und B-Zellen?

Regulation of acquired immune responses during infection with intracelllular bacteria

”Vaccines”

Geschichte der Vakzinierung: eine Erfolgsgeschichte ! Vor und nach Einführung des Impfstoffes (CDC seit 1912) Polio Pocken Masern/Mumps/Röteln Diphtherie Keuchhusten

100 % (USA, Westeuropa) 100 % (weltweit) 99 % (USA) 99 % (USA, Westeuropa) 97 % (USA)

Vor und nach Einführung des Impfstoffes (UK seit 1999) Neisseria meningitidis C Salmonella Vi Konjugat

92 % (Kleinkinder) 95 % (Heranwachsende) 90 % (2 - 4 jährige Kinder)

Sicherheit ? Masern-Enzephalopathie

1/1000 natürliche Infektion 1/1.000.000 Impfung

Die drei größten Killer in Millionen (Jahr 2000) 2.3 AIDS 1,7 TB 0.5 TB/HIV

1.2 Malaria

Dringend benötigte Impfstoffe: HIV Tuberkulose Malaria Hepatitis C Chlamydien Helicobacter pylori Leishmaniose Filariose Schistosomiasis (Bilharziose) Papilloma Virus Rotaviren (Durchfallerkrankungen) Respiratorisches Synzytienvirus (RSV), Rhinoviren u.v.a. Nicht nur Infektionskrankheiten Tumorvakzine Alzheimer

Neue Ansätze zur Impfstoff-Entwicklung ► Memory/Immuologisches Gedächtnis ► Wirksamkeit von Vakzinen Nachweis von Immunantworten ► Neue Strategien zur Verbesserung alter und zur Entwicklung neuer Vakzine !

Memory/Immunologisches Gedächtnis ► B-Zell-Memory - Antikörper - Memory-B-Zellen - Plasmazellen ► T-Zell-Memory - CD4 Th-Zellen - CD8 T-Zellen

B-Zellen/Antikörper ► mit wenigen Ausnahmen beruhen alle zur Zeit verwendeten Impfstoffe auf der Induktion von B-Zellen/Antikörpern ► Antikörper sind relativ leicht induzierbar ► Die Induktion und Wirksamkeit von Antikörpern lässt sich relativ einfach testen. -> Nachweis der Wirksamkeit der Vakzine

B-Zell-Memory/Antikörper: Nachweis einer B-Lymphozytenantwort ► Qualitativer und quantitativer Nachweis von spezifischen Antikörpern • ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) • Western-Blot • Neutralisierungstests ► Nachweis der antikörperbildenden Zellen • Plaquetest • ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay)

Memory-T-Zellen Verschiedene Memory-T-Zellsubpopulationen ► CD4, CD8 ► CD4 Th-Zellsubpopulationen (Zytokin-Profil) - Th1, Th2, Th17…. ► Memory-T-Zellsubpopulationen - central Memory T-Zellen - effector Memory T-Zellen ► Expression von (hemmenden) Co-Rezeptoren ► Lokalisation der T-Zellen - Lunge, Darm…. Welche dieser Populationen schützt ??

Central vs Effector-Memory T-Zellen CD4 CD4

CD8

Sallusto et al, Science 1999

Central vs Effector-Memory T-Zellen

CCR7 CD62L Gewebe Proliferation Effektorfunktion Cosignale Lebensdauer

Central ++ ++ Lymphgewebe ++ +/? +

Effector +/Peripherie +/++ ?

Methoden zur Analyse der erworbenen T-Zellantwort

Problem: Kein Antigen-spezifisches, den Antikörpern vergleichbares und einfach messbares Zellprodukt vorhanden!

Qualitative Nachweismethoden für T-Zellen (z.T. semi-quantitativ) in vitro • Proliferation und Zytokinproduktion nach Stimulation mit dem Antigen • Zytotoxizität • Limitierende Verdünnungskultur (Limiting Dilution Assay) • T-Zellklonierung und Analyse der individuellen Klone in vivo • DTH Reaktion (Tuberkulin-Test) • Bestimmung der schützenden Immunität “Infektionsexperimente“

Neuere Methoden zur quantitativen und qualitativen Analyse der T-Lymphozyten-Antwort • ELISPOT-Assay • Intrazelluläre Zytokinfärbung nach kurzer Antigenstimulation • MHC/Peptid-Komplexe (Tetramere)

Klassisches Beispiel einer Delayed-Type-Hypersensitivity-Reaction: Tuberkulin-Test

Zytokintest

Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente)

100

naiv

80

immunisiert mit einem attenuierten S. typhimurium-Stamm

60 40 20 0 0

20

40

60

80

Tag nach einer Infektion mit S. typhimurium (400 i.v.)

Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente)

-> Große Impfstudien können auch als Infektionsexperiment angesehen werden

ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay) Methode: *

*

*

*

APC* ** APC* * T* T* T *

anti-IFNg-Antikörper

E EE E

Substrat

+ T-Zellen + APC +Antigen

*

*

*

*

APC* ** APC* * T* T* T *

24h

E EE E

anti-IFNg-Antikörper -Enzymkomplex

Entfernen der Zellen

ELISPOT-Assay Beispiel

ohne Antigen

mit Antigen

IFN-g+ Spots/105 Zellen

250

200 150 100 50 0

-

Antigen

naiv

-

Antigen

infiziert

FACS: Intrazelluläre Zytokinfärbung Prinzip:

Blockade der Zytokinsekretion (Brefeldin A)

Fixierung und Permeabilisierung der Zellen

intrazelluläre Zytokinfärbung mit Antikörpern

Intrazelluläre Zytokinfärbung Beispiel:

FACS

T

T

T

APZ APZ APZ APZ

T T

T

T

extra- und intrazelluläre Färbung

IFN-g

CD8

T

CD8

Inkubation

APZ APZ APZ APZ

4h IFN-g

Multizytokin-Produzenten

MHC Klasse I-Tetramere Prinzip H-2Kd

Peptid (LLO91-99)

b2-Mikroglobulin

Streptavidin

Biotin

CD8

TZR

Streptavidin

PE PE

PE PE

Primärinfektion (103 i.v.)

Titer

Sekundärinfektion (105 i.v.)

0

1 Wochen

2

Primärinfektion 0,02

Tag 4 0,14

Tag 7 2,22

Tag 10 3,11

1,41

Sekundärinfektion Tag 0 0,36

Tag 3 1,48

Tag 5 20,05

Tag 17

Tag 7 9,44

CD62L FITC

Epitop: Listeriolysin O Peptid 91-99

Tetramer PE

Tag 0

HIV-Infektion

107

3

106 2

105 104

1 103 0 0

100 200 300 Days after HIV infection

Viral load (copies per ml)

HLA-B27-gag 263-272 staining (%)

anti-viral Therapy

102 400

McMichael and Rowland-Jones, Nature 2001 410:908

Akute Infektiöse Mononukleose (Epstein-Barr-Virus)

Callan et al. JEM 1998 187:1395

Grundlagenforschung und Vakzine-Entwicklung: Biologie der Immunantwort: • Welche Immunantwort schützt? (Welche führt zu Pathologie?) • Tiermodelle zur Testung • Korrelat für Schutz im Menschen. Biologie des Erregers: • Lokalisation im Wirt, in der Wirtszelle? • Virulenzfaktoren, Attenuierung (Abschwächung) • Impfstoff-Kandidatenauswahl. - Genome, Proteome. - Welche Antigene macht der Erreger im Wirt?

Hauptproblem: Wie sieht eine schützende Immunantwort überhaupt aus?

“Correlates of protection“

Correlates of protection Für wichtige Krankheitserreger ist unklar wie eine schützende Immunantwort aussieht! ► B-Zellen und/oder T-Zellen? ► Zielstrukturen/Antigene für T- und B-Zellen? ► Quantität der Memory-T-Zellen? ► Qualität der Memory-T-Zellen? - Zytokinprofil (multi-Zytokinproduzenten) - Oberflächenmoleküle - Langlebigkeit - Effektorfunktionen/Proliferation

Neue Strategien: 1. Subunit-Vakzine: - rekombinante Proteine - Peptide, Peptide-Agglomerate 2. Lebend attenuiert: gezielte Eliminierung von Virulenzfaktoren 3. Lebend rekombinant:

- Antigene (Eigen-, Fremd-) - Zytokine (IL-12, GM-CSF) - Zytolysine (Listeriolysin)

4. DNA: Antigene, Zytokine, CpG-Motive 5. Neue Adjuvantien

6. Prime-Boost-Ansätze

Subunit-Vakzine

+ rekombinante Proteine sicher, definiert, stabil richtige Konformation (B-Zellen)

wenig immunogen keine CD8 T-Zellen

-> Lipoproteine, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate

Peptide

sicher, definiert, stabil billig

wenig immunogen keine CD8 T-Zellen Konformation (B-Zellen) MHC (Impflöcher)

-> Lipopeptide, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate, Choleratoxoid-Konjugate, Polypeptide mit Schnittstellen für Proteasomen

Attenuierte (rekombinante) Lebend-Vakzine

+ Lebend/ attenuiert

ähnlich der Infektion, immunogen, Gedächtnis, mukosale Immunität, Persistenz, multivalent immunstimulatorisch lange Erfahrung (Vaccinia, Adenoviren, BCG, Salmonellen)

Entzündung Sicherheit Immunsuppression Reversion Rekombination

-> Expression rekombinanter Fremdantigene, Zytokine; Prime/Boost Vakzinierung

Nackte DNA Vakzine

+ Nackte DNA

Persistenz, ähnlich der Infektion, billig, haltbar CD4, CD8 T-Zellen, B-Zellen

Sicherheit ? Einbau

Zytokingene CpGs: hohe konzentrationen nicht-methylierter Motive Aktivierung von TLR-9 -> TH1 -Antwort

Adjuvantien

+

-

Adjuvantien Depoteffekt Entzündung alle Prozessierungswege Immunstimulation Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat ISCOMs, Saponin, Mannosepolymere Öl in Wasser, Liposomen Virus-like Particles Lipid A Cholera-Toxoid (B-Untereinheit)

Prime-Boost-Vakzinierung

McShane et al. Nat. Med. 2004 10:1240

TB reactive T-Zellen

Prime-Boost-Vakzinierung

Tuberkulose Ist eine Impfung möglich?

Tuberkuloseerreger leben in Wirtsmakrophagen

Mykobakterien

T-Zellen schützen gegen Tuberkulose-Erreger

1927: Der Impfstoff M. bovis Bacille-Calmette-Guerin (BCG) attenuierte M. bovis-Stamm

Léon Charles Albert Calmette (1.7.1863 - 29.10.1933)

Jean-Marie Camille Guérin (22.12.1872 - 9.6.1961)

# wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff # zunehmender Wirkungsverlust!!

Listerien entweichen ins Zytoplasma der Zelle: Listeriolysin Listeria monocytogenes

O min

20 min

Schutz durch einen gentechnisch veränderten Impfstamm: rBCGureC-Hly Aerosol Infektion mit dem Beijing Stamm in der Maus.

ungeimpft BCG BCG ureC Hly

Grode et al. JCI 2005

Verschiedene Vakzinierungsstrategien gegen SIV gag in Rhesusaffen

CD4 Zellen

viral load

McElrath et al. Lancet 2008

Die Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung gibt ihnen mehrere Millionen Euro zur Impfstoffentwicklung.

Wie gehen sie vor?