Vermehrung oder Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien in

13.11.2014

Vermehrung oder Eliminierung  antibiotikaresistenter Bakterien in  Biogasanlagen? Prof. Dr. Dr.-Ing. Peter Kämpfer Institut für Angewandte Mikrobiologie Justus-Liebig-Universität Gießen

Potentieller Transfer antibiotikaresistenter Bakterien aus der Landwirtschaft

Eingangsproben: Gülle und Festmist aus intensiver Tierhaltung

Pharmazeutika (Antibiotika) Futtermittelrückstände (Cu, Zn) Pathogene Bakterien Bakterielle Sporen Antibiotiaresistente Bakterien Resistenzgene Viren

Biogasanlagen als technologische Barriere für pathogene und antibiotikaresistente Bakterien ??

Ausgangsproben: Fermentierter Rückstand aus Biogasanlagen

Pharmazeutika (Antibiotika) Futtermittelrückstände (Cu, Zn) Pathogene Bakterien Bakterielle Sporen Antibiotiaresistente Bakterien Resistenzgene Viren

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Dargestellte Ergebnisse aus Untersuchungen von: 15 Biogasanlagen 2012-2014 (BGA001-BGA015) Untersuchungen im Rahmen des BMBF Projektes RiskWa

11 Biogasanlagen 2013 (BG1-BG11) Untersuchung in Kooperation mit Prof. Breves, Tierärztliche Hochschule Hannover Eingangsproben/Gärsubstrat (nur Gülle/Festmistanteil) Ausgangsproben/Gärrest

Vorkommen potentiell humanpathogener antibiotikaresistenter Bakterien in der Großtierhaltung Extended-Spectrum- Beta- Lactamase (ESBL)-tragende Enterobacteriaceae > Gram-negative Gammaproteobacteria > Klinisch relevant: Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli

Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) > Gram-positive Firmicutes > Klinisch relevant: Staphylococcus aureus

saureus.mlst.net

Vancomycin-resistente Enterococcus (VRE) > Gram-positive Firmicutes > Klinisch relevant: Enterocccus faecalis, Enterococcus faecium efaecalis.mlst.net

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ESBL tragende Enterobacteriaceae CHROMagar ESBL (www.mast-diagnostica.com)

Genomische DNA

Plasmid mit ESBL Gen

Multiplex-PCR (Parallele Detektion verschiedener Gene)

blaSHV (747 bp) blaCTX-M (593 bp) blaTEM (445 bp)

Monstein et al. (2007) APMIS 115, 1400-1408

ESBL – Extended-Spectrum-Beta-Lactamasen Beta-Laktamasen: bakterielle Enzyme, hydrolysieren Laktam-Ringstrukturen der Antibiotika Punktmutationen in den enzymcodierenden Genen können „Effektivität der Enzyme” erhöhen (=Extended-Spectrum Beta-Laktamasen; ESBL) -> Hydrolysieren Cephalosporine (1. – 4. Generation) Erstes ESBL Auftreten: SHV-2 in 1983 Klebsiella ozeanae Bisher 9 Familien an Beta-Laktamasen bekannt: TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES, TLA, BES, OXA

SHV-2

CTX-M

Paterson and Bonomo (2005) Clin. Microbiol. Rev. 218(4): 657-686 CTX-M Dominierend nach TEM und SHV Zum ersten Mal beschrieben in 1992 Erfolgreiche/schnelle Verbreitung ->110 CTX-M Typen sind bekannt

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ESBL E. coli Populationen bei Mensch, domestizierten Tieren und Wildtieren ESBL tragende E. coli gleicher Sequenztypen wurden bei Menschen, Wildtieren und domestizierten Tieren detektiert Möglicher Transmission: Großtierhaltung Genomische DNA

Mensch

Plasmid mit ESBL Gen

1. E. coli Stamm 1

E. coli Stamm 1

E. coli Stamm 1

E. coli Stamm 2

2. Gunther et al. (2011) Frontiers in Microbiology 2(246): 1-13

Detektionprinzip - ESBL, MRSA, VRE Detektion Direktplattierung vs. spezifischer Voranreicherung

10 g 1x

Eingangs/Ausgangsproben 10 g 10 g 1g 0.1 g 1x 2x 3x

Serielle Verdünnung in 0.9% NaCl

1. Selektive Voranreicherung (Selektivmedium mit Antibiotika) 24 Stunden, 37°C

Plattierung auf CHROMAgarTM ESBL, VRE, MRSA 24 Stunden, 37°C

2. Vereinzelungsausstrich CHROMAgarTM ESBL, VRE, MRSA 24 Stunden, 37°C

3. Screening einzelner Kolonien Nachweis von Resistenzgenen (Multiplex-PCRs) “Phylogenetische” Identifizierung: 16S rRNA Gen

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Ergebnisse der Direktplattierung auf CHROMAgar E. coli E. coli

Direktplattierung auf CHROMAgar ESBL Erfassung koloniebildender Einheiten (KBE) Ergebnisse von 5 BGAs Beprobt 2012

Konzentration auf CHROMAgar ESBL kultivierbare Bakterien waren in Eingangsproben deutlich höher als im Gärrest. ESBL-E. coli (pink-gefärbte Kolonien) wurden nur in Eingangsproben detektiert. Phylogenetische Identifizierung: Pink gefärbte Kolonien: Spezifisch ESBL-E. coli Blaue Kolonien: Citrobacter, Enterobacter, aber auch Aeromonas (unspezifisch) Braun/Beige Kolonien: Größtenteils Pseudomonaden, Acinetobacter FAZIT: Spezifischer Nachweis, aber geringe Detektionseffizienz bei der Direktplattierung

Vergleich Direktplattierung – Voranreicherung zur Detektion von ESBL E. coli auf CHROMAgar ESBL

Pinke Kolonien repräsentieren ESBL-E. coli -> Obwohl der Nachweis bei der Direktplattierung nicht möglich war waren fast alle Proben nach Voranreicherung positiv.

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ESBL E. coli Nachweis Vergleich der Direktplattierung und nach Voranreicherung

February 2013/2014

April

July/ August

October

DP 10 g 1g 0.1 g DP 10 g 1g 0.1 g DP 10 g 1g 0.1 g DP 10 g 1g 0.1 g

Untersuchung von zwei BGAs (BGA001 und 015) zwischen Februar 2013 und Februar 2014 (4 Probenahmen) DP: Direktplatterung (aus 10 g) 10 g, 1g , 0.1 g = Mengen an Ausgangsmaterial das in den die Voranreicherung eingesetzt wurde

1 11 5

SHV+TEM

SHV

TEM

CTX-M

CTX-M+TEM

SHV+TEM

Output

SHV

TEM

CTX-M

BGA 001

CTX-M+TEM

Input

4 7 2 2 4

3 6 1 7 1 6 3 5 3 1 2 3 1 4 2 2 4

6 5 1 8

Nummern in den Kästchen repräsentieren die Anzahlen von E. coli Kolonien die die oben genannten ESBL Gene trugen.

1

Den Hauptanteil machten CTX-M Gene aus, zusätzlich detektierten TEM Gene sind vermutlich keine ESBL sondern chromosomal codierte TEM-1 Gene (vereinzelt bestätigt mit Sequenzdaten)

Abundanz verschiedener ESBL Gentypen bei E. coli Isolaten (BGA001 und BGA015) n=72

Fraction of E. coli with respective ESBL genes (%)

100%

n=40

2

n=8

3

SHV+TEM

4

90% 80%

n=57

SHV TEM

25

CTX-M

70%

27

60%

7 41

50% 40% 30%

44

20%

13

10%

9

1

Input BGA015

Output BGA015

0% Input BGA001

Output BGA001

Zusammenfassung aller isolierten und gescreenten E. coli Isolate aus BGA001 und BGA015 der Untersuchungen zwischen Februar 2013 und Februar 2014 Total: 176 Isolate

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Auftreten verschiedener CTX-M Gruppen Zusammenfassung der Daten von BGA001 und BGA015 Analyse basiert auf 66 sequenzierten CTX-M Genen Input

Output CTX-M-9 6%

CTX-M-2 2%

CTX-M-2 5%

CTX-M-9 15%

CTX-M-1 83%

n = 48 CTX‐M Gene 

Total CTX-M-9 12% CTX-M-2 3%

CTX-M-1 85%

CTX-M-1 89%

n = 18 CTX‐M Gene 

n = 66 CTX‐M Gene 

CTX-M Gene der isolierten E. coli wurden waren aus der CTX-M-1 Gruppe (>80%), CTX-M-9 und 2 wurden mit geringer Abundanz nachgewiesen.

Nachweis Methicillin resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) CHROMagar MRSA

(www.mast-diagnostica.com)

Multiplex-PCR

Poulsen et al. (2003)

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MRSA Nachweis (BG 1 – 10) 10 g MRSA 1E 1A 2E 2A 3E 3A 4E 4A 5E 5A 6E 6A 7E 7A 8E 8A 9E 9A 10E 10A +

+ + + + + + + + + + + + + + + + 1 + + +

1g a + + + + + + + + + + + + + + + + 2 + + +

b + + + + + + + + + + + + + + 2(3) + + + + +

a + + + + + + + + + + + + + + + + 2 + + +

0,1 g b + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

c + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Resistenzgen n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. mecA n.d. mecA n.d. n.d. n.d.

Kein Wachstum Wachtsum Resistenzgennachweis: Anzahl positive Kolonien nach Vorscreening (Isolate mit Resistenzgenen nach Vereinzelung)

Kein MRSA detektiert, In 2 Eingangsproben mecA tragende andere Staphylococcus spp.

E: Eingangsprobe/ Gärsubstrat A: Ausgangsprobe/ Gärrest

Phylogenetische Identifizierung Staphylococcus cohnii

Staphylococcus hominis

Staphylococcus lentus

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Nachweis Vancomycin resistenter Enterokokken (VRE) CHROMagar VRE (www.mast-diagnostica.com)

Multiplex-PCR

Kariyama et al. (2008)

1: E. faecalis mit vanA 4: E. faecium mit vanB

VRE Detektion (BG 1 bis 10) 10 g VRE 1E 1A 2E 2A 3E 3A 4E 4A 5E 5A 6E 6A 7E 7A 8E 8A 9E 9A 10E 10A +

+ + + + + + 1 + + + + + + + + 1(0) +

1g a + + + + + + + 1 + + + + + + + 1 +

0,1 g Resistenzgen b a b c + + + + n.d. - n.d. + + + + n.d. + + 2 + vanA + + + + n.d. + + + + n.d. + + + + n.d. + 1 vanA+vanC1 + 1(0) + + vanA + 1 + 1 vanC1 + + 1(2) vanC1 1(0) + 1(0) + vanC1 + + + + n.d. + + + + n.d. + + 1(0) + vanC1 + + + + n.d. + + + + n.d. + + - vanC1 - n.d. + + + + n.d.

Kein Wachstum Wachtsum Resistenzgennachweis: Anzahl positive Kolonien nach Vorscreening (Isolate mit Resistenzgenen nach Vereinzelung)

VRE Nachweis in 3 Eingangs- und 5 Ausgangsproben

E: Eingangsprobe/ Gärsubstrat A: Ausgangsprobe/ Gärrest

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Phylogenetische Identifizierung der VRE Isolate Enterococcus faecium

Enterococcus mundtii

Enterococcus pseudoavium/ Enterococcus viikkiensis Enterococcus cassilifalvus

Direkter kultivierungsunabhängiger Resistenzgennachweis ESBL Gene der CTX-M Gruppe

Mit ESBL E. coli „gespikte“ Proben (Spiking vor der DNA Extraktion)

Nicht „gespikt“

Mix

Output 107 cells

Marker

Input 107 cells

E. Coli SHV

Output 105 cells

Output mix

Input 105 cells

Input mix

Output 103 cells

Input NaCl

Input 103 cells

Output NaCl

Marker

Test der Nachweiseffizienz für ESBL Gene mittels „spiking“-Experiment

E. coli CTX-M

ResistenzgenNachweis über PCR 1, Multiplex-PCR (CTX-M, TEM, SHV) 2, QPCR (CTX-M-1 Gruppe) E. coli TEM

Direkte DNA Extraktion aus der Umweltprobe

Reinkulturen (Positivkontrolle)

DNA Extraktion aus 250 mg Probe 103 ESBL E. coli Zellen → Schwaches Signal 105 ESBL E. coli Zellen → Starkes Signal

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ESBL MRSA

Standard B1E B1A B2E B2A B3E B3A B4E B4A B5E B5A B6E B6A B7E B7A B8E B8A B9E B9A B10E B10A Referenz NTC Standard

Direktnachweis von Resistenzgenen aus Eingangs/Ausgangsproben (Kultivierungsunabhängig) für ESBL und MRSA und VRE Gene B: Biogasanlage 1-10 E: Eingang A: Ausgang Referenz: Positivekontrolle NTC: No-Template Kontrolle

mecA

+ + + + + +

+ + +

+ + + + + + + + + + +

nuc SHV CTX-M TEM 16S rRNA Gen (Amplifiktionskontrolle)

-> ESBL Gene waren in Eingangs- und Ausgangsproben detektierbar (in 2 von 10 Eingängen waren CTX-M Gene detektierbar, nicht in Gärresten) -> mecA Gene wurden in 4 von 10 Eingangs- und Ausgangsproben detektiert -> VRE: vanA, vanB, vanC1 konnten nicht detektiert werden

Ergebniszusammenfassung •

Biogasanlagen eliminieren ESBL und VRE nicht vollständig

•

Probenabhängig wurden ESBL-tragende E. coli und VRE in Eingangs- und Ausgangsproben von Biogasanlagen detektiert

•

ESBL Gene wurden in Eingangs- und Ausgangsproben auch Kultivierungsunabhängig detektiert.

•

VRE: klinisch relevante Enterococcus faecalis wurden nachgewiesen

•

MRSA konnten nicht nachgewiesen werden: mecA tragende Staphylokokken wurden kultivierungsabhängig nur in zwei Eingangsproben nachgewiesen; kultivierungsunabhängig wurden mecA Gene in Eingangs- und Ausgangsproben detektiert

Input sample

Output sample

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Projektpartner

IAM

IHU

Institut für  Hygiene und  Umweltmedizin

Institut für  Angewandte  Mikrobiologie

Prof. Dr. Peter Kämpfer

Stefanie Glaeser Thorsten Schauss Steffen Wohlgemuth Olivia Sovinsky Jana S. Brunner Alexandra Gütschow

Prof. Dr. Wolfgang Dott

Tina Wings

ILL

Institut für  Lebensmittelchemie  und ‐biotechnologie

Prof. Dr. Gerd Hamscher

Astrid Spielmeyer

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