les génomes séquencés, y compris ceux d’organismes pour lesquels on croyait connaitre presque tout, comme E. coli ou la levure, on a trouvé un stock très important (de 40% à 70% du total) de gènes inconnus.  Gènes orphelins Étape obligatoire : la Génomique fonctionnelle

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Génétique appliquée

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Semestre 5

On compte le nombre d’individus qui survivent. Normalement, on se place à la dose qui tue la moitié des individus piqués. Une fois que l’on a fait les courbes de cytotoxicité, on regarde les courbes de mutagenèse. Toxicité

Dose 1

Survie droso 50%

Dose 2 Dose 3 Temps

On peut aussi prendre des femelles qui ont les chromosomes X attachés (XXY). On les croise par des males de lignée sauvage, à la dose 2 de l’agent mutagène. On regarde alors le rapport male/femelles. Male\Femelle XX Y X Mort XY Y YXX Mort L’Y est alors échangé, l’X reste en lignée male. Les plus fréquentes des mutations sont les létales (60%) donc si les mutations sont létales, elles seront exclusivement chez les males, elles vont le tuer, et donc on ne les verra jamais. Donc : Male/Femelle = 1  normal Male/Femelle < 1  mutation létale. Aujourd’hui, le problème de la génétique est de comprendre la fonction des gènes. Tous les organismes ont à peu près le même nombre de gènes, de 20 à 30 000. Sur l’ensemble des génomes que l’on étudie, on a pour l’ensemble des gènes une fonction qui peut être attribuée, mais pour la moitié, on ne connaît pas la fonction. Le but aujourd’hui est donc de connaître le rôle de ces gènes. On va les casser, et on regardera le phénotype des mutants, et on déterminera une fonction. On a donc entrepris de grandes manipulations de mutagenèse systématique, chez beaucoup d’organismes, comme par exemple dans la région sur les souris mutantes. On a été dans un grand nombre de cas déçus, car après avoir cassé le gène et fait de la mutagenèse, il ne se passait rien.

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Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

La Drosophile comme animal modèle

I.

Mutagenèse A. Mutagénèse réalisée pour trouver des mutations affectant le développement chez la drosophile

9

Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

Le marqueur dts91 est fondamental, cette mutation est létale dominante (qui n’existe habituellement pas) mais thermosensible. La mouche ne meure qu’à 29°C. On a donc le male sauvage traité à l’EMS, on le fait sur 1500 males. On le croise, et il faut faire des croisements individuels. C’est là qu’il y a beaucoup de travail, c’est l’étape de multiplication. On met le croisement à 29°C. Le papa et la maman meurent alors, avec le dts91. La descendance qui porte dts91 meure aussi. Tous les individus qui restent, on les fait croiser. On regarde alors la descendance. L’homozygote existe-t-il ? Si non, on a mis en évidence un gène létal. Si oui, on regarde s’il y a phénotype particulier. Si oui, on a mis en évidence un nouveau caractère. Si non, pas de chance, on a fait des expériences inutiles. S’il n’y a pas de conditionnement, l’expérience ne fonctionne pas. On peut systématiquement faire de la mutagenèse de chromosomes.

B. Mutagénèse utilisant des éléments transposables chez la drosophile L’idée est simple, dans nos génomes, on a des morceaux d’ADN qui peuvent se transposer, sous certaines conditions. S’il se déplace, il peut aller dans un gène, et casser le gène. On aura alors forcément une mutation nulle, ou amorphe, quelque chose qui n’a aucune expression, ni au niveau ARN, ni au niveau protéines. Si l’on peut contrôler la protéine, on a un outil pour faire systématiquement des mutations nulles. L’intérêt est que l’on connaît l’élément transposable, et le récupérer, et savoir où il est, dans quelle séquence il est entré. Au début des années 80, des généticiens des populations ont ramené des souches spécifiques. Certaines sont stériles, d’autres sont fertiles. Des gens ont fouillé les systèmes stériles, pour comprendre pourquoi ça ne fonctionnait pas. On pouvait avoir des males et des femelles capturés dans la nature, et la même chose, mais au labo. Un seule de ces croisements ne fonctionne pas, une femelle de laboratoire que l’on croise avec le male de la nature. C’est une dysgénie des hybrides. On regarde alors les individus, on les dissèque, et dans ce cas là, male et femelle ont des organes sexuels avortés. On a dans ce système : P

femelle M x male

G1

femelles et males stériles (26°C) fertiles à 20°C.

G2

Apparition de mutations au sens large, de défauts au niveau des chromosomes.

Dans ce système, les individus G1, du point de vue somatique, sont parfaitement normaux. Il y a un défaut au niveau germinal. Dans les mutants qui apparaissent, on a regardé la séquence du gène white, et dans ce système, on a chez ces individus un élément transposable, présent, inséré dans un exon du gène white, l’élément P, qui a de particulier une structure. On a un ensemble de transposas, qui permettent à l’élément de s’exciser, et d’aller ailleurs. On a donc un élément qui fait à peu près 3 kb, aux extrémités des IR, et à l’intérieur une phase de lecture appelée Transposase. Pour comprendre la différence entre lignée somatique et germinale, les souches de labo n’ont pas d’élément P, celles de la nature ont toutes des éléments P. Dans toute la nature, si elles ont toutes l’élément P, il y aurait extinction de l’espèce, mais il y a répression. La répression se fait par formation d’une protéine tronquée, et en ayant 012, on a répression du système, il reste stable.

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Semestre 5

La femelle M n’a pas de P, et donc pas de répresseur 012. Quand l’élément P arrive, il n’y a pas de répression, le répresseur est transposé dans l’œuf, pas de lignée. On est capable avec ce système de faire de la transgénèse. De quoi a-t-on besoin pour la transposition ? De pieds et de transposase. Dans un œuf de drosophile, à un stade précoce, on injecte un élément P marqué par des pieds cassés, et donc il n’apporte qu’une activité, et puis on injecte le helpeur de transposition, et un élément avec des pieds complets, mais sans transposase, et avec à la place l’ADNc white, que l’on veut étudier, et capable de régénérer l’action normale du gène white. En faisant ça avec une mouche mutante white, on obtient un individu qui a les yeux blancs, mais dans sa lignée germinale, comme on l’a manipulé, on a des transpositions qui vont se produire, cet individu aux yeux blancs, si on le croise avec un autre, dans la descendance, en G2, on obtient des yeux blancs et quelques yeux rouges.

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Semestre 5

Cette transposition est très utilisée pour étudier des modèles ou faire de la mutagénèse.

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Semestre 5

On prend une lignée avec un starteur Δ2-3, on a enlevé le problème d’épissage alternatif, elles font de la transposase tout le temps. Puis on a sur une autre lignée un autre élément transposable qui peut bouger si on lui donne de la transposase. Dans ce système on ne regarde que les males, ceux qui ont des yeux qui ont changé, on a eu transposition, on a un système qui permet de cribler toutes les transpositions possibles sur un autosome.

C.

Principe de la récupération d’un plasmide

PADNct W+

EcoRI ORI

EcoRI

ApR

Cet ADN de drosophile [W+], on le digère par EcoRI, on le soumet à l’ADN ligase, et on le transforme avec l’ADN des bactéries ApS, et on fait ensuite le séquençage des bactéries devenues ApR. On obtient après traitement par EcoRI des cercles, le génome en 3’ du transposon, d’autres variables, et celui en 5’ du transposon, qui est le seul capable d’apporter la résistance à l’ampicilline des bactéries. On fait alors le séquençage du plasmide par PCR. Pour obtenir la séquence en 3’, il faut utiliser un autre système de restriction.

D.

Système enhancer trap

// Voir diapo disponible ?

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Le gène ne s’exprime qu’à la condition qu’un enhancer le fasse s’exprimer. On essaie d’insérer un élément P avec un gène rapporteur, qui va décrire l’activité d’un gène. L’élément P, c’est le white de tout à l’heure. C’est un marqueur de couleur des yeux, le mini-white. La séquence PUC sert à récupérer le plasmide. LacZ est rajouté, il a un promoteur minimum, il ne peut exprimer lacZ qu’en présence d’un enhancer. On récupère les mouches à yeux rouges, et on regarde la coloration de lacZ. Le transposon est généralement inséré dans un 5’UTR. Grâce à lacZ, on peut voir d’une cellule à l’autre ce qu’il se passe. Aujourd’hui, plutôt que lacZ, on mettra de la GFP (green fluorescent protein). Un autre système s’est développé.

E.

Système Gene trap

// Voir diapo disponible ? Contrairement à l’enhancer trap où le gène X n’est pas mutant, on peut ici suivre le X. Gene trap : il faut aller dans un gène pour que ça fonctionne. Gal4 est un système de régulation chez la levure, activateur de la transcription au niveau de séquences UAS. On a donc des plus, on est sûr d’être dans un gène, on a mutation amorphe dans un gène, on peut faire de la récupération de plasmides, et on peut très rapidement connaître le gène, sa fonction, et rapidement son expression.

F.

Systèmes permettant la surexpression des gènes

On a beaucoup de mutant qui n’ont pas de phénotypes, ou alors un niveau de base de protéines dans un tissu, et l’effet d’une augmentation de ces protéines. On peut mettre GAL4 sous contrôle d’un gène.

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Gènes maitres/gènes esclaves ? Ils ont mis un gène qui ne s’exprime que dans certaines cellules, dans les autres cellules. Ce sont des mouches eyeless, qui perdent complètement les yeux, et donc on cherche le facteur important correspondant.

1er temps : recherche d’expression GAL4 dans les D.I. Faire bouger Gal4

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1000 lignées d’insertions différentes. Chaque lignée x UAS LacZ Recherche DI bleu 2ème temps Gal4 spé DI x UAS eyeless Descendants Expression forcée d’eyeless+ dans les DI. On avait donc bien un gène qui contrôle tout un programme, ici eyeless, qui gouverne, dès qu’on l’exprime, le déclenchement de la formation d’un œil. Si on le bloque, on bloque toute expression d’un œil. On a donc des gènes capables de gouverner toute la formation d’un tissu. Si l’on prend l’équivalent chez les mammifères, que se passe-t-il ? On sait que chez l’homme, une mutation pax6 par exemple, l’individu ne développe pas d’œil. C’est l’équivalent. Donc des chercheurs ont remplacé eyeless par pax6, dans la lignée UAS, et ont fait la même chose. La différence entre les types d’yeux est énorme. Cependant, la hiérarchie est la même, en appuyant sur le bouton, on actionne la formation d’un œil, peu importe le type.

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En faisant de l’expression forcée, on a de nouvelles mutations qui apparaissent. Les effets suppressor et enhancer sont utiles dans les tests pharmacologiques.

II.

Transgénèse A. Limite de l’utilisation de P : le transposon ne s’insère pas au hasard. Solution : utiliser de nouveaux transposons

Il y a des régions du génome de la drosophile dans lequel P ne va pas se mettre. Il faut chercher de nouveaux transposons. P a une préférence pour le 5’. Le défaut est que la plupart du temps, il n’a pas d’effet mutagène. Donc il y a une solution qui consiste à le faire partir, mais généralement il fait un trou. Une deuxième transposition permet généralement d’avoir un mutant. PiggyBac est un élément qui se distribue de façon homogène, non aléatoire, plus dans les introns que dans les exons, et notamment dans le 1. Cependant, une fois inséré, on ne peut plus le faire bouger. Quand il se fixe, il ne fais pas apparaître les mutations, s’il se fixe sur une séquence non muté, on ne peut rien en faire. On utilise alors un 3ème élément, Minos, trouvé en Crète, qui s’insère dans les séquences TA, on peut le faire repartir et avoir des défauts au niveau du cycle avant son arrivée. Quand il part il forme une mutation, s’il ne se fixe pas dans un TA dans un exon. C’est celui qui semble le plus proche de la perfection. Cependant, il ne vient pas d’une drosophile, et donc n’est pas encore parfait. Avantage : on sait tout se suite où se trouve la mutation Désavantage : l’élément P ne va pas partout, au hasard, il va que dans le 5’UTR, et donc il est possible que l’on n’ait pas de réponse. Il faut faire une 2ème mutagénèse, faire sortir l’élément P.

III.

Clones mitotiques A. Production des crossing over mitotiques et mise en évidence de clones mitotiques

C’est un ensemble de cellules issues d’un fondateur, par des mitoses. A l’intérieur d’un clone, toutes les cellules sont identiques. Quand on a des clones chez la drosophile, on peut avoir des clones mutants dans un contexte sauvage, on aura par exemple une tache de coloration jaune sur un fond gris-noir du corps. Ceci sert notamment à étudier l’effet des mutations létales, c'est-à-dire qu’une mutation létale qui tue au niveau embryon, on ne sait pas à quoi correspond la fonction de ce gène plus tard dans le développement. On sait juste qu’il est létal au stade embryon. On peut faire une mutation, et voir par exemple l’effet sur l’œil de drosophile. On peut aussi tester l’autonomie cellulaire, c'est-à-dire tester si le gène, la protéine, peut être complétée par les cellules environnante. Si non, la protéine a une autonomie cellulaire, elle doit produire elle-même.

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Pour faire cette étude, il nous faut essentiellement des marqueurs visibles, que l’on peut suivre, et bien sûr avoir un système qui permet l’induction des crossing over mitotiques. On le faisait à une époque aux rayons X, mais préférentiellement, aujourd’hui on utilise des systèmes génétiques, FLPFRT, et aussi le système Cre-Lox plutôt utilisé chez la souris. Ca sert à faire de la recombinaison site spécifique.

Ce système est d’autant plus efficace que le gène est loin du centromère. Donc ce système mesure la distance gène centromère ici. Il faut qu’il y ait appariement pour que ce phénomène soit possible. Donc chez la souris il faut trouver des astuces pour favoriser ces appariements. Il faut aussi qu’on ait la bonne recombinaison pour qu’on voie quelque chose, une fois sur 2 on ne verra rien. On peut induire ce système avec des rayons X, ou utiliser les systèmes génétiques : Flp = flippase

FRT = Flp reconnaissance cible

C’est une séquence de 34 nucléotides, reconnue et coupée par une enzyme spécifique, et ce système dérive est est observé naturellement chez la levure, au niveau d’un plasmide naturel de levure appelé plasmide 2µm. Des astucieux ont pris ce système, l’ont cloné, et l’on placé chez la drosophile. Ce système fonctionne très bien chez la drosophile. Par contre, il ne fonctionne pas très bien chez la souris. Chez la souris, on utilise Cre-Lox. Comment ça fonctionne ?

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L’intérêt est que l’on a une enzyme qui contrôle tout ça. On prend un élément P, qui va tout contenir, on a notre gène avec la flippase qui a un signal de polyA, et en amont on met un promoteur qui vient des HSP, il fait fonctionner le gène quand on passe une température de 37°C.

Lignée A Possède Flippase Gouvernée HSP promoteur (transgénèse)

x

Lignée B Possède FRT (Transgénèse)

Hybride A/B Réunion FLP FRT On commande les drosophiles toutes faites pour faire ceci, sauf si on s’intéresse à un système particulier, où il faudra tout faire. Ce système est très utilisé. Avec des gènes létaux, on peut forcer la formation d’hétérozygotes.

B.

Souris

1. Mutagenèse L’agent mutagène utilisé est l’éthylnitrosourée (ENU) est utilisé à la place de l’étylméthanesulfonate, très cytotoxique est moins mutagène que l’ENU pour la souris. Dans ce système, 95% des mutations ponctuelles sont des transitions de bases (purine par purine, pyrimidique par pyrimidique). On modifie la guanine, mais aussi l’appariement de la guanine, qui peut se fixer à T. Les protocoles sont simples, la mutagenèse se fait chez le male, comme chez la drosophile, et on lui injecte de l’ENU, à l’intérieur de l’abdomen, de façon à ce que les gonades baignent dans l’ENU, et on fera le croisement avec une femelle qui a des chromosomes normaux.

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On a développé ce système pour faire des études d’interaction génétique. Si l’on part d’une lignée qui a une mutation :

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On peut aussi rechercher des allèles différents d’un même gène :

On peut encore faire des mutations dans un espace donné :

Ce qu’on fait aussi chez la souris, c’est qu’on construit des souches létales balancées, on copie ce qu’on a fait chez la drosophile, on induit des agents, et on recherche des mutations qui sont létales, que l’on puisse utiliser sur des souches létales balancées. On commence à avoir quelques lignées, mais ça n’est pas encore entré dans les études. 2. Cellules ES et recombinaison Le K.O. de 2 gènes, c'est-à-dire l’inactivation de gène, ou bien le K.in, c’est l’introduction d’un gène rapporteur à l’intérieur d’un gène de souris. C’est quelque chose que l’on n’a pas encore vu chez la souris. On a le gène A, et on veut l’inactiver. Quand on veut faire des modèles de maladie humaine, ou bien on a l’existence de l’équivalent, ou bien on fait soi-même la mutation. On étudie avec le K.O. les relations gène-phénotype. On va se baser sur la recombinaison homologue, qui consiste par exemple :

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D. Locker

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On l’intègre :

Les cellules ES sont totipotentes, on travaille au niveau du blastocyste, on récupère des cellules souches embryonnaires (Cellule ES). Cette cellule est capable de se multiplier, en boite de culture. Une fois multipliée, on peut avoir des millions de cellules de ce type, on peut les mettre en face de l’ADN transformant, dans le but de recombinaisons homologues. A partir de là, on peut faire un ADN transformant NeoR. On les met ensuite sur milieu sélectif G418, on sélectionne les cellules NeoR, donc qui ont pris notre morceau d’ADN. Une fois fait, on récupère un blastocyste, et on fait une injection des cellules NeoR. Le premier blastocyste provient par exemple d’une souris blanche, et l’injection se fait dans un blastocyste qui vient de souris noires. On fait ensuite une réimplantation dans une mère porteuse. Les cellules se multiplient, entrent dans la formation de l’embryon, et on aura des souriceaux patchwork, un certain nombre de cellules vient du premier, d’autre du deuxième blastocyste. On aura des taches de blanc sur un fond noir. Si l’on a de la chance, un certain nombre de cellules viennent de là, et toutes ces cellules sont annulées pour le gène de départ.

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Semestre 5

Ce qu’il faut retenir : Quand on amène du DNA dans une cellule, s’il n’est pas dégradé, il s’intègre n’importe où. L’évènement que l’on cible va être d’à peu près 1/1 000 000 d’évènements d’intégration. C’est rare. Donc au niveau des cellules en boite, le phénomène de résistance ne veut pas dire qu’il y a eu recombinaison homologue, mais que l’ADN s’est intégré dans les chromosomes. Il faut donc un deuxième moyen de sélection. La plupart du temps, que fait-on ? On table sur 2 types de sélections.

Si on a de la recombinaison homologue, la cellule est NeoR, mais TK-. S’il y a intégration au hasard, le système est résistant à la néomycine, mais il est TK+. Donc la différence se fait sur TK. On peut facilement faire la différence, en mettant un analogue de la thymine dans le milieu de culture. Si elle l’intègre, elle ne pourra se répliquer, et donc va mourir. On utilise le gancyclovir. Toute cellule infectée par le virus de l’herpès a la TK, et donc avec un analogue de thymidine, il ne pourra se multiplier. On peut faire de la chirurgie très pointue des gènes, en annulant ces gènes de toutes les autres possibilités. Ces manipulations ne sont pas complexes, mais très longues. On donc faire : -

Mutations mutagenèse Recombinaison des homologues Piège à enhancer Piège à polyA Piège à gène

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Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

L’outil Cre-Lox : C’est la même chose que le système FLP-FRT. Cre est la recombinase du phage P1, qui reconnaît LoxP, qui fait 34 paires de bases, et qui est capable d’introduire une recombinaison entre ces 2 systèmes Lox et P. La probabilité de les rencontrer est de 1/1020. Si l’on met par transgénèse 2 séquences loxP qui vont encadrer par exemple le gène X, que va faire la Cre recombinase ? Elle va agir sur les 2 sites présents, et il y aura excision du gène X.

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Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

Pour modifier les cellules ES pour faire de la mutation, soit le phénotype est sélectionnable par son expression, ce qui sera rarement le cas, soit il ne l’est pas. C’est basé sur la recombinaison homologue. Quand il n’y a pas de sélection précise de la mutation, on joue sur 2 cas : -

Dans 99% des cas, l’ADN intégré est dégradé Dans 1% des cas, il est intégré

On utilise donc par exemple la thymidine kinase, ou un gène reporter.

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Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

3. Utilisation des éléments transposables pour la mutagenèse chez la souris Le but est le même que dans le cas de la drosophile. L’avantage est d’avoir accès au gène cible, c’est par exemple le plasmide rescue. Le désavantage est que ça ne se fixe pas partout. L’élément transposable mariner se retrouve chez tous les organismes. Cet élément transposable est incapable de se déplacer, ce sont des fossiles, depuis longtemps. On les a trouvés chez la truite arc-en-ciel. Cet élément était inactif chez le poisson, et il a fallu faire de la mutagenèse dirigée pour changer chacun des triplets nonsens, et vérifier que ces changements avaient toujours une activité de transposition. On l’a appelé Sleeping Beauty. Cet élément SB est capable de se déplacer dans le génome d’un mammifère. On l’a bien montré dans les cellules de souris, ou humaines. On l’a choisi parce que sa seule dépendance au niveau du mouvement est d’avoir un dinucléotide TA. Quand il se déplace, il va la plupart du temps laisser une duplication de se dinucléotide TA sur la cible.

C.

Mutagenèse chez le poisson zèbre Danio rerio

Le poisson zèbre est utilisé dans l’étude du développement, son intérêt est qu’il est transparent tout au long du développement. L’embryologie descriptive est plus pratique. De plus, c’est un vertébré. On prend de l’étylméthane sulfonate que l’on intègre dans le poisson :

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Génétique appliquée

D. Locker

Semestre 5

On a :

Le développement démarre, mais sera haploïde. L’intérêt de ces individus est que la moitié des descendants portera la mutation, l’autre moitié ne la portera pas. L’intérêt est que l’on gagne une génération. On a une autre technologie, le crible d’individus gynogéniques. Des techniques permettent de faire fusionner le globule polaire 2 avec la cellule.

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Génétique appliquée

D.

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Semestre 5

Analyse génétique chez Caenorhabditis elegans

Sidney Brenner a montré la présence de l’ARNm. Il a travaillé là-dessus, et sur le code génétique. Il a eu un prix Nobel pour son idée de mettre en place comme modèle le C. elegans. Ce nématode a 959 cellules, et la provenance de chaque cellule est connue. Le génome est entièrement séquencé, il a 19 000 gènes. Il fait 1 mm. Il est hermaphrodite, et peut être male ou femelle, ce qui nous arrange pour les croisements. Il arrive que l’on rencontre des mâles stricts. En 2 jours, on a une reproduction complète de l’animal. 42% des gènes de C. elegans ont des homolgues chez les autres espèces. Ses avantages : -

Ils poussent sur des boites de pétri en mangeant E. coli Petite taille Transparent Temps de génération court Auto-fertilisation Clonal Congélation à long terme (-80°C)

On peut l’utiliser pour travailler sur l’apoptose, le développement, la neuroscience, l’immunologie…

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Génétique appliquée

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Semestre 5

Un hermaphrodite redonne 99% d’hermaphrodites et 1% de males. Quand on le croise avec un male, on a 50/50. L’intérêt est qu’en une seule génération, on peut obtenir des mutants.

On gagne ici une génération. On peut mettre à l’état homozygote notre descendance en une génération.

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Génétique appliquée

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Semestre 5

On ne peut pas faire de gynogénique chez les mammifères, à cause du sexe du gène, de l’empreinte parentale. Si l’on met à l’état homozygote un génome femelle, on aura que du génome femelle. Donc par exemple, si le génome maternel exprime le caractère « je ne m’exprime pas », il n’y a pas du tout d’expression du gène.

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Semestre 5

Interférence ARN Comment avoir accès aux phénotypes mutants sans faire de mutagénèse ? Utiliser l’interférence ARN. Quand on n’arrive pas à faire de mutagenèse classique, une technologie permet d’accéder au génotype sans faire de mutagenèse. Cet accès utilise une technologie apparue en 2000 et qui utilise l’interférence ARN. Le prix Nobel de physique a été décerné l’an dernier à 2 chercheurs qui ont trouvé cette technologie.

I.

Histoire de l’interférence ARN

1990 : PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) est découvert chez le Pétunia à partir d’observations sur la coloration des feuilles. Ce phénomène est appelé par Rich Jorgensen “cosuppression” Plant Cell 2 : 279-289 1998 : Andrew Fire démontre que l’ARN double brin est responsable du PTGS chez le C. elegans Nature 391 : 806-811 Depuis 1998 : l’ARN interférence devient un outil pour déterminer des phénotypes mutants chez différents organismes. Depuis 2000 : augmentation exponentielle du nombre de publications sur l’interférence ARN (1000 publications en 2004)

II.

Définitions

Génétique inverse : aller du génotype au phénotype par ingénierie génétique. Par exemple obtention de mutants KO par recombinaison homologue. PTGS = Post-transcriptional Gene Silencing : inhibition de l’expression d’un gène par introduction d’un ARN double brin. ARN interférence : PTGS induit par l’introduction d’un ARN double brin (siRNA) dans un organisme ou des cellules en culture. RISC : RNA-induced silencing complexe, correspond à un ensemble de protéines et du siRNA.

III.

Les publications

Il faut toujours chercher à comprendre quand un contrôle donne des résultats non attendus.

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Génétique appliquée

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Semestre 5

Observations importantes : -

L’ARNi ne fonctionne qu’avec une séquence de l’ARNm ciblé La séquence doit provenir d’ARN mature L’ARNm ciblé semble être dégradé Quelques molécules d’ARNds suffisent (soit amplification, soit catalyse) L’effet peut se transmettre entre les tissus, voire à la descendance (transmission)

Ce phénomène est un système double, d’un point de vue naturel, il est utilisé par la cellule comme lutte contre les infections virales. Cette interférence est liée à la régulation de l’expression des gènes. Elle intervient aussi dans l’épigénétique, dans l’inactivation de l’X.

IV.

1999 : Le mécanisme

C’est dû à de petits ARN : siRNA, de 20 à 25 nucléotide. C’est un duplex avec des extrémités sortantes, avec un 5’P et un 3’OH. C’est un produit du clivage des ARNds. Les interactants sont ces petits ARN.

V.

2000 : découverte de la machinerie

Dicer : Rnase III -

Coupe un segment double-brin de 21-25 nucléotides Asymétrique : bouts libres de 2 nucléotides

RISC : RNA-induced Silencing Complex -

VI.

Un des deux brins (celui avec bout 3’ libre) est sélectivement incorporé dans RISC RISC dirige le clivage du mRNA complémentaire

Importance de la découverte

Ce système est à la base essentiellement une protection contre les infections virales double-brin. La mutation RISC compromet la résistance des plantes aux virus. C’est un nouvel outil pour réprimer

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Génétique appliquée

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Semestre 5

spécifiquement les gènes, et ainsi réprimer la synthèse protéique. Il y a aussi des siRNA qui interviennent dans la régulation du développement.

Ce qui est important, c’est la RdRP (une ARN polymérase ARN dépendant qui peut amplifier le siRNA). Il y a amplification possible au moins chez C. elegans et les végétaux, un système est capable de re-synthétiser des doubles brins.

VII. RISC RISC a une activité hélicase, exonucléase, endonucléase et recherche d’homologie. Initialement, RISC est inactif et devient actif après l’ouverture de l’ARNds et perte du brin ARN sens (passenger). Le brin ARN antisens (guide) va définir la spécificité du RNAi.

VIII. Activation du siRNA Voir film à récupérer dans nature

IX.

Méthodes pour produire le siRNA

La plus simple est la synthèse chimique. Il y a aussi la transcription in-vitro. On peut aussi partir d’un grand ARN double brin (virus), et on le coupe à la RNase III (Dicer, Rnase III). Enfin, on peut faire de l’expression de l’ARN dans les cellules à partir d’un vecteur. Plasmide exprimant un ARNi :

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Les méthodes permettant de donner de l’ARNi à un organisme sont variables selon les organismes : -

C. elegans : injection nourriture D. melanogaster : exposition des cellules dans le milieu de culture Cellules de mammifère : électroporation ou transfection

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Commentaires à faire : 1- Ça marche 2- Mais ça ne marche pas à 100%, il reste une trace, l’inhibition n’est pas complète. On a élimination de la protéine, mais il reste une bande. Quand ça marche, on n’a jamais une inhibition totale.

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Semestre 5

Ça ne marche de plus pas tout le temps. Il faut se méfier car quand on fait ce travail, l’ARNm fait 10 fois la taille de l’ARNi. On envoie donc des cibles à des endroits qui ne sont peut-être pas bien choisis. On fait de plus des cibles de 20 nucléotides, et donc aura des cibles que l’on va targetter sans le vouloir qui vont tuer le mutant. Enfin, le génome est très redondant. On utilise des systèmes à haut débit, on étudie l’effet des RNAi sur l’ensemble des gènes humains, en transfectant. Sur tous les chromosomes du C. elegans, on trouve de nouveaux phénotypes, mais pour beaucoup de cibles on n’a pas de phénotype.

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Génétique appliquée

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Semestre 5

Les marqueurs de polymorphisme utilisés en génétique humaine I. Le polymorphisme des protéines : Séparation des protéines par électrophorèse Le nombre de protéines sujettes aux différences de migration, les variants électrophorétiques, ne sont qu’au nombre d’une centaine, et ne sont donc pas très bons.

Alors on a fait des électrophorèses liées à l’ADN, sur les protéines. Avantage : peu coûteux. Désavantage : Révèle une faible partie du polymorphisme de l’ADN. On recherche alors des marqueurs, et des bons marqueurs. Ils doivent être polymorphes : si l’on a 2 formes, a et A ; sur 10 000, 9 999 sont A et 1 est a, le marqueur n’est pas bon. La fréquence de A doit être proche de 0,5, et celle de a aussi. Il faut aussi qu’il y ait codominance. Dans notre système, on peut déterminer la forme [A], la forme [A/a] et la forme [a]. C’est fondamental, parce qu’en revenant à une famille, un bon marqueur est en fréquence ½-½, et donc il y a des chances que l’on ait des parents hétérozygotes, et donc on peut dans la descendance déterminer facilement l’ensemble des phénotypes, et donc la fréquence de tout ce système. S’il n’y avait pas codominance, toute la famille aurait le même phénotype. Il faut aussi qu’il ne soit pas épistatique, c'est-à-dire qu’il n’interagit pas avec d’autres marqueurs. Il doit être indépendant du milieu, c'est-à-dire que peu importe où l’on prend les individus, le phénotype sera le même. Le marqueur doit de plus être neutre, il n’est pas sujet à la sélection, dans le sens sélection darwinienne. On doit avoir une répartition uniforme dans le génome de l’ensemble des marqueurs. Les marqueurs servent à la cartographie, et donc il faut que les marqueurs ne se trouvent pas que sur un seul chromosome.

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Génétique appliquée

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Semestre 5

Il faut que le marqueur soit reproductible, on doit pouvoir refaire l’expérience dans des labos différents et retrouver le même résultat. La température de chaque puits n’est pas la même partout en PCR. La qualité de l’ADN utilisé en PCR est fondamentale. Enfin, le système doit être économique, et doit être mis en place dans les unités qui n’ont pas les moyens de mettre en place la technique. Il est difficile d’avoir des marqueurs qui répondent à toutes ces qualités, donc on prendra le moindre mal. On verra les RFLP, les RAPD, les AFLP, les VNTR et les SNPs. Les plus utilisés en génétique humaine sont les 2 derniers. Le plus ancien est la RFLP. Les deux autres servent dans des organismes autres que l’humain, dans lesquels on n’a pas les mêmes connaissances que chez l’humain.

II.

RFLP

Polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism).

C’est la technique de Southern. RFLP : un site de restriction, un type d’enzymes de restriction. Sonde qui reconnaît un endroit particulier de l’ADN.

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Semestre 5

Le RFLP est défini par une sonde : un hétérozygote On parlera encore d’allèle sans qu’on ait à faire une référence. Ne pas confondre le marqueur de type RFLP et un gène particulier. Le premier RFLP à avoir été utilisé est le marqueur de l’hémoglobine. Les endonucléases de restriction coupent l’ADN en des sites précis qui peuvent être polymorphes. Les fragments de restriction auront des tailles différentes en fonction de la présence ou de l’absence d’un site reconnu par une endonucléase de restriction.

Dans le cas de l’anémie, on a 3 types d’individus. On définit un site de restriction MstII. Dans la séquence du malade (type S), le changement se fait de βA à βS, on n’a plus glu mais val, ce qui provoque le changement. Le site MstII disparaît alors, il est détruit. Dans les années 80, on commence à séquencer l’ADN, on s’aperçoit qu’il y a en amont le site MstII et un autre en aval. On s’aperçoit que le site des malades est à 1,1 kb du normal, et à 0,2 de l’autre. La technologie suivante se développe alors : On a une sonde et 3 types d’individus. On le fait avec la

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Semestre 5

radioactivité. Ces trois individus, on leur fait l’hybridation avec des sondes. Si le site de restriction est là, on est sûr que l’individu est βA, s’il n’y est pas on est sûr qu’il est βS.

Nous avons une distance de 1 cM, donc on a une probabilité de 99%. On peut diminuer les risques en plaçant un deuxième RFLP à droite du gène, et on obtient, avec une distance d’encore 1 cM, la probabilité est de 1%x1%=1 pour 10000. Cependant, 1 cM c’est grand, et des gènes peuvent être plus grands que ça.

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Semestre 5

Le déterminisme βS/βA a été le premier diagnostique prénatal mis en place. Les hôpitaux l’ont alors utilisé, et dans un pays à influence catholique, on ne propose pas de soin, mais un avortement thérapeutique. Il faut ici cependant des fonds, de la radioactivité, et les habilitations. Avec l’arrivée de la PCR, les choses ont changé.

On diminue le temps de l’expérience, les résultats sont aussi sûrs, les coûts sont très diminués. On n’a de plus pas besoin d’habilitation particulière. Cette arrivée de la PCR a fait exploser la technologie des RFLP et permis à de nombreux laboratoires de ce lancer là dedans. Pourquoi y a-t-il 3 bandes ? Il n’y a pas 3 allèles, la spécificité est excellente, pas de piste de ce côté-là.

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Semestre 5

L’analyse des individus par RFLP : Avantages : codominance des allèles ; polymorphisme au niveau de l’ADN. Désavantages : très laborieuse ; demande de grandes quantités d’ADN (peu de RFLP dans l’organisme).

III.

Les VNTR (Variable Number Tandem Repeats)

Nombre variable de répétitions en tandem. -

Non spécifiques des régions codantes Répétitions de séquences courtes Grand nombre d’allèles différents dans les populations naturelles

Ils sont typiquement à l’origine des cartes d’identité génétiques. Ils ont été trouvés par Alec Jeffrey. Les VNTR font des tailles supérieures à 16 paires de bases. Les microsatellites sont formés d’1, 2, 3 ou 4 paires de bases répétées en tandem. Les VNTR ne sont pas distribués également dans le génome, contrairement aux microsatellites.

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Semestre 5

On n’a pas qu’une bande, et elles ne sont pas toutes de la même intensité. Ca veut donc dire que sur d’autres chromosomes, à d’autres loci, on a d’autres systèmes identiques, capables de se fixer de la même façon à la même sonde. On n’a cependant pas la même distribution d’un individu à l’autre. Les marqueurs peuvent donc servir à identifier des individus, car avec 70 marqueurs, on ne peut pas trouver 2 fois le même individu. Ça sert donc en médecine légale, mais aussi en reconnaissance de paternité. Dans une famille quelle qu’elle soit, l’enfant doit avoir les marqueurs du père ou de la mère, il n’invente rien. Il montre qu’on a une distribution mendélienne des marqueurs de paternité.

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Le défaut de ce type d’analyse est qu’il y a beaucoup trop de bandes. En trouvant une bande, c’est un indice (d’identité ou de paternité). Cependant, une position identique n’indique pas que les 2 génomes sont les mêmes. On a donc abandonné ce système. On utilise alors des sondes qui ne sont plus localisées au même endroit, mais par exemple ici :

On utilise alors des sondes qui permettent de sonder pour un seul allèle, en utilisant la PCR. L’intérêt évident est que dans une population, on a plein d’allèles différents, le polymorphisme est beaucoup plus important, et donc on aura plus de répétitions. Un individu avec ces sondes ne porte au maximum que 2 allèles. Il ne faut donc pas regarder qu’une sonde, qu’une répétition, mais plusieurs à la fois, par technique de PCR. Il y a de nombreux allèles car on a beaucoup de crossing-over possibles dans ces unités répétées. On peut dans notre exemple passer de 6 à 9 unités. Ils sont plus utilisés que les VNTR. Ce sont des répétitions de 2, 3, ou 4 paires de bases. Il y a beaucoup d’allèles différents. Avec à peu près 1000 loci chez l’homme (beaucoup plus que chez les VNTR). Ils viennent du génome humain.

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Semestre 5

On utilise les microsatellites essentiellement au niveau des tests ADN. Ces marqueurs sont très intéressants car il existe de nombreux allèles, on peut s’en servir comme marqueur, mais la répartition de ces microsatellites n’est pas homogène. Pour les tests ADN, on utilise VNTR et microsatellites.

IV.

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

Les RAPD et les AFLP sont utilisés pour la génétique non-humaine, pour les organismes où il n’y a pas de carte génétique, ni de génome séquencé. Les RAPD, pour recherche de polymorphisme au hasard, a un principe simple : on prend une amorce pour faire la PCR qui soit une amorce de petite taille, c'est-à-dire inférieure ou égale à 10 nucléotides. La séquence de l’amorce va se retrouver plusieurs fois. Chaque nucléotide, dans une position de l’ADN, a une probabilité d’1/4. Dans une séquence de 20 nucléotides, on a 1/420 chances d’avoir notre séquence. Cependant, notre hypothèse de départ est fausse, la répartition des nucléotides n’est pas aléatoire. Alors, si on prend une séquence de 4 nucléotides, on a 1/44 chances de la trouver, donc on la retrouve toutes les 256 paires de bases.

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Semestre 5

On a utilisé cette technique pour établir la carte génétique de l’abeille. L’intérêt est que c’est rapide, économiques, et il y a beaucoup d’allèles. Mais les marqueurs sont dominants, la présence d’une bande ne permet pas de savoir si on a un hétérozygote ou une homozygote.

V.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

On digère un AND par 2 enzymes de restriction différentes A et B. On aura des fragments A/A, A/B et B/B. Aux A/B, on peut coller des amorces, séquences connues, qui permettent une PCR.

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Semestre 5

C’est d’un point de vue technologique le point le plus délicat. La propreté de l’ADN est fondamentale pour avoir une coupure qui se fasse correctement à tous les sites présents, que ce soit EcoR1 ou Mse1.

On trie les fragments pour avoir un nombre de fragments importants, mais pas trop. L’analyse se fait à l’œil.

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VI.

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SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

C’est lié au séquençage des génomes, et à l’arrivée de ce séquençage. Il a déjà apporté les microsatellites, et plus on réduit les coûts, mieux c’est. On pourra à l’horizon 2010 séquencer un ADN pour 500 à 1000€. On a montré le polymorphisme d’un seul nucléotide. On fait encore cette expérience sans s’intéresser à qui appartient cette séquence. On appelle indel une insertion ou délétion. Pour les SNP, on suppose que dans nos chromosomes, il y a à peu près 2 millions de différences entre 2 individus. On s’intéresse à ce problème parce qu’ils sont distribués au hasard, ils sont 2 millions, il y a un faible polymorphisme. On compense le faible polymorphisme par le très grand nombre dans le génome. Ils sont utilisés à la corrélation avec des caractères héréditaires de maladies. Les grosses entreprises pharmaceutiques sont très intéressées. La corrélation se fait aussi entre SNP et l’effet des médicaments. On sait que les médicaments ont une efficacité différente suivant le moment et l’individu. Donc l’intérêt est de trouver le meilleur médicament pour un individu. En effet, sur un individu, on regarde les 2 millions de marqueurs, et leur distribution.

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On a fait des analyses de lod score, entre des individus qui avaient Alzheimer et d’autres qui ne l’ont pas. On a ainsi déterminé que le gène présent dans la région ciblée est celui de l’ApoE4.

Comment trouver des SNP ? Beaucoup d’argent peut être obtenu. Beaucoup de techniques sont développées : -

Séquençage SSCP DGGE Spectrométrie de masse Puces à ADN PCR Hybridation

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Affymetrix a développé une technique. On met une sonde SNP et on détermine l’hybridation obtenue. C’est basé sur l’hybridation ADN/ARN. S’il n’y a pas polymorphisme, on hybride toujours au même endroit, s’il y a polymorphisme, le lieu d’hybridation change. La spectrométrie de masse est une technologie très utilisée. C’est ce qui permet de déterminer avec 3 chiffres après la virgule la masse d’un produit. Donc ça permet de le caractériser. En obtenant un différentiel de masse, on peut conclure qu’un phosphate a été rajouté, ou encore un sucre. La puissance de l’outil permet de déterminer les modifications post-traductionnelles de la molécule. L’analyse protéomique utilise aussi la spectrométrie de masse. C’est la caractérisation de protéines présentes dans une cellule à un instant donné. Elle se fait de la façon suivante :

On veut savoir quelles sont les protéines qui ont changé. On envoie ça aux gens de la spectrométrie de masse, et ils déterminent la masse de la protéine. On a une caractérisation très rapide et peu chère (20€ pour une tache). On ne fait cependant pas des banques de protéines, mais on fait des peptides, en découpant. Pour faire ces expériences, on connait les SNP, on connait le polymorphisme, on est capables de réaliser les sondes, et on veut savoir si l’individu A a un T, un G, un C ou un A à cet endroit. On envisage de faire des puces à ADN avec des nanopores, qui laissent passer des molécules ou non.

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Les cartes d’identité génétique I.

Histoire

En 1985, Alec Jeffreys met en évidence les VNTR. C’est lui qui a d’idée de ces cartes d’identité génétiques. Dès 1987, début des tests ADN aux USA, en médecine légale. Ca n’est pas passé facilement dans les mœurs, mais c’est passé. La difficulté d’interprétation venait du grand nombre de bandes. En 1989, les tests se généralisent, passent au Canada et en Europe. C’est utilisé pour la reconnaissance d’individus, notamment lors du Tsunami du golfe du Bengale, ou lors d’un conflit en ex-yougoslavie, lors du crime au CHR de Pau, dans les affaires de viol, mais aussi dans le crime de la Plaine-Fougère (affaire Dickinson), dans la recherche de paternité (Yves Montant), ou dans des crimes divers. On utilise l’équivalent des empruntes digitales, mises en place par Jeffreys. Ces tests ADN ont l’air d’être une preuve universelle, mais le plus important est le résultat : le test montre que vous n’êtes pas coupable. L’idée de base est que chaque individu a un génome unique, l’ADN d’un individu est unique. La présence d’ADN issu du chromosome Y permet d’identifier le sexe du donneur sur une tache de sang par exemple.

II.

Principe de l’obtention des empreintes génétiques -

Obtention et extraction d’ADN Obtention de fragments représentatifs des régions hautement variables du génome Séparation des fragments obtenus qui diffèrent en longueur d’une personne à l’autre Révélation de ces fragments Interprétation des résultats

Si l’on ne travaille pas en conditions de grande sécurité, de grande attention par rapport aux contaminations. Attention : l’empreinte génétique ne représente pas le patrimoine génétique d’une personne. Elle ne représente qu’un certain nombre de fragments d’ADN d’une personne. On ne regarde que 10 à 15 fragments différents des chromosomes. Ce qu’on oublie quand on a un test ADN, c’est qu’on doit donner une fréquence, une probabilité. On connait la répartition dans la population des allèles. Dans le résultat de l’individu, on peut obtenir :

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Semestre 5

Quelles sont les sources possibles de l’ADN en pratique ? -

On prélève des cellules de l’épithélium buccal avec un coton-tige, et on dépose le prélèvement sur un papier buvard spécifique La peau Le sperme Les ongles La racine du cheveu La salive Le sang

Le gène de l’amelogenin, se trouve dans la partie commune de l’X et de l’Y, il présente un morceau polymorphe de 107 nucléotides sur l’X et de 113 sur l’Y. L’analyse ne se fait plus en gel, mais par électrophorèse capillaire, les fragments sont marqués par fluorescence, on va mettre au niveau des amorces un agent fluorescent, il va permettre de passer les évènements devant un rayon fluorescent, et on peut mettre plusieurs agents fluorescents.

On peut aussi faire ces déterminations chez les animaux ou les végétaux, notamment pour étudier la fidélité des oiseaux. L’ADN mitochondrial est utilisé pour déterminer la maternité. On peut faire de la PCR à partir d’une cellule. C’est facile à mettre en œuvre, on a des kits prêts à l’emploi. La réponse est très rapide, le sang répond en 12h, le sperme en 72h. Les cellules buccales répondent en 6h, ce qui est compatible avec la garde à vue. Inconvénient essentiel : liés aux avantages, très grande sensibilité, risque énorme de contamination avec des ADN étrangers. Il faut donc des précautions draconiennes au niveau des prélèvements de l’ADN. Attention aux artéfacts : la Taq polymérase ajoute ou non des A, ce qui a pour conséquence que les pics sont plus petits ou plus grands qu’attendu. Les glissements de l’ADN polymérase conduisent à des unités de répétition en plus ou en moins. Une mauvaise filtration des ADN amplifiés entraine un recouvrement des pics.

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Semestre 5

En cas de mélange d’ADN, il devient difficile de déterminer le génome. Les allèles de grande taille disparaissent lorsque l’échantillon est dégradé. Mise en œuvre pratique : l’utilisation de préparations commerciales amplifiant plusieurs loci STR, en général au moins 8, réduisant la probabilité que deux ADN présentent le même profil à 1/10-13. La tendance est de multiplier les loci (16 par exemple). Il faut des préparations spéciales pour les loci Y et mt ADN. Interprétation des résultats : si pour un individu on obtient 2 allèles différents en taille de ceux caractérisant un ADN inconnu (scène de crime) l’exclusion est formelle, aucun risque d’erreur. L’exclusion est toujours absolue. Si les allèles d’un suspect sont de la même taille que l’inconnu, on parlera de concordance sans pouvoir écarter la possibilité qu’un autre individu possède sur cette région précise de son ADN les mêmes caractéristiques génétiques. Il est nécessaire d’utiliser un nombre de marqueurs élevé. Il faut de plus déterminer au sein d’une population la probabilité que deux individus présentent le même génotype. La base de données ADN CoDIS est la base de données avec les profils ADN des criminels. C’est la loi (variant d’un état à l’autre) qui détermine quels sont les profils qui doivent être retenus. Celle-ci contient 2.038.470 échantillons provenant d’individus et 93.956 venant de scènes de crimes. La force de la base CoDIS : c’est un outil très puissant pour résoudre des énigmes policières. Mais le coté obscur du système est dû à des profils mal interprétés (mélange, dégradation) ont conduit à des erreurs d’interprétation. Certains états permettent de mettre dans la base des profils provenant d’individus innocents. Ajouter le profil d’individu venant d’être arrêté viole le principe de la présomption d’innocence. En France, le consentement est obligatoire pour un prélèvement dans le but d’établir une empreinte génétique, mais en cas de refus, 1 an de prison et 15 000 euros d’amende sont risqués, et le double est demandé pour les détenus. Quelles sont les personnes fichées ? Celles visées précédemment ou susceptible d’avoir commis une infraction de ce type. Les empreintes sont effacées si la personne est innocente, mais conservées durant les délais d’appel. Les prélèvements biologiques sont conservés 40 ans. A qui appartient le prélèvement ? A l’intéressé, au laboratoire, à la police, à la justice ? Celui-ci contient la totalité des informations génétiques d’une personne. Certains pays détruisent les prélèvements : D, OS, FI, S, DK, NL. En France, on les conserve 40 ans (contre expertise éventuelle).

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Génétique appliquée

III.

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Semestre 5

Identification des restes des Romanoff

En aout 1917 la révolution russe commence. La famille royale est capturée et emprisonnée. Les comprend le Tsar Nicolas II et la Tsarine, les enfants : Alexandra, Olga, Tatyana, Anastasia, Nicholi. 16 juillet 1918 les Romanoff sont assassinés peu après minuit. Les corps sont transportés dans un wagonnet de mine, mis dans une fosse au bord de la route, recouverts de chaux vive et de terre. Juillet 1991 on découvre des cadavres dans une fosse commune près d’Ekatarinbourg. Ils correspondent aux restes de 9 personnes. On détermine le sexe, l’âge et le statut social de 9 personnes. 1992 les analyses ADN commencent. Analyse avec les microsatellites. Analyse avec l’ADN mitochondrial. Détermination du sexe : Amplification d’une séquence du gène de l’amélogénine. Il est porté dans la partie commune X et Y. Sur l’X un fragment de 106 pb est produit. Sur l’Y un fragment de 112 pb est produit. Ceci permet de confirmer la présence du corps de 4 hommes et 5 femmes. On n’a pas utilisé un fragment qui ne serait que sur l’Y car ça serait un problème de résultat négatif pour confirmer quelque chose, comme dans le test ADN. Il est toujours plus simple de prouver que quelque chose est présent plutôt que de prouver que quelque chose est absent. Analyse par microsatellites : Utilisation de 5 microsatellites correspondant à des répétitions de tétranucléotides : HUMTHO1, HUMVWA31, HUMF13A1, HUMFES/FPS, HUMACTPB2.

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Semestre 5

Les résultats de l’analyse : Les squelettes 4 et 7 sont parents des squelettes 3, 5 et 6, les squelettes 1, 8 et 9 correspondent aux serviteurs. Comment prouver que ce sont les restes des Romanoff ? Schéma mtADN On peut avoir de l’homoplasmie ou de l’hétéroplasmie, les mitochondries peuvent présenter un mélange d’ADN muté et non muté (hétéroplasmie). Analyse de l’ADN mitochondrial : la séquence nucléotidique de la région hypervariable de l’ADN mitochondrial permet de tester l’hypothèse. Le prince Philip d’Angleterre est parent de la tsarine Alexandra. Les descendants de Louise de Hesse-Cassel sont parents du Tsar Nicolas II.

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Semestre 5

Les conclusions de l’analyse: Les squelettes 4 et 7 sont ceux du Tsar et de la Tsarine, les squelettes 3, 5 et 6 sont ceux de leurs enfants, les squelettes 1, 8 et 9 sont ceux des serviteurs, le squelette 2 est celui du Dr Botkin.

IV. Exemple de l’utilisation des tests ADN dans le cadre d’un crime – USA versus Raymond Jenkins Le meurtre, 4 juin 1999 : Dennis Dolinger est retrouvé mort dans sa cave. Il a reçu 25 coups de couteau. Il y a du sang dans la cave, rez-de-chaussée, 1er et 2ème étage de sa maison. Son portefeuille a disparu. Dennis Dolinger : Sa vie publique : Politicien local, combat les revendeurs de drogue. Steven Watson : Musicien de rue, drogué, casier judiciaire important : drogue, vols, bagarres de rue. Les preuves contre Watson : il est arrêté en utilisant la carte de crédit de Dolinger le lendemain du meurtre. Il est en possession du portefeuille de Dolinger. Il a sur lui des traces de sang. Le crime est résolu : Watson est arrêté, il est accusé de meurtre. Il est envoyé en prison en attendant le procès. Les tests ADN mettent en évidence un autre meurtrier. Le FBI rejette la possibilité que l’ADN provienne de Watson. Habile déduction : c’est quelqu’un d’autre qui est coupable! Recherche sur l’ADN : Le profil ne correspond à aucune des données de la banque CODIS. Une correspondance est trouvée dans une autre banque avec l’ADN de Raymond Jenkins. Jenkins est accusé du meurtre. Jenkins est mis en prison et en attente de son procès depuis janvier 2000. La suite : Les preuves contre Watson sont rejetées, il est libéré, il disparaît de la circulation.

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Génétique appliquée

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Semestre 5

Les mythes sur les tests d’ADN : l’ADN d’un individu est unique. La recherche des allèles est objective. Les scientifiques sont et on travaille bien dans tous les labos. Le test n’est basé que sur 13 marqueurs. L’interprétation est humaine ! Le test ADN est une confirmation et non une preuve de culpabilité. Confirmation d’identité : Le suspect est identifié dans un premier temps par des preuves autres que l’ADN. Le test ADN ne vient que confirmer une identité. Test ADN uniquement : Le suspect est identifié par des comparaisons d’ADN avec les bases de données. On peut exclure d’autres suspects. Attention dans le deuxième cas nous avons affaire uniquement à une coïncidence statistique ! En 1989 à l’US open de golf, 4 joueurs ont fait un trou en un coup la probabilité d’un tel résultat est de 1/89 1015 (1,000,000,000,000,000). La signification diminue avec l’augmentation de la taille des banques de données. Conclusions : Les tests ADN doivent être interprétés avec prudence. Il faut augmenter le nombre de marqueurs. Il ne faut pas faire dire n’importe quoi à la statistique. Il faut faire renouveler les tests par des laboratoires indépendants. L’interprétation des tests doit être faite par des experts extérieurs au laboratoire où ils ont été réalisés.

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Semestre 5

Les Puces à ADN Les puces à ADN sont réalisées en déposant tout le génome d’un organisme sur une lamelle de microscope. On apporte un fluorochrome, si ça s’attache, lumière ! Il y a besoin d’informatique pour traiter la masse de données. Les couts de reviens de ce type de manipulations a été diminué par 100. Par exemple, la puce Affymetrix du génome humain. Macroarray : les spots sont macroscopiques. On peut mettre dessus une 100aine de spots, que ce soit des gènes, des cDNA… Microarray spottée : on passe dans le domaine microscopique, les spots sont de l’ordre de 100 µm, il y a 1000 à 10000 spots par cm². Pour déposer sur les spots, on utilise des imprimantes jet d’encre, qui ont des buses très précises. Genechips d’Affymetrix : la taille des spots est de moins de 20 µm. La densité est de 250000 spots par cm². On utilise ici du photodécoupage. On peut mettre des gènes sous la forme d’un cDNA entier. Les sondes utilisées sont généralement des ARNm produits dans 2 conditions différentes. Par exemple, on veut comparer la production de la larve ou de l’adulte, de la cellule tumorale ou normale, dans une condition ou dans une autre. C’est la comparaison de l’expression totale du génome dans 2 conditions différentes. On transforme les ARNm en ADN, en les marquant avec un fluorochrome. On les place sur la plaque. On aura alors sur la lame des spots d’ADN.

Les différentes étapes de l’analyse d’image : 1) Localisation des spots sur la lame 2) Délimitation des pixels correspondant à la zone d’hybridation 3) Délimitation des pixels pour l’estimation du bruit de fond Finir Présentation des résultats : les résultats correspondent à des valeurs numériques pour chaque couleur et on calcule un rapport rouge/vert.

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Semestre 5

Ces tables sont dures à lire, c’est pourquoi les groupes de résultats sont convertis en rapport de couleur. Le traitement des données se fait par informatique. Les problèmes sont des erreurs à la fabrication, des longueurs de sondes (25-60 nucléotides), l’hybridation est un phénomène stochastique, le bruit de fond est important, et la quantification des résultats n’est pas évidente. Les solutions à ces problèmes ne sont pas connues actuellement. Les buts de l’utilisation des puces à ADN : Recherche fondamentale : -

Visualisation du lot de gènes actifs dans un tissu particulier Exemple du stress cellulaire

Diagnostique médical : -

Liaison mutation/maladie.possibilité et efficacité des traitements pharmaceutiques 1999 – une puce avec 6800 gènes humais a été utilisée pour différencier leucémies myéloïdes et lymphoblastiques

Fabrication des médicaments : -

Production et test des nouveaux produits de l’industrie pharmaceutique Evaluation, spécificité, réponse

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Manque 1 cours

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Semestre 5

Sur la voie du tri des embryons : le DPI Le but est de faire de la FIV, et au niveau des embryons de les laisser se développer jusqu’à 4 divisions, de prélever une cellule, de l’analyser, et alors faire un choix : réimplantation ou pas. Le but est de répondre à certains couples qui ont des maladies génétiques entrainant ma mort de l’enfant, ou en aidant un enfant malade pour une greffe. On fait ici de l’eugénisme. Il faut faire attention aux dérives, dans tout ce qui est sélection, sportive, de sexe… La fivete et le DPI 1234-

Hyper ovulation Récupération des ovocytes Insémination artificielle Transfert d’embryons

Pour ce type de FIV, on fait au maximum 3 essais. Ça ne fonctionne pas toujours, c’est douloureux et lourd. Le déficit en une cellule au stade 8 cellules n’est pas gênant. En principe, on prélève plusieurs embryons, et on ne prélève que ceux qui ne portent pas la maladie. En attendant, les autres sont congelés. Les problèmes étiques sont les suivants : -

-

Que faire des embryons surnuméraires ? o Congélation et stockage o Don aux couples stériles o Don aux recherches sur les cellules ES Que faire des embryons atteints ? o Don à la recherche o Rejet

L’argument de fond est de dire que ces cellules souches peuvent être utilisées dans le cas de thérapies reconstructrices. Toute une thérapie cellulaire est possible grâce à ces cellules souches totipotentes. Ce genre de cellules, quand on les réimplante, on une telle amplification qu’il y a risque de tumeur. On ne maitrise de plus pas les possibilités de différenciation. On a transformé des fibroblastes en cellules souches. C’est une solution de transgénèse. On a des cellules souches chez l’adulte qui sont utilisables. Création des enfants médicaments ? Dans le cas de l’anémie de Fanconi. Glissement possible vers l’eugénisme moderne. Qui définit « amélioration » ? -

Que faire si votre enfant a 60% de probabilité de devenir schizophrène ? Que faire si votre enfant a 60% de probabilité d’avoir un QI de 80-90 ?

Où placer les limites ?

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La politique interationale sur le DPI dit qu’en Allemagne dit qu’il est totalement interdit d’utiliser des embryons. Aux USA, c’est possible suivant les états. En France et en UK, c’est possible dans le cas de maladies très graves.

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Semestre 5

Lod Score : rappel 𝐿𝑜𝑑 𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒 =

𝑣𝑟𝑎𝑖𝑒𝑚𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑙𝑖𝑎𝑖𝑠𝑜𝑛 𝜃 (𝑓𝑟é𝑞𝑢𝑒𝑛𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑖𝑠𝑜𝑛) 𝑣𝑟𝑎𝑖𝑠𝑒𝑚𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑙 ′ 𝑖𝑛𝑑é𝑝𝑒𝑛𝑑𝑎𝑛𝑐𝑒 𝜃 = 0,5 𝐿𝑜𝑑 𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒 =

L(θ) = (θ/2)r ((1- θ)/2)n-r

log(𝜃 < 0,5) log(𝜃 = 0,5)

r = nombre de recombinants

n = nombre de méioses.

L’hypothèse nulle est l’indépendance. Le Lod score peut être calculé pour toutes les valeurs entre 0 et 0.5 souvent on se contentera de θ ) 0,01 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4. Zmax est la valeur maximale de la valeur de l’hypothèse. Si Lod score > 3 : évidence de liaison 2 < Lod score < 3 : il faut plus de détails -2 < Lod score < 2 : non informatif Lod score < -2 : exclusion de la liaison. Si Lod score > 3, l’hypothèse de liaison est 1000 fois plus probable. Si l’on est au niveau de 3 ou supérieur à 3, le Zmax :

Z 3

0,5

fθ

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Haplotypes L’utilisation des haplotypes en génétique humaine. Un haplotype est un ensemble de marqueurs qui ont telle forme allélique qui définisse un haplotype. C'est-à-dire qu’on aura un chromosome qui sera caractérisé par, à différents emplacements, la forme allélique de chaque gène. On obtiendra ainsi un haplotype.

Chromosome 1

haplotype 1 malade 1

3

1

4 1

5

2

1

2

Marqueur de la mucoviscidose Chromosome 2

haplotype 2 + 1

2

3

3 2

2

1

3

4

Au bout de n générations, toutes les liaisons sont rompues, et chaque haplotype a autant de chance de survenir au cours du temps. Le temps est fonction de la distance entre les 2 gènes. Plus les gènes sont proches, plus le temps de l’égalisation sera long. On a donc brassage des haplotypes qui aboutira à rompre les liaisons, et le nombre de générations pour atteindre l’équilibre dépend de la distance. On prend : -

-

100 individus malades et leurs haplotypes : o 41 90% o 42 2% o 31 3% o 32 5% 100 individus non malades et leurs haplotypes : o 41 24% o 42 26% o 31 28% o 32 22%

On a un déséquilibre de liaison, on n’a pas eu le temps de rompre toutes les liaisons pour arriver à ce résultats, pas eu le nombre de générations qu’il fallait, et donc la mutation de la mucoviscidose est apparu il y a peu de temps sur le chromosome humain. A-t-on le même déséquilibre de liaison si l’on prend des marqueurs plus larges ? -

100 individus malades et leurs haplotypes : o 15 60% o 32 10% o 12 15%

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Génétique appliquée

-

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o 35 15% 100 individus non malades et leurs haplotypes : o 15 24% o 32 26% o 12 28% o 35 22%

Une courbe de déséquilibre de liaison aurait cette allure : Chromosome

haplotype

Le généticien cherche des familles nombreuses, avec beaucoup de recombinaisons. Beaucoup de trais présentent des variations continues, par exemple, la taille des individus, le poids des individus, la pression artérielle… L’environnement gomme la distinction entre les classes. La moyenne et la variance sont les deux seules choses importantes, que l’on va étudier. La variance est l’indice de dispersion qui permet de décrire le système. En génétique quantitative, on cherche à établir des modèles génétiques permettant de prédire l’évolution des caractères quantitatifs. La variance phénotypique est définie par le déterminisme génétique des caractères : nombre de gènes, répartition dans le génome, effet des gènes. On va utiliser des systèmes simplistes : -

Les caractères quantitatifs peuvent s’expliquer par la ségrégation de nombreux gènes (système polygénique). Chaque gène influence de la même façon le phénotype. Il n’y a pas d’interaction entre les gènes.

A/a :

0,5

Allèles dominants

A//a

A//A

a//a

0,25

1

2

0

0 0

1

2

AB x ab

AB Ab Ab aB

AB 4 2 3 3

ab 2 0 1 1

Ab 3 1 2 2

aB 3 1 2 2

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6/16 4/16

1/16 4

3

2

1

0

Le nombre de phénotypes : 2n+1 Estimation du nombre de gènes en jeu : il faut estimer en F2 la proportion d’individus exprimant le phénotype des parents : ¼n Les données statistiques : -

-

La distribution des phénotypes suit une loi normale o Cette loi est décrite par une moyenne symbolisée pa µ et une variance symbolisée par σ². La variance décrit la dipersion des valeurs autour de la moyenne µ o 68% des valeurs sont comprises entre +1 et -1 σ autour de µ, 95% autour de +2 et -2 σ, et plus de 99,5% autour de +3 et -3 σ La moyenne peut être calculée avec : o

𝑀𝑜𝑦𝑒𝑛𝑛𝑒 = 𝑥̅ =

∑𝑛 ̅ 𝑖=1 𝑥𝑖 𝑛−1

L’étude des variances va renseigner sur l’héritabilité des caractères. La variance d’un phénotype est égale à la variance génotypique + la variance environnementale : VP = VG + VE La variance génétique peut être décomposée en phénomènes que sont l’additivité des gènes, la variance due à l’épistasie, la variance due à la récessivité des gènes… On en arrive à une notion : l’héritabilité ℎ² =

𝑉𝐺 𝑉𝑃

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Génétique appliquée

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Semestre 5

L’héritabilité Vp = Vg + Ve

µ

Dans la lignée, Vp = Ve. Dans la F1, Vp = Ve aussi. Si on arrive à la F2, là, comme tout le système va être brassé, la variance phénotypique sera égale aux différences du génotype et de l’environnement. C’est valable pour une lignée pure. Chez l’homme, c’est plus complexe, puisqu’on n’a pas de lignée pure. On va donc comparer des jumeaux. Cependant, les vrais jumeaux sont élevés dans le même environnement, ce qui pose problème. Autre point là-dessus, il faut voir la variance, c'est-à-dire la diversité. On fait un saut rapide en disant que pour ce caractère, comme il y a tel calcul de variance, on ne peut pas dire que telle partie est due à l’environnement, l’autre au génotype. La variance génétique recouvre ce qui est dû au nombre de gènes qui sont en jeu, ce qui est dû à l’épistasie, et ce qui est dû aux relations de dominance et de récessivité. Ce dont on s’occupe en général, c’est le nombre de gènes. On s’occupe ici de la notion d’héritabilité, qui est relié aux variances. L’héritabilité au sens large est h², elle mesure la variance génétique additive. h² = Vg/Vp

0 < h² < 1

Une autre notion, H², est l’héritabilité au sens strict, la variance génétique complète est mesurée. On peut suivre l’évolution de h², pour H² c’est plus compliqué, on peut donc faire des prévisions dans le premier cas, pas dans le second. // Voir diapo Artificial selection and h² On sélectionne les queues de courbes, composée d’individus de moyenne m’. En G2, on observe une deuxième courbe qui aura une nouvelle moyenne m’’. On a donc un système au niveau de la sélection telle qu’elle est déterminée. On a une valeur m – m’ = S, et une valeur m – m’’ = R. S est donc la moyenne des individus sélectionnés, et R est le gain. h² sera égale à R/S. Quand on arrive à une valeur de h² de 0, le système est fixé, il n’y a plus d’amélioration possible.

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Semestre 5

Recherche des QTL QTL = loci trait quantitatif = recherche des loci qui contiennent des gènes qui gouvernent les caractères quantitatifs. On a donc une distribution, avec une courbe de distribution, avec des caractères, des traits, et on a plusieurs gènes différents qui gouvernent le caractère étudié. La question posée par les QTL, c’est lesquels ? Trait

Individus Un QTL (quantitative trait locus) correspond à la position d’un ou plusieurs gènes qui affectent un caractère quantitatif. Exemples : la taille des individus, le rendement en protéine d’une plante ou d’un animal. Les caractères quantitatifs sont souvent influencés par plusieurs gènes et l’environnement. La localisation des QTL est donc généralement beaucoup plus difficile que celle des gènes affectant un caractère qualitatif comme la couleur d’une fleur. Les éléments nécessaires pour pouvoir détecter des QTL sont les suivants : 1- Disposer d’une descendance en ségrégation a. Population F2, lignées recombinantes (HD ou SSD), back-cross, croisement entre hétérozygotes ou autres b. Effectifs les plus élevés possibles 2- Connaitre les génotypes de tous les individus de la population a. Pour chaque individu de la descendance, disposer du génotype à un ensemble de marqueurs régulièrement répartis sur les chromosomes  Carte génétique de bonne qualité : o Espacement de 5 à 10 cM o Pas trop de données manquantes

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Génétique appliquée

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Semestre 5

Longueur

Longueur

mP2

mP1

a//a P2

A//A P1

Individu s

Individus x

Longueur MF1 A//a P1

Individus Il faut également avoir une bonne carte génétique de l’organisme étudié :

Comment réaliser l’analyse des QTLs ? -

Classer les descendants vis à vis des marqueurs génotypiques Comparer les phénotypes entre les classes (test t) Si test significatif = marqueur lié à un QTL Mesure de l’effet du QTL par différences entre les moyennes

La taille est corrélée avec le génotype AA (grand) versus aa (petit) un QTL impliqué dans la taille des plantes est lié aux marqueurs A;a. // Voir diapo Le principe de la détection de QTL et Analyse simple pour un marqueur Absence de liaison marqueur /QTL

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Semestre 5

Recherche de QTL chez le poulet Problématique : identifier les gènes directement responsables de la variabilité de l’engraissement chez le poulet de chair. Il faut déterminer 2 lignées : une qui fait du gras, et une qui n’en fait pas. On n’a pas de lignée pure chez le poulet. L’important est de savoir qui intervient là dedans.

A.

Approche génétique : approche QTL

Mettre en évidence des régions du génome responsable de la variabilité de l’engraissement

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Génétique appliquée -

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Semestre 5

Régions = QTL quantitative trait loci Il ne faut pas d’à priori sur la nature du gène causal recherché

// Schémas Au niveau des QTL, on détecte les gènes qui ont le plus d’influence. Si on a une vingtaine de gènes qui interviennent faiblement dans un caractère, on ne déterminera rien.

B.

Répertorier l’ensemble des gènes des régions QTL

En 2000 : peu de gènes localisés : moins de 10 gènes localisés sur GGA 5. Juin 2004 : séquençage du génome : tous les gènes localisés. // Schémas

C.

Choisir les bons candidats

Le choix des candidats sur fait sur le critère de leur fonction (lien avec le métabolisme des lipides). Difficultés : 1- Nombreux gènes candidats 2- Existence de nombreux gènes à fonction inconnue Nécessité de développer différentes approches complémentaires pour mieux caractériser ces régions QTL. 1- Poursuite de l’approche génétique : réduire la région QTL. 1ère réduction du QTL du GGA 5 de septembre 2003 à septembre 2004 (long) 2- Développer une approche fonctionnelle : trancriptome. Apporter des informations fonctionnelles nouvelles sur ces régions QTL en précisant leur implication dans le métabolisme des lipides. L’approche fonctionnelle = l’approche transcriptomique compare les profils transcriptomiques LG/LM, détection de 2 groupes de gènes… // voir diapos On a ici une information très importante au niveau de la physiologie, puisqu’on aura les ARN surexprimés ou réprimés, et ainsi penser que tel gène correspond à tel caractère ou non. Ce sont les eQTL, responsables de la variation d’expression du groupe de gènes identifiés. On a des cellules que l’on peut modifier, totipotentes, que l’on peut remettre dans les embryons. On fait du knock-out, et on les réinsère. On se demande alors quelle est la qualité de la viande. On peut ensuite faire le sauvetage, pour montrer que ce n’est pas une corrélation. L’autre proposition serait de s’adresser à un véritable animal modèle de laboratoire. On cherche l’homologue chez la souris, et on l’étudie. C’est plus facile chez la souris, on peut faire des systèmes conditionnels, comme Lox. On reviendra par la suite au poulet.

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