Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000 - 2001

Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg 2002

Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000 - 2001

Deutsche Zentren für Gesundheitsforschung (DZGF)

Kurzfassung 2

Der “Wissenschaftliche Ergebnisbericht” des Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) wird alle zwei Jahre alternierend zum englischsprachige “Research Report“ herausgeben. Der Wissenschaftliche Ergebnisbericht hat die Aufgabe, die Berichtsverpflichtung des DKFZ als Großforschungseinrichtung gegenüber den Zuwendungsgebern (Bund sowie Land Baden-Württemberg) zu erfüllen. Zur Erschließung des Berichts im Rahmen der Berichtsverpflichtung werden die Nummern des Forschungsprogramms 2001/2002 des DKFZ (ein internes Planungspapier) in Klammern an die Titel angehängt. Das DKFZ hat diesen Bericht so konzipiert, daß neben dieser Aufgabe die Berichte über die Aktivitäten des DKFZ auch zur Information von Fachkollegen und wissenschaftlich Interessierten dienen. Der „Research Report“, der sich an die internationale wissenschaftliche Öffentlichkeit wendet, wurde 2001 für die Periode 1999 / 2000 erstellt. Beide Bücher werden nach den derzeit acht Forschungsschwerpunkten des DKFZ gegliedert. Die neue deutsche Rechtschreibung wurde von einer Reihe von Autoren angewandt. Eine Vereinheitlichung der Rechtschreibung wurde nicht vorgenommen, so daß beide Formen vorkommen.

Abstract The Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ, German Cancer Research Center) publishes alternating every year the “Wissenschaftlicher Ergebnisbericht” (in German) and the “Research Report” (in English). Both volumes are reports on the present state of research activities of the DKFZ as a National Research Center to the funding federal and state authorities [Federal Republic of Germany, Land (state) Baden-Württemberg]. Furthermore they shall inform colleagues and the scientifically interested public. Both reports are structured according to the center’s eight research programs. The last Research Report was published in 2001. In Germany a new orthography has been accepted. Some authors used the new form others the traditional one. The orthography was not standardized.

Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 © DKFZ 2002 Herausgeber: Deutsches Krebsforschungszentrum Postfach 101949, D-69009 Heidelberg Im Neuenheimer Feld 280, D-69120 Heidelberg Tel. (06221) 42-0; Fax (06221) 42 29 95 Internet: http://www.dkfz-heidelberg.de Redaktion: Dr. Horst Metzler, Zentralbibliothek (e-mail: [email protected]) Layout: Heidi Hnatek, DKFZ Satz: DKFZ (Adobe Page Maker)

Druck:

Printed in the Federal Republic of Germany

ISSN 0931-8364

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Vorwort ............................................................................................................................................. 5 Stellung und Auftrag ....................................................................................................................... 7 Erforschung der Krebsursachen ....................................................................................................... 7 Identifizierung von Krebsrisikofaktoren und Verbesserung der Krebsvorbeugung............................. 8 Diagnostik und Therapie - Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung ................................ 8 Forschungsschwerpunkte des DKFZ ............................................................................................... 9 Nationale und internationale Zusammenarbeit .................................................................................. 9 Interdisziplinarität mit oder ohne Fokussierung Gedanken zur Strukturreform der Großforschungseinrichtungen ................................... 14 Forschungsschwerpunkt Krebsentstehung und Differenzierung .......................................... 16 Abteilung Zellbiologie (A0100) .......................................................................................................... 18 Zytometrie (A0102) .......................................................................................................................... 25 Abteilung Molekularbiologie der Zelle I (A0200) ................................................................................ 26 Abteilung Molekularbiologie der Zelle II (A0300) ............................................................................... 30 Abteilung Entwicklungsgenetik (A0400) ........................................................................................... 34 Abteilung Molekulare Embryologie (A0500) ..................................................................................... 39 Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung (A0600) .............................................. 42 Arbeitsgruppe Epigenetik (A0700) ................................................................................................... 49 Zentrale Proteinanalytik (R0800) ..................................................................................................... 51 Forschungsschwerpunkt Tumorzellregulation ......................................................................... 53 Abteilung Pathochemie (B0100) ...................................................................................................... 56 Biochemische Zellphysiologie (B0200) ........................................................................................... 61 Abteilung Biochemie der Zelle (B0300) ........................................................................................... 66 Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (B0400) ........................................................................... 67 Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit (B0401) ..................................................................... 70 Abteilung Biochemie der Gewebsspezifischen Regulation (B0500) ............................................... 71 Abteilung Differenzierung und Carcinogenese (B0600) .................................................................. 76 Abteilung Tumorbiochemie (B0700) ................................................................................................ 82 Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) ..................................................... 87 AG Hormonwirkung und Signaltransduktion (B0810) ...................................................................... 93 Abteilung: Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) ........................................................................ 96 Zentrale Spektroskopie (R0400) ...................................................................................................... 99 Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ................................. 109 Abteilung: Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200) .................................................................112 Abteilung Molekulare Toxikologie (C0300) ..................................................................................... 133 Abteilung Klinische Epidemiologie (C0500) ................................................................................... 139 Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie (C0600) ............................................................................. 148 Abteilung Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese (C0700) ........................................ 153 Stabsstelle Krebsprävention (S0103) ............................................................................................ 155 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe (S0108) ................................................................ 157 Abteilung Mechanismen der Tumorigenese (S0109) ..................................................................... 160

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Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie ................................ 163 Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (D0100) ................................................................. 165 Arbeitseinheit Pharmakologie der Krebsbehandlung (D0200) ....................................................... 170 Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie (D0301) ............................................................... 174 Kooperation des DKFZ mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg (D0302) ............................................................................................................................ 176 Rekombinante Antikörper (D0500) ................................................................................................ 179 Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D0600) ............................................................. 181 Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (D0700) ............................... 190 Klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (D0800) ................................................... 191 Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie des DKFZ an der Klinik für Dermatologie des Klinikum Mannheim (D0900) ..................................................................................................... 195 Zentrales Tierlabor (ZTL, R0200)................................................................................................... 203 Forschungsschwerpunkt Radiologische Diagnostik und Therapie ...................................... 209 Abteilung Onkologische Diagnostik und Therapie (E0100) ............................................................211 Abteilung Biophysik und medizinische Strahlenphsik (E0200) ...................................................... 228 Abteilung Radiochemie und Radiopharmakologie (E0300) ........................................................... 236 Abteilung Medizinische Physik (E0400) ......................................................................................... 242 Klinische Kooperationseineit Strahlentherapeutische Onkologie (E0500) ..................................... 259 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E0600) ................................................................ 272 Forschungsschwerpunkt Angewandte Tumorvirologie ........................................................ 280 Abteilung Tumorvirologie (F0100) .................................................................................................. 282 Abteilung Genomveränderungen und Carcinogenese (F0200) ..................................................... 290 Abteilung Tumorvirusimmunologie (F0300) ................................................................................... 295 Pathogenitätsmechanismen (F0400) ............................................................................................ 304 Zelldifferenzierung (F0500) ............................................................................................................ 308 Abteilung: Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen (F0600) ................................................................. 310 Abteilung Tumorvirus-Charakterisierung (F0700) .......................................................................... 314 Abteilung Retrovirale Genexpression (F0800) ............................................................................... 316 Forschungsschwerpunkt Tumorimmunologie ........................................................................ 318 Abteilung Zelluläre Immunologie (G0100) ..................................................................................... 320 Abteilung Immunchemie (G0200) .................................................................................................. 327 Abteilung: Immungenetik (G0300) ................................................................................................. 332 Arbeitsgruppe Apoptose Regulation (G0310) ................................................................................ 338 Abteilung Molekulare Immunologie (G0400) .................................................................................. 341 Forschungsschwerpunkt Genomforschung und Bioinformatik ............................................ 351 Abteilung Medizinische und Biologische Informatik (H0100) ......................................................... 354 Molekulare Biophysik (H0200) ....................................................................................................... 360 Abteilung Klassische und Molekulare Zytogenetik (H0400) ........................................................... 365 Abteilung Biophysik der Makromoleküle (H0500) ........................................................................... 368 Molekulare Genomanalyse (H0600) .............................................................................................. 377 Arbeitsgruppe: Molekulargenetik des Mammakarzinoms (H0602) ................................................ 387 Abteilung Molekulare Genetik (H0700) ........................................................................................... 389 Abteilung für Funktionelle Genomanalyse (H0800) ........................................................................ 395 Abteilung Intelligente Bioinformatik Systeme (B0900) ................................................................... 400 Zentrale Einheit Biostatistik (ZEB) (R0700) ................................................................................... 408 Autoren-Index .............................................................................................................................. 415 Schlagwort-Index 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Vorwort

Vorwort Das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg legt hiermit seinen Wissenschaftlichen Ergebnisbericht für die Jahre 2000/2001 vor. Der Bericht informiert über die in dieser Zeit gewonnenen Ergebnisse und Fortschritte der Arbeiten im Rahmen des Forschungsprogrammes des DKFZ. Damit wollen die Wissenschaftler und Wissenschaftlerinnen auch gegenüber dem Kuratorium, den Zuwendungsgebern und den Parlamenten Rechenschaft über ihre Forschungsarbeit ablegen. Die zusammenfassenden Darstellungen wenden sich darüber hinaus an die wissenschaftlich interessierte Öffentlichkeit und dienen dem Überblick über die am DKFZ vertretenen Forschungsrichtungen für Studenten und Wissenschaftler, die eine Mitarbeit im DKFZ erwägen. Neben der durch die kurzen Artikel gegebenen Übersicht bieten die dazu zitierten Publikationen dem an Einzelheiten interessierten Leser die Möglichkeit zur Vertiefung der Information. Eine vollständige Liste aller Veröffentlichungen der Mitarbeiter des DKFZ wird jährlich in Buchform und im Internet vorgelegt. Wir hoffen, daß dieser Wissenschaftliche Ergebnisbericht dazu beiträgt, die von den Mitarbeitern und Kooperationspartnern des Deutschen Krebsforschungszentrums erarbeiteten Ergebnisse über den Kollegenkreis hinaus zu verbreiten. Heidelberg, im Juni 2002

Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Harald zur Hausen Vorsitzender des Stiftungsvorstands

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Organigramm Kuratorium Vorsitzender Parlamentar. Staatssekrär Wolf-Michael Catenhusen Bundesministerium für Bildung und Forschung Stellvertretender Vorsitzender MinDirig. Dr. phil. Heribert Knorr Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg Vorsitzender des Wissenschaftlichen Komitees Prof. Dr. Paul Kleihues

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Stabsstellen Presse- und Öffentlichkeitsarbeit Hilke Stamatiadis-Smidt, M.A.  42-2854 Krebsprävention Dr. med. Martina Pötschke-Langer  42-3007 Sicherheit Dipl.-Ing Edgar Heuss  42-2866 Innenrevision Dipl. Kfm. Dietmar Elspaß  42-2863

Zentrale Einrichtungen Zentrale Datenverarbeitung Dr. rer. pol. Kurt Böhm  42-2358 Zentrales Tierlabor Dr. med. vet. Uwe Zillmann  42-4260 Zentralbibliothek Dr. phil. nat. Horst Metzler  42-3666 Zentrale Spektroskopie Dr. (PhD) William E. Hull  42-4515 Strahlenschutz und Dosimetrie Dr. rer. nat. Karl Heinz Hoever  42-2556 Zentrale Einheit Biostatistik Dr. rer. nat Lutz Edler  42-2392

Stiftungsvorstand Vorsitzender und Wissenschaftliches Mitglied Prof. Dr. med. Dr. h. c. mult. Harald zur Hausen  42-2850 Administrativ-kaufmännisches Mitglied Dr. rer. pol. Josef Puchta  42-2860

Forschungsschwerpunkte Krebsentstehung und Differenzierung Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Werner W. Franke  42-3212 Tumorzellregulation Sprecher: Dr. rer. nat. Peter Angel  42-4570 Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch  42-3300 Diagnostik und Experimentelle Therapie Sprecherin: Prof. Dr. med. Margot Zöller  42-2454 Radiologische Diagnostik und Therapie Sprecher: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat Wolfhard Semmler  42-2563 Angewandte Tumorvirologie Sprecher: Prof. Dr. (PhD) Jean Rommelaere  42-4960

Wissenschaftlicher Rat Vorsitzender Priv.-Doz. Dr. med. Dr. rer. nat. Jürgen Debus  42-2867/42-2868

Verwaltung Leiter Dr. jur. Wolfgang Henkel  42-2750 Admin. Projektmanagement/Gremien Bettina Crispin  42-2700 Personal- und Sozialwesen Klaus Pregartner  42-2760 Finanz- und Rechnungswesen Winfried Schwarz  42-2776 Beschaffung/Materialwirtschaft Dr. jur. Rolf Zimmermann  42-2775 Technik Rudi Lange  42-2800

Tumorimmunologie Sprecher: Prof. Dr. med. Peter Krammer  42-3717 Technologie Transfer Büro Dr. rer. nat. Ruth Herzog  06221 42-2955 FAX 06221 42-2956 e-mail: [email protected]

Genomforschung und Bioinformatik Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Peter Lichter  42-4609

Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)

Postfach 101949, D-69009 Heidelberg Im Neuenheimer Feld 280, D-69120 Heidelberg  06221 42 - 0 (Zentrale); FAX 06221 422995 Internet: http://www.dkfz-heidelberg.de (Stand:Juni 2002)

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Einführung

Stellung und Auftrag

Erforschung der Krebsursachen

Das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ), Stiftung des öffentlichen Rechts des Landes Baden-Württemberg, wurde 1964 mit Sitz in Heidelberg gegründet. Als eine überregionale Forschungseinrichtung ist das DKFZ Mitglied der Hermann von Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF) und wird im Rahmen der institutionellen Förderung finanziell zu 90% vom Bund und zu 10 % vom Bundesland Baden-Württemberg getragen. Seit 1977 ist das DKFZ Mitglied der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Darüber hinaus wird ein wesentlicher Anteil der Projekte durch Mittel der Projektförderung finanziert.

Die Krebsforschung hat in den letzten Jahren stark von der Entdeckung der genetischen Grundlagen der Krebserkrankungen profitiert. Dennoch stellt die detaillierte Aufklärung der molekularen Ereignisse bei der Entstehung eines Tumors nach wie vor eine große Herausforderung in der Krebsforschung dar.

Das Ziel der Stiftung Krebs ist ein weltweites Problem von enormem Ausmaß. Auch wenn sich seit den 90er Jahren mit dem leichten Rückgang der Krebssterblichkeit eine mögliche Trendwende in Deutschland anzeigt, wird unter Berücksichtigung der steigenden Lebenserwartung voraussagbar jede dritte lebende Person an Krebs erkranken und jede vierte an Krebs sterben. Der klar definierte und programmorientierte Forschungsauftrag des Zentrums läßt sich daher wie folgt umreißen: 1. Erforschung der Krebsursachen 2. Identifizierung von Krebsrisikofaktoren 3. Verbesserung der Krebsvorbeugung 4. Verbesserung der Frühdiagnostik von Krebserkrankungen 5. Optimierung der Krebstherapie und Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung Die Organe der Stiftung sind: Das Kuratorium überwacht die Rechtmäßigkeit, Zweckmäßigkeit und Wirtschaftlichkeit der Führung der Stiftungsgeschäfte. Es besteht aus Vertretern des Bundes und des Landes Baden-Württemberg, der Universität Heidelberg, Mitarbeitern der Stiftung sowie dem Wissenschaftlichen Komitee, welches aus externen Fachwissenschaftlern zusammengesetzt ist. Das Wissenschaftliche Komitee bereitet die Entscheidungen des Kuratoriums in allen wissenschaftlichen Angelegenheiten vor und trägt die Verantwortung für die fortlaufenden Ergebnisbewertungen der Forschungsschwerpunkte und Abteilungen durch wissenschaftliche Begutachtungen. Der Stiftungsvorstand leitet die Stiftung und setzt sich aus einem wissenschaftlichen Mitglied (Vorsitz) und einem kaufmännisch-administrativen Mitglied zusammen. Der Wissenschaftliche Rat ist ein DKFZ-internes Gremium zur Beratung des Stiftungsvorstands und des Kuratoriums in allen bedeutsamen wissenschaftlichen Angelegenheiten.

Eingeleitet wird die Entartung zur Krebszelle durch eine Veränderung im Erbgut und den damit verbundenen Folgen im funktionellen Zellgeschehen. Entgeht die so veränderte Zelle einer Erkennung durch das Immunsystem, wird in der nächsten Zellteilung die mutierte Information an die Tochterzellen weitergegeben. In den folgenden Zellzyklen können sich schrittweise weitere Mutationen akkumulieren. Wenn schließlich einzelne veränderte Zellen den Primärtumor über angrenzende Blut- oder Lymphgefäße verlassen und sich an anderer Stelle im Körper ansiedeln, ist es zu der in der Klinik so gefürchteten Metastasierung gekommen. Eine vergleichende Analyse der genetischen Veränderungen von Tumoren gibt Hinweise darauf, daß unterschiedliche Krebserkrankungen auf verschiedenartigen Mustern von Genveränderungen beruhen. Hinter dem eingängigen Begriff ‚Krebs‘ versteckt sich somit die Tatsache, daß es sich um viele unterschiedliche Erkrankungen handelt, von denen jede über ihre eigenen Charakteristiken verfügt. Aus der Entschlüsselung der zentralen Ereignisse bei der Entstehung von Tumoren und bei der Metastasierung werden neue Ansatzpunkte sowohl für eine verbesserte Diagnostik wie auch für die gezielte Entwicklung neuer Therapien erwartet. In den letzten Jahren haben Untersuchungen der Differenzierung embryonaler Zellen zur Identifizierung von Entwicklungskontrollgenen geführt, die zum Verständnis von pathophysiologischen Ereignissen in der Zelldifferenzierung beigetragen haben. Auch in Zukunft verspricht die Entwicklungsgenetik weitere, wertvolle Anhaltspunkte für die Krebsforschung. Über die Identifizierung von neuen Krankheitsgenen hinaus bietet die Analyse des Expressionsprofils embryonaler Entwicklungsvorgänge auch Potential für medizinische Anwendungen, wie beispielsweise im Stammzellbereich. Da umgekehrt die Transformation einer Zelle zur Krebszelle als Auflösung der Alterungsvorgänge verstanden werden kann, wird gleichermaßen aus der Analyse der genetischen Steuerung von Alterungsprozessen mit aufschlußreichen Erkenntnissen für die Krebsforschung gerechnet. Gegenwärtig wird im Zentrum zudem den Mechanismen der Metastasierung sowie der Tumorangiogenese, der Induktion der Gefäßversorgung eines Tumors, großes Interesse entgegen gebracht. Die Aufklärung beider Prozesse profitiert stark von weitreichenden Kenntnissen über krebsrelevante Signaltransduktionsprozesse und vom zunehmenden Verständnis für die Regulation der Genexpression. Gemeinsam mit den grundlagenwissenschaftlichen Disziplinen wie der Zellbiologie, der Histologie und den Techniken der Molekularbiologie soll Einblick in die Mechanismen erlangt werden, mit deren Hilfe

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Einführung in Zukunft dem Tumor die notwendige Anbindung an die Gefäßversorgung des Körpers unterbunden werden soll.

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Aus dem Human-Genom-Projekt liegt umfangreiches Datenmaterial aus den DNA-Sequenzanalysen vor. Um eine sinnvolle Interpretation dieser Informationen im Kontext von Ereignissen wie Krankheit, Alterung oder Tumorgenese zu ermöglichen, sind den jeweiligen physiologischen Rahmenbedingungen angepaßte funktionelle Testsysteme erforderlich. Da auf zellulärer Ebene Proteine die eigentlichen Funktionsträger sind, muß bei der Analyse der veränderten Genexpression konsequenterweise die Frage nach qualitativen und quantitativen Unterschieden in der Proteinbiosynthese berücksichtigt werden. In jüngerer Zeit sind verschiedene Verfahren zur umfassenden Untersuchung von Proteinen im Kontext von physiologischen Fragestellungen unter dem Begriff Proteomics zusammengefaßt worden. Die Mutation in der DNA-Kodierung eines bestimmten Proteins wirkt sich in krebsrelevanten Ereignissen nicht nur auf die posttranslationale Modifizierung und Aktivität anderer Proteine aus, sondern beeinflußt auch deren relative Konzentration. Der Analyse von Protein-Expressionsmustern in der Krebsforschung wird daher im Hinblick auf die Analyse von Ereignissen bei Tumorgenese und Metastasierung große Bedeutung beigemessen. Die Erfahrungen im genomischen Informationsmanagement im Zentrum werden der Auswertung des zu erwartenden umfangreichen Datenmaterials aus den Proteomics zu Gute kommen. Die frühzeitig erfolgte, aktive Förderung der Genomforschung im Zentrum hat bereits ausgezeichnete Entwicklungen hervorgebracht, hier sind insbesondere die DNAChip-Technologie wie auch die Entwicklung zytogenetischer Techniken (Matrix-CGH) zu erwähnen. Gegenwärtig profitieren von dieser nicht nur die biomedizinische Grundlagenforschung, sondern auch epidemiologische Forschungsansätze. Virale Onkogene beeinflussen die Zellproliferation. Sie werden gleichzeitig durch intrazelluläre und extrazelluläre Kontrollmechanismen in ihrer Expression reguliert. Da bei Krebserkrankungen durch Viren in der Regel Mutationen in den zellulären Regulationsgenen vorliegen, wird daher im Zentrum auch der Entschlüsselung von genetischen bzw. epigenetischen Kontrollmechanismen nachgegangen. Ferner existiert im Zentrum ein Programm zur Identifizierung von neuen, noch nicht als tumorigen beschriebenen Viren und deren molekulargenetischer Charakterisierung.

Identifizierung von Krebsrisikofaktoren und Verbesserung der Krebsvorbeugung Als Ursache von Krebserkrankungen sind genetische Veränderungen im Erbgut wie Mutationen, Infektionen, Einwirkung Strahlen oder Chemikalien nachgewiesen worden. Die Krebsvorbeugung erfordert daher eine rationale Strategie zur Aufklärung von Krebsrisiko-faktoren

und wurde frühzeitig als eine besonders wichtige Aufgabe des Deutschen Krebsforschungszentrums definiert. Bei der Prävention von Krebserkrankungen gewinnen zwei Bereiche Bedeutung, dies sind zum einen vorbeugende Impfungen bei Virus-bedingten Krebserkrankungen sowie die sogenannte Chemoprävention. Die Entwicklung von präventiven Impfstoffen gegen humanpathogene Viren ist im DKFZ fest etabliert, mit den ersten klinischen Testergebnissen wird im Jahr 2003 gerechnet. In der sogenannten Chemoprävention steht die Identifizierung von pharmakologisch wirksamen Substanzen mit dem Ziel, eine potentiell mögliche Tumorgenese zu verhindern, im Vordergrund. Die zunehmende Anzahl neu isolierter Verbindungen aus verschiedenen Nahrungsmitteln gibt Hoffnung auf ihren künftigen Einsatz zum Schutz gegen Krebs. Ergänzung finden diese Untersuchungen in der breit angelegten Studie ‚Gesundheit, Ernährung und Krebs‘, die Teil der großen europäischen EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition)-Studie ist und die Zusammenhänge zwischen Ernährungsgewohnheiten und Krebs in verschiedenen Ländern Europas erforscht. Neben Ernährungsfaktoren wird in der Studie auch der Einfluß von Alkoholund Tabakkonsum sowie der Lebensstil erfaßt. Wissenschaftler des DFKZ sind aktiv an der Durchführung und Auswertung der Heidelberger Komponente dieser Studie beteiligt, die allein 25.000 Personen einschließt. In Untersuchungen zu umweltrelevanten Krebsursachen werden Wechselbeziehungen zwischen krebserzeugenden Stoffen und genetischen Faktoren berücksichtigt. Die Aufklärung der Bevölkerung über die Risiken des Tabakkonsums ist seit einigen Jahren aktiver Bestandteil des Forschungsprogramms im DKFZ und umfaßt Befragungen von Schülern zu Rauchverhalten, Passivrauchen und Gesundheitsproblemen, die Gründung eines wissenschaftlichen Netzwerks zur Tabak- und Krebsprävention und den Aufbau eines nationalen Rauchertelefons zur Raucherentwöhnung. Mit der Einrichtung des Krebsinformationsdienstes (KID) und eines KrebsSchmerztelefons werden über den Stiftungsauftrag hinausgehende, projektfinanzierte Aufgaben der nationalen Gesundheits-fürsorge wahrgenommen.

Diagnostik und Therapie - Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung Im Hinblick auf eine Optimierung der Krebstherapie und die erforderliche Entwicklung neuer effizienter Konzepte in der Krebsbehandlung wird die Interaktion zwischen den grundlagenwissenschaftlich orientierten Disziplinen im Zentrum und den behandelnden Ärzten in der Klinik als wichtige Schnittstelle angesehen, da nur so ein direkter Transfer wissenschaftlicher Erkenntnisse in die klinische Anwendung möglich ist. Im Zentrum wurde daher ein Konzept zur Etablierung von klinischen Kooperationseinheiten aufgelegt, deren weiterer Ausbau in den nächsten Jahren als eine wichtige Aufgabe gesehen wird. Neben einem Kooperationsprojekt mit der Chir-

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Einführung urgischen Klinik der Universität Heidelberg sind gegenwärtig fünf klinische Kooperationeinheiten im DKFZ etabliert. Aus der Zusammenarbeit des Zentrums mit der GSI in Darmstadt und dem Forschungszentrum Rossendorf ist ein strahlentherapeutischer Ansatz hervorgegangen: Inzwischen können Schwerionenstrahlen zur Behandlung sonst nur mit unbefriedigenden Ergebnissen zu therapierender Tumoren eingesetzt werden. Dieses innovative Verfahren gestattet es, auch tiefliegende Tumore, wie Glioblastome, ohne Beschädigung des umliegenden Nervengewebes zu bestrahlen. Bislang hat die eingeschränkte Kapazität der Pilotanlage nur eine Behandlung von 30 Patienten pro Jahr erlaubt, der Aufbau einer entsprechenden Anlage durch die Universitätsklinik Heidelberg ist in Vorbereitung. Weiterhin wird im Rahmen neuartiger Entwicklungen in der Medizintechnik die Visualisierung von CT-, MR- und Ultraschall-Darstellungen, die gleichzeitig eine interventionelle Steuerung zulassen, verfolgt. Von der Gen- und Immuntherapie, d.h. der Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten mittels Gentransfer, wurde lange Zeit erwartet, daß sie Möglichkeiten zu einer gezielten und lokalisierten Behandlung eröffnet. In der jüngeren Vergangenheit sind im Hinblick auf eine verbesserte Genvektortechnologie einige Fortschritte erzielt worden, die damit verbundenen Erwartungen lassen die Gen- und Immuntherapie wieder in eine größere Anwendungsnähe rücken. Im Zentrum werden dazu in erster Linie die Helfer-unabhängigen Parvoviren sowie Adeno-assoziierte Viren, Herpes-Viren, HI- und Spumaviren verwendet. Die Entwicklung therapeutischer Strategien wird voraussichtlich in den nächsten Jahren von aktuellen Erkenntnissen zum programmierten Zelltod, der Apoptose, profitieren können. Auf diesem Gebiet ist der Transfer herausragender Ergebnisse aus der Grundlagenforschung in anwendungsorientierte Fragestellungen gelungen: Er führte nicht nur zu einem Einblick in die Pathogenese von AIDS und Sepsis, sondern auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Schlaganfällen, die gegenwärtig auf ihre generelle Anwendbarkeit überprüft werden. Mit der Entdeckung der TRAIL-induzierten Apoptose (TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie) haben sich auch für die Krebstherapie wertvolle Möglichkeiten für vielversprechende therapeutische Ansätze ergeben: TRAIL induziert den Zelltod in Tumorzellen, wohingegen eine Wirkung auf normale Körperzellen, mit Ausnahme der Leber, nicht nachweisbar ist; ein Ansatz, der in Zukunft für die Entwicklung rationaler Therapien ausgeschöpft werden soll. Die Kenntnis der Ursachen ist eine grundlegende Voraussetzung für die Frühdiagnostik ebenso wie für die Entwicklung neuer Konzepte und Strategien in der Krebstherapie. Sie ist neben der Erfassung der Krebsrisikofaktoren auch entscheidend für Entwicklungen auf dem Gebiet der Krebsvorbeugung.

Da Probleme der Krebsforschung im Zusammenwirken vieler für die Krebsforschung relevanter Fachrichtungen besser bearbeitet werden können, wird das gemeinsame Forschungsziel mit dem jeweiligen Instrumentarium der einzelnen wissenschaftlichen Disziplinen angegangen. Vor diesem Hintergrund hat sich das Forschungsprogramm des DKFZ entwickelt und wird konsequent fortgeführt. Die Forschungsaufgaben werden von 50 Abteilungen und zeitlich befristeten Abteilungen sowie von Projektund Arbeitsgruppen im Rahmen definierter Forschungsschwerpunkte wahrgenommen. Die Mehrzahl der Abteilungsleiter wurde dabei gemeinsam mit der Universität Heidelberg berufen. Unterstützt werden die Projekte und die Arbeit der Abteilungen durch die Zentralen Einrichtungen und Dienste wie Tierlabor, Zentralbibliothek, Strahlenschutz und Dosimetrie, Histodiagnostik, Cytometrie, Tumorbank, Spektroskopie, Proteinanalytik, Biostatistik, Zentrale Datenverarbeitung und verschiedene Informationssysteme sowie durch die Abteilungen der Verwaltung. Für die kommenden Jahre werden durch den multidisziplinären Einsatz des Forschungspotentials, konzentriert auf die Forschungsschwerpunkte, vielversprechende Möglichkeiten gesehen, in der Analyse der Tumorentstehung und -entwicklung sowie in Krebsdiagnostik und -therapie wesentliche Fortschritte zu erreichen. Gegenwärtig werden die vielfältigen Aufgaben in der Krebsforschung und Prävention im Rahmen von derzeit acht Forschungsschwerpunkte wahrgenommen.

Forschungsschwerpunkte des DKFZ (A) Krebsentstehung und Differenzierung (B) Tumorzellregulation (C) Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention (D) Diagnostik und Experimentelle Therapie (E) Radiologische Diagnostik und Therapie (F) Angewandte Tumorvirologie (G) Tumorimmunologie (H) Genomforschung und Bioinformatik In der Haushaltsplanung sind für die Forschungsarbeiten 2002 ein Personaleinsatz von 1440 Personenjahren (PJ) und ein Finanzmitteleinsatz von 129,6 Mio Euro vorgesehen.

Nationale und internationale Zusammenarbeit Der nationalen und internationalen Zusammenarbeit widmet das Zentrum besondere Aufmerksamkeit. So weist das Forschungsprogramm 2001/2002 über 900 Kooperationen mit Wissenschaftlern in 45 Ländern aus. Daraus resultiert auch der hohe Anteil (etwa 60%) von gemeinsamen Veröffentlichungen aus dem DKFZ mit anderen Forschungsinstituten.

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Erwähnt seien hier national die Kooperationen innerhalb der DFG-Sonderforschungsbereiche 352 ‘Molekulare Mechanismen intrazellulärer Transportprozesse’, 405 ‘Immuntoleranz und ihre Störungen’, 601 ‘Molekulare Genese hepato-gastroenterologischer Erkrankungen’, 414 ‘Informationstechnik in der Medizin - Rechner- und sensorgestützte Chirurgie’, sowie im Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim und mit weiteren Instituten und Forschungsstätten im Heidelberger Raum. Einzelkontakte bestehen zu über 60 Universitäten und außeruniversitären Forschungsinstituten in der Bundesrepublik Deutschland. Der Klinisch-Biomedizinische Forschungsverbund (KBF), dessen Gründung vom DKFZ initiiert wurde, zählt inzwischen insgesamt 17 Mitgliedseinrichtungen, darunter 10 HGF-Zentren und 7 assoziierte Einrichtungen. Der Verbund hat sich zum Ziel gesetzt, durch die Qualitätsoptimierung entsprechender Forschungsansätze sowie die gezielte Förderung von Gemeinschaftsprojekten mit dem klinischen Umfeld einen Beitrag zur Verbesserung der klinisch-orientierten biomedizinischen Forschung zu leisten. Die Qualitätsoptimierung soll im wesentlichen durch eine entsprechende Berufungspolitik und die Leistungsbewertung der eigenen Forschung erzielt werden. Als HGF-Zentrum ist das DKFZ Mitglied im Forschungsverbund Gesundheit - der auch dem KBF als Dachverband dient - und sich in drei Forschungsbereiche gliedert: die biomedizinische Forschung, die Medizintechnik und den Bereich „Public Health“. Der Forschungsverbund Gesundheit wird sich auf HGF-Ebene medizinischen Fragestellungen widmen, die wissenschaftliche Netzwerke und interdisziplinäre Ansätze zu ihrer Bearbeitung erfordern. Im Rahmen der ersten Runde des HGF-Strategiefonds warben Wissenschaftler des Zentrums in zwei kooperativen biomedizinischen Anträgen eine Fördersumme von 5,37 Mio DM für den Zeitraum Juli 1998 - Juni 2001 ein. In der zweiten - den Zeitraum Juli 1999 - Juni 2002 umfassenden - Runde des Strategiefonds, flossen Mittel für insgesamt 10,95 Mio DM an das Zentrum zurück. In der dritten Antragsrunde sind Wissenschaftler des DKFZ an insgesamt 6 Anträgen aus den Gebieten Biomedizin, Bioinformatik und Epidemiologie beteiligt. Das DKFZ war am Aufbau der 1980 gegründeten Sektion und heutigen Arbeitsgemeinschaft Experimentelle Krebsforschung (AEK) der Deutschen Krebsgesellschaft deutlich beteiligt und veranstaltet alternierend zum Deutschen Krebskongreß alle zwei Jahre AEK-Symposien in Heidelberg, die ein Diskussionsforum der verschiedenen Sektoren der experimentellen und klinischen Krebsforschung darstellen. Die internationale Zusammenarbeit entwickelt sich ebenfalls in erfreulicher Weise weiter und wurde besonders durch aktive Zusammenarbeit im Rahmen der „Organisation of European Cancer Institutes (OECI)“ verstärkt. Diese Organisation, die zur Zeit etwa 70 europäische Krebszentren umfaßt, hat insbesondere auf dem Gebiet der Datenverarbeitung und -übertragung eine

enge Kooperation begonnen und gleichzeitig den Ausbau von Krebsinformationsdiensten, vor allem auch im osteuropäischen Raum vorgesehen. Darüber hinaus ist das DKFZ Mitglied der UICC (International Union against Cancer). Nach gemeinsamem Beschluß der UICC wird die Herausgabe des „International Journal of Cancer“, einer internationalen Fachzeitschrift auf dem Gebiet der Krebsforschung, ab dem Jahre 2000 an das DKFZ übertragen. Wissenschaftler des DKFZ arbeiten in der EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer), der EACR (European Association for Cancer Research) und in der WHO (World Health Organization) mit. Mit der IARC (International Agency for Research on Cancer) der WHO in Lyon, Frankreich, arbeitet das DKFZ eng zusammen. Die Projekte der Forschungskooperation mit dem MOS (Ministry of Science) Israels wurden von Gutachtern hervorragend beurteilt und werden fortgesetzt bzw. erweitert werden. Weiter bestehen besondere institutionalisierte Kooperationen mit dem NCI (National Cancer Institute) der USA. Durch Aufnahme einer Forschergruppe, die gleichzeitig zum INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) gehört, sollen die traditionell guten Kontakte zu französischen Forschern in Universitäten und CNRS (Centre Nationale de la Recherche Scientifique) weiter vertieft werden. Mit verschiedenen Einrichtungen der Volksrepublik China und dem Chulabhorn Research Institute, Thailand, bestehen Kooperationsverträge. Im Rahmen der deutsch-japanischen Forschungskooperation wird die wissenschaftliche Zusammenarbeit durch den Austausch von Wissenschaftlern weiter intensiviert und durch die Organisation Deutsch-Japanischer Workshops (beispielsweise 1996 in Heidelberg, 1998 in Kumamotu, Japan) unterstützt. Gemeinsame Forschungsarbeiten von Wissenschaftlern aus Indien und dem DKFZ werden fortgesetzt. In Rahmen eines von der Europäischen Union geförderten Kooperationsprojektes zwischen dem DKFZ und der Semmelweis Universität in Budapest werden Kurse und Austauschprogramme zur Harmonisierung der Ausbildung medizinischer Doktoranden in Ungarn durchgeführt. Die internationalen Kooperationen werden erheblich durch Gastaufenthalte von Wissenschaftlern aus aller Welt (2000 122 Gäste aus 38 Ländern, 2001 127 Gäste aus 38 Ländern) gefördert. Aufgrund der begrenzten Finanzierungsmöglichkeiten mußte die Anzahl der DKFZfinanzierten Gastwissenschaftleraufenthalte trotz stetig steigender Nachfrage leicht abgesenkt werden. Das DKFZ bemüht sich, trotz dieser Problematik insbesondere den Staaten Osteuropas und Asiens durch Gastwissenschaftler-Finanzierungen Hilfestellung zu leisten. Die Förderung gemeinsamer wissenschaftlicher Projekte im Rahmen der Europäischen Union hat darüber hinaus zu zahlreichen Kooperationen mit Forschern anderer Länder der Gemeinschaft geführt, die hier nicht im Detail aufgeführt werden.

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Einführung

Prüfung und Bewertung des Forschungsprogramms Das Forschungsprogramm des DKFZ unterliegt einer permanenten Überprüfung: Die internen Begutachtungen finden auf der Basis von Präsentationen sämtlicher Abteilungen eines Forschungsschwerpunktes (etwa alle zwei Jahre für jede Abteilung) statt. Diese Präsentationen sowie die vorbereiteten schriftlichen Unterlagen führen zu einer vergleichenden Bewertung der Qualität der wissenschaftlichen Arbeit der Abteilungen, welche unter Berücksichtigung des Erfolgs bei der Drittmitteleinwerbung Einfluß auf die Höhe der leistungsabhängigen Mittelzuweisung an die Abteilungen hat. Nach den internen Begehungen wird auch beraten, welche der laufenden Forschungsaktivitäten in dem Ausmaß der Förderung oder in der Laufzeit begrenzt werden sollen. Bei den externen Begutachtungen der Forschungsschwerpunkte (alle 5 Jahre) werden unter der Federführung des Wissenschaftlichen Komitees des Kuratoriums des DKFZ unabhängige, wissenschaftlich besonders ausgezeichnete und überwiegend ausländische Gutachtergruppen benannt. Während der 2-tägigen Begutachtung machen sich die Gutachter durch eine Vielzahl von Gesprächen mit Mitgliedern der jeweiligen Abteilungen und durch die Präsentationen des Forschungsschwerpunktes ein Bild über die wissenschaftliche Qualität der betreffenden Abteilungen. Die Eindrücke dieser Gespräche sowie die vorbereiteten schriftlichen Unterlagen dienen dann als Basis für die Erstellung des schriftlichen Gutachtens. Um für die im biomedizinischen Bereich arbeitenden Forschungseinrichtungen, die im Verbund ‘Klinisch-Biomedizinische Forschung’ (KBF) zusammengeschlossen sind, einheitliche Bewertungsmaßstäbe anzulegen, sind an den externen Begutachtungen der Forschungsschwerpunkte des DKFZ jeweils 1-2 Vertreter des Verbundes als Beobachter anwesend. Im Gegenzug entsendet das DKFZ ebenfalls Gutachter zu Begutachtungen von Instituten/ Forschungsschwerpunkten der anderen Mitglieder des Verbundes.

Struktur und Stellung des Wissenschaftlichen Ergebnisberichts Die Arbeiten der Wissenschaftler des DKFZ werden in wissenschaftlichen Zeitschriften, Sammelbänden, Monographien und durch Beiträge zu Kongressen sowie Vorträge veröffentlicht. Die Literaturliste wird jährlich in den „Veröffentlichungen des DKFZ“ als Buch und im Internet (http://www.dkz-heidelberg.de/zbi/pub/pv2000.pdf) publiziert. Das DKFZ erstellt jährlich einen zusammenfassenden wissenschaftlichen Bericht für die zurückliegenden zwei Jahre: Alternierend den „Wissenschaftlichen Ergebnisbericht“ und den englischen „Research Report“. Der Wissenschaftliche Ergebnisbericht hat primär die Aufgabe, eine Berichtsverpflichtung des DKFZ als Großfor-

schungseinrichtung gegenüber den Zuwendungsgebern (Bund sowie Land Baden-Württemberg) zu erfüllen. Das DKFZ hat diesen Bericht aber von Anfang an so konzipiert, daß neben diesen Adressaten die Berichte über die Aktivitäten des DKFZ auch zur Information von Fachkollegen und wissenschaftlich Interessierten dienen. Seit 1986 wird ein englischer Bericht, der „Research Report“, erstellt, der sich an die internationale wissenschaftliche Öffentlichkeit wendet. Die letzte Ausgabe des Research Reports erschien 2001 für die Jahre 1999/2000. Beide Bücher werden nach den derzeit acht Forschungsschwerpunkten des DKFZ gegliedert. Zur Erschließung des Berichts im Rahmen der Berichtsverpflichtung werden die Nummern des Forschungsprogramms 2001/ 2002 des DKFZ (ein internes Planungspapier) in Klammern an die Titel angehängt (beginnend mit einem Buchstaben für die Zugehörigkeit zu einem Forschungsschwerpunkt [A-H], den Zentralen wissenschaftlichen Einrichtungen [R]) oder dem Vorstandsbereich [S]). Für die interessierte Öffentlichkeit sind eine im Buchhandel erhältliche Sammelbände mit Darstellungen einzelner Aspekte der Forschung und der Arbeit des DKFZ unter dem Titel „Krebsforschung heute“ (englische Fassung „Current Cancer Research“) (beide Steinkopff Verlag Darmstadt) sowie die viermal jährlich erscheinende Zeitschrift „einblick“ bestimmt.

Chancengleichheit im DKFZ Ende der 90er Jahre einigten sich Bund und Länder darauf, daß auch die außeruniversitären Einrichtungen Frauenbeauftragte bestellen konnten, die die Bezeichnung „Beauftragte für Chancengleichheit“ erhielten. Mit Hilfe der Beauftragten soll es Frauen in der HGF durch geeignete Maßnahmen ermöglicht werden, Wege in Führungspositionen zu finden. Bei den Stellenbesetzungsverfahren sollen die Beauftragten die Transparenz der Auswahlverfahren erhöhen - angesichts des in den kommenden Jahre anstehenden Generationswechsels und daraus ergebenden Neubesetzungen von Professuren eine große Chance. Für die Beauftragten allein sind die damit verbundenen Aufgaben natürlich nicht zu leisten; mit Unterstützung war jedoch einiges zu erreichen. 1999 wurde die erste Vorstandsbeauftragte für Chancengleichheit im DKFZ, Dr. Barbara Bertram, von den Frauen des Zentrums gewählt und vom Vorstand für 2 Jahre bestellt, 2001 für weitere 2 Jahre verlängert. Sie verfolgt mit 50% ihrer Arbeitszeit ihre frauenpolitischen, mit den übrigen 50% weiterhin ihre wissenschaftlichen Ziele. 2001 wurde Dr. Bertram zur Vorsitzenden des „Arbeitskreis Frauen in Forschungszentren“ der HGF gewählt. Bevor die Beauftragte für Chancengleichheit ihre Arbeit aufnahm, hatte die 1989 gegründete „Fraueninitiative“ die Arbeit auf dem Gebiet der Chancengleichheit geleistet. Die Fraueninitiative löste sich auf und im März 2001 wurde der „Arbeitskreis Chancengleichheit“ gegründet. Auch zu diesem Gremium hält die Beauftragte engen Kontakt.

Maßnahmen zur Förderung der Chancengleichheit

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Einführung

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Personalentwicklungsplan Die Fraueninitiative des DKFZ und die Beauftragte für Chancengleichheit haben den Entwurf eines Personalentwicklungsplans erarbeitet. Er stellte inhaltlich den Vorläufer des „Plan zur Förderung der Chancengleichheit“ dar, der im Mai 2001 in Kraft trat. Der Plan bezieht sich auf Männer und Frauen aus dem wissenschaftlichen und dem nichtwissenschaftlichen Personal und regelt u.a. die Auswahl von Bewerberinnen und Bewerbern, den Wiedereinstieg, die Fort- und Weiterbildung, die Arbeitszeit, die Teilzeit, die Beurlaubung sowie die Rechte und Pflichten der Beauftragten für Chancengleichheit. Zur Zeit ist ein Plan zu Wiedereinstiegsmaßnahmen in Arbeit. Die vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) zur Verfügung gestellten „Stellenermächtigungen“ sind an hervorragende Wissenschaftlerinnen des Hauses vergeben worden. Insgesamt 18 Stellen konnten so besetzt werden. Kinderbetreuung Das BMBF hat das DKFZ ermächtigt, Maßnahmen zur Kinderbetreuung (mit) zu finanzieren. Diese Unterstützung erhält der Verein „Die Wichtel“ für das Betreiben einer vom DKFZ mitgenutzten Kindertagesstätte in Heidelberg. Netzwerke / Vorbilder Das Mentoring Programm „MuT“ (Mentoring und Training) des Landes Baden-Württemberg wurde im DKFZ etabliert. In Kooperation mit der Pädagogischen Hochschule Heidelberg haben die Beauftragte für Chancengleichheit und die Abteilung für Presse- und Öffentlichkeitsarbeit „Science goes public“ konzipiert, eine Veranstaltungsreihe, die als Satellitenveranstaltung im Jahr der Lebenswissenschaften anerkannt wurde und in zwei Jahren 6 8 Veranstaltungen anbieten wird. Bislang haben drei Veranstaltungen stattgefunden:1. „Dem Tumor den Saft abdrehen - Modelle zur Antiangiogenese“ mit Dr. Maren Hansen, 2. „Krebsprävention mit Messer und Gabel“ mit Dr. Clarissa Gerhäuser und 3. „Das Unsichtbare sichtbar machen. Proteine - Bausteine des Lebens“ mit Dr. Martina Schnölzer. Information / Transparenz Eine mailing-list mit aktuellen Infos und Tipps für Habilitandinnen und post-docs im DKFZ wurde eingerichtet. Daraus ist das Netzwerk für Habilitandinnen hervorgegangen.

Stabsstelle Technologietransfer Die Infrastruktur der Stabstelle Technologietransfer am Zentrum stellt den Schutz von geistigem Eigentum am Zentrum sicher und trägt dazu bei, Fortschritte aus der Krebsforschung zur klinischen Anwendung zum Wohl der Krebspatienten voran zu bringen. Die aktive Verwertung von Ergebnissen der Grundlagenforschung hilft die Lükke zwischen wissenschaftlicher Forschung und kommerzieller Entwicklung zu überbrücken.

Kontakte bestehen zwischen Forschung am Zentrum und der Industrie durch wissenschaftliche Kooperationen, Workshops und vielfältigen Netzwerkaktivitäten wie z.B. in der BioRegion Rhein-Neckar-Dreieck. National und weltweit werden Kooperations- und Lizenzvereinbarungen mit kleinen, mittleren und großen Unternehmen getroffen. Auch Prototypen werden mit Industriepartnern zur Evaluierung und Testung ausgetauscht. Das Zentrum unterstützt Wissenschaftler darüber hinaus bei der Gründung von spin-off-Unternehmen. Die Stabsstelle Technologietransfer sensibilisiert die Wissenschaftler für die kommerzielle Verwertbarkeit ihrer Ergebnisse und motiviert sie, ihre Erfindungen parallel zu einer Publikation zum Patent anzumelden. Bei einer Patentanmeldung werden die Forscher von der Stabsstelle beraten und unterstützt und die Kommerzialisierung von Ideen bereits zu einem frühen Stadium mit den Wissenschaftlern abgestimmt und vorbereitet. Erfindungen des Deutschen Krebsforschungszentrums werden an den bestmöglichen Industriepartner lizenziert, der von der Stabsstelle Technologietransfer hinsichtlich einer möglichst raschen Entwicklung von Produkten identifiziert wurde. Von den lizenzierten Patenten des Zentrums, die schließlich als Produkte auf dem Markt verkauft werden, wie beispielsweise ein neues Medikament gegen Krebs, profitieren die Erfinder und das Zentrum und letztlich insbesondere die Krebspatienten. In Jahr 2001 reichte das Deutsche Krebsforschungszentrum 45 neue Anmeldungen zum Patent ein. Derzeit verfügt das DKFZ über einen Gesamtbestand von 1328 angemeldeten (darunter 510 erteilten) Schutzrechten weltweit. Die Stabsstelle Technologietransfer unterhält Internetseiten mit einem aktualisierten Patentportfolio. Die Seiten sind abrufbar unter der Homepage des DKFZ (http://www.dkfz.de/techtrans/htm).

Tierschutz und Tierversuche Trotz zunehmender Entwicklung von Ersatzmethoden haben Tierexperimente im DKFZ ihren Stellenwert; dies spiegelt sich in Hinweisen auf die Verwendung von Versuchstieren oder tierischen Geweben und Zellen in nahezu jeder dritten Publikation des Zentrums wieder. Der Tierbestand im DKFZ beträgt durchschnittlich ca. 27.000 Tiere pro Jahr (2001), wobei ein stetiger leichter Anstieg - bedingt durch die zunehmende Generierung transgener Mausmodelle - (1997: 20.000 T., 1998: 23.000 T., 1999: 24.000 T.) zu verzeichnen ist. Die Zahl der genehmigten und angezeigten Versuchsvorhaben in den Jahren 1990 bis 2001 schwankte zwischen 160 und 198 Vorhaben (davon bis zu 65 % genehmigungs- und bis zu 53 % anzeigepflichtige Versuchsvorhaben). Der Hauptanteil der Versuchstiere (ca. 97 % Mäuse, ca. 2 % Ratten) wird zur Erforschung oder Erprobung von Methoden zur Diagnostik, Prophylaxe oder Therapie, in der Grundlagenforschung, zur Entnahme von Geweben und Organen und zur Aus-, Fort- und Weiterbildung eingesetzt.

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Einführung Die Tierschutzbeauftragten (TSB) des DKFZ werden vom Stiftungsvorstand bestellt und sind nebenamtlich tätig, sie vertreten die Berufsgruppen der Veterinärmedizin, Humanmedizin und Biologie. Sie sind nach dem Tierschutzgesetz von 1986 verpflichtet, auf die Einhaltung von Vorschriften, Bedingungen und Auflagen im Interesse des Tierschutzes zu achten und die Einrichtung und die mit den Tierversuchen und mit der Haltung der Versuchstiere befassten Personen zu beraten. Des weiteren müssen sie zu jedem Antrag auf Genehmigung eines Tierversuches Stellung nehmen und innerbetrieblich auf die Entwicklung und Einführung von Verfahren und Mitteln zur Vermeidung oder Beschränkung von Tierversuchen hinwirken. Jeder Antrag (Genehmigung oder Anzeige von Versuchsvorhaben) wird in der Internen Tierschutzkommission (ITSK) zur Beurteilung seiner wissenschaftlichen und statistischen Relevanz vorgelegt. Die ITSK wurde 1986 vom Stiftungsvorstand des DKFZ einberufen und setzt sich aus Wissenschaftlern verschiedener Fachrichtungen zusammen. Die Stellungnahme und das Votum der ITSK werden dem TSB mitgeteilt, der dann in seiner Stellungnahme zum Antrag darauf Bezug nimmt. Darüberhinaus sind die TSB des DKFZ Mitglieder der ‚Arbeitsgemeinschaft der Tierschutzbeauftragten BadenWürttembergs’ (ATBW). Diese Arbeitsgruppe erarbeitet und veröffentlicht gemeinsam mit Behördenvertretern Richtlinien und Empfehlungen, wie: Empfohlene maximale Injektionsvolumina, Kriterien zur vorzeitigen Tötung tumortragender Ratten und Mäuse, Blutentnahme und Immunisierung von Versuchstieren, Herstellung transgener Mäuse und Ratten, ect.. Zu dem ist ein Großteil der TSB aktiv am ‚Einführungskurs in das tierexperimentelle Arbeiten’ beteiligt, in dem Doktoranden, Diplomanden und weitere interessierte Mitarbeiter auf das fachkundige und damit tierschutzgerechte tierexperimentelle Arbeiten vorbereitet werden.

Biologische Sicherheit am DKFZ Fragen der Biologischen Sicherheit werden durch eine Vielzahl von Gesetzen, Verordnungen und Vorschriften geregelt. Für die am DKFZ weitverbreiteten molekularbiologischen Arbeiten spielen neben dem Infektionsschutzgesetz, dem Tierseuchenerregergesetz und der Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen (Biostoffverordnung) das Gentechnikgesetz (GenTG), und die Gentechniksicherheitsverordnung eine besondere Rolle. Gentechnische Arbeiten und solche mit biologischen Agenzien werden an Hand des Risikopotentials in vier Sicherheitsstufen eingeteilt. Am DKFZ werden nur Arbeiten der Stufen S1, S2 und S3 durchgeführt: - Sicherheitsstufe S1(ohne Risiko für Mensch und Umwelt) gilt z. Z. für über 40 Labors des DKFZ. - Sicherheitsstufe S2 umfaßt Arbeiten mit geringem Risiko für die menschliche Gesundheit oder die Umwelt

in 24 besonders gekennzeichneten Labors des DKFZ, in denen ca. 100 S2-Projekte angemeldet sind. - Sicherheitsstufe S3 beinhaltet Arbeiten mit krankheitserregenden Organismen, bei denen von einem mäßigen Risiko für Mensch und Umwelt auszugehen ist. Dem DKFZ stehen vier S3 Laboratorien für Untersuchungen z.B. an HI-Viren und für Hepatitis-Viren zur Verfügung. Zur Beratung der Projektleiter im Sinne des GenTG und des Stiftungsvorstands hat dieser einen Ausschuß für Biologische Sicherheit (ABS) bestellt. Dieser unmfaßt derzeit 14 Wissenschaftler, die selbst im Labor arbeiten und die Funktion von Beauftragten für Biologische Sicherheit (BBS) nebenamtlich wahrnehmen. Die fachnahen BBS betreuen die gentechnische Projekte und Projektleiter, beraten die Antragsteller und empfehlen Sicherheitsmaßnahmen. Der ABS verfaßt Muster-Betriebsanleitungen für die gentechnischen Anlagen und setzt seine fachliche Kompetenz zur Aufstellung hausinterner Sicherheitsregelungen ein. Voraussetzung für eine erfolgreiche Arbeit ist dabei die Unterstützung aus dem Bereich des Stiftungsvorstands und die enge Zusammenarbeit aller für die Arbeitssicherheit verantwortlichen Gremien am DKFZ. Die gentechnischen Bereiche des Hauses werden regelmäßig durch das Regierungspräsidium Tübingen als zuständiger Aufsichtsbehörde begangen. Bei diesen Begehungen, die über die Kontrolle hinaus auch der fachlichen Diskussion zwischen den verschiedenen Verantwortungsebenen dienen, fungieren die BBS als Anlaufstelle für Behörde und Projektleiter. Ein enges Zusammenwirken mit der Stabsstelle Sicherheit ermöglicht die fruchtbare Zusammenarbeit mit dem Regierungspräsidium. Seit Inkrafttretens des Gentechnikgesetzes (1990) ist nach anfänglichen Schwierigkeiten die Lösung vieler organisatorischer und bürokratischer Probleme zur Routine geworden. Die Risikobewertung wurde durch die ständig erweiterten Empfehlungen der Zentralen Kommission für die Biologische Sicherheit und die von ihr erstellten Listen bereits bewerteter Organismen und Arbeiten vereinfacht. Die bisherigen Novellierungen der gentechnikrechtlichen Bestimmungen haben für den Bereich der Grundlagenforschung nicht zu den von vielen Wissenschaftlern erhofften Erleichterungen der Arbeitsbedingungen geführt. Als problematisch empfindet der ABS die geltenden Vorschriften für gentechnische Arbeiten der Sicherheitsstufe S1, also für Arbeiten, bei denen von keinem Risiko für Mensch und Umwelt auszugehen ist . Der ABS befürwortet daher eine kritische Überprüfung aller S1-Arbeiten mit dem Ziel, diese weitgehend aus dem Regulierungsbereich des Gentechnikgesetzes herauszunehmen, da ausreichende Sicherheitsbestimmungen außerhalb des GenTG vorhanden sind. Dies könnte zur Konzentration auf die eigentlich risikobehafteten Arbeiten führen und letztlich die biologische Sicherheit erhöhen. In diesem Sinne versucht der ABS auf nationaler und europäischer Ebene auf die Gesetzgebung Einfluß zu nehmen.

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Interdisziplinäre Forschung

Interdisziplinarität mit oder ohne Fokussierung Gedanken zur Strukturreform der Großforschungseinrichtungen 14

Harald zur Hausen In einer Vielzahl von Kommentaren zur Hochschulreform, aber auch zur Neustrukturierung der Einrichtungen der Helmholtz-Gemeinschaft (HGF, frühere AGF) wird mit besonderer Betonung Wert auf interdisziplinäre Forschung gelegt. Gab es sie bisher nicht? Ist sie verbesserungswürdig? Wird diesem Begriff überall die gleiche Bedeutung zugrunde gelegt? Die Verbindung unterschiedlicher Fachbereiche, das Ineinanderfließen neuer Denkansätze zur Lösung oft langanstehender Fragen, das Aufkeimen eines neuen Verständnisses für schwer durchdringbare Problemkreise durch sachfremde, aber eben darum unvoreingenommene Einwürfe nicht unmittelbar Beteiligter hat so häufig zum wissenschaftlichen Fortschritt beigetragen, dass dies eigentlich keiner weiteren Erörterung bedarf. Wie aber können wir einen solchen Prozess beflügeln, ihn sozusagen institutionalisieren, um damit nicht nur eine Optimierung anstehender Forschung zu erreichen, sondern auch originelle - wirklich innovative - Ideen in den Forschungsprozess einmünden zu lassen? In besonders nachhaltiger Weise wird diese Fragestellung zur Zeit über das Bundesministerium für Bildung und Forschung in die Mitgliedseinrichtungen der Helmholtz-Gemeinschaft hineingetragen und hat hier zu vielfältigen Resonanzen geführt. Die Aufwendungen für den Unterhalt dieser Einrichtungen mit annähernd 22.000 Beschäftigten übersteigen die zwei Milliarden Euro Grenze pro Jahr. Es ist daher mehr als verständlich, wenn sich vor allem das zuständige Bundesministerium die Frage stellt, ob hier ein möglichst effizienter Mitteleinsatz gewährleistet ist und wenn Überlegungen angestellt werden, in welchem Umfang Strukturveränderungen mögliche Verkrustungen aufbrechen und Effizienzsteigerungen bewirken können. Das Zauberwort der Interdisziplinarität der Forschung steht hierbei ganz im Vordergrund der Diskussion. Diese Interdisziplinarität wird nun über Programme angestrebt, die eine möglichst enge Vernetzung der Zentren untereinander erzeugen sollen. Der Kernpunkt laufender Diskussionen ist die Frage nach Art und Gestaltung dieser Programme. Die Forschungszentren der HGF sind sehr unterschiedlich strukturiert. Frühere Kernforschungszentren haben in der Zwischenzeit eine Reihe unterschiedlicher neuer Aufgaben übernommen, die von technischen Neuentwicklungen, physikalischer Grundlagenforschung, über Umweltforschung bis hin zu gesundheitsrelevanten Fragestellungen führen. Wieder andere Forschungszentren stellen Großgeräte überwiegend für die Grundlagenforschung zur Verfügung, die gleichzeitig die fachliche Basis für die Mehrzahl ihrer Mitarbeiter darstellt, wie etwa DESY in Hamburg und die GSI in Darmstadt. Zwei Zentren (DKFZ in Heidelberg und MDC in Berlin-Buch) betreiben eine eher anwendungsorientierte medizinische Grundlagenforschung, deren Ergebnisse rasch in die klinische Anwendung einmünden sollen. Wiederum andere betrei-

ben Umweltforschung, die neben anderen Aspekten Klimaforschung, Bodenveränderungen und Gesundheitsaspekte einschließt. Diese Liste ließe sich noch von meeresbiologischer Forschung bis hin zur Weltraum- und Verkehrsforschung erweitern, um nur zwei weitere Beispiele zu benennen. Die Bemühungen um verbesserte interdisziplinäre Forschung stehen schon aufgrund der Heterogenität der Einrichtungen vor einem beträchtlichen Problem. Ist Interdisziplinarität dann am besten zu erreichen, wenn eher Methoden-orientierte Themenkreise, die in verschiedenen Einrichtungen bearbeitet werden, in einen gemeinsamen „Topf“ geworfen werden? Dies könnte zum Beispiel für die Genomforschung, die alle Bereiche der Gesundheitsforschung umfasst, die sogenannten Proteomics (die Analyse der Eiweißprofile von Zell- und Organstrukturen) oder auch in einem gewissen Umfang für die Zellbiologie als Grundlage für Herz-Kreislauf-, Krebs-, Infektions- und Allergieforschung gelten. Ein gemeinsames „Programm“ aller beteiligten Einrichtungen wäre dann jeweils auf diesen Sektoren zu erarbeiten, dessen Koordinator primär die innere Abstimmung aller Programm-Beteiligten im Auge behalten sollte, möglicherweise sogar unter Einflussnahme auf die gemeinsame Forschungsrichtung durch Budget- und Programmsteuerung. Wäre es als Alternative nicht sinnvoller - um im Bereich der Gesundheitsforschung zu bleiben - Themenkreise, die komplexe Krankheitsinhalte bearbeiten, also etwa Herz-Kreislaufforschung, Krebs und Allergien, interdisziplinär anzugehen? Ist es sinnvoll, etwa über eine Einrichtungs-übergreifende Struktur, die Themenkreise mit sehr unterschiedlicher Zielsetzung aber mit ähnlicher Methodik (also etwa die Genomforschung, die Zellbiologie, die Medizintechnik) zusammenfasst, dieser Entwicklung entgegen zu wirken und damit ein über längere Zeiträume gewachsenes Gefüge interdisziplinärer Zusammenarbeit auseinander zu reißen? Ich halte es für wichtig, vor dieser Entwicklung zu warnen, die letztlich zu einer Verschiebung von gesundheitspolitisch wichtigen Forschungsthemen - im wesentlichen auf enggleisige Technologie-Entwicklungen und zu einer Verwässerung wirklicher Forschungsziele führen muss. Hier droht die Gefahr einer Entwicklung, die man als falsch verstandene Interdisziplinarität interpretieren kann. Zwar ist die anwendungsfreie Grundlagenforschung zweifellos nicht die Hauptaufgabe der staatlich geförderten Forschungszentren der Helmholtz-Gemeinschaft und der Institute der Leibniz-Gesellschaft. Sie ist sicherlich bevorzugt bei der Max-Planck-Gesellschaft und den universitären Instituten aufgehoben. Auf der anderen Seite ist die Bearbeitung komplexer Fragestellungen - wie etwa im Gesundheitsbereich der Krebs - sicherlich nur im interdisziplinären Zusammenspiel daran interessierter Gruppen möglichst aus verschiedenen Fachrichtun-

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Interdisziplinäre Forschung gen zu erreichen. Unter dieser Prämisse sind eine Reihe der Großforschungseinrichtungen entstanden, wie etwa das Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung in Bremerhaven, das Deutsche Krebsforschungszentrum in Heidelberg und noch andere. Hier waren etwa die Berufungen von vornherein darauf ausgerichtet, möglichst viele Forschungsdisziplinen zu vereinen, um in interdisziplinären Programmen Fortschritte zu erzielen. Interdisziplinarität gedeiht dort, wo klare Profile bestehen und wo Fokussierungen auf langfristige Forschungsziele vorliegen. Programme können für Klarheit sorgen, sie können aber auch Probleme verwaschen - nämlich dann, wenn sie keine wirklichen Programme darstellen. Eine entscheidende forschungspolitische Zukunftsaufgabe liegt darin, für einen lokalen und überregionalen interdisziplinären Aufbau Sorge zu tragen, der Profile schafft und Fokussierungen ermöglicht. Wenn wir über bestehende institutionelle Grenzen hinweg denken, ist es keineswegs unmöglich, Konzepte zu entwickeln, die unter diesen Vorgaben auch Einrichtungs-übergreifende technische Zusammenarbeiten ermöglichen und Vernetzungen schaffen. Auch wenn es sicherlich notwendig ist, immer wieder über Verbesserungsmöglichkeiten unseres Forschungssystems nachzudenken und - wo immer dies sinnvoll ist - diese auch zu implementieren, lässt sich über eine falsch verstandene Interdisziplinarität auch vieles zerstören.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Übersicht

Forschungsschwerpunkt Krebsentstehung und Differenzierung Sprecher: Prof. Dr. Werner W. Franke Zellbiologie (A0100) Prof. Dr. rer. nat. Werner W. Franke  06221 42-3212, FAX 06221 42-3404 e-mail: [email protected]

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Molekularbiologie der Zelle I (A0200) Prof. Dr. med. Günther Schütz  06221 42-3411, FAX 06221 42-3470 e-mail: [email protected] Molekularbiologie der Zelle II (A0300) Prof. Dr. rer. nat. Ingrid Grummt  06221 42-3423, FAX 06221 42-3404 e-mail: [email protected] Entwicklungsgenetik (A0400) Prof. Dr. rer. nat. Bernard Mechler  06221 42-4502, FAX 06221 42-4552 e-mail: [email protected] Molekulare Embryologie (A0500) Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs  06221 42-4690, FAX 06221 42-4692 e-mail: [email protected] Biomedizinische Strukturforschung (A0600) Prof. Dr. Michael Trendelenburg  06221 42-3241, FAX 06221 42-3459 e-mail: [email protected] Prof. Dr. Eberhard Spiess  06221 42-3426, FAX 06221 42-3459 e-mail: [email protected] Epigenetik (A0700) Dr. rer. nat. Frank Lyko  06221 42-3800, FAX 06221 42-3802 e-mail: [email protected] Zentrale Proteinanalytik (R0800) Dr. rer. nat. Martina Schnölzer  06221 42-4599, FAX 06221 42-4562 e-mail: [email protected]

In den Abteilungen des Forschungsschwerpunktes werden - vorwiegend mit zell- und molekularbiologischen Methoden und auch in transfizierten Zellen bzw. transgen veränderten Tieren - verschiedene Aspekte der Spezialisierung von Zellen und Geweben (Differenzierung) erforscht. Insbesondere die Regulationsmechanismen der Synthese Zelltyp-spezifischer Proteine und ihrer Funktionen sowie funktionell bedingte bzw. die Tumorbildung fördernden Veränderungen in den Genen bzw. im Chromatin des Zellkerns stehen dabei im Mittelpunkt der Untersuchungen. Die den Arbeiten der Abteilung Zellbiologie zugrundeliegende Frage ist die nach den molekularen Grundlagen der zelltypischen Architektur normaler und maligne veränderter Zellen. Hierbei stehen zur Zeit die Filamente des Cytoskeletts und ihre Verankerungsstellen an der Plasmamembranen im Vordergrund, besonders die transmembranen Cadherine der Desmosomen als duale Ordnungsmoleküle. Die hierbei gefundenen zelltypischen Unterschiede in der molekularen Ausstattung der jeweiligen Intermediärfilamente und der Zellverbindungen (Junctions) werden systematisch auf ihr mögliches Einsatzpotential als molekulare Leitmerkmale (Marker) in der histologischen Diagnostik untersucht. In entsprechender Weise wie die Cytoskelettproteine werden auch die strukturbildenden Proteine des Zellkerns (Karyoskelett) untersucht, vor allem die der Kernhülle und des Nukleolus, vor allem auch mit dem Ziel, molekulare Prinzipien der intranukleären Topogenese und der Kerncytoplasmakompartimentierung und ihre funktionelle Bedeutung aufzuklären. Die Arbeit der Abteilung Molekularbiologie der Zelle I konzentriert sich auf: (1) Die Analyse der Rolle hormonabhängiger Signalketten in der Entwicklung und in physiologischen una pathologischen Prozessen. Um die Rolle hormonabhängiger Genexpression zu bestimmen, haben wir Mutantionen in wichtigen Komponenten der cAMP- und Glucocorticoid-abhängigen Signalübertragungswege gesetzt und untersuchen jetzt die Auswirkungen dieser Mutationen. (2) die Analyse der Leber und Darmentwicklung. Ziel dieses Projekts ist, die Funktion von Genen der HNF3/ forkhead - Gruppe durch Erstellung von Mutationen zu charakterisieren. (3) Mit der in der Abteilung entwickelten Technik der Erstellung transgener Mäuse mit Hilfe künstlicher Hefechromosomen soll die Existenz und Wirkungsweise von Expressionsdomänen analysiert werden. In der Abteilung Molekularbiologie der Zelle II werden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Genregulation in Säugerzellen durchgeführt. Der Schwerpunkt der Arbeiten liegt daher auf der Analyse der Prozesse, durch die extrazelluläre Signale in den Zellkern übertragen werden und dort die Transkriptionsrate positiv oder negativ beeinflussen. Dies erfordert die strukturelle und funktionelle Analyse der am Transkriptionsprozess beteiligten Proteinfaktoren, die Aufklärung deren intermolekularen Wechselwirkungen sowie die Identifizierung modifizierender Enzyme (Proteinkinasen und Phosphatasen), die die Aktivität

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung definierter Transkriptionsfaktoren in Abhängigkeit von Zellwachstum und Differenzierung steuern. Die Zielsetzung der Abteilung Entwicklungsgenetik ist die Identifizierung und funktionelle Analyse von Tumorsuppressorgenen bei Drosophila. Die Anwendung der gegenwärtig verfügbaren molekularen Methoden für die rasche Isolierung derartiger Gene und von Techniken der Analyse ihrer Funktion sollen neue Einsichten in die Mechanismen, die die Zellproliferation steuern, gewähren. Es konnte gezeigt werden, daß das erste Tumorsuppressorgen, welches für ein Cytoskelettprotein kodiert, mit nichtmuskulärem Myosin II interagiert. Beide Proteine sind Komponenten des Cytoskelettnetzwerkes, welches das gesamte Cytoplasma der Zellen durchzieht und mit der peripheren Matrix, die an die Plasmamembran angelagert ist, assoziiert ist. Ein weiteres Ziel der Abteilung ist die Identifizierung der anderen Zellbestandteile, die mit den identifizierten Tumorsuppressorgenen interagieren, um so die Regulationsmechanismen für die Zellproliferation aufzuklären. Die Kenntnis molekularer Anatomie von Differenzierungsvorgängen stellt eine wichtige Basis für die Untersuchung pathologischer Zelldifferenzierung, beispielsweise von Krebszellen, dar. Ziel der Abteilung Molekulare Embryologie ist daher die Charakterisierung molekularer Mechanismen, die verantwortlich für die Entwicklung des mittleren Keimblatts (Mesoderm) sind. Spezifisch sollen (1) unbekannte Entwicklungskontrollgene identifiziert, (2) die Musterbildung des Mesoderms mit molekularen Markern charakterisiert und (3) die zellulären Grundlagen morphogenetischer Bewegungen untersucht werden.

Übersicht re mit definierten Mutationen in den Kernkomponenten des Drosophila DNA-Methylierungssystems. Außerdem werden Hypermethylierungs-induzierte Phänotypen in Fliegen untersucht, um einen Einblick in die zellulären Signalwege zu erhalten, die während der Krebsentstehung von der DNA-Methylierung beeinflußt werden. Darüberhinaus entwickelt die Gruppe spezifische Hemmstoffe für DNA-Methyltransferasen, um die Hypermethylierung in Krebspatienten zu blockieren. Dem Forschungsschwerpunkt eng verbunden ist die Zentrale Proteinanalytik. Aufgabenschwerpunkt ist die Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung von Proteinen und Peptiden im Subpikomol-Bereich. Für diese Aufgaben werden überwiegend moderne massenspektrometrische Methoden wie MALDI-MS und Electrospray-MS gekoppelt mit nanoHPLC-Techniken eingesetzt. Um den Probendurchsatz zu erhöhen, soll die Probenvorbereitung für die MS-Analyse in verstärktem Maß durch den Einsatz von Robotern automatisiert werden. Die Identifizierung und Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen in Proteinen werden im Rahmen von Kooperationen mit Arbeitsgruppen des DKFZ durchgeführt. In Kooperation mit klinischen Partnern in Berlin und Mannheim werden Proteomprojekte bearbeitet, um diejenigen Proteine in verschiedenen Tumorzelllinien zu identifizieren, die an der Entwicklung von Chemoresistenz beteiligt sind.

Die Arbeiten der Abteilungen des Forschungsschwerpunktes Krebsentstehung und Differenzierung werden in entscheidender Weise durch die zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung unterstützt. Im Service-Betrieb und in den eigenen Forschungsprojekten dieser zentralen Arbeitsgruppe werden die Techniken der hochvergrößernden digitalen Lichtmikroskopie (konfokale Mikroskopie, Videomikroskopie) für spezifische Lokalisationen, insbesondere durch Mehrfachfluoreszenz im subzellulären Bereich, eingesetzt. Auf dem Gebiet der Elektronenmikroskopie soll die in den letzten Jahren entwickelte Technologie der elektronenoptischen Spektroskopie eingeführt werden. Das Potential dieser Technik soll für biologische Objekte ausgenützt werden, um auf molekularer Ebene in direkter Abbildung die Wechselwirkung von DNA und Proteinen zu studieren. Hier bieten sich vor allem in Zusammenarbeit mit anderen Abteilungen des Schwerpunktes Untersuchungen an Transkriptionskomplexen an. Epigenetische Mechanismen regulieren die Interpretation der gentetischen Information und spielen eine zentrale Rolle in der Entstehung von Krebs. Die Arbeitsgruppe Epigenetik wechselte Ende 2000 an das DKFZ. Sie entdeckte vor kurzem ein einfaches DNA-Methylierungssystem in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster: Diese Entdeckung eröffnet die Möglichkeit, komplexe Regulationsmechanismen in einem einfachen Modellorganismus zu untersuchen. Dazu etabliert die Gruppe transgene Tie-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Abteilung A0100 Zellbiologie

Abteilung Zellbiologie (A0100) Leiter: Prof. Dr. Werner W. Franke

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Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Leonid Eshkind ( - 03/00) Dr. Hans Heid PD Dr. Harald Herrmann-Lerdon Dr. Ilse Hofmann Prof. Dr. Jürgen Kartenbeck Dr. Lutz Langbein Dr. Hans-Richard Rackwitz (-06/00) Dr. Thorsten Ralle (05/99-04/00) Dr. Ansgar Schmidt (-09/00) PD Dr. Marion Schmidt-Zachmann PD Dr. Reimer Stick (10/98-08/00) Doktoranden Kemal Akat (med.; 02/00 - ) Angelika Alonso (med.; 03/01-) Judit Boda (10/01 - ) Carola Borrmann ( - 02/01) Christine Dreger (02/01 - ) Jens Eilbracht Bettina Hämmerling (med.; 12/01 - ) Sandra Kneissel Alexandra König (02/01 - ) Claudia Mertens ( - 08/00) Michaela Reichenzeller Wiebke Peitsch (med.; -08/00) Beate Straub (med.) Qi Tian ( - 03/01) Gastwissenschaftler/Stipendiaten Dr. Barbara Deumling (Köln, Deutschland; MPG; - 08/00) Dr. Birgit Kräling (Deutschland/USA; DKFZ-Stip.; - 04/00) Technisches Personal Jutta Arlt (85%; - 05/01) Katrin Götzke (65%; - 09/00) Michaela Hergt Andreas Hunziker ( - 05/01) Monika Mauermann (- 02/00) Jutta Osterholt Sonja Reidenbach (¼) Tatjana Wedig (½)

Peter Eichhorn Christine Grund (80%) Astrid Hofmann Cäcilia Kuhn Edeltraut Noffz (½) Silke Prätzel Heiderose Schumacher (½) Stefanie Winter-Simanowski Ralf Zimbelmann

Die Abteilung Zellbiologie arbeitet über zelluläre Strukturelemente - sowohl des Zellkerns als auch des Cytoplasma - und deren Verankerungsstrukturen an der Kernhülle wie an Zell-Zell-Verbindungen (“Junctions”). Mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und morphologischer Untersuchungen (hier insbesondere Elektronenmikroskopie und Immunlokalisierung) werden die beteiligten Proteine charakterisiert und ihre Wechselwirkungen sowie Funktionen aufgeklärt, sowohl durch in vitro als auch in vivo Experimente, von der Transfektion von Kulturzellen bis zur Erzeugung transgener Mäuse. Neben der Aufklärung grundsätzlicher zellbiologischer Fragestellungen sollen diese Erkenntnisse einem besseren Verständnis entwicklungsbiologischer Vorgänge der Zell- und Gewebsdifferenzierung sowie der malignen Transformationen dienen. Mehrere im Rahmen dieser Forschungsarbeiten gewonnene Reagenzien, besonders monoklonale Antikörper, werden bereits zur Zelltypisierung in der Tumordiagnostik und zur Früherkennung von Metastasen eingesetzt.

Cytoskelett und Karyoskelett von normalen und transformierten Zellen: Molekulare Charakterisierung der Hauptkomponenten und funktionellen Domänen W.W. Franke, H. Herrmann, L. Langbein In Zusammenarbeit mit: U. Aebi, P. Burkhard, Biozentrum, Basel, Schweiz; H. Baribault, La Jolla Cancer Research Foundation, USA; R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; A. Ben Ze’ev, Dept. of Molecular Genetics and Virology, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; B. Bernard, L’Oréal, Paris, Frankreich; W. Birchmeier, P. Ruiz, MDC Berlin; V. Bosch, Abt. F0200, DKFZ; D. Fürst, P. van der Ven, Universität Potsdam; B. Geiger, Dept. of Chemical Immunology, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; R.D. Goldman, V.E. Gould, Department of Pathology, Rush-Presbyterian-St. Luke’s Medical Center, Chicago, USA; T. Hashimoto, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan; N. Hernandez, S. Sepehri Chong, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA; G. Krohne, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; P. Krammer, Abt. G0300, DKFZ; H. Kurzen, W. Hartschuh, Hautklinik, Universität Heidelberg; B. Lane, CRC Labs, Dundee, Scotland; I. Leigh, Royal College London, U.K.; R. Leube, Anatomisches Institut, Universität Mainz; T. Magin, Institut für Genetik, Universität Bonn; J. Markl, Institut für Zoologie, Universität Mainz; I. Moll, Haut- und Poliklinik, UKE Hamburg; R. Moll, Zentrum für Pathologie, Universität Marburg; D. Olins, A. Olins, Foundation for Blood Research, Scarborough, USA; D. Parry, Massey University, Palmerston North, New Zealand; R.G. Roeder, M. Teichmann, Z. Wang, Rockefeller University, New York, USA; R. Schröder, C. Klasen, J. Reimann, Abt. Neurologie, Universitätskrankenhaus Bonn; J. Schweizer, M. Rogers, Abt. B0500, DKFZ; K. Sperling, A. Reis, Institut für Humangenetik, FU Berlin; P.M. Steinert, NIH, Bethesda, USA; J.-P. Thiery, CNRS, Laboratoire de Physiopathologie du Développement, Paris, Frankreich; M. Trendelenburg, H. Tröster, Abt. A0601, DKFZ; S.M. Troyanovsky, Washington University School of Medicine, St. Louis, USA; K. Weber, MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen; K. Zatloukal, H. Denk, Pathologisches Institut, Universität Graz, Österreich.

Die Architektur der einzelnen Zelle und ihre Wechselwirkung mit Nachbarzellen oder nicht-zellulären Komponenten wird u.a. durch komplexe, zelltyp-spezifische Anordnungen verschiedener cytoplasmatischer Strukturen bestimmt, die als “Cytoskelett” zusammengefaßt werden. Die Mechanismen der zelltyp-spezifischen Synthese der verschiedenen Cytoskelett-Proteine, ihrer Polymerisation (“Assembly”) und der Anordnung der so gebildeten Strukturen in der jeweiligen Zelle können folglich in unterschiedlichen Zell- und Gewebetypen - normalen wie transformierten - voneinander abweichen. Eine Grundvoraussetzung für das Verständnis dieser Entwicklungsprozesse ist die Identifizierung und Lokalisierung der beteiligten Proteine, ihrer Synthese und Modifikation sowie die Charakterisierung ihrer funktionellen Domänen. Deshalb ist es ebenfalls von großer Wichtigkeit, die Mechanismen der Topogenese solcher cytoskeletärer Proteine aufzuklären, da sie in unterschiedlichen Zellkompartimenten durchaus unterschiedliche Funktionen übernehmen können. Hatten wir früher schon gezeigt, daß Mutationen in typischen cytoplasmatischen Proteinen oder auch ihre ektopische Expression in bestimmten Zelltypen zu einer “Fehllokalisa-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung tion” im Zellkern führen kann, so konnten wir nun sogar zeigen, daß bestimmte Cytoskelett-Proteine sowohl in Zell-Zell-Verbindungen als auch im Zellkern - und zwar in einer Vielzahl unterschiedlicher Zellarten - konstitutiv vorkommen. Die Bedeutung dieser spezifischen Doppellokalisation für die Regulation des Differenzierungsgeschehens gilt es nun aufzuklären.

I. Organisationsfaktoren und strukturbestimmende Prinzipien zellulärer Filamentsysteme Die Intermediärfilament-(IF-)Proteine stellen - wie die anderen filamentbildenden Proteine - eine große Multi-GenFamilie dar, deren etwa 50 Vertreter zelltyp-spezifisch exprimiert werden und deren Gen-Produkte sich im Cytoskelett des Cytoplasma (z. B. Cytokeratine, Vimentin und Neurofilament-Proteine) oder im Karyoskelett des Zellkerns (Lamine) anreichern [13, 26-29, 31-33, 46]. Besonders komplexe Bildungsmuster weisen die Cytokeratine (CK) auf - beim Menschen mit 22 verschiedenen epithelialen Polypeptiden und 15 weiteren, an der Bildung von Haaren und Nägeln beteiligten (“trichocytären”) Vertretern. Diese Komplexität wird noch weiter erhöht durch die generelle bzw. zelltyp-spezifische Wechselwirkung mit IF-assoziierten Proteinen wie Plectin [5, 12, 45], Plakophilin [3, 4, 17, 18] und anderen IF-verankernden Proteinen der Desmosomen und Hemidesmosomen (s. Kap. III). Am Beispiel der Typ-III IF-Proteine Vimentin und Desmin haben wir den Ablauf der in vitro Filamentbildung (Assembly) für cytoplasmatische IF-Proteine neu beschrieben ([13, 43]; siehe auch [29]). Den molekularen Mechanismus des Assembly-Vorganges sowie die atomaren Voraussetzungen für die Wechselwirkung mit anderen Cytoskelett-Komponenten klären wir im Augenblick durch die Ermittlung der IF-Struktur mittels Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse einzelner IF-Proteine und IF-ProteinFragmente sowie ganzer “unit-length”-Filamente [14, 48]. In bezug auf die Dynamik der IF-Cytoskelett-Wechselwirkung haben wir kürzlich gezeigt, dass gerade Integrationsfaktoren wie Plectin primäre Angriffsziele des zellulären apoptotischen Apparates sind, noch vor den IF-Proteinen selbst, und daß sich hieraus wichtige Fragen zu Differenzierungsereignissen ergeben. Die Kenntnis des Assembly-Verhaltens individueller IFProteine erlaubte es uns, diese cytoplasmatischen Komponenten in einem völlig neuen Zusammenhang, als experimentelle Arbeitswerkzeuge zur Erkundung des reaktiven Raumes im Zellkern, einzusetzen [25]. Und zwar haben wir Amphibien-Vimentin gentechnisch durch Integration eines Kernwanderungssignals (NLS) in seiner Sequenz dermaßen verändert (NLS-Vimentin), daß es nach Transfektion der entsprechenden cDNA vollständig in den Zellkern transportiert wird. Je nach Temperatur, bei der die Zellen gehalten werden, ist NLS-Vimentin in “Nuclear Body”-ähnlichen Strukturen (37°C) oder in räumlich relativ begrenzten Filamentsystemen (28°C) zu finden. Dieser Raum wurde als identisch mit dem bisher nur aus funktionellen Überlegungen postulierten “Interchromosomal Domain Compartment” nachgewiesen und in vivo durch “live cell imaging”-Techniken beschrieben [39]. Es bot sich somit an, das NLS-Vimentin-Konstrukt als “Raumfähre” zu be-

Abteilung A0100 Zellbiologie nutzen, um in chimärer Form Wechselwirkungsdomänen von Kernproteinen zwecks Interaktionstest in den Kern einzubrigen. Diese Technik wurde bereits erfolgreich für einen direkten in vivo Nachweis der Wechselwirkung der Lamin-B1-Schwanzdomäne mit dem N-terminalen, nukleoplasmatischen Teil vom Lamin-B-Rezeptor (LBR) angewendet [9]. Die Versuche sind u.a. mit der menschlichen promyelozytischen Leukämie-Zelllinie HL-60 fortgesetzt worden, die im Verlauf ihrer Retinsäure-induzierten Differenzierung eine komplexe Umwandlung der Kernmorphologie, insbesondere des Chromatins und der Kernhülle, durchmacht [32, 33].

II. Keratin-Intermediärfilamente - Bildung, Struktur und Funktion während der Differenzierung Nachdem Genomanordnung und Genstruktur und die Expression der sauren (Typ I) Haarkeratine aufgeklärt waren, konnte die genetische Zuordnung für die basischen (Typ II) Haarkeratine abgeschlossen werden. Die Zahl der Gene, die in einem Gencluster auf Chromosom 12q13 liegen, hat sich von früher 4 auf 6 (hHb1-6) erhöht ([40]; vgl. auch [38, 42]). In umfangreichen Genexpressionsstudien zeigten wir mittels in situ Hybridisierung und Immunhistochemie (gegen alle Haarkeratine wurden spezifische Antiseren hergestellt), daß die Haarkeratine - wie die Cytokeratine - in einer differentiellen Abfolge gebildet werden. Einige sind sogar auf bestimmte Strukturen (z.B. die Cuticula) im Haarfollikel beschränkt. Eines der Typ-II-Haarkeratine wird, obwohl es ein echtes Haarkeratin ist, aber nicht im Haar, sondern lediglich in bestimmten Bereichen des Zungenepithels (filiforme Papillen) gebildet. Aus diesen Ergebnissen konnte der Katalog der Typ-II-Haarkeratine erstellt werden [27] und somit der Gesamtkatalog der Haarkeratine fertiggestellt werden. Nach dem heutigen Erkenntnisstand sind alle Haarkeratin-Gene bekannt: 9 Typ I (hHa1, 2, 3-I, 3-II, 4-8) und 6 Typ II (Hhb1-6). Damit können dann Schlußfolgerungen zur Filamentbildung (Heteropolymere aus Typ-I- und -II-Proteinen) gezogen werden. Innerhalb dieser Studie wurde ein neues Cytokeratin (K6irs1) entdeckt [65]. Hier konnten wir zeigen, daß seine Synthese auf eine genau definierte Struktur des Haarfollikels beschränkt ist, die innere Wurzelscheide (IRS). K6irs1 wird in allen Bereichen der IRS, der Henle- wie der Huxley-Schicht und der Cuticula synthetisiert. Dieses neue Protein ist auch in spezialisierten Zellen (Flügelzellen) darstellbar, die damit eindeutig als Huxley-Zellen identifizierbar sind. Es gibt bereits erste Hinweise, daß in der IRS drei weitere, neue Typ-I-Cytokeratine gebildet werden (K6irs2-4). Einen besonderen evolutionären Aspekt betrifft ein Pseudogen der Typ-I-Haarkeratine (ΨhHa). Es ist im Menschen nicht funktionell, wird aber in Schimpansen- und GorillaHaar als “zusätzliches” Haarkeratin gebildet. Vor ca. 240.000 Jahren - so ließ sich berechenen - wurde es während der menschlichen Evolution zum nicht-funktionellen Pseudogen [53]. Ferner wurden erste Arbeiten zur Genregulation der Haarkeratine begonnen und die Rolle des Transkriptionsfaktors Hox C13 beschrieben werden [62]. Diese Arbeiten wurden erweitert, indem auch die gro-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung ße Genfamilie der Keratin-assoziierten Proteine (KAPs) einbezogen und deren Expressionsmuster dargestellt wurde [38, 41, 66]. KAPs vernetzen die Keratinfilamente zu einer sehr festen Struktur, wie sie besonders im Haar auftritt. Die Arbeiten zur Synthese der Haarkeratine und die neu entdeckten Cytokeratine im Haarfollikel sind Grundlagen für Untersuchungen an Tumoren des haarbildenden Systems (s. auch Kap. IV, [6, 26, 58]).

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In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie der Universität Graz konnte erstmals eine neue Art von Funktion, nämlich Schutz vor zelltyp-spezifischer Toxizität am Beispiel des Cytokeratin 8 der Leber, in Genausschaltungsversuchen bestimmt werden [54].

III. Desmosomen: zelltyp-spezifische Zell-Verbindungsstrukturen und Verankerungsstellen des Zellskeletts Die räumlich und zeitlich regulierte Ausbildung von ZellZell-Verbindungsstrukturen (“Junctions”) ist eine Voraussetzung für die Bildung und den Bestand von Geweben und Organen. Die Kenntnis ihrer Struktur, ihrer molekularen Zusammensetzung und der Mechanismen, die ihren Auf- und Abbau steuern, sind daher für das Verständnis normaler Entwicklungsvorgänge und bestimmter maligner Prozesse, insbesondere der Bildung von Tumormetastasen, von besonderer Wichtigkeit. Eine auffällige und häufige Zell- Verbindungsstruktur epithelialer und myokardialer Zellen ist das Desmosom. Dieser Junction-Typ dient sowohl der Zellkopplung als auch der Verankerung bestimmter Elemente des Zellskeletts, der Intermediärfilamente, an der Plasmamembran. Während des Berichtszeitraums wurden vor allem die Untersuchungen zur speziellen Topogenese und Funktion der Plakophiline (PP) vorangetrieben, wobei sowohl die desmosomale als auch die kernständigen Formen biochemisch charakterisiert wurden [3, 4, 17, 18, 30, 50]. Im Zellkern diverser Zellen konnte ein Partikel nachgewiesen werden, das PP2 als konstitutiven Bestandteil eines Polymerase-III-Komplexes enthielt [30]. Auch stellte sich bei den Ausschaltungsexperimenten für das Gen des Cytokeratins 8 eine topogene wie funktionelle Unabhängigkeit der Plakophiline, hier besonders des PP2, heraus [54].

IV. Cytoskelett-Proteine als Zelldifferenzierungsmerkmale in der Tumordiagnostik Antikörper gegen bestimmte Cytoskelett-Proteine wurden zur Unterstützung der histologischen Zelltyp-Ansprache in der pathologischen Diagnostik eingesetzt. Nach Ergebnissen, die zur Aufklärung einer genetisch bedingten Haarerkrankung durch Mutation eines Haarkeratins führten, sind die Ergebnisse der Expression der Typ-I- und Typ-IIHaarkeratine, von CK6hf und von Ck6irs1 Bestandteil laufender Untersuchungen zur Charakterisierung und Diagnose trichozytärer Tumoren und anderer Tumoren der Haut [6, 26, 58]. Ferner wird die ektopische Expression von Haarkeratinen und den neuen Cytokeratinen in Plattenepithelcarcinomen und Teratomen untersucht (zusammen mit Prof. Dr. Roland Moll, Klinisches Zentrum für Pathologie, Universität Marburg).

Abteilung A0100 Zellbiologie

Intranukleäre Kompartimentierung und molekulare Grundlagen der Topogenese von Proteinen des Zellkerns M.S. Schmidt-Zachmann, I. Hofmann In Zusammenarbeit mit: R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; M.-C. Dabauvalle, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; J. Gall, Carnegie Institution, Baltimore, USA; W. Keller, Biozentrum, Universität Basel, Schweriz; A. Krämer, Universität Genf, Schweiz; N. Hernandez, S. Sepehri Chong, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA; R.G. Roeder, M. Teichmann, Z. Wang, Rockefeller University, New York, USA; Michael Stoehr, A0102, DKFZ; M. Schnölzer, R0800; DKFZ.

Die Kompartimentierung der Zelle und ihrer Funktionen beruht wesentlich auf der Topogenese der Zellproteine. Während für die Cytoplasma-Zellkern-Verteilung von Proteinen in den letzten Jahren die molekularbiologischen Prinzipien weitestgehend aufgeklärt werden konnten, sind die Mechanismen der intranukleären Subkompartimentierung von Proteinen noch großteils unbekannt. Die in eukaryotischen Zellen morphologisch auffälligste intranukleäre Substruktur ist der Nukleolus. Diese charakteristische Kernstruktur ist ein Beispiel für eine multifunktionelle Kerndomäne. Neben seiner bekannten Grundfunktion in der Ribosomenbiosynthese konnten dem Nukleolus in jüngster Zeit zusätzliche Funktionen sowohl bei der Zellzyklus-Kontrolle, dem Kernexport von Proteinen, bei Alterungsprozessen als auch bei der Bildung oder dem Transport verschiedenster Ribonukleoproteinpartikel, nachgewiesen werden. Nukleolen sind darüber hinaus durch eine spezifische Anreicherung von Proteinen in definierten nukleolären Substrukturen charakterisiert. Aufbauend auf früheren und aktuellen Ergebnissen ist eines der Hauptziele dieser Arbeitsgruppe, neue nicht-ribosomale Proteine des Nukleolus zu identifizieren, biochemisch und molekularbiologisch zu charakterisieren und in ihrer strukturellen Anordnung innerhalb des Nukleolus aufzuklären. Als biologisches Ausgangsmaterial dienen dafür häufig die Oocytenkerne des Krallenfrosches Xenopus laevis. Diese enthalten eine hohe Anzahl extrachromosomaler, amplifizierter Nukleolen (ca. 1000/Kern) und sind somit prädestiniert für die Untersuchung topologischer Prinzipien der Ribosomen-Biosynthese sowie der strukturellen Organisation dieser intranukleären Hauptkomponente. Kürzlich gelang uns die Identifizierung und molekulare Charakterisierung eines neuen 61 kDa großen Nukleolusproteins, das als NOH61 („Nucleolar Helicase of 61 kDa“) bezeichnet wurde. Dieses Protein, das in allen untersuchten Arten (von Mensch bis Xenopus) nachgewiesen werden konnte, gehört zur Familie der „DEAD-Box“(Asp-Glu-Ala-Asp)-Proteine. Hierbei handelt es sich um eine Subklasse der ATP-abhängigen RNA-Helikasen. Die bemerkenswert hohe evolutionäre Konservierung, seine ausschließliche Lokalisierung in Nukleolen und vor allem seine spezifische Assoziation mit den Vorläuferpartikeln für die große ribosomale Untereinheit, legten den Schluß nahe, daß das ubiquitär vorkommende Protein NOH61 eine wichtige Funktion bei der Ribosomenbiosynthese spielt [55].

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Während über die molekulare Zusammensetzung des Nukleolus in den letzten Jahren einige neue Erkenntnisse gesammelt werden konnten, ist die Existenz von Faktoren bzw. Proteinen, die zur Bildung eines funktionell und morphologisch intakten Nukleolus benötigt werden, noch weitestgehend ungeklärt. Von besonderer Bedeutung war daher die kürzlich gelungene Identifizierung, Klonierung und Sequenzierung eines neuartigen, nukleolären Proteins NO145 aus Oocytenkernen, das sich in seinen Eigenschaften und insbesondere in seiner Topologie von allen bisher bekannten Nukleolusproteinen unterscheidet. Die biochemischen Eigenschaften von NO145 (resistent gegen Extraktionen mit Puffern hoher Ionenstärke und Detergenz) lassen den Schluß zu, daß es sich hierbei um ein Nukleolus-spezifisches „Karyoskelett-Protein“ handelt. Die Analyse seiner Primärsequenz zeigte, daß es sich um ein neuartiges Protein handelt, das interessanterweise in einem kurzen N-terminalen Abschnitt auffällig hohe Sequenzhomologie zum Protein SCP2 der Ratte, einem strukturbildenden Protein des meiotischen Synaptonemalkomplexes, aufweist. Letzteres deutet auf eine funktionelle Verwandtschaft dieser beiden strukturbeteiligten Kernproteine hin. Die Gewinnung NO145-spezifischer Antikörper ermöglichte eine detaillierte Untersuchung dieser neuen Nukleoluskomponente. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer Immunlokalisierungsstudien konnte gezeigt werden, daß NO145 spezifisch in einem filamentösen Netzwerk im Cortex der amplifizierten Nukleolen vorliegt, wobei seine Anordnung von der Konzentration bivalenter Ionen abhängig ist. Seine intranukleoläre Verteilung unterscheidet NO145 von allen bisher beschriebenen Nukleolusproteinen. Protein NO145 ist in allen Stadien der Oogenese vorhanden. Kommt es allerdings zur Eireifung und damit zur Auflösung der Kernhülle und der Nukleolen, ist es nicht mehr nachweisbar. „Northern-Blot“-Analysen haben allerdings gezeigt, daß das Verschwinden von NO145 nicht auf der RNA-Ebene reguliert wird. Den für die spezifische Degradation von NO145 verantwortlichen Mechanismus gilt es in weiterführenden Studien zu entschlüsseln. Da Protein NO145 bisher nur in den Nukleolen der Xenopus-Oocyte nachgewiesen werden konnte, sollen künftige Untersuchungen zeigen, ob eine ähnliche nukleoläre Gerüststruktur in anderen Zelltypen und Spezies durch ein homologes oder analoges Protein gebildet wird. Als Arbeitshypothese zur Funktion dieses Proteins wird eine tragende Rolle als topogenes Karyoskelettelement vorgeschlagen: Protein NO145 bildet unter physiologischen Bedingungen ein filamentöses Netzwerk, das den nukleolären Cortex bestimmt, der nukleoläre Strukturen zu einem spezifischen Reaktionsraum (Subkompartiment) umschließt und so Größe und Aussehen der amplifizierten Oocyten-Nukleolen beeinflußt [21,22]. Untersuchungen des Xenopus-Oocytenkerns bzw. daraus gewonnener Kernfraktionen führten außerdem zur Identifizierung und molekularen Charakterisierung eines während der Evolution hoch konservierten Kernproteins, das als Komponente des Spleiß-Faktors SF3b identifiziert werden konnte („SF3b155“; Schmidt-Zachmann et al., 1998, Mol.

Abteilung A0100 Zellbiologie Biol. Cell 9, 143-160). Es liegt im Zellkern sowohl in einer löslichen als auch in einer Struktur-assoziierten Form vor, wobei letztere als Kern-“Speckles“ identifiziert werden konnte. Für diese intranukleäre Substruktur ist bekannt, daß sie eine große Anzahl von Spleiß-Faktoren enthält. Die Primärsequenz von SF3b155 weist im Gegensatz zu allen anderen bisher untersuchten „Speckles-Proteinen“ keine RS-Domäne (Sequenzbereich reich an Arginin-SerinResten) auf. In einer weiterführenden Studie wurden deshalb topogene Sequenzelemente, welche die Aufnahme in den Zellkern sowie die spezifische Anreicherung dieses Proteins in den „Speckles“ vermitteln, identifiziert. Durch detaillierte Mutationsanalyse konnte gezeigt werden, daß SF3b155 ein klassisches Kernwanderungssignal besitzt. Für die Akkumulation in den Kern-“Speckles“ dagegen wird ein Sequenzbereich von 232 Aminosäuren benötigt, der durch die gehäufte Anwesenheit des Dipeptids Threonin/Prolin („TP-Domäne“) gekennzeichnet ist. Es gelang somit die Identifizierung eines bisher unbekannten Sequenzsignals, das ein Protein in „Speckles“ dirigiert [10]. Diese und frühere Studien (zur Topogenese von Nukleolusproteinen siehe Schmidt-Zachmann und Nigg, 1993, J. Cell Sci. 105, 799-806; Zirwes et al., 1997, Mol. Biol. Cell 8, 231-248) haben gezeigt, daß die Lokalisierung von Proteinen in bestimmten Kernstrukturen offensichtlich in zwei aufeinander folgenden Schritten erfolgt: 1. Aktiver Transport in den Zellkern mit Hilfe des Kernwanderungssignals. 2. Anreicherung in der jeweiligen Kernstruktur durch spezifische Wechselwirkungen mit anderen dort befindlichen Komponenten, die unterschiedlicher Natur sein können (Nukleinsäure, Proteine).

Mechanismen der Biogenese und Dynamik von Membrandomänen J. Kartenbeck In Zusammenarbeit mit: Angel Alonso, Abt. F0500, DKFZ; Ursula Bantel-Schaal, Abt. F0400, DKFZ; Franz Bosch, HNO-Klinik, Universität Heidelberg; Nikolaus Gassler, Institut für Pathologie, Universität Heidelberg; Ari Helenius, ETH Zürich, Schweiz; W.W. Just, Biochemie-Zentrum, Universität Heidelberg; T.W. Keenan, Virginia Polytechnic Institute, Blacksburg, USA; Dietrich Keppler, Abt. B0700, DKFZ; Rudolf Leube, Institut für Anatomie, Universität Mainz.

Hemidesmosomale Strukturen vermitteln die stabile Anheftung von mehrschichtigen Epithelien an das darunter liegende Bindegewebe. Aufgebaut werden diese an der basalen Plasmamembran durch bestimmte, nicht-desmosomale Proteine wie z.B. dem Bullösen Pemphigoid-Antigen (BPA1) und α6β4-Integrin-Komplexen. Am Gewebematerial von Patienten, die an Plattenepithelkarzinomen erkrankt waren, wurde Synthese und Anordnungsverhalten dieser Proteine bei der Tumorzellinvasion und bei Metastasierungsprozessen untersucht. Dabei zeigte sich, daß bei invasivem Wachstum eine erhöhte Synthese von BPA1 und α6β4-Integrinen einsetzt, die sich über mehrere untere Zelllagen und dabei zusätzlich über fast die gesamten Zelloberflächen erstreckt. Trotz der erhöhten Synthese hemidesmosomaler Proteine war jedoch ein Rückgang -

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung fast bis zum vollständigen Verlust - hemidesmosomaler Strukturen in den metastasierenden Tumorbereichen feststellbar. Dieser Nachweis und das veränderte Expressionsmuster über mehrere basale Zellreihen kann als deutlicher diagnostischer Hinweis auf einen metastasierenden Phänotyp eines Plattenepithels angesehen werden [15].

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Ein häufig beschriebener Verlust oder eine stark reduzierte Expression von Proteinen, die am Aufbau interzellulärer Zellkontakte wie z.B. Zonulae adhaerentes und Desmosomen, beteiligt sind, wird z.Z. allgemein als Hinweis für eine vorliegende maligne Entartung und als prognostischer Faktor angesehen. In einer Langzeitstudie bei 190 Patienten ist ein spezieller Tumortyp, das Plattenepithelkarzinom, auf das Vorkommen verschiedener Zellkontaktproteine wie z.B. Desmoplakin, Desmoglein und E-Cadherin untersucht worden - und zwar in Primärtumoren wie Metastasen. In der Mehrzahl der Fälle wurde zwar eine reduzierte Expression der untersuchten Proteine gesehen, ein Verschwinden der Kontaktstrukturen wurde jedoch nicht beobachtet. Die statistische Auswertung zeigte außerdem, daß es keine klare Korrelation zwischen einer Abnahme der Expressionsmuster und der Zunahme der Metastasierungsvorgänge gibt. In einer weiteren Untersuchung wurde das Verhalten von interzellulären Zellverbindungen bei entzündlichen Darmprozessen, sie sich häufig zu Krebsvorstufen entwickeln können, untersucht [11]. Um herauszufinden, ob eine schnelle Degeneration und Instabilität einer mutierten kanalikulären Isoform der MRP2-RNA oder ein defektes MRP2-Protein für das Fehlen dieser Ionenpumpe beim Dubin-Johnson-Syndrom (vgl. Kartenbeck et al., 1996, Hepatology 23, 1061-1066) verantwortlich ist, wurde die Synthese und die subzelluläre Anordnung eines mutierten MRP2-Proteins in transfizierten Zellkulturen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß das veränderte Protein im rER akkumuliert und danach über Proteasomen abgebaut wird und so nicht zum Einbau in die apikale Plasmamembran zur Verfügung steht [20]. Bei der viralen Infektion von Zellen nutzen die Viren endozytotische Passagewege, die in den Zellen vorhanden sind. Mit Hilfe von Viren ist es daher möglich, auch Routen und Organellen zu erkennen, deren Beteiligung bei der zellulären Partikelaufnahme bisher nicht beschrieben ist. So konnte bei der Aufnahme von SV40-Viren ein neues Organell, das Caveosom, entdeckt werden [37] und die Teilnahme von Anteilen des Golig-Anteilen bei der Endocytose von AAV5 aufgezeigt werden [56].

Abteilung A0100 Zellbiologie

Besondere zelltyp-spezifische Cytoskelettstrukturen H. Heid, W.W. Franke In Zusammenarbeit mit: R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; H. Denk, K.Zatloukal, Pathologisches Institut, Universität Graz, Österreich; W. Kriz, Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg; I. Moll, W. Peitsch, Hautklinik des Universitätsklinikums Eppendorf, Hamburg; T. Magin, Institut für Genetik, Universität Bonn; M. Schnölzer, R0800, DKFZ; W. Schulze, Abt. für Andrologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf.

Das Cytoskelett der Spermien: Spezifische Strukturproteine der perinukleären Kalyx In Weiterführung unserer früheren Untersuchungen zur molekularen Zusammensetzung der Kalyxstruktur der Spermienköpfe von Säugetieren - besonders von Bullen und Menschen - und der Identifizierung und Charakterisierung der Spermien-spezifischen basischen Proteine Cylicin I, Cylicin II und Calicin sowie des “Capping Protein β3” (Hess et al., 1993, J. Cell Biol., 122, 10543-1052; Hess et al., 1995, Exp.Cell Res., 218, 174-182; von Bülow et al., 1995, Exp.Cell Res., 219, 407-413; von Bülow et al., 1997, Exp.Cell Res., 233, 216-224 ) haben wir aus SpermienPräparationen u.a. zwei Actin-verwandte Proteine (“Actinrelated proteins”, Arps), das Arp-T1 und das Arp-T2, und das Selenoprotein PHGPx entdeckt und mit Hilfe spezifischer Antikörper in der Kalyx-Struktur lokalisiert (Heid et al.: A novel actin-related protein: ARP-T is a component of the cytoskeletal calyx of the mammalian sperm head. (Poster). 2001. Biol. Cell 93:233). Bei beiden Proteinen, ArpT1 und Arp-T2, handelt es sich um neuartige Proteine, die hier offenbar auch eine neuartige Funktion haben, jedenfalls keine Kristallkeimbildung für Aktinfilamente. Die Bedeutung und genaue Anordnung dieser spezifischen Proteine bei der Bildung der Cytoskelettstruktur von Spermien und die Regulation ihrer Synthese soll näher untersucht werden. Berichte zu Spermien-Mißbildungen (Teratozoospermien; u.a. sog. “Rundköpfe”) bei Fehlen oder falscher Anordnung einiger dieser Proteine geben Hinweise auf die Wichtigkeit solcher Proteine.

Drebrin-haltige Strukturen in nichtneuronalen Zellen und ihre Funktionen Ausgehend von unserem Befund, daß das Actin-bindende Protein Drebrin keineswegs auf Neuronen beschränkt ist, sondern in vielen verschiedenen Zelltypen z.T. in beträchtlichen Mengen und in bestimmten Strukturen ([36]; vgl. Peitsch et al., 1999, Eur. J. Cell Biol., 78, 767-778) auftritt, ist die Form des Vorkommens in verschiedenen Geweben biochemisch bestimmt worden, wobei auch Hinweise auf besondere Drebrin-haltige Partikel (“Drebrosomen”) gefunden wurden. Das auffällige Vorkommen von Drebrin bzw. Drebrosomen an - oder in - Filopodium-artigen Zellfortsätzen sowie in überaus enger Bindung an die Plasmamembran hat zur Arbeitshypothese einer Beteiligung von Drebrin bei der Bildung solcher Zellausläufer-Strukturen und deren Funktionen geführt. In Rahmen der Mikrosequenzierung von Proteinen und Peptiden wurden in Kooperation mit verschiedenen Arbeitsgruppen weitere neue Proteine entdeckt und charakterisiert [2, 17, 19, 22, 23, 52, 60, 68].

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Aleem, E.A., Flohr, T., Hunziker, A., Mayer, D., Bannasch, P., Thielmann, H.W. 2001. Detection and quantification of protein phosphatase inhibitor-1 gene expression in total rat liver and isolated hepatocytes. Mol. Cell. Biochem. 217, 1-12. [2] *Alsheimer, M., *von Glasenapp, E., Schnölzer, M., Heid, H., *Benavente, R. 2000. Meiotic lamin C2: the unique aminoterminal hexapeptide GNAEGR is essential for nuclear envelope association. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13120-13125. [3] Borrmann, C. 2000. Molekulare Charakterisierung der Adhärens-Zellverbindungen des Herzens: Identifizierung einer neuen Art, der Area composita. Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg. Dissertation.

Abteilung A0100 Zellbiologie [17] Hofmann, I., Mertens, C., Brettel, M., Nimmrich, V., Schnölzer, M., Herrmann, H. 2000. Interaction of plakophilins with desmoplakin and intermediate filament proteins: an in vitro analysis. J. Cell Sci. 113, 2471-2483. [18] Hofmann, I., Mücke, N., Reed, J., Herrmann, H., Langowski, J. 2000. Physical characterization of plakophilin 1 reconstituted with and without zinc. Eur. J. Biochem. 267, 4381-4389. [19] *Keenan, T.W., Winter, S., Rackwitz, H.-R., Heid, H.W. 2000. Nuclear coactivator protein p100 is present in endoplasmic reticulum and lipid droplets of milk secreting cells. Biochim. Biophys. Acta 1523, 84-90.

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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

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Abteilung A0100 Zellbiologie

[34] Patzelt, U. 2000. Untersuchungen zur Heteropolymerbildung der Intermediärfilamentproteine Vimentin und Desmin in vitro. Universität Heidelberg/Oberschulamt Karlsruhe. Staatsexamensarbeit.

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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung [68] *Zatloukal, K., *Stumptner, C., *Fuchsbichler, A., Heid, H., Schnölzer, M., *Kenner, L., *Kleinert, R., *Prinz, M., *Aguzzi, A., *Denk, H. 2002. p62 is a common component of cytoplasmic inclusions in protein aggregation diseases. Am. J. Pathol. 160, 255-263.

Abteilung A0100 Zellbiologie

Zytometrie (A0102) Leiter: Dr. Michael Stöhr Tel: 06221 - 42 3208; FAX: 06221 - 42 2652 E-mail: [email protected]

Mitarbeiter Monika Frank-Stöhr Dr. Karl J. Hutter

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Überblick Auftragsgemäß bestanden die Aktivitäten im Wesentlichen aus: * Analysen, Beratung, und Einweisung bei allen Fragen, zu denen zytometrische Techniken routinemäßig in wissenschaftliche Experimente mit Zellmodellen einbezogen wurden. *

technische Weiterentwicklung des Instrumentariums unter besonderer Berücksichtigung der Integration von PC-Technologie in die Erfassung und Verarbeitung von Meßdaten;

* Organisation und Durchführung des jährlichen Heidelberger Zytometrie Symposiums.

Routineanalysen und Kooperationen Im Einzelnen wurden Analysen zu folgenden Themen bearbeitet: Thema * Zellzyklusanalyse, Apoptose und Wachstumssynchronisation

Anzahl Aufwand (%)

600

70

* Elektronische Zellsortierung

20

20

* Immunphenotypisierung

25

5

* Photosensibilisierung durch Laserbestrahlung

15

5

Hard- und Software Entwicklung Eigene Entwicklungen führten zu einem weiteren Ausbau der Datenerfassung auf PC - Basis und C - sowie FORTRAN - Hochsprache, welches die simultane Messung, Speicherung, Analyse und Dokumentation von vier zellulären Merkmalen im Durchflußverfahren gestattet. Die Transportierbarkeit der Meßdaten und Ergebnisse in geläufige Anwendungen zur Text- und Graphikverarbeitung (Word, Designer, Paint brush, Harward Graphics etc.) lag dabei im Vordergrund der Bemühungen.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Abteilung A0200 Molekularbiologie der Zelle I

Abteilung Molekularbiologie der Zelle I (A0200) Leiter: Prof. Dr. med. Günther Schütz

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Rolle hormonabhängiger Signalketten in der Entwicklung und Funktion von Zellen und Geweben

Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. Wolfgang Schmid Dr. Holger Reichardt (-04/01) Dr. Theo Mantamadiotis (-08/00) Dr. Christiane Otto Dr. Erich Greiner Dr. François Tronche (-06/00) Dr. Oliver Kretz (-04/01)) Dr. Stefan Berger Dr. Susanne Bleckmann Dr. Anton Bauer (-08/01) Dr. Rosa Arribas (-10/01) Dr. Emilio Casanova Dr. Lukas Schwake (09/01-) Dr. Thomas Lemberger Dr. Marc Kenzelmann Dr. Jan Tuckermann

G. Schütz

Stipendiaten Dr. Brenda Stride, Kanada (01/99 -) Gastwissenschaftler Dr. Minqiang Chai, China (12/01 -) Doktoranden Igor Borissevitch (-03/01) Tim Wintermantel Maja Vujic

Daniel Gau (-11/01) Tim Beißbarth (-11/01) Milen Kirilov (01/01-)

Technisches Personal Dagmar Bock Frank Exner Heidrun Kern (-12/00) Sandra Fehsenfeld Stefanie Päbst (09/00-) Katrin Anlag (-03/00)

Ralf Klären Annette Klewe-Nebenius Heike Alter Myriam Grüner (12/00-) Magdalena Westphal (11/01-) Christiane Zacher (-03/00)

Sekretariat Monika Bock

Die Abteilung Molekularbiologie der Zelle I untersucht mit genetischen Methoden die Rolle von hormonabhängigen Signalketten in der zell- und entwicklungsspezifischen Genaktivierung. Durch gezielte Geninaktivierung werden Komponenten in den Signalwegen für Gluko-/Mineralokortikoide und Östrogen sowie cAMP inaktiviert und die Auswirkung dieser Mutationen auf Differenzierung, Physiologie in der Maus im einzelnen untersucht. Mit diesem Ansatz wurde die Rolle des G-Protein-gekoppelten Rezeptors, PACAP-Typ-I-Rezeptor, charakterisiert. Von diesen Untersuchungen erwarten wir wichtige Einblicke in die Mechanismen des normalen und entarteten Zellwachstums, der Differenzierung und der Funktion von Zellen und Geweben.

Ziel unserer Arbeiten ist die Charakterisierung von Mechanismen, die zur Aktivierung von Genen in spezifischen Zellen und Geweben in Abhängigkeit von externen Signalen führen. Hormonabhängige Signalketten sind in vielen Zellen vorhanden, viele davon sind ubiquitär. Eine Frage, die uns seit langem beschäftigt, ist, wie solche ubiquitären Signale letztlich zu zellspezifischen Antworten führen. Von besonderem Interesse für uns ist die Rolle der cAMP-abhängigen und der Glukokortikoid-/Mineralokortikoid- und Östradiol-vermittelten Genexpression während der Entwicklung und in der Physiologie. Um die Rolle dieser Rezeptoren und von cAMP -abhängigen Transkriptionsfaktoren in der Entwicklung und in physiologischen und pathologischen Prozessen zu verstehen, haben wir die Gene, die für diese Proteine kodieren, in der Maus gezielt zerstört. Da Mutationen in diesen Genen häufig zur Lethalität führen (dies gilt für den Gluko- und Mineralokortikoid-Rezeptor und für CREB), haben wir mit Hilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems organspezifische Mutationen erzeugt. Selektive Inaktivierung des CREB-Gens und des Glukokortikoid- und Mineralokortikoid-Rezeptorgens erlauben uns nun, die Funktion dieser Signalmoleküle genau zu beschreiben. Diese Mutationen werden genuzt, um Zielgene für diese Transkriptionsfaktoren in den jeweiligen Zielzellen mit Hilfe von Expressionsprofilanalysen zu definieren und zu isolieren.

Analyse der Funktion von cAMP-abhängigen Transkriptionsfaktoren durch gezielte GenInaktivierung S. Bleckmann, E. Casanova, D. Gau, T. Lemberger, T. Mantamadiotis, C. Otto, W. Schmid, I. Borissevitch, T. Beißbarth Extrazelluläre Signale steuern die Genaktivität durch Kontrolle von intrazellullären Signaltransduktionswegen. Während Steroidhormone durch die Bindung an ihren Rezeptor direkt die Genaktivität beeinflussen, wirken Hormone, die an Rezeptoren an der Zelloberfläche binden, durch intrazelluläre Signalkaskaden. Viele Hormone, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter regulieren die Genaktivität über Aktivierung der Proteinkinase A und anderer Kinasen, die die Proteine CREB, CREM und ATF-1 modifizieren. Diese Proteine enthalten eine bZIP-DNA Bindungsdomäne und wirken als Homo- oder Heterodimere. Um die Rolle dieser drei Proteine in der signalabhängigen Genexpression zu definieren, haben wir Mausmutanten erzeugt, bei denen die Gene für CREB, CREM und ATF-1 gezielt zerstört wurden. Da Tiere ohne CREB-Funktion kurz nach der Geburt sterben, haben wir sowohl Keim-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung bahnmutationen wie auch somatische Mutationen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems entwickelt. Homozytoge Nullmutanten für CREB sterben kurz nach der Geburt wegen Atelektase der Lunge. Diese Tiere sind kleiner und zeigen eine Reduktion in der T-Zellreifung [1]. Verlust von CREB führt zu stark beeinträchtigter Glukoneogenese [2]. CREB- und Ko-Aktivator-Wechselwirkung ist wichtig für die Genaktivierung [3]. Mäuse mit einem hypomorphen CREB-Allel überleben und haben erlaubt, die Rolle von CREB im erwachsenen Tier zu studieren. Reduzierte CREB-Aktivität führt zur beeinträchtigten Gedächtnisleistung und synaptischen Plastizität [4,5]. Analyse der Rolle dieses Proteins in der Morphinabhängigkeit zeigte, daß CREB für die Entwicklung der körperlichen Abhängigkeit notwendig ist. [6]. Doppelmutanten für CREB und ATF1 haben einen sehr dramatischen Phänotyp, da die Entwicklung schon auf der Stufe von Blastozysten inhibiert ist. Bleibt ein ATF1-Allel erhalten, entwickeln sich die Embryonen bis zu E7 [7]. Mutation im CREM-Gen führt zum Abbruch der Spermatogenese auf der Stufe der runden Spermatiden. Wir haben diese Mutation eingesetzt, um Zielgene für CREM im Hoden zu beschreiben. Dies erfolgte sowohl durch differentielle Hybridisierung wie auch durch Einsatz von Affymetrix-Chips. Auf diese Weise konnten mehrere hundert Gene als direkte Zielgene bzw. als Produkte von runden Spermatiden charakterisiert werden. Da Mäuse ohne CREB kurz nach der Geburt sterben, haben wir zell- und organspezifische Mutationen unter Einsatz des Cre/loxP-Systems entwickelt. Das CREB-Gen wurde durch homologe Rekombination so verändert, daß loxP-Erkennungssequenzen für die Cre-Rekombinase um das Exon für die DNA-Bindungsdomäne in embryonalen Stammzellen zu liegen kommen. Um Mutationen im zentralen Nervensystem, in Thymus und Makrophagen zu entwickeln, wurde die Cre-Rekombinase nach Transgenese in diesen Zellen und Geweben zur Expression gebracht und mit Mäusen verpaart, bei denen das CREB-Gen durch Insertion von loxP-Sequenzen gezielt verändert worden ist. Durch entsprechende Wahl eines geeigneten Promoters konnte die CREB-Funktion während der Entwicklung (mit Hilfe des Nestin-Promoters) oder postnatal (mit Hilfe des CaMKIIα- oder des Dopamin I-Rezeptorgens) exprimiert werden. Mäuse ohne CREB auf einem CREM-/- Hintergrund zeigen extensive Apoptose von postmitotischen Neuronen während der Entwicklung [8]. Im Gegensatz dazu zeigen Mäuse, bei denen das CREB-Gen in der postnatalen Periode inaktiviert wird, progressive Neurodegeneration in selektiven Regionen, im Hippocampus und dem dorsolateralen Striatum. Diese Untersuchungen zeigen, daß die CREB-Familienmitglieder CREB und CREM für Überleben von Neuronen in vivo notwendig sind. Fehlen von CREB und CREM im sich entwickelnden Gehirn führt zu generalisierter Apoptose, während postnatale Unterbrechung der Transkription, die durch CREB und CREM vermittelt wird, zur selektiven und fortschreitenden Neurodegeneration führt. Interessant ist, daß nur das Fehlen von CREB alleine nicht das neuronale Überleben beeinträchtigt. Diese Beobachtungen zeigen die Bedeutung der Proteine der CREB-Familie für das zelluläre Überleben.

Abteilung A0200 Molekularbiologie der Zelle I Die Funktion von CREB wird durch Phosphorylierung am Ser133 reguliert. Es war gezeigt worden, daß die CaMKIIα in der Lage ist, neben Ser133 auch Ser142 zu modifizieren. Die Rolle der Phosphorylierung am Ser142 und ihre mögliche funktionelle Bedeutung war unbekannt. Mit Hilfe eines Antikörpers gegen das phosphorylierte Ser142 haben wir nachweisen können, daß diese Phosphorylierung in der Tat in vivo vorkommt. Wir konnten ferner zeigen, daß diese Modifikation für die Einstellung der cirkadianen Uhr wichtig ist. Im suprachismatischen Nukleus (SCN) führt Licht zu einer Phosphorylierung von CREB an Ser133 und auch an Ser142. Um die Bedeutung dieser Modifikation in vivo zu definieren, haben wir eine Mausmutante, CREBS142A, erzeugt, bei der diese Phosphorylierung nicht erfolgen kann. Lichtabhängige Phasenverschiebungen in der Aktivität und Expression von c-fos und mPER1 im SCN sind in CREBS142A-Mutanten stark abgeschwächt. Diese Beobachtungen zeigen, daß CREB Ser142Phosphorylierung bei der Einstellung der cirkadianen Uhr wichtig ist, und zeigen ferner eine neue phosphorylierungsabhängige Regulation der CREB-Aktivität [9]. Der PACAP-Typ-I- Rezeptor (PAC1) entfaltet seine Wirkung über Beeinflussung der PKA, der PKC und des MAPKinase-Pathways. PAC1 wird vorwiegend im zentralen Nervensystem exprimiert und ist an einer Reihe von physiologischen Abläufen beteiligt, z.B. Neurotransmitter/Neurotrophin-Wirkung, neuronale Differenzierung, und synaptische Plastizität [10]. PACAP-abhängige Genexpression spielt aber auch eine Rolle in der frühen Entwicklung [11]. Mäuse mit einer Keimbahn-Mutation oder einer Vorderhirn-spezifischen Mutation zeigen spezifische Defizite im Hippocampus-abhängigen assoziativen Lernen [12,13] und im emotionalen Verhalten [14]. Da die Expression von PAC1 fast ausschließlich auf die ´mossy fibres´ begrenzt ist, liegt es nahe, daß präsynaptische PAC1-vermittelte Signalgabe an der Plastizität in dieser Synapse beteiligt ist. Durch Lernversuche konnte gezeigt werden, daß PAC1 eine wichtige Rolle in Hippocampus-abhängigen assoziativen, nicht aber in deklarativen Lernvorgängen hat. Es ist interessant, daß Drosophila-Mutanten im PACAP-verwandten Gen Amnesiac starke Defizite im assoziativen Lernen zeigen. Dies legt nahe, daß die starke evolutionäre Konservierung dieses Signalweges eine wichtige Rolle in einem phylogenetisch alten Lernparadigma, assoziativem Lernen, hat.

Analyse der Funktion des Glukokortikoidund Mineralokortikoid-Rezeptors A. Bauer, S. Berger, E. Greiner, F. Tronche, O. Kretz, H. Reichardt, B. Stride, W. Schmid, R. Arribas, L. Schwake, M. Kenzelmann, J. Tuckermann, M. Vujic Die Wirkung von Steroidhormonen wird über spezifische Rezeptoren, die die Transkription von Zielgenen aktivieren oder hemmen, vermittelt. Gluko- und Mineralokortikoide kontrollieren die Expression von überlappenden Genen durch zwei verwandte Rezeptoren, die beide Glukokorti-

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koide binden können [15]. In der Niere bindet nur der Mineralokortikoid-Rezeptor an Mineralokortikoide, da durch einen spezifischen enzymatischen Mechanismus Glukokortikoide inaktiviert werden. Im Gehirn und anderen Zielzellen können sowohl der Gluko- wie auch der Mineralokortikoid-Rezeptor zur Wirkung kommen. Mäuse ohne Glukokortikoid-Rezeptor sterben kurz nach der Geburt wegen schwerer Atelektase der Lunge [16]. Aktivierung glukoneogenetischer Enzyme und die Synthese von Epinephrin im Nebennierenmark ist aufgehoben [17] und die Proliferation von Vorläufern für rote Blutzellen ist beeinträchtigt [18]. Tiere ohne Mineralokortikoid-Rezeptor sterben wegen extremen Salzverlustes kurz nach der Geburt [19,20]. Wir vermuten, daß Mineralokortikoide die Stabilität bzw. Aktivität des Natriumkanals in einer bisher nicht bekannten Weise verändern. Daher werden wir versuchen, die Zielgene, die für diesen lethalen Defekt verantwortlich sind, zu definieren [21]. In MR-defizienten Mäusen ist die Neurogenese der granulären Zellen im Hippocampus beeinträchtigt [22]. Durch eine funktionsselektive Mutation im Rezeptor gelang es, Wirkungen über DNA-Bindung von solchen, die durch direkte Protein/Protein-Wechselwirkung zustande kommen, zu definieren. Mäuse mit dieser Mutation überleben und sind fertil. Mit diesen Mäusen gelang es, die Wirkungsweise des Glukokortikoid-Rezeptors in einer Vielzahl von Glukokortikoid-abhängigen Funktionen zu definieren [15,23-26]. DNA-bindende Aktivität ist notwendig für einige Funktionen des Glukokortikoid-Rezeptors im Hippocampus [27]. Der Dimerisierungs-defekte Rezeptor ist in der Lage, die Aktivierung von Zytokinen nach LPS-Behandlung in T-Zellen und Makrophagen zu blockieren [28]. Erhöhte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors durch erhöhte Kopienzahl nach Transgenese macht die Tiere resistent gegenüber endotoxischem Schock [29]. Verschiedene Aktivitäten des Rezeptors spielen auch eine Rolle in der Entwicklung der Brustdrüse [30]. Daher stellen diese Mäuse ein interessantes Modell für die Analyse von Substanzen mit immunosuppressiver und anti-inflammatorischer Wirkung dar. Sie werden von großem Nutzen bei der Suche von neuen pharmakologischen Substanzen sein, die mit der inflammatorischen Wirkung interferieren, aber nicht DNA-Bindungs-abhängige Vorgänge des Rezeptors beeinflussen. Da Mäuse mit der Rezeptor-Null-Mutation kurz nach der Geburt sterben, haben wir das Cre/loxP-System eingesetzt, um zellspezifische Mutationen zu entwickeln [31,32]. Mit diesem Ansatz wurden Mäuse entwickelt, die spezifische Glukokortikoid-Rezeptor-Mutanten in Thymozyten, Monozyten/Makrophagen, Leber und Haut haben. Mäuse ohne Glukokortikoid-Rezeptor im Gehirn zeigen eine beeinträchtigte Regulation über die HPA-Achse [16]. Leberspezifische Inaktivierung des Glukokortikoid-Rezeptors führt zu einer starken Wachstums-Beeinträchtigung. Dies deutet auf eine wichtige Funktion des GlukokortikoidRezeptors in der Kontrolle des Wachstums. Interessanterweise haben die GRdim-Mutanten normale Größe. Offensichtlich ist der monomere Rezeptor hinreichend für die

Abteilung A0200 Molekularbiologie der Zelle I Kontrolle des Wachstums. Zielgene in der Wachstumshormon-IGFI-Kaskade werden charakterisiert, um die Ursache für den Minderwuchs zu charakterisieren. Verlust des Rezeptors reduziert auch die Hyperglykämie, die in experimentell induziertem Diabetes beobachtet wird. Dies ist ein weiterer, sehr bedeutender Hinweis darauf, daß Glukokortikoid-abhängige Genexpression in der Leber eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Typ-II-Diabetes spielt [33]. YAC-transgene Mäuse, die zwei zusätzliche Kopien des Glukokortikoid-Rezeptorgens enthalten, sind resistenter gegenüber endotoxischem Schock [29]. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von U. Schibler, Universität Genf, konnte gezeigt werden, daß Glukokortikoide die cirkadiane Genexpression regulieren, indem sie die Phase der circadianen Genexpression im peripheren Gewebe verändern [34,35]. Mäuse mit selektiver Inaktivierung des Glukokortikoid-Rezeptors in Makrophagen und Granulozyten sind weniger resistent bei induzierter Sepsis [28]. Ein weiteres Mitglied der Kernrezeptorfamilie HNF4γ wurde in unserer Gruppe isoliert. Dieses Gen wird im Pancreas, in der Niere, im Darm und Hoden exprimiert [36]. Um die Funktion dieses Gens zu charakterisieren, bereiten wir eine gewebsspezifische Mutation mit Hilfe des Cre/loxP-Systems vor. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Rudolph, D., Tafuri*, A., Gass, P., Hämmerling, G. J., Arnold, B. and Schütz, G. (1998). Impaired fetal T-cell development and perinatal lethality in mice lacking the cAMP response element binding protein (CREB). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 44814486. [2] Herzig*, S., Fanxin*, L., Jhala*, U., Hedrick*, S., Quinn*, R., Bauer, A., Rudolph, D., Schütz, G., *Yoon, C., *Puigserver, P., *Spiegelman, B. and *Montminy, M. (2001). CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature 413, 179-183. [3] Wagner*, B. L., Bauer, A., Schütz, G. and Montminy*, M. (2000). Stimulus-specific interaction between activator-coactivator cognates revealed with a novel complex-specific anteriserum. J Biol Chem 275, 8263-8266. [4] Gass, P., Wolfer*, D. P., Balschun*, D., Rudolph, D., Frey*, U., Lipp*, H.-P. and Schütz, G. (1998). Deficits in memory tasks of mice with CREB mutations depend on gene dosage. Learning & Memory 5, 274-288. [5] Rammes*, G., Steckler*, T., Kresse*, A., Schütz, G., Zieglgänsberger*, W. and Lutz, B. (2000). Synaptic plasticity in the basolateral amygdala and fear conditioning in transgenic mice expressing dominant-negative cAMP response element binding protein (CREB) in forebrain. Eur. J. Neuroscience 12, 2534-2546. [6] Mantamadiotis, T., Torrecilla*, M., Ugedo*, L., Pineda*, J., Bleckmann, S., Gass, P., Kretz, O., Valverde*, O., Maldonado*, R. and Schütz, G. (2002). Dissociation between morphine physical dependence and motivational responses in CREB deficient mice. (submitted). [7] Bleckmann, S., Blendy, J. A., Rudolph, D., Monaghan, A. P., Schmid, W. and Schütz, G. (2002). ATF-1 and CREB are important for cell survival during early mouse development. Mol. Cell. Biol. 22, 1919-1925. [8] Mantamadiotis, T., Lemberger, T., Bleckmann, S., Kern, H., Kretz, O., Villalba-Martin, A., Tronche, F., Kellendonk, C., Gau, D., Kapfhammer*, J., Otto, C., Schmid, W. and Schütz, G. (2002). Disruption of CREB function in brain leads to neurodegeneration. Nat. Genet. (in press)

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Abteilung A0200 Molekularbiologie der Zelle I

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Abteilung A0300 Molekularbiologie der Zelle II

Abteilung Molekularbiologie der Zelle II (A0300) Abteilungsleiterin: Prof. Dr. rer.nat. Ingrid Grummt

Genregulation durch Wachstumsfaktoren

Arbeitsgruppenleiterin PD Dr. Renate Voit

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I. Grummt

Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Sebastian Iben Dr. Raffaela Santoro (EU) Theologos Michaelidis (DFG, - 09/00) Dr. Jochen Bodem (DFG, - 08/01) Sonja Ghidelli (12/00-08/01) Gastwissenschaftler Dr. Yonggang Zhou (China 09/00 -) Doktoranden Sonia Ciarmatori (DFG, - 10/00) Attila Nemeth (DFG, - 03/01) Yuan Xuejun (04/99 -) Jian Zhao (10/00 -) Corina Popovici (DFG, 09/01 -) Alex Epanchinsev (DFG, 10/01 -) Technische Assistenten Bettina Dörr Urs Hoffmann-Rohrer Nadine Wagner Petra Elbert (- 08/01) Die Abteilung “Molekularbiologie der Zelle II” untersucht die molekularen Mechanismen, die Zellwachstum und Genregulation koordinieren. Der Schwerpunkt der Forschungsarbeiten liegt daher in der Aufklärung der komplexen Vorgänge, über die äußere Signale in den Zellkern gelangen und dort Genaktivitäten stuern. Dies schließt die Identifizierung, Klonierung und funktionelle Charakterisierung der Proteine ein, die an Einzelschritten der Transkription beteiligt sind, sowie die Aufklärung der Signalübertragungswege und Kontrollmechanismen, die Genaktivitäten in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen bzw. während distinkter Phasen des Zellzyklus regulieren. Derartige Untersuchungen sind die Voraussetzung für das Verständnis der Prozesse, die kontrollierte Genexpression außer Kraft setzen und somit ursächlich für maligne Entartung und eine Vielzahl genetischer Krankheiten verantwortlich sind. (www.dkfz-heidelberg.de/polymeraseI/mainpage.htm)

Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die das Anund Abschalten einzelner Gene bzw. ganzer Genfamilien regulieren, steht seit Jahren im Zentrum molekularbiologisch orientierter Krebsforschung. Eine effektive Steuerung der Aktivität verschiedener Gene während zellulärer Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse setzt das Vorhandensein äußerst wirksamer Kontrollmechanismen voraus, die die Genexpression regulieren und somit die Synthese verschiedener zellulärer Proteine dem Bedarf der Zelle anpassen. Die vielfältigen Regulationsvorgänge werden durch extrazelluläre Signale eingeleitet und koordiniert. Bei vielzelligen Organismen spielen dabei durch Zell-Zell-Kontakte vermittelte Signale, aber auch extrazelluläre Faktoren eine wichtige Rolle. Fallen bestimmte Signalübertragungswege oder Steuerungszentralen aus, erleidet die Zelle meist irreversible Schäden, die entweder zum Zelltod oder aber zur Verwandlung in eine Krebszelle führen. Für die experimentelle Analyse der Transkriptionskontrolle bei der Regulation komplexer biologischer Vorgänge sind besonders solche Systeme interessant, bei denen Genaktivitäten in Abhängigkeit von der Vermehrungsrate der Zellen positiv oder negativ beeinflußt werden. Dies geschieht, indem die Aktivität bestimmter Proteine verändert wird, die für die Umschreibung der in den Genen verschlüsselten Information erforderlich sind. Auf diese Weise wird eine Feinregulation der Transkription definierter Gene erreicht, die es der Zelle ermöglicht, auf eine Vielzahl von Umwelteinflüssen rasch und wirksam zu reagieren. Ein geeignetes Untersuchungsobjekt für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Genaktivität und Zellwachstum miteinander koppeln, stellen die Gene dar, die für ribosomale RNA kodieren. Diese Gene werden von RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert und stellen die aktivsten Transkriptionseinheiten der Zelle dar. Ihre Aktivität fluktuiert in Abhängigkeit von zellulärem Wachstum und Differenzierung. Der Schwerpunkt unserer Forschungsarbeiten liegt auf der Aufklärung der komplexen Vorgänge, über die äußere Signale in den Zellkern gelangen und dort Genaktivitäten steuern. Dies schließt zum einen die Identifizierung sowie funktionelle und strukturelle Charakterisierung der Proteine ein, die für Gen-Erkennung und Transkripition notwendig sind, zum anderen die Identifizierung und Charakterisierung der Signalübertragungswege, die für die Modulation von Genaktivitäten in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen verantwortlich sind.

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Regulation der rRNA Synthese durch den Wachstums-abhängigen Transkriptionsfaktor TIF-IA J. Bodem, W. Ross, G. Dobreva, S. Iben, U. Hoffmann-Rohrer In Zusammenarbeit mit M. Vingron (DKFZ, jetzt MPI Berlin)

Werden Zellen essentielle Nahrungsstoffe entzogen oder die Proteinsynthese gehemmt, wird die rRNA Synthese rasch und effizient reduziert. Diese Wachstums-abhängige Regulation der rRNA Synthese wird durch den basalen Transkriptionsfaktor TIF-IA vermittelt. Die Aktivität von TIF-IA korreliert mit dem physiologischen Zustand der Zelle, d.h. TIF-IA aus exponentiell wachsenden Zellen weist eine hohe Transkriptionsaktivität auf, während TIF-IA aus Wachstums-arretierten Zellen praktisch inaktiv ist. Die molekularen Mechanismen, die die Aktivität dieses mit RNA Polymerase I-assoziierten Transkriptionsfaktors modulieren und dem Zellwachstum anpassen, sind noch gänzlich unverstanden. Zur Aufklärung der Signaltransduktionswege, die die Aktivität von TIF-IA regulieren, haben wir die für TIF-IA kodierende cDNA von Mensch und Maus kloniert sowie in Transfektions- und in vitro Transkriptionsexperimenten funktionell charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigten, dass das rekombinante Protein zellulären TIF-IA zu substituieren vermag, d.h. die Transkriptionsaktivität von Extrakten aus Wachstums-arretierten Zellen stimuliert [1]. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass TIF-IA an mehreren Serin-Resten phosphoryliert ist [9]. Dies läßt vermuten, dass die Aktivität von TIF-IA durch spezifische, Wachstums-abhängige Phosphorylierungsprozesse reguliert und somit eine entscheidende Rolle im Prozess des Transfers extrazellulärer Signale in den Nukleolus spielt. Die Verfügbarkeit von rekombinantem TIF-IA und der entsprechenden Antikörper versetzt uns jetzt in die Lage, die Signaltransduktionswege zu analysieren, die die Aktivität von TIF-IA modulieren und somit die biosynthetische Kapazität der Zellen steuern.

Regulation der rRNA Synthese durch Zellzyklus-abhängige Phosphorylierung basaler Transkriptionsfaktoren R. Voit Die Transkription ribosomaler Gene fluktuiert während distinkter Phasen des Zellzyklus. Sie ist am höchsten in der S- und G2-Phase, dem Zeitpunkt innerhalb des Zellzyklus, der eine hohe Neusynthese von Ribosomen zur Aufrechterhaltung der Proteinbiosyntheserate in der nachfolgenden Zellgeneration erfordert. Hingegen ist die Pol I Transkription während der Mitose völlig abgeschaltet. Die molekularen Mechanismen, die der Kontrolle der rRNA Synthese während Zellzyklus zugrunde liegen, waren weitgehend unbekannt. Wir haben ein zellfreies Transkriptionssystem etabliert, das die Zellzyklus-abhängige Oszillationen der rDNA Transkription in vitro reproduziert. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die nukleoläre Transkriptionsaktivität während der Mitose und in der frühen G1 Phase des Zellzyklus reprimiert ist, und dass rever-

Abteilung A0300 Molekularbiologie der Zelle II sible Phosphorylierung von essentiellen Transkriptionsfaktoren durch Cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) das Abschalten der rRNA-Synthese während der Mitose bewirkt. Wir konnten zeigen, dass die Kinase cdc2/cyclin B in vivo und in vitro die größte Untereinheit des TBP-TAFIKomplexes SL1, TAFI110, an Threonin-852 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung verhindert die Interaktion zwischen SL1 und UBF. Die Interaktion von UBF mit SL1 ist essentiell für den ersten Schritt der Transkription, dem Aufbau aktiver Präinitiationskomplexe. Für die Reaktivierung der rRNA-Synthese nach Austritt aus der Mitose genügt nicht nur die Entfernung der mitotischen Phosphorylierungen, sondern UBF muß an den Serinresten 484 und 388 phosphoryliert werden, um seine Funktion auszuüben. Wir konnten über tryptische Phosphopeptidkartierung zeigen, dass die Phosphorylierung an Serin-484 in vivo durch die G1-spezifische Kinase cdk4/cyclin D1 und die Phosphorylierung von UBF an Serin-388 durch S- und G2-spezifische Cdks vermittelt wird. Die Phosphorylierung an Serin-388 ist essentiell für die Assoziation von UBF mit RNA Polymerase I, ein essentieller Schritt bei der Ausbildung von Präinitiationskomplexen [2]. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl positiv als auch negativ wirkende Proteinkinasen die Aktivität essentieller Transkriptionsfaktoren modulieren und somit die rRNA-Synthese während distinkter Phasen des Zellzyklus regulieren.

Regulation der rRNA Synthese durch Acetylierung von Transkriptionsfaktoren R. Voit, V. Muth, S. Ghidelli Die funktionelle Analyse verschiedener Regionen des ribosomalen Gen-Promotors in Säugerzellen zeigte, dass die Promotorregion ca. 160 bp stromaufwärts vom Transkriptionsstart ein Sequenz-spezifisches DNA-Bindungsmotif (T0) für den Pol I Transkriptions-Terminationsfaktor TTF-I enthält. Bei der Analyse von Proteinen, die mit TTF-I assoziieren, konnten wir zeigen, dass TTF-I mit der Histon-Acetyltransferase PCAF interagiert [3]. Dieser Befund weist darauf hin, dass TTF-I für die gezielte Rekrutierung von Histon-Acetyltransferase Aktivität an den rDNA Promoter verantwortlich ist. Weiterführende Experimente haben gezeigt, dass in transkriptionell aktiven Zellen TAFI68, die zweitgrößte Untereinheit des Promotor-bindenden Transkriptionsfaktors TIF-IB/SL1, acetyliert ist. Die Acetylierung wird in vitro sowohl durch PCAF als auch GCN5 vermittelt. Acetylierung durch PCAF und GCN5 stimuliert die Bindung von TAFI68 an das Core-Element des rDNA Promotors und aktiviert die Pol I Transkription in vitro. Umgekehrt geht die Deacetylierung von TAFI68 mit einer Reduktion der rDNA Transkription einher. Die Deacetylierung von TAFI68 ist insensitiv gegenüber dem HDAC-Inhibitor Trichostatin A (TSA), wird jedoch durch NAD+ gehemmt. Wir konnten zeigen, dass Sir2, eine NAD+-abhängige Deacetylase, TAFI68 spezifisch deacetyliert und die rDNA Transkription hemmt. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dass Acetylierungs-/Deacetylierungsprozesse die Aktivität des basalen Pol I Transkriptionsapparates regulieren. Somit ist die reversible Acetylierung des TAFI/TBPKomplexes TIF-IB/SL1 ein wichtiger regulatorischer

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Schritt, der nicht nur die zelluläre rRNA Synthesekapazität sondern auch die Ribosomenbiosynthese und die metabolische Aktivität der Zelle kontrolliert.

Repression der rRNA Synthese durch Tumorsuppressoren der “Pocketprotein”Familie 32

R. Voit, S. Ciamatori In Zusammenarbeit mit R. White (University of Glasgow, UK)

Dem Tumorsuppressor-Gen pRb sowie dessen Verwandten p107 und p130 kommt eine Schlüsselfunktion bezüglich des korrekten Ablauf des Zellzyklus und der Regulation von Differenzierungsprozessen zu. Es besteht eine Korrelation zwischen der Inaktivierung von Tumorsuppressoren und dem Auftreten verschiedener menschlicher Tumorarten, was die Bedeutung dieser Proteine für die Kontrolle des Zellwachstums und maligner Entartung unterstreicht. pRb moduliert die Transkriptionsaktivität verschiedener Gene, insbesondere von solchen, die eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus spielen. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass pRb mit dem basalen Transkriptionsfaktor UBF interagiert, dessen Bindung an den rDNA Promoter blockiert und somit die rRNA Synthese hemmt (Voit et al., 1997, Mol. Cell. Biol. 17, 4230-4237). In homozygoten knock-out Zellen (Rb-/-) wird jedoch kein signifikanter Abfall der rRNA Syntheseleistung beobachtet. Dies legt den Schluss nahe, dass die verwandten “Pocket”-Proteine p107 und p130 die Funktion von pRb übernehmen können. Wir haben daher den Einfluß von p107 und p130 auf die rDNA Transkription analysiert. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dass neben pRb auch p130, nicht jedoch p107, die rDNA Transkription reprimiert. p130 inaktiviert - ähnlich wie pRb - die rDNA Transkription über eine direkte Interaktion mit UBF [6]. Dies zeigt, dass die einzelnen Mitglieder der “Pocketprotein” Genfamilie einander funktionell zu komplementieren vermögen, obwohl sie distinkte zelluläre Funktionen während des Zellzyklus oder zellulärer Differenzierungsprozesse ausüben. Diese Untersuchungen geben nicht nur Aufschlüsse über Zellzyklus-abhängige Regulationskaskaden, die die rRNA-Syntheseaktivität der Zelle steuern, sondern darüber hinausgehende neue Erkenntnisse zur Wirkungsweise von pRb und p130 bei der Kontrolle des Zellzyklus.

Transkriptionsaktivierung an ChromatinMatrizen A. Nemeth, R. Strohner, U. Hoffmann-Rohrer In Zusammenarbeit mit G. Längst (LMU München)

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Transkriptions-Terminationsfaktor TTF-I neben seiner Funktion bei der Termination der Transkription eine entscheidende Rolle bei der Transkriptions-Aktivierung an nukleosomal organisierten DNA-Matrizen spielt (Längst et al., 1997, 1998). Bindung von TTF-I an seine Zielsequenz, den “upstream terminator” verschiebt in einem ATP-abhängigen Prozeß die Nukleosomen am Promoter und führt zur Akti-

Abteilung A0300 Molekularbiologie der Zelle II vierung der Transkription. Auf der Suche nach Proteinen, die durch Interaktion mit TTF-I die Struktur des Chromatins am rDNA Promoter verändern, haben wir mittels eines genetischen ‘screens’ in Hefezellen ein unbekanntes Gen, TIP5 (TTF interacting protein #5), identifiziert. TIP5 kodiert für ein > 200 kDa Protein, das mit der ATPase SNF2h assoziiert ist und die Mobilität von rekonstitierten Nukleosomen zu verändern vermag [8]. Immunfluoreszenz-Experimente haben gezeigt, dass der TIP5/SNF2h Komplex, genannt NoRC (nucleolar remodeling complex), präferenziell im Nukleolus lokalisiert ist. Dieser Befund weist darauf hin, dass die bevorzugte oder gar ausschließliche Funktion von NoRC darin besteht, die Positionierung von Nukleosomen am rDNA Promoter zu steuern bzw. durch Interaktion mit Histon-modifizierenden Enzymen die Chromatinstruktur und somit die Aktivität ribosomaler Gene zu regulieren.

Epigenetische Kontrollmechanismen der rDNA Transkription R. Santoro, Y. Zhou Veränderungen bzw. Fehler im Methylierungsmuster bestimmter Gene sind maßgeblich an der Entstehung von Krebs und anderen Krankheiten beteiligt. In unserer Gruppe wurden die den Genen übergeordneten, d.h. epigenetischen, Regulationsmechanismen aufgeklärt, die das Anund Ausschalten der Aktivität ribosomaler Gene bewirken. Es wurde gezeigt, dass die Methylierung von einem CpG Rest im ‘upstream control element’ (UCE) des rDNA Promoters die Erbsubstanz dichter packt, so dass der Transkriptionsapparat die Gene nicht mehr ablesen kann. Der reprimierende Effekt der DNA-Methylierung wird ausschließlich bei Transkription an Chromatin-Matrizen beobachtet, nicht aber an nackter DNA. Dies läßt die Schlußfolgerung zu, dass Methylierung direkt oder indirekt die Chromatinstruktur am rDNA Promotor beeinflußt. Tatsächlich haben wir durch Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente (ChIP assays) und RT-PCR nachgewiesen, dass inaktive ribosomale Gene methyliert sind und andere Histonmodifikationen aufweisen als aktiv transkribierte GenKopien. Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen. In metabolisch aktiven Zellen ist etwa die Hälfte der ribosomalen Gene transkriptionell inaktiv. Diese inaktiven Gene sind an CpG Resten methyliert und liegen in heterochromatischer Konfiguration vor, d.h. die assoziierten Histone sind nicht acetyliert, jedoch an Lysin 9 von Histone 3 methyliert. Aktive Genkopien sind hingegen nicht methyliert, liegen in offener, euchromatischer Struktur vor und die Nukleosomen sind im N-terminalen Bereich der Histone acetyliert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Chromatinremodellierung, DNA-Methylierung und Histon-Modifikation eng vernetzte Prozesse sind, die sowohl für die Etablierung als auch die Aufrechterhaltung des konstanten Verhältnisses von aktiven und inaktiven Genen verantwortlich sind.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Abteilung A0300 Molekularbiologie der Zelle II

Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Bodem, J., Dobreva, G., Hoffmann-Rohrer, U., Iben, S., Zentgraf, H., Delius, H., Vingron, M. and Grummt, I.: TIF-IA, the factor mediating growth-dependent control of ribosomal RNA synthesis, is the mammalian homolog of yeast Rrn3p. EMBO Reports (2000) 1, 171-175. [2] Jansa, P., Burek, C., Sander, E.E., and Grummt, I.: The transcript release factor PTRF augments ribosomal gene transcription by facilitating reinitiation of RNA polymerase I. Nucleic Acids Res. (2001) 29, 423-429. [3] Voit, R. ,and Grummt, I.: Phosphorylation of UBF at serine 388 is required for interaction with RNA polymerase I and activation of rDNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 24, 1363113636. [4] Muth, V., Nadaud, S., Grummt, I., and Voit, R.: Acetylation of TAFI68, a subunit of TIF-IB/SL1, augments DNA binding and activates RNA polymerase I transcription. EMBO J. (2001) 20, 1353-1362. [5] Santoro, R. and Grummt, I.: Molecular mechanisms mediating methylation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Molec. Cell (2001) 8, 719-725. [6] Ciarmatori, S., Scott*, P.H., Sutcliffe*, J.E., McLees*, A., Alzuherri*, H.M., Dannen*, J.-H., te Riele*, H., Grummt, I., Voit, R., and White*, R.J.: Overlapping functions of the pRb family in the regulation of rRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. (2001) 21, 58065814. [7] Seither, P., Iben, S., Thiry, M.,* and Grummt, I.: PAF67, a novel protein that is associated with the initiation-competent form of RNA polymerase I. Biol. Chem. (2001) 382,1163-1170. [8] Strohner, R., Nemeth, A., Jansa, P., Hoffman-Rohrer, U., Santoro, R., *Längst, G. and Grummt, I.: NoRC - a novel member of mammalian ISWI-containing chromatin remodeling machines. EMBO J. (2001) 20, 4892-4900. [9] Schlosser, A., Bodem, J., Bossemeyer, D., Grummt, I., and Lehmann, W.D.: Identification of protein phosphorylation sites by combination of elastase digestion, immobilized metal affinity chromatography, and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Proteomics (2002), in press. [10] Dagher*, J.H., Scheer*, U., Voit, R., Grummt, I., Lonzetti*, L., Raymond*, Y. and Senécal*, J.-L.: Autoantibodies to NOR90/ hUBF: Long-term clinical and serological followup from childhood to adulthood in a patient with limited systemic sclerosis suggests an antigen-driven immune response. J. Rheumatology, in press. [11] Iben, S., Bier*, M., Tschochner*, H., Hoogstraten*, D., Hozak*, P., Egly*, J.-M. and Grummt, I.: TFIIH plays a role in RNA polymerase I transcription. Cell (2002)109,297-306 [12] Michaelidis, T.M. and Grummt, I.: Inhibition of RNA polymerase I transcription by DNA-dependent protein kinase: Phosphorylated Ku protein binds to the rDNA promoter and prevents initiation complex formation.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik

Abteilung Entwicklungsgenetik (A0400) Leiter: Prof. Dr. Bernard Mechler

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Wissenschaftliche Mitarbeiter: PD Dr. Dirk-Henner Lankenau (04/00 - 03/01) Dr. Mingfa Li (-12/01) Dr. Joachim Marhold (08/01 - ) PD Dr. Heide Schenkel (- 07/01 - 12 h/Mo) Dr. István Török

1. Untersuchungen über Tumorsuppressorgene bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster

Gastwissenschaftler: Dr. Joël Anne (Paris, Frankreich (11/00 - ) Dr. Robert Farkas (Bratislava, Slowakei 02/00, 03/00, 06/ 00, 08/00, 11/00, 03/01, 07/01, 09/01, 11/01)) Dr. Mathias Gorjanacz (Szeged, Ungarn 01+11/00, 06-09/01) Dr. István Kiss (Szeged, Ungarn 01/01, 07/01) Dr. Susanne Lankenau (04-09/01) Dr. Arati Mishra (Indore, Indien 06/99-05/00) Prof. Ivan Raska (Prag, Tschechische Republik 09/01) Dr. Jagat Roy (Varanasi, Indien 05/00-06/00) Dr. Pradip Sinha (Indore, Indien 04/00) Peter Danis (Bratislava, Slowakei 04/01) Lucia Medved’ova (Bratislava, Slowakei 03/01) Satish Sasikumar (Varanasi, Indien 06/01-10/01)

In Zusammenarbeit mit: I. Kiss, M. Gorjanacz und G. Adam. Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn; I. Raska, Czech Academy of Sciences, Prag, Tschechische Republik; R. Farkas, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slowakei; P. Sinha und A. Mishra, School of Life Sciences, Indore, Indien; J. Roy, University of Varanasi, Banares, Indien

Doktoranden Joachim Marhold (01/00-07/01) Fani Papagiannouli (01/00-12/01) Jingyang Wu (04/00 - ) Diplomanden Muhammad Kashif (05/01 - 12/01) Techniker Dorothee Albrecht (1/2) Hartmut Kalisch (01/00 - ) Heinrich Kocher ( - 07/00) Katja Kühle (11/01 - ) Sylvia Oksas (07/00 - 08/01) Gabriele Robinson Rolf Schmitt Sekretariat

Karin Helm

Die meisten menschlichen Gene (ca. 80 %) besitzen genetische Gegenstücke in Drosophila melanogaster. Obwohl das Genom der Fruchtfliege nur aus 15 bis 20.000 Genen - verglichen mit den ca. 100.000 Genen bei höheren Vertebraten besteht - weiß man, daß viele dieser Gene beim Menschen Duplikationen ihrer Insektenäquivalente sind oder Mitglieder von Multigenfamilien. Da die wesentlichen zellulären Prozesse und „multistep pathways“ im Verlauf der Evolution konserviert wurden, kann man davon ausgehen, daß das Studium von Drosophila unzweifelhaft zum Verständnis der Reaktionsmechanismen der homologen menschlichen Gene beitragen wird. Die Bedeutung von Mutationsereignissen bei der Entstehung von Tumoren konnte bei Drosophila eindeutig nachgewiesen werden. Für eine Reihe von Genen konnte gezeigt werden, daß durch Mutationen maligne Tumoren in bestimmten Geweben im Verlauf der Entwicklung entstehen. Diese Tumore weisen alle charakteristischen Eigenschaften von Krebs des Menschen auf. Die Abteilung für Entwicklungsgenetik untersucht seit einigen Jahren Gene bei Drosophila, die an der Entstehung und Suppression von Krebs beteiligt sind. Hauptziel dabei ist, die Funktion dieser Gene aufzuklären und genetische Interaktionen zu identifizieren. Außerdem wird die Funktion von besonders interessanten Drosophila-Genen sowie jeder Reparatur-Mechanismus von DNA-Doppelstrangbrüchen in Keimbahnzellen von Drosophila untersucht.

B.M. Mechler, M. Li, H. Schenkel, I. Török

Tumoren bei Drosophila können in zwei große Kategorien unterteilt werden: neoplastische und hyperplastische. Der Unterschied zwischen beiden Kategorien wird insbesondere deutlich am Beispiel der Imaginalscheiben. Neoplastisches Wachstum wird durch massive Zellproliferation und durch Zerstörung der mono-layer Struktur des Epithels der Imaginalscheiben charakterisiert. Im Gegensatz dazu: hyperplastische Imaginalscheiben, ungeachtet dessen, daß sie ein Mehrfaches ihrer Normalgröße erreichen, behalten ihre monolayer Struktur des Epithels mit Zellen, die ein säulenförmiges Muster und eine normale apiko-basale Polarität aufweisen. Mutationen der lethal(2)giant larvae [l(2)gl], discs large [dlg] und scribble [scrib] Gene, rufen neoplastisches Wachstum hervor. Allen drei Genen ist gemeinsam, daß sie für Proteine kodieren, die an der Organisation des Zytoskeletts und/oder der Membran-Junctions beteiligt sind [1, 2]. Neoplastisches Wachstum beobachtet man auch bei Mutationen, welche die hämatopoetischen Organe betreffen. Hierauf weist das autonome Wachstum von transplantierten Zellen hin. Die Aufklärung der Funktion von Genen, welche die Proliferation der hämatopoetischen Zellen kontrollieren, läßt auf einen, im Vergleich mit Epithelzellen, anderen Mechanismus schließen. Wir konnten zeigten, daß der massive „overgrowth“ der hämathopoetischen Organe durch die down-Regulation von ribosomalen oder Ribosomen assoziierten Proteinen, einschließlich RpS6, RpS21 und P40, verursacht wird genauso wie durch die down-Regulation des spliceosome core Proteins SmD3 [3].

1.1. Zytoskeletale Proteine und ihre Funktion bei scaffolding und Signal-Transduktion Zu den Genen, welche die Entstehung von Tumoren in Drosophila kontrollieren, gehören das lethal(2)giant larvae, das discs large und das scribble Gen. Unsere Analysen zeigten, daß ihre Produkte an der Struktur und Funktion der Zelloberfläche beteiligt sind, indem sie für die Rekrutierung, Lokalisation und Organisation weiterer Proteine an der Zellmembran verantwortlich sind [1, 2]. Durch die Stabilisierung der zytoskeletalen Matrix und der ZellJunctions, tragen diese Proteine sowohl zur Struktur als auch zur Erhaltung der Zellgestalt genauso bei wie zur Organisation der Proteine, welche in signal-pathways involviert sind. Obwohl es schwierig ist, die Funktion eines Proteins bei der Signaltransduktion nachzuweisen, waren wir

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung in der Lage zu zeigen, daß p127, das von dem l(2)gl Gen kodiert wird, an dem Mechanismus beteiligt ist, der die Histolyse der Speicheldrüsen während der Metamorphose kontrolliert [4]. Unsere kürzlich durchgeführten Mosaikanalysen mit scribble zeigten, daß auch scribble eine kritische Rolle für Signale spielt, die zwischen Zellen ausgetauscht werden. Die Inaktivierung von scribble in bestimmten Domänen der Imaginalscheiben führte zur Bildung neuer Organisationszentren in den dem scribble Klon benachbarten Geweben sowie zu Duplikationen der Anhänge.

1.1.1. Das lethal(2)giant larvae Gen Unter den bisher identifizierten Tumorsuppressorgenen von Drosophila partizipiert p127 an der Strukturierung und Funktion der zytoskeletalen Matrix, indem es andere Komponenten rekrutiert, lokalisiert und organisiert. Über die Stabilisierung der zytoskeletalen Matrix ist p127 beteiligt an der Strukturierung und Erhaltung der Form der Zellen, sowie an der Organisation von Proteinen, die eine Rolle in Signalpfaden spielen [1, 2]. Das lethal(2)giant larvae Gen war das erste Gen, das als Tumorsuppressorgen identifiziert und isoliert wurde. Mutationen in l(2)gl führen zu Formationen von Tumoren im Gehirn und Imaginalscheiben der Tiere. Das Gen kodiert für ein zytoskeletales Protein, das als p127 bezeichnet wird und in allen eukaryotischen Spezien von Hefe bis zum Menschen vorkommt. p127 besitzt drei Homomerisierungsdomänen, welche an der Formation von komplexen Strukturen beteiligt sind, die entweder im Zytoplasma als diffuse Aggregate vorliegen oder an der zytoskeletalen Matrix assoziiert sind. Unter den mit p127 interagierenden Partnerproteinen gelang uns die schwere Kette von Myosin II, eine p127 spezifische Kinase, welche aus der Assoziierung von p127 an Myosin II resultiert und das nucleosome protein-1 (NAP1) zu identifizieren. Das Erforschen der Interaktionen zwischen p127 und dessen Partnerproteinen könnte eine Möglichkeit sein, die Funktion von p127 an der Organisation von Zellform und Zellzyklus zu erklären. Die Organisation des Zytoskeletts wird kontrolliert über die Bindung von p127 an die rod-Domäne von Myosin II, des weiteren konnten wir zeigen, daß p127 ein negativer Regulator der kontraktiellen Aktivität von Myosin II ist [1, 2]. Die Interaktion von p127 an NAP1 könnte die Beteiligung von p127 am Zellzyklus erklären, da NAP1 wiederum mit dem Cyclin Bp34cdc2 Kinase-Komplex assoziiert ist, der den Eintritt in die Mitose einleitet [5]. NAP1 zeigt eine dynamische Verteilung während des Zellzyklus; es ist am Zytoskelett während der Interphase gebunden und assoziiert an den Kernspindeln im Laufe der Mitose. Wir fanden, daß die Casein Kinase 2 (oder CK2) an NAP1 binden und so NAP1 phosphorylieren kann. Die Interaktion zwischen p127, NAP1 und CK2 könnte an kritischen mitotischen Ereignissen beteiligt sein.

Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik

1.1.2. p127 und Myosin II regulieren die transkriptionelle Zugänglichkeit des Transkriptionsfaktors BR-C Z1 und der Histon-Deacetylasen SIN3 und RPD3 in den Speicheldrüsen von Drosophila melanogaster und kontrollieren hiermit deren Degeneration Die Degeneration der Speicheldrüsen wird zu Beginn der Metamorphose von Drosophila durch die Einleitung eines Programms herbeigeführt, welches durch das Steroidhormon Ecdyson gestartet wird. Hierbei spielt der heterodimere Kernrezeptor, bestehend aus dem Ecdyson-Rezeptor (EcR) und Ultra-Spiracle (USP) eine vermittelnde Rolle. Dieser EcR/USP-Komplex reguliert direkt die sogenannten frühen „response“ Gene, zu denen das Broad-Complex (BR-C) Gen gehört, welches für eine Familie von Zink-Finger-BTB Transkriptionsfaktoren kodiert. Die Isoform Z1 ist hierbei kritsch für die Degeneration der Speicheldrüsen. Der Verlust der l(2)gl-Genaktivität führt zu einem Arrest der Entwicklung der Tiere während der larvalen zur pupalen Metamorphose. Zu dieser Zeit ist das p127 Protein in den Speicheldrüsen von Wildtyplarven exprimiert. Die Speicheldrüsen werden ca. 12 - 13 h nach der Verpuppung der Larven komplett abgebaut. Im Gegensatz zu Wildtyplarven kann die Zugabe von 20-Hydroxy-Ecdyson zu Speicheldrüsen von l(2)gl-defizienten Larven keinerlei Histolyse der Speicheldrüsen bewirken. Die Histolyse wird durch das Freisetzen von sogenannten Speichel-Granularen bewirkt. In den l(2)gl-defizienten Larven werden diese Granulare nicht freigesetzt und es kann zu einer normalen Verpuppung inklusive der normalen Entstehung von „Puffs“ auf den Chromosomen kommen. Diese Daten belegen, daß das p127-Protein notwendig ist für die Apoptose der Speicheldrüsen. Um die Rolle von l(2)gl in diesem Gewebe näher zu bestimmen, wurden transgene Fliegen verwendet, die entweder zu wenig (~ 0,1) oder zu viel (3,0) p127-Protein herstellen können. Es konnte gezeigt werden, daß der Zeitpunkt der Histolyse der Speicheldrüsen abhängig ist von der Menge des vorhandenen p127-Proteins. Zu geringe Mengen an p127-Protein verzögern die Histolyse, zu hohe Mengen hingegen führen zu einer beschleunigten Histolyse, wobei weder die Entwicklung der Larven des dritten Stadiums, noch die vorpupale- bzw. pupale Entwicklung betroffen ist. Ein ähnlicher Effekt konnte auch bei der Expression von cell-death Genen beobachtet werden, was die Annahme erhärtet, daß das p127-Protein eine wichtige Rolle bei der Ecdyson-vermittelnden Apoptose der Speicheldrüsen von Drosophila spielt. Ebenfalls konnte beobachtet werden, daß der Zeitpunkt der Apoptose der in den Speicheldrüsen beeinflußt werden kann, ohne dabei die normale Entwicklung der Tiere zu verändern. Diese Daten führen möglicherweise zu einer neuen Sichtweise der Funktion des Apoptose-Signalpfades und deren Komponenten in den Speicheldrüsen [4]. Aufgrund der Tatsache, daß die Degeneration der Speicheldrüsen auch bei rbp-mutierten Tieren nicht stattfindet, wurde die Verteilung des BR-C Z1-Transkriptionsfaktors untersucht. Rbp ist eines der Gene, welches im Ecdysoninduzierbaren Broad Complex (BR-C) Lokus liegt und für

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

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die BR-C Z1 Isoform kodiert. In Speicheldrüsen von Wildtyplarven konnte BR-C Z1 assoziiert am Chromatin gefunden werden. In Speicheldrüsen von l(2)gl-defizienten Tieren hingegen, konnte BR-C Z1 an der Kernlamina und im Zytoplasma, nicht jedoch am Chromatin, nachgewiesen werden. Ähnliche Ergebnisse konnten ebenfalls gefunden werden, wenn zipper vor der Verpuppung ektopisch exprimiert wurde. Zipper kodiert für das nicht-muskuläre Myosin II, einem Partnerprotein von p127. Die Analyse des EcR/Usp-Heterodimers, welches die Transkription von BR-C kontrolliert, ergab, daß beide Komponenten mit dem Chromatin der Speicheldrüsen von l(2)gl-defizienten Tieren assoziiert vorliegen. Dieses Ergebnis zeigt, daß Ecdyson in den mutierten Tieren eine frühe „response“ in den Speicheldrüsen bewirken kann. Die beiden Histon-Deazetylasen SIN3 und RPD3, welche die Kondensation des Chromatins kontrollieren, konnten im Zytoplasma der Zellen von Speicheldrüsen der l(2)gldefizienten Tiere nachgewiesen werden. Zusammenfassend wurde gezeigt, daß die Kooperation zwischen p127 und Myosin II an der Assoziation von BR-C Z1 an das Chromatin beteiligt ist und somit die transkriptionelle Kaskade von Genen blockiert, welche die Degeneration der Speicheldrüsen bewirkten [zur Veröffentlichung eingereicht]. Weitergehende Analysen der Strukturveränderungen in den Speicheldrüsen ergaben, daß Komponenten des Zytoplasmas wie p127 und Myosin II ca. 6 - 8 h nach Verpuppung spezifisch in das Lumen der Drüsen sezerniert werden. Diese Sezernierung findet ca. 3 bis 4 h vor der Expression von „cell-death“-Genen statt, zu einer Zeit, in der die apikalen Domänen der Plasmamembranen teilweise aufgelöst vorliegen, was mit Hilfe von Elektronenmikroskopie gezeigt werden konnte [6]. Die Transkriptions- und Translationsmaschinerie bleibt zu diesem Zeitpunkt jedoch aktiv, was durch den Nachweis von Transkriptionen spezifischer RNAs während der späten Phase der Degeneration von Speicheldrüsen, sowie dem Nachweis der Synthese der Untereinheit D der vesikulären ATPase gezeigt werden konnte.

1.1.3. Das scribble Gen Wir haben zeitgleich mit einer anderen Gruppe das scribble Gen isoliert [7]. Das Scribble-Protein kolokalisiert mit dem Dlg-Tumorsuppressorprotein an spezifischen Domänen der Zellmembran. Mutationen in scribble führen zu Tumorbildung in den Gehirnhemisphären und einigen Imaginalscheiben mit veränderter Lokalisierung von p127 und Dlg. Genetische Mosaikstudien zeigten, daß der Verlust der scribble-Aktivität zu Wachstumsstörungen in Imaginalscheiben und dem follikulären Epithel der Eikammern führt, die Ähnlichkeiten zu den Mosaiken von dlg-defizienten Klonen haben. Wir konnten ebenso zeigen, daß die Letalität, die durch scribble-Verlust verursacht wird, durch Zufuhr von zusätzlichem Dlg-Protein verhindert werden kann. Das Dlg-Protein besitzt wie auch das Scribble-Protein, mehrere sogenannte PDZ-Domänen. Diese Ergebnisse zeigen, daß Scribble wie auch Dlg an einem Mechanismus beteiligt sind, welcher die Bildung und Erhaltung epithelialer Strukturen reguliert.

Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik Mutationen des scribble-Gens führen zur Bildung von Tumoren im Gehirn und einigen Imaginalscheiben, wie z.B. Thorax-, Flügel-, Haltere-, drittes Bein- und Genitalimaginalscheiben. Die anderen Imaginalscheiben entwickeln sich nicht. Das scribble-Gen erstreckt sich über einen Bereich von über 53 kb genomischer DNA und kodiert für zwei Klassen von Transkripten, welche in insgesamt drei Transkripten resultieren [7]. Die beiden größten Transkripte werden von 23 Exons gebildet, das kleinste Transkript wird aus 14 Exons gebildet, wobei die ersten 13 Exons identisch mit denen der beiden großen Transkripte sind. Das scribble Gen kodiert für zwei Proteine von je 1756 bzw. 1247 Aminosäuren Länge, mit multiplen leucinrich repeats (LRR) und PDZ-Domänen, welche an ProteinProtein Interaktionen, speziell in den zellulären junctions verantwortlich sind. Proteine, welche mehrfach LRR- und PDZ-Domänen besitzen, werden als sogenannte LAP-Proteine bezeichnet [8]. Das Auftreten dieser Domänen in den Scribble-Proteinen könnte eine Funktion als scaffoldingKomponente oder als Mediator in Signalketten implizieren. Es wurden genetische Mosaike erzeugt, um die Rolle von scribble während der Entwicklung der Fliege zu studieren. Die Analyse zeigt, daß scrib-defiziente Zellen, die während der larvalen Entwicklung induziert wurden, voll differenziertes kutikuläres Gewebe bilden können, welches in Abhängigkeit der Position, oftmals zu Duplikationen ganzer Organe führten. So führte z.B. die Erzeugung von scribbledefizienten Zellen im Äquator des Komplexauges zu einer spiegelbildlichen Duplikation des gesamten Auges. Unsere Daten zeigen, daß (a) scribble eine wichtige Rolle in bestimmten Signal-pathways spielt, (b) für bestimmte Gewebe notwendig ist und (c) daß der zygotische Verlust von scribble zu gewebsspezifischen Tumoren führt. Das Vorhandensein von multiplen PDZ-Domänen in beiden Proteinen und ihre gemeinsame Lokalisierung in den „septate junctions“ führte zu der Frage, ob Dlg-Protein Scribble-Protein ersetzen kann und umgekehrt. Daher exprimierten wir entweder FLAG-markiertes Dlg-Protein oder V5-markiertes Scribble 1-Protein in dlg oder scribdefizienten Tieren mit Hilfe des dualen UAS GAL4-Systems. Wir fanden heraus, daß das AUS::scrib+-Transgen, wenn es mit dem dpp::GAL4-Treiber exprimiert wurde, scrib-defiziente Tiere vollständig retten kann, nicht jedoch dlg-defiziente. Im Gegensatz hierzu kann das UAS-dlg+Transgen, welches mit dppGAL4 exprimiert wird, etwa die Hälfte aller scrib-defizienten Tiere retten. Die Rettung konnte ebenfalls durch den Einsatz von T80-GAL4 erreicht werden, jedoch mit geringerer Effizienz (16 %). Obwohl die Expression von UAS-dlg+ mit Hilfe von 69B-GAL4 oder patched-GAL4 dlg-defiziente Tiere retten kann, was bereits beschrieben wurde, gelang uns keine Rettung dieser Tiere mit Hilfe von dpp-GAL4. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Dlg-Protein Scribble-Funktion übernehmen kann, jedoch besitzen Dlg und Scribble unterschiedliche spatiotemporale Expressionsmuster. Weitergehende Immunofluoreszenz-Studien zeigen, daß Scribble-1 und Scribble-2 Proteine weitaus spezifischere Expressionsmuster aufweisen, als das mehr ubiquitär exprimierte Dlg-Protein.

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1.1.4. Das SmD3 Gen Das Drosophila snRNP SmD3 Gen oder SmD3, ist in umgekehrter Transkriptionsrichtung im ersten Intron des Ornithine Decarboxylase Antizyme (AZ) Gens lokalisiert. Frühe Untersuchungen zeigten, daß der gutfeeling Phänotyp der gekennzeichnet ist durch embryonale Letalität und abnorme neuronale und muskuläre Zelldifferenzierung, in zwei Mutanten auftritt, die durch die Insertion eines P-Elements hervorgerufen wurden. Das oder die, durch die PElementinsertion betroffenen Gene, waren nicht bekannt. Wir konnten weiterhin zeigen, daß in einer Reihe von PElementmutationen die P-Elementinsertionen in der 5‘ nicht-translatierten Region (UTR) des SmD3 Gens oder seines Promotors lokalisiert sind und ausschließlich die Expression des SmD3 Gens betreffen. Unsere weiteren Analysen ergaben, daß der „gutfeeling“ Phänotyp, der mit den P-Elementinsertionen im 5‘UTR von SmD3 assoziiert ist, aus einer amorphen oder stark hypomorphen Mutation resultiert. Dagegen reduzieren P-Elemente, die im Promotorbereich des SmD3 Gens insertiert sind, die Expression von SmD3 und rufen larvale Letalität sowie Entartung der Imaginalscheiben, der Gehirnhemisphären und der hämatopoetischen Organe hervor. Diese Mutationen konnten vollständig durch ein SmD3+ Transgen gerettet werden. Die Komplementierung von Df(2R)gufLex47, einer Mutante, in welcher das SmD3 sowie das AZ-Gen deletiert sind, mit dem SmD3+ Transgen, machte den Phänotyp des inaktivierten AZ deutlich. Interessanteweise verursacht die Inaktivierung des AZ einen neuen Phänotyp, der durch späte larvale Letalität, Atrophie des Gehirns sowie der Imaginalscheiben, der hämatopoetischen Organe und der Speicheldrüsen [9] gekennzeichnet ist.

2. Homologe Rekombination D.-H. Lankenau, S. Lankenau, B.M. Mechler Die Etablierung der gene targeting-Methode für Drosophila könnte die Analyse von genetischen Interaktionen verbessern, insbesondere die Analyse von gering analysierten Mutationen von bestimmten Genen oder zur Einführung von Mutationen in bisher nicht mutierte Gene. Die Mutagenese des Drosophila Genoms durch Chemikalien bzw. PElementen ergab, daß etwa nur ein Drittel der putativen Protein-kodierenden Gene mutiert werden können. Im Falle der P-Elemente können sogar nur etwa ein Viertel der putativen Protein-kodierenden Gene mutiert werden. Es ist von größter Wichtigkeit, interessante Gene mutieren zu können, für die bisher noch keine Mutationen erhältlich sind. Daher untersuchten wir in der Keimbahn von Drosophila den Mechanismus von DNA Doppelstrangreparatur, welcher für die Etablierung der gene-targeting Methode bedeutend ist. Zusätzlich benutzten wir die von Rong und Golic (2000, Science 288:2013-2018) entwickelte Methode, um das NAP-1 Gen zu mutieren.

2.1. Der Mechanismus der DNA DoppelstrangReparatur in Keimbahnzellen von Dosophila Bei Metazoen ist die DNA-Reparatur in der Keimbahn präziser als in somatischen Zellen, da das Genom fehlerfrei von einer Generation zur anderen überführt werden muß

Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik (Lankenau and Gloor*, 1998, BioEssays 20:317-327; Gloor* and Lankenau 1998, Trends in Genet. 14:43-46.). Drosophila bietet hierbei einige Vorteile zur Erforschung von diesem Mechanismus: 1.) In der männlichen Keimbahn gibt es keine meiotische Rekombination, die mit der DNA Doppelstrang-Reparatur interferieren könnte, 2.) über 90 % aller DNA-Doppelstrangbrüche werden durch den sogenannten „Synthesis dependent strand annealing“ (SDSA)-Mechanismus repariert, 3.) die beiden Enden des Doppelstrangbruchs können unabhängig voneinander das gesamte Genom nach geeigneten Matrizen „absuchen“, welche zur Reparatur benötigt werden. Insbesondere letzteres könnte helfen, Fragen zu klären, inwieweit Struktur und Organisation des Genoms die „Suche“ dieser beiden Enden des Doppelstrangbruchs beeinflussen könnten. Das Su(Hw)-Chromatin-Insulator-Protein wurde zur Erforschung des Mechanismus der DNA-DoppelstrangbruchReparatur in der Keimbahn von Drosophila hinzugezogen. Um die Frequenz der Reparatur zu bestimmen, wurden Bitarget gene conversions der Gene „forked“ und „white“ in einem Su(Hw)-defizienten oder normalen background benutzt. Im Wildtyp konnte eine Reduktion der conversion im „forked“-Lokus relativ zum „white“-Lokus beobachtet werden. Dieser Unterschied konnte auch nicht durch die Einführung von ektopischer DNA-Matrize behoben werden, die von „gypsy-insulator-binding-sites“ flankiert wird. Die Ergebnisse zeigen, daß der DNA-DoppelstrangbruchReparaturmechanismus unabhängig ist von lokalen Effekten der Chromatin-Insulatoren. Weitergehende Analysen zeigten, daß die Frequenz der gene-conversion in einem Su(Hw)-defizient background am „forked“-Lokus zunahm, jedoch am „white“-Lokus abnahm, wenn bestimmte allelic-target-combinations getestet wurden. Im Gegensatz hierzu, konnte die Frequenz der gene-conversion an beiden Loci dreifach erhöht werden, wenn ektopische Matrizen in einem su(Hw)v/Su(Hw)fbackground verwendet wurden. Die Ergebnisse lassen vermuten, daß dem Reparaturmechanismus eine genomweite Suche nach Homologen DNA-Matrizen zu Grunde liegt, der stark beeinflußt wird durch die Entfernung von Insulatorproteinen von den Chromosomen. Basierend auf einem Modell der Insulatorfunktion und subnukleärer Chromatinarchitektur propagieren wir ein Modell, in dem die Homologiesuche stattfindet, wenn das Chromatin dekondensiert vorliegt. Durch die Dekondensation des Chromatins könnten die 3‘DNA-Enden eine höhere Bewegungsfreiheit zur Suche erhalten (Gloor* and Lankenau 1998, Trends in Genet. 14:43-46, [11]). In einer weiteren Arbeit wurde die DNA-Reparatur in somatischen Zellen untersucht. Man vermutet, daß in diesen Zellen die DNA-Enden am Doppelstrangbruch gebunden an poly(ADP-ribose) Polymerase (PARP) vorliegen. PARP ist zuständig für den Transfer von ADP-Ribose-Derivate von NAD+ zu Akzeptor-Proteinen und zu ADP-ribosyl Addukten, was in verzweigten Polymeren von Protein gekoppelten poly(ADP-ribose) (pADPr) resultiert. PARP-gebundene Polymere könnten als Ankerpunkte dienen, die spezifische Proteine zu dem DNA-Bruch rekrutieren könnten und somit die geschädigte DNA zur Reparatur vorbe-

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reiten. Daher erforschten wir den Effekt von Gamma-Bestrahlung während der Spermatogenese von Drosophila auf die katalytische Aktivität von PARP. Mit Hilfe von antipADPr Antikörpern gelang es nachzuweisen, daß in Gamma-bestrahlten Hoden die PARP Aktivität signifikant erhöht ist. Darüber hinaus fanden wir, daß die subnukleäre Lokalisierung von pADPr während der Spermatogenese variiert, wobei in prä- und postmeiotischen Zellen eine periphere Akkumulation im Zellkern beobachtet wird und in primären Spermatozyten eine Assoziation an den bivalenten Chromosomen festgestellt werden konnte [10].

[7] Li, M., Marhold, J., Gatos, A., Török, I., Mechler, B.M. (2001) Differential expression of two scribble isoforms during Drosophila embryogenesis. Mech. of Dev. 108:185-190.

2.2. Gen-targeting mit Hilfe homologer Rekombination in Drosophila

[10] Lankenau S., Bürkle A., and Lankenau D.-H. (1999). Detection of poly(ADP-ribose) synthesis in Drosophila testes upon gamma-irradiation. Chromosoma 108:44-51.

Wir benutzten die von Rong und Golic entwickelte Methode zur Mutagenese des NAP-1 Gens, welches sich in der chromosomalen Region 60C befindet. Das NAP-1 Protein ist ein potentiell mit dem p127 Tumorsuppressorprotein interagierendes Protein, das mit Komponenten des Zytoskeletts während der Interphase kolokalisiert und während der Mitose an den Kernspindeln assoziiert ist. Von sechs Rekombinationsereignissen, konnten drei Ereignisse als Null-Knockout des NAP-1-Gens identifiziert werden. Der Verlust der Genfunktion resultiert in einem semi-letalen Phänotyp. Es konnte kein NAP-1-Protein in Proteinextrakten von knock-out Fliegen nachgewiesen werden. In fast allen Fällen wurde die Nukleotid-Sequenz des Nap1-Donorkonstrukts, welches nahe dem Doppelstrangbruch liegen sollte, durch Wildtyp Nap1-Sequenz ausgetauscht. Dieses Ergebnis zeigt, daß das durch Exonukleaseaktivität veränderte Donorkonstrukt mit Hilfe der Wirts-DNA-Sequenz als Matrize repariert wurde. Die Analyse von „Recombination-tracts“ zeigte, daß der „break-inducedreplication“ Mechanismus mit hoher Wahrscheinlichkeit der Mechanismus für „ends-in gene targeting“ ist.

[8] Bilder, D.*, Birnbaum, D.*, Borg, J.-P., Bryant, P.*, Huigbretse, J.*, Jansen, E., Kennedy, M. B.*, Labouesse, M.*, Legouis, R.*, Mechler; B. M., Perrimon, N.*, Petit, M.*, and Sinha, P.* (2000) Collective nomenclature for LAP proteins. Nature Cell Biology 2:114. [9] Schenkel, H., Hanke, S., DeLorenzo, C., Schmitt, R., und Mechler, B. M. P-elements inserted in the vicinity of within the Drosophila snRNP SmD3 gene nested in the first intron of the Ornithine Decarboxylase Antizyme gene affect only the expression of SmD3. Genetics, in press.

[11] Lankenau D.H., Peluso M., and Lankenau S. (2000). The Su(Hw) chromatin insulator proteins alters double-strand breakpoint repair frequencies in the Drosophila germ line. Chromosoma 109:148-160.

Publikationen (* = externe Koautoren) [1] De Lorenzo, C., Mechler B. M., and Bryant P.J.* (1999) What is Drosophila telling us about cancer. Cancer and Metastasis Reviews. 18:295-311. [2] Mechler, B. M., Li, M., Papagiannouli, F., and Farkas, R. (2000) Exploring the l(2)gl tumour suppressor of Drosophila: A regulator of the cytoskeletal dynamic is involved in the control of cell proliferation and programmed cell death. In: New Frontiers in mechanistic Cancer research in Animal Models. Symposium Princess Takamatsu. Cancer Res. Fund. Vol. 30:38-44. [3] Török, T, Herrmann-Horle, D., Kiss, I.*, Tick, G.*, Speer, G., Schmitt, R., and Mechler, B. M. (1999). Down-regulation of RpS21, a putative translation initiation factor interacting with P40stubarista, produces viable Minute imagos and larval lethality with overgrown hematopoietic organs and imaginal discs. Mol. Cell. Biol., 19: 2308-2321. [4] Farkas, R., and Mechler, B. M. (2000) The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays and l(2)gl-dose response. Cell Death and Diff. 7:89-101. [5] Li, M., Strand, D., Krehan, A., Pyerin, W., Heid, H. W., Neumann, B., and Mechler B. M. (1999) Casein kinase II binds and phosphorylates the nucleosome assembly protein (NAP1) in Drosophila melanogaster. J. Mol. Biol. 293:1067-1084. [6] Farkas R., and Sutakova G.* (1999). Ultrastructural changes of Drosophila larval and prepupal salivary glands cultured in vitro with ecdysone. In vitro Cell. Dev. Biol. 34:813-824.

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Abteilung A0500 Molekulare Embryologie

Abteilung Molekulare Embryologie (A0500) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs

Mechanismen der Achsenentwicklung im Frosch

Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Mao Bingyu Dr. Gary Davidson (02/00 - ) Dr. Andrei Glinka Dr. Christop Hansis (10/01 - ) Dr. Olga Kazanskaya Dr. Ryu Maeda (03 - 06/01) Dr. Wei Wu (05/01 - )

In Zusammenarbeit mit: S.-L. Ang, A.P. Gomez, IGBMC Strasbourg, Frankreich; K. Cho, Univ. California, Irvine, USA; J.-C. Izpisua-Belmonte, W.-C. Jen, C. Kintner, Salk Inst., San Diego, USA; M. Muenke, Heiner Westphal, NIH, Bethesda, USA; E. Nigg, MPI München; T. Pieler, Uni Göttingen; A. Skerra, TU München; H. Delius, R. Eils, G. Schütz, M. Vingron, DKFZ.

Gastwissenschaftler Dr. Nicolas Pollet, Universität Paris, Frankreich ( - 01/01) Dr. Bao Sujin, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China ( - 05/01) Doktoranden Danila Baldessari (02/00 - ) Ralph Boettcher Ivan Del Barco Emil Karaulanov (05/00 - ) Clemens Kiecker ( - 10/01) Technische Assistenten Ursula Fenger Dana Hoppe Markus Klenk (02 - 08/01) Peter Stannek Carmen Walter Sekretariat Bianca Dornseiff ( - 06/01) Kerstin Garbe (07/01 - )

Eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie der Wirbeltiere befasst sich mit der Anlage der embryonalen Achsen, d. h. Kopf-Schwanz- (anterior-posterior) und RückenBauch- (dorsal-ventral) Achse. Für die Achsenentwicklung hat der sogenannte Spemann Organisator eine herausragende Bedeutung. Dieses Gewebe wurde 1926 von Spemann und Mangold durch Transplantationsexperimente entdeckt. Der transplantierte Organisator ist in der Lage in einem Embryo einen kompletten sekundären Embryo zu induzieren und somit die Achsenanlagen zu duplizieren. Die Tiere entwickeln sich dann ähnlich siamesischen Zwillingen [3]. Die Arbeitsgruppe analysiert die molekularen Grundlagen, die zu den vielfältigen Eigenschaften des Organisators führen. Der Spemann Organisator wird durch die antagonisierenden Effekte von Wnt und BMP Wachstumsfaktoren reguliert. Die Aufklärung dieser Signalwege ist daher für das Verständnis der molekularen Vorgänge im Spemann Organistaor aufschlußreich.

Whole-mount in situ Hybridisierungs Screening

Die Abteilung beschäftigt sich mit der Frage, wie das Schicksal embryonaler Zellen während der Frühentwicklung der Wirbeltiere reguliert wird. Dies wird am Frosch studiert, einem traditionellen Objekt der Embryologie, das erlaubt klassische Techniken wie Transplantationen und Explantationen mit modernen molekularbiologischen Techniken zu verknüpfen. Durch Mikroinjektion von einzelnen mRNAs in Embryonen wird die Funktion von Genen im Kontext des sich entwickelnden Organismus studiert. Hybridisierungstechniken ermöglichen die räumliche Detektion der Expression einzelner Gene in den verschiedenen Geweben des Wirbeltierkeims. Im Vordergrund steht die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Achsenentwicklung sowie der Zellinteraktionen, die eine Rolle im Spemann Organisator spielen. Mit molekularbiologischen Ansätzen werden in diesem Zusammenhang neue Entwicklungskontrollgene identifiziert und charakterisiert. Die in Embyronen gewonnenen Erkenntnisse sind bedeutsam für das Verständnis von Zellwachstum und Differenzierung in normalen und malignen Zellen.

R. Boettcher, N. Pollet, C. Niehrs In einem screening Projekt zur Identifizierung entwicklungsregulatorischer Gene mit Funktion im Mesoderm werden in der Abteilung in großem Maßstab cDNAs mit Hilfe von in situ Hybridisierung auf ihr Expressionsmuster hin untersucht. cDNAs, die ein interessantes Muster zeigen, werden in Zusammenarbeit mit Dr. Hajo Delius (DKFZ) ansequenziert und gegebenenfalls näher untersucht. In unserem Pilotscreen wurden wahllos cDNAs einer Neurula cDNA Bibliothek aus Xenopus Embyronen isoliert und das Expressionsmuster der entsprechenden Gene in verschiedenen Embryonalstadien untersucht. Es wurden ca. 10.000 cDNAs analysiert und 1.400 differentiell exprimierte Gene ansequenziert. Nach Abzug mehrfach identifizierter Gene resultierten 900 differentiell exprimierte Gene, von denen 388 Gene keine signifikante Sequenzhomologie zu bekannten Genen zeigen. Auf Grund der Erfahrungen mit einem vorangegangenen Pilotscreen wissen wir, daß ca. 300 dieser Gene potentielle Entwicklungskontrollgene darstellen, z. B. Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, Komponenten von Signalwegen, Transkriptionsfaktoren. Unter den identifizierten Klonen waren solche mit einer belegten regulatorischen Funktion in der Embryonalentwicklung.

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Im vorangegangenen Pilotscreen war die Beobachtung sogenannter Synexpressionsgruppen, d. h. Gruppen von Genen, die ein gemeinsames, komplexes Expressionsmuster aufweisen von besonderer Bedeutung. Interessanterweise sind diese Gene nicht nur durch ihre Expressionen sondern auch ihre potentielle Funktion verknüpft. So zeigen die vier Mitglieder der Delta-Gruppe alle das charakteristische Expressionsmuster von Delta-1, einem Liganden des Notch-Rezeptors. Die DNA Sequenzhomologien dieser Gene weist darauf hin, daß sie Komponenten des Delta-Notch-Signalwegs sind, und dies konnte für einen neuen HLH Transkriptionsfaktor gezeigt werden. Somit machen Synexpressionsgruppen wertvolle Voraussagen über die potentielle Funktion unbekannter Gene. Alle 900 Gene des gegenwärtigen Screens werden momentan einer Synexpressionsanalyse unterworfen [1, 10, 11, 15, 17, 18, 22].

ADMP und Regulation des Spemann Organisators R. Dosch, C. Niehrs Der Spemann Organisator kann in Kopf- und Rumpforganisator unterteilt werden und es ist unklar, wie diese Regionalisierung reguliert wird. Der Rumpforganisator in Xenopus exprimiert Anti-Dorsalizing Morphogenetic Protein (ADMP), ein potenter Organisatorantagonist. Wir konnten zeigen, daß ADMP die Kopfinduktion während der Gastrulation unterdrückt, indem es die Expression von BMP Antagonisten inhibiert. Dominant-negatives ADMP anteriorisiert Embryos und seine Ko-expression mit BMPAntagonisten induiziert die Ausbildung sekundärer Köpfe und die Expression von Kopfinduktoren. Anders als andere BMPs wird ADMP nicht durch dominant-negativen BMP Rezeptor I, Noggin, Cerberus und Chordin, wohl aber durch Follistatin gehemmt. ADMP weist damit deutlich unterschiedliche Eigenschaften zu anderen BMPs auf. Die Resultate zeigen, daß ADMP im Rumpforganisator fungiert, um dort die ektopische Kopfbildung zu hemmen [2, 4].

Dickkopf1 und der Wingless Signalweg im Spemann Organisator

Abteilung A0500 Molekulare Embryologie Wenn dkk1 zusammen mit BMP Inhibitoren überexprimiert wird, so führt dies zur Induktion von sekundären Köpfen, mit Augen und Vorhirnstrukturen. Im Gegensatz dazu führt die Injektion von inhibitorischen dickkopf Antikörpern zum Verlust von Köpfen in Kaulquappen. Das dkk1 Gen ist also hinreichend und notwendig für die Kopfinduktion durch den Spemann Organisator im Frosch. Wir konnten ferner zeigen, daß dkk1 als Wnt-Inhibitor wirkt. Genauere Analysen im Frosch belegen, daß dkk1 für die Ausbildung des anterioren Endomesoderms (prechordales Mesoderm) notwendig ist, welches seinerseits an der Induktion des anterioren Nervensystems zentral beteiligt ist [9, 13, 14, 21]. Heiner Westphal (NIH) hat in Zusammenarbeit mit uns das Maus dkk1 Gen durch homologe Rekombination inaktiviert. Diesen dkk1 Mausmutanten fehlt der anteriore Bereich des Kopfs bis zum Mittelhirn, während der Rumpf der Mäuse normal ist. Molekulare Markeranalysen zeigten, daß bereits während der Gastrulation das anteriore Endomesoderm nicht normal differenziert ist. Außer den Kopfdefekten zeigen die dkk1 Mausmutanten auch Mißbildungen der Extremitäten, die eine Rolle des dkk1 Gens im programmierten Zelltod (Apotose) belegen [5, 20]. Dkk1 Protein inhibiert den Wnt Signalweg, indem es als Antagonist für den Wnt Korezeptor Lipoprotein-related protein6 (LRP6) fungiert. LRP6 ist zusammen mit dem Wnt Rezeptor Frizzled an der Signalweiterleitung von Wnt Ligand beteiligt, vermutlich indem ein ternärer Komplex zwischen Wnt, LRP6 und Frizzled ausgebildet wird. LRP6 vermittelt lediglich einen von drei möglichen Signalwegen, die von Wnt Liganden ausgelöst werden können, nämlich den sog. β-catenin Weg. Dkk1 bindet mit hoher Affinität an LRP6 und verhindert dadurch spezifisch die Signaltransduktion durch β-catenin aber nicht durch die alternativen Wnt Kaskaden [16]. Dkk1 ist Mitglied einer unbekannten Multigenfamilie und beim Mensch kommen neben dem Xenopus Homologen dickkopf1 drei weitere dickkopf Gene vor. Die Funktion von dkk2 wurde mittels Mikroinjektion in Xenopusembryonen untersucht. Dkk2 aktiviert im Gegensatz zu dkk1 den Wnt/ β-catenin Weg, und zwar synergistisch zusammen mit koexprimierten Frizzled Rezeptoren. Andererseits ist dkk1 in

B. Mao, I. del Barco, A. Glinka, O. Kazanskaya, C. Kiecker, W. Wu, C. Niehrs Der Spemann’sche Kopforganisator wird von Mitgliedern der Wnt und BMP Wachstumsfaktorfamilie antagonisiert. Dies sind Wachstumshormone, die in zahlreichen Prozessen in der Embryonalentwicklung Zellwachstum und Differenzierung regulieren. Wir haben ein 2-Inhibitor Modell vorgeschlagen, nach dem das wirksame Prinzip des Spemann’schen Kopfinduktors die gleichzeitige Inhibition von BMP und Wnt Signalen ist [8]. In einem molekularen Screen für neue Kopfinduktoren haben wir das dickkopf (dkk1) Gen identifiziert, dessen Überexpression zu Kaulquappen mit vergrößerten Köpfen führt. Das Gen kodiert für ein sekretiertes Protein von ca. 30 kDa, das spezifisch im Kopforganisator exprimiert ist.

Abb.1: Dickkopf1 Mausmutanten fehlt der Kopf Wildtyp (links) und dkk1-mutante Mausembryonen (rechts) am Tag 17 p.c.. In dkk1-/- Mäusen fehlen Kopfstrukturen bis zum Mittelhirn [20].

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung der Lage die Aktivität von dkk2 zu hemmen. Somit können dkk1 und dkk2 als gegenseitige Antagonisten wirken und den Wnt/β-catenin Weg regulieren. Dkk3 ruft im Gegensatz zu dkk1 und dkk2 nach Überexpression in Xenopus keine messbaren Effekte hervor und seine Beteiligung am Wnt/β-catenin Weg ist noch unklar [12].

Ein Aktivitätsgradient von Wnt/β β-catenin Signalen reguliert die antero-posteriore Musterbildung des frühen embryonalen Nervensystems C. Kiecker, C. Niehrs Die anteroposteriore (AP) Musterbildung der Neuralplatte von Wirbeltieren beginnt während der Gastrulation und wird durch den Spemann Organisator und seine Derivate reguliert. Das klassische Nieuwkoop Modell für AP-Musterbildung sagt in diesem Zusammenhang die Existenz eines nach kaudal zunehmenden Morphogens voraus, das anterior spezifizierte neurale Zellen in posteriore umwandelt. Jedoch ist die molekulare Identität dieses transformierenden Morphogens noch ungeklärt. Unsere Untersuchungen zeigen, daß ein Aktivitätsgradient der Wnt/β-catenin Signalkaskade Kandidat für ein solches Morphogen ist. Wnt3a Protein ist in der Lage dosisabhängig mindestens drei verschiedene Hirnregionen zu spezifizieren. Wnts vermitteln den posteriorisierenden Einfluß auf ektodermale Zellen über eine längere Reichweite und zwar direkt, ohne daß eine Kaskade sekundärer sezernierter Faktoren notwendig zu sein scheint. Ergebnisse mit Wnt Inhibitoren zeigen, daß die Wnt/β-catenin Signalkaskade auch notwendig für die AP-Musterbildung der Neuralplatte ist. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen ist mit Antikörpern ein Gradient von aktivem β-catenin in der Neuralplatte nachweisbar, mit höchster Aktivierung in der posterioren Neuralplatte und geringer Aktivierung in der anterioren Neuralplatte. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich ein Model, in dem ein Aktivitätsgradient von Wnt/βcatenin Signalen die AP-Musterbildung der Neuralplatte reguliert [19]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Pollet, N., *Schmidt, H.A., Gawantka, V., Vingron, M. and Niehrs, C. (2000): Axeldb: A Xenopus laevis database focussing on gene expression. Nucleic Acids Res. 28, 139-140. [2] Dosch, R. and Niehrs, C. (2000): Requirement of anti-dorsalizing morphogenetic protein in organizer patterning. Mech. Dev. 90, 195-203. [3] Niehrs, C. (2000): Amphibian organizer activity. In: Developmental Biology Protocols, Vol III (eds. R. S. Tuan and C. W. Lo), Humana Press, Totowa. pp. 179-183. [4] Niehrs, C., Dosch, R. and Onichtchouk, D. (2000): Embryonic patterning of Xenopus mesoderm by BMP-4. Proceedings of the E. Schering Research Foundation (eds. C. Nüsslein-Volhard and J. Kräztschmer) 29, 165-190.

Abteilung A0500 Molekulare Embryologie [6] Otto, C., Schütz, G., Niehrs, C. and Glinka, A. (2000): Dissecting GHRH- and PACAP-mediated signalling in Xenopus. Mech. Dev. 94, 111-116. [7] Kiecker, C., *Müller, F., Wu, W., Glinka, A., *Strähle, U. and Niehrs, C. (2000): Phenotypic effects in Xenopus and zebrafish suggest that one-eyed-pinhed functions as antagonist of BMP signalling. Mech. Dev. 94, 37-46. [8] de Souza, F. and Niehrs, C. (2000): Anterior endoderm and head induction in early vertebrate embryos. Cell Tissue Res. 300, 207-217. [9] Kazanskaya, O., Glinka, A. and Niehrs, C. (2000): The role of Xenopus dickkopf1 in prechordal plate specification and neural patterning. Development 127, 4981-4992. [10] Pollet, N., Gawantka, V., Delius, H. and Niehrs, C. (2000): Large scale gene expression screening identifies molecular pathways and predicts gene function. In Genomics and Proteomics. S. Suhai, eds. (New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers), pp. 27-36. [11] Pollet, N., *Schmidt, H. A., Gawantka, V., Niehrs, C. and Vingron, M. (2000): In silico analysis of gene expression patterns during early development of Xenopus laevis. Pac Symp Biocomput 443-454. [12] Wu, W., Glinka, A., Delius, H. and Niehrs, C. (2000): Mutual antagonism between dickkopf1 and dickkopf2 regulates Wnt/bcatenin signalling. Curr. Biol. 10, 1611-1614. [13] Kiecker, C. and Niehrs, C. (2001): The role of prechordal mesendoderm in neural patterning. Curr Opin Neurobiol 11, 2733. [14] Niehrs, C. (2001): MEDAL REVIEW: The Spemann organizer and embryonic head induction. EMBO J 20, 631-637. [15] *Chen, Y., Pollet, N., Niehrs, C. and *Pieler, T. (2001): Increased XRALDH2 activity has a posteriorizing effect on the central nervous system of Xenopus embryos. Mech. Dev. 101, 91103. [16] Mao, B., Wu, W., Li, Y., Hoppe, D., Stannek, P., Glinka, A. and Niehrs, C. (2001): LDL receptor related protein 6 is a receptor for Dickkopf proteins. Nature 411, 321-325. [17] *Lamar, E., *Deblandre, G., *Wettstein, D., Gawantka, V., Pollet, N., Niehrs, C. and *Kintner, C. (2001): Nrarp is a novel intracellular component of the Notch signaling pathway. Genes Dev 15, 1885-99. [18] Pollet, N. and Niehrs, C. (2001): Expression profiling by systematic high-throughput in situ hybridization to whole-mount embryos. Methods Mol Biol 175, 309-21. [19] Kiecker, C. and Niehrs, C. (2001): A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signaling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. Development 128, 4189-4201. [20] *Mukhopadhyay, M., *Shtrom, S., *Rodriguez-Esteban, C., *Chen, L., *Tsuku, T., *Gomer, L., *Dorward, D. W., Glinka, A., *Grinberg, A., *Huang, S.-P., Niehrs, C., *Izpisúa Belmonte, J.-C. and *Westphal, H. (2001): Dickkopf1 is required for embryonic head induction and limb morphogenesis in the mouse. Developmental Cell 1, 423-434. [21] Niehrs, C. (2001): Dickkopf-1, a secreted protein involved in head induction. Human Frontier Science Program Workshop X (Ang, S.-L et al. editors) p. 128-132. [22] *Duncan, P. I., Pollet, N., Niehrs, C. and *Nigg, E. A. (2001): Cloning and Characterization of Plx2 and Plx3, Two Additional Polo-like Kinases from Xenopus laevis. Exp Cell Res 270, 78-87. [23] Niehrs, C. (2001): Solving a sticky problem. Nature 413, 787788.

[5] *Roessler, E., *Du, Y., Glinka, A., *Dutra, A., Niehrs, C. and *Muenke, M. (2000): The genomic structure, chromosome location, and analysis of the human DKK1 head inducer gene as a candidate for holoprosencephaly. Cytogenet Cell Genet 89, 220224.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

A0600 Biomedizinische Strukturforschung

Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung (A0600) Leiter: Prof. Dr. Michael F. Trendelenburg, Prof. Dr. Eberhard Spiess

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A0601: Strukturelle Genanalyse und Service Betriebseinheiten (A0603/A0601): Konfokale Mikroskopie und Videomikroskopie Mikroinjektion Analytische Elektronenmikroskopie in Zell- und Molekularbiologie Arbeitsgruppenleiter: Prof. Dr. Michael F. Trendelenburg Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Herbert Spring Dr. Karin Schwab (08/99 - 08/02) Technische Mitarbeiter Roger Fischer Doktoranden, Diplomanden Dipl. Chem. Marco Marcello (09/01-07/02) Gastwissenschaftler Prof. Dr. Luiz Monteiro Leal (03/2001-02/2002) Dr. Aurora Marques Cianciarullo (08/2001-04/2002) Dr. Marcelo Pelajo Machado (01/2002-12/2002) Loraine Campanati Araujo (09/2001-02/2002) A0602: Modellversuche zur Invasion und Metastasierung und Service Betriebs Einheit (A0603/A0602) Konventionelle Elektronenmikroskopie Arbeitgruppenleiter: Prof. Dr. Eberhard Spiess Doktoranden, Diplomanten Dipl. Biol. Felix Bestvater (11/1997 - 11/2000) Technische Mitarbeiter Anna Heckel-Pompey (Techniker ½ ; 08/00)

Mit dem Beginn des Jahres 1993 wurde am DKFZ eine Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung eingerichtet, die im Bereich der modernen sehr Apparate aufwändigen licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren die Abteilungen des DKFZ unterstützt. Ein - begrenztes - Service-Angebot (A0603) der Gruppe besteht für folgende Gebiete: Konfokale Laserscan-Mikroskopie, Videomikroskopie, Automatisierte Mikroinjektion, Elektronenspektroskopische Strukturanalysen im Nanometer Bereich durch Elektron Spectroscopic Imaging (ESI) Videomikroskopie und konfokale Mikroskopie erlauben durch die Kombination molekularbiologischer und optischer Detektionsverfahren und der Digitalisierung der Bilder eine vielseitige rechnergestützte Auswertung inklusive 3D-Rekonstruktion. Die konfokale Technik ermöglicht eine Erweiterung der Bildinformation auf einen in der Z-Achse definierbaren Focusbereich, der im Sub-Mikrometer-Bereich liegt. Durch Bewegen des Präparats in der optischen Achse sowie durch Unterdrückung der nicht zur Fokusebene gehörenden Bildinformationen durch die sogenannte konfokale Blende werden lichtmikroskopische Schnittserien vom Ob-

jekt im Fluoreszenzverfahren möglich, ohne dieses zu zerstören. Über die computergestützte Rekonstruktion wird dann z.B. ein 3-dimensionales Bild des Objektes erhalten. In Verbindung mit Mehrfach-Fluoreszenzmarkierungen und simultaner Detektion kann auf diese Weise die räumliche Struktur intrazellulärer Kompartimente sichtbar und quantifizierbar gemacht werden. Darüberhinaus ermöglicht diese Technik auch einen Einblick in relativ “dicke” mikroskopische Präparate wie bespielsweise Zellverbände, Eizellen oder Embryonen. In sehr raschem Ausbau befinden sich gegenwärtig Technologien zur in -vivo Zell-Fluoreszenzmikroskopie. Von besonderem Interesse ist dabei die Zeit-aufgelöste Dokumentation verschiedenster GFP (Green Fluorescent Protein) Konstrukte. Eine wesentlich verbesserte Analytik der hierbei verwendeten Fluorochrome/ oder Fluorophore ermöglicht das als Zusatz zum verwendeten ZEISS LSM 510 einsetzbare META-Erweiterungssystem. Erstmals ist es möglich, Fluoreszenzen rein spektral quantitativ zu erfassen, also ohne die überlappenden Mischspektren („cross-talk“), die mit den bisherigen Verfahren meist mehr oder weniger vollständig aus dem Bild herausgerechnet werden mußten. Das mit der Lichtmikroskopie eng verbundene Gebiet der automatisierten Mikroinjektion ermöglicht einen gezielten Transfer unterschiedlichster Proben in lebende Gewebekulturzellen. In Verbindung mit den beiden zuvor genannten Techniken ist sie ein elegantes Verfahren zum Studium komplexer Regulations- und Transportvorgänge auf zellulärer Ebene. Gründliche Beratung wird auch für den Bereich elektronenmikroskopischer Präparations- und Fixierungstechniken angeboten: Speziell für die Präparation und Strukturuntersuchung von Makromolekülkomplexen sowie für Detailuntersuchungen an definierten subzellulären Domänen. Im Jahr 1995 wurde zusätzlich eine Serviceeinheit „Analytische Elektronenmikroskopie für Biomedizinische Proben“ eingerichtet (Förderung durch das BMBF Programm Biotechnologie 2000). In enger Zusammenarbeit mit anderen Abteilungen des DKFZ werden gegenwärtig sowohl Probenvorbereitung als auch Analyseparameter dieser neuartigen Spektroskopie-Technik soweit optimiert, daß ein Einsatz dieses hochauflösenden Analyseverfahrens in weiten Gebieten der molekularen Biomedizin möglich wird. Parallel hierzu werden neuartige molekulare Markierungstechniken für diesen Anwendungsbereich entwickelt.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Service Betrieb (A0603/A0601) Konfokale - und Videomikroskopie H. Spring, M.F. Trendelenburg, K. Schwab, R. Fischer Konfokale und Video Mikroskopie Für die konfokale Mikroskopie wird ein Zeiss LSM S10 UVMikroskop verwendet. Dieses Instrument ist mit vier Lasern (insgesamt sechs Wellenlängen) ausgerüstet. Eine entsprechende Peripherie inklusive 3D-Dekonvolution und Fotodrucker ist vorhanden. Im Bereich der hochvergrößerten Videomikroskopie steht ein Argus 20 System (Hamamatsu Photonics, Japan) zur Verfügung. Dieses System wird vor allem zur Analyse dynamischer Prozesse in lebenden Zellen verwendet. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Herrmann, H., U. Aebi*: Intermediate filaments and their associates: Multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. Curr. Opin. Struct. Biol 12, 79-90, 2000 (mit Titelbild) [2] Tajbakhsh, J. H. Luz*, H. Bornfleth*, S. Lampel, C. Cremer*, P. Lichter: Spatial distribution of GC- and AT-rich DNA sequences within human chromosome territories. Exp. Cell Res. 225, 229237, 2000 [3] Cziepluch, C., S. Lampel, A. Grewenig, C. Grund, P. Lichter, J. Rommelaere: H-1 parvovirus-associated replication bodies: A distinct virus-induced nuclear structure. J. Virology 74, 4807-4815, 2000 [4] Reichenzeller, M., A. Burzlaff, P. Lichter, H. Herrmann: In vivo observation of a nuclear channel-like system: Evidence for a distinct interchromosomal domain compartment in interphase cells. J. Structural Biology, 129, 175-185, 2000 [5] Keitel, V., J. Kartenbeck, A.T. Nies, H. Spring, M. Brom, D. Keppler: Impaired protein maturation of the conjugate export pump multidrug resistance protein 2 as a consequence of a deletion mutation in Dubin-Johnson syndrome. Hepatology, 32, 13171327, 2000 (mit Titelbild) [6] Hofemeister*, H., K. Weber*, R. Stick: Association of prenylated proteins with the plasma membrane and the inner nuclear membrane is mediated by the same membrane-targeting motifs. Mol. Biology of the Cell 11, 3233-3246, 2000 [7] Oxelmark, E., A. Marchini*, I. Malanchi*, F. Magherini*, L. Jaquet, M.A. Nasser Hajibagheri*, K.J. Blight*, J.-C. Jauniaux, M. Tommasino: Mmf1p, a novel yeast mitochondrial protein conserved throughout evolution and involved in maintenance of the mitochondrial genome. Mol. Cell. Biol. 20, 7784-7797, 2000 [8] Borrmann, C.M., C. Mertens, A. Schmidt, L. Langbein, C. Kuhn, W.W. Franke: Molecular diversity of plaques of epithelialadhering junctions. Annals of the New York Acad. Sci. 915, 144150, 2000 [9] Henzler, T., A. Harmache, H. Herrmann, H. Spring, M. Suzan*, G. Audoly*, T. Panek, V. Bosch: Fully functional, naturally occurring and C-terminally truncated variant human immunodeficiency virus (HIV) Vif does not bind to HIV Gag but influences intermediate filament structure. J. General Virology 82, 561-573, 2001

A0600 Biomedizinische Strukturforschung [12] Mertens, C., I. Hofmann, Z. Wang*, M. Teichmann*, S.S. Chong*, M. Schnölzer, W.W. Franke: Nuclear particles containing RNA polymerase III complexes associated with the junctional plaque protein plakophilin 2. Proc. Nat. Acad. Sci USA 98, 7795-7800, 2001 [13] Peitsch, W.K., I. Hofmann, S. Prätzel, C. Grund, C. Kuhn, I. Moll*, L. Langbein, W.W. Franke: Drebrin particles: Components in the ensemble of proteins regulating actin dynamics of lamellipodia and filopodia. Eur.J. Cell Biol. 80, 567579, 2001 (mit Titelbild) [14] Langbein, L., M.A. Rogers, H. Winter, S. Praetzel, J. Schweizer: The catalog of human hair keratins. II. Expression of the six type II members in the hair follicle and the combined catalog of human type I and II keratins. J. Biol. Chemistry 276, 3512335132, 2001. [15] *Zhang, J.B., H. Spring, M. Schwab: Neuroblastoma tumor cell-binding peptifed identified through random peptide phage display. Cancer Letters 171, 153-164, 2001. [16] *Constien, R., A. Forde*, B. Liliensiek*, H.J. Gröne, P. Nawroth*, G. Hämmerling, B. Arnold: Characterization of a novel EGFP reporter mouse to monitor Cre recombination as demonstrated by a Tie2 Cre mouse line. Genesis 30, 36-44, 2001. [17] Cui, Y.H., J. König, D. Keppler: Vectorial transport by doubletransfected cells expressing the human uptake transporter SLC21A8 and the apical export pump ABCC2. Mol. Pharmacol. 60, 934-943, 2001. [18] Kneissel, S., W.W. Franke, J.G. Gall, H. Heid, S. Reidenbach, M. Schnölzer, H. Spring, H. Zentgraf, M.S. SchmidtZachmann: A novel karyoskeletal protein: Characterization of protein NO145, the major component of nucleolar cortical skeleton in Xenopus oocytes. Mol. Biol. Cell, 12, 3904-3918, 2001.

Mikroinjektion

R. Fischer, M.F. Trendelenburg Mikroinjektionsexperimente an Gewebekulturzellen werden an einem automatisierten Injektionssystem AIS (Carl Zeiss) sowie an einem Eppendorf-System durchgeführt. Injektionsapparaturen und Beratung werden auch für Injektionsexperimente an Amphibien Oocyten und Embryonen zur Verfügung gestellt. Publikationen(* = externe Autoren) [1] *Bayerl, C., *Jung, E.G.,: Microinjection of an antibody against HSP 72 in keratinocytes to study acute UV in jury. Exp. Dermatol.8; 247-253 (1999) 8 [2] Marcello, M., Fischer, R., Troester, H., Trendelenburg, M., Sczakiel, G.,: Selecting karyophilic DNA cis elements in Xenopus laevis oocytes: a new approach. Int. J. Dev. Biol. (2002), in press

Organisation Internationaler DKFZ Laborkurse und Symposien auf den Gebieten: Digitale Mikroskopie und Proben Detektion in der Biomedizin Koordination: M.F. Trendelenburg und H. Spring. A. Burzlaff, K. Schwab, H. Tröster, R. Fischer

[10] Bashir, T., J. Rommelaere, C. Cziepluch: In vivo accumulation of cyclin A and cellular replication factors in autonomous parvovirus minute virus of mice-associated replication bodies. J. Virology 75, 4394-4398, 2001

Konzeption und Durchführung internationaler DKFZAdvanced Courses on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Biomedical Cell Biology und

[11] Rogers, M.A., L. Langbein, H. Winter, C. Ehmann, S. Praetzel, B. Korn, J. Schweizer: Characterization of a cluster of human high/ultrahigh sulfur keratin-associated protein genes embedded in the type I keratin gene domain on chromosome 17q12-21. J. Biol. Chem. 276, 19440-19451, 2001

Mitarbeit bei EMBO Practical Courses in Zusammenarbeit mit: W.W. Franke, H. Herrmann, J. Kartenbeck , L. Langbein (A0100), P. Lichter, St. Joos (H0700). Th. Bächi (Zürich, Schweiz), H. Bauch, D. Brocksch, H. Gundlach,

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung R. Käthner, W. Malkusch (Fa.Carl Zeiss), J.C. Bulinski, M. Sheetz (New York, USA), W. Gräwe, B. Moomaw, N.Sugiyama, L. Schleinkofer, K. Weinbuch (Fa. Hamamatsu Photonics), W. Ansorge, T. Hyman, E.Stelzer, R. Saffrich (EMBL, Heidelberg), R. Leube (Mainz), S.Terakawa (Hamamatsu, Japan), M. White (Liverpool, UK.)

DKFZ Advanced Practical Courses 44

2. - 6. Oktober 2000 DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Fluorescent Protein Technology in Living Cells, Multiparameter Fluorescence, Advanced Digital Microscopy, Confocal Microscopy Calcium Imaging, 3-D Procedures, FISH) 8. - 12. Oktober 2001 DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Advanced Digital Microscopy, Green Fluorescent Protein Technology, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Multifluorescence Microscopy, Confocal Microscopy, Image Processing, 3-D Procedures, Calcium Imaging, FISH & CHIPS)

EMBO Practical Courses M.F. Trendelenburg, R. Fischer: Kursteil Microinjection into Xenopus Oocytes and Eggs. EMBO Practical Courses on Microinjection and Probe Detection EMBL Heidelberg June 5-9,2000 EMBL Heidelberg, June 18-23,2001 H. Spring: Kursteil Fluorescent live cell microscopy EMBO Practical Course on Confocal and Multi-Photon Microscopy of Live Specimens EMBL, Heidelberg; April 16-23,1999

A0600 Biomedizinische Strukturforschung

Analytische Elektronenmikroskopie in Zellund Molekularbiologie Koordination: M.F. Trendelenburg, H. Spring. C. Crucifix, H. Tröster, L. Monteiro-Leal, L. Campanati-Araujo, A. Marques-Cianciarullo. in Zusammenarbeit mit W.W. Franke, J. Kartenbeck (A0100); I. Grummt, R. Voit (A0300); M. Wießler (C0300); W. Schlegel (E0400); M. Pawlita (F0200) alle DKFZ E. Delain (Inst. Gustave Roussy, Villejuif/Frankreich); S. Fakan (Univ. Lausanne / Schweiz); P. Oudet, P. Schultz (Univ. Strasbourg, Frankreich); Steinbeis Transferzentrum Analyt. EM in Biomedizin u. Biotechnologie (Heidelberg), H. Kohl (Univ. Münster) M. Schwarz (Orthopädie, Univ. Klinikum Mannheim), M. Hafner (FH Mannheim).

Gerätekonfiguration: ZEISS < LEO > EM 912, Omega, Slow Scan CCD Kamera, Electron Spectroscopic Imaging System und Software Programm, EELS Detektor, Komponenten für Kryo-EM. Grundlage des Electron Spectroscopic Imaging ist die inelastische Elektronenstreuung in den inneren Atomschalen, d.h. wird ein Hüllelektron durch Energieübertragung angeregt oder ionisiert, als Folge ergibt sich ein elementcharakteristischer Energieverlust des Strahlelektrons. Sind in einem elektronmikropskopischen Präparat Elemente in einer nachweisbaren Masse vorhanden, so entstehen im Energieverlustspektrum definierte Absorptionskanten. Aus diesen Absorptionskanten lassen sich dann Rückschlüsse auf das Element, das Hüllenelektron und die Konzentration ziehen (vgl. Darstellung in Abb.1). Hauptzielsetzung dieses Projekts (unterstützt durch Fa. LEO Elektronenmikroskopie, Oberkochen und durch das BMBF, Bonn-Berlin) ist der Einsatz des ESI-Verfahrens in Zell- und Molekularbiologie. Im Speziellen, ein hochauflösender, quantitativer Phosphor-Nachweis in DNA und RNA sowohl in EM Spreitungspräparaten, als auch in Ultradünnschnitten. Parallel hierzu werden orientierende Untersuchungen an Bor- und Halogen markierten Biomolekülen durchgeführt.

Hauptprojekte: Forschung und Entwicklung I. Quantifizierung erforderlicher Objekte- und Analyse Parameter biomedizinischer Proben für das Electron Spectroscopic Imaging (ESI) und die Electron Energy Loss Spektroskopie (EELS). Als Hauptsächliche Präparattypen verwenden wir Adsorptionspräparate von DNA bzw. RNA/ Nukleinsäurekomplexen, sowie nichtkontrasAbb. 1 : Prinzip und Anwendung der elektronenspektroskopischen Abbildung (ESI) in der biomedizinischen Strukturanalyse. A: Strahlengang im analytischen Mikroskop für das Abbildungsverfahren mit inelastisch gestreuten Elektronen. B: Prinzip der elementarspezifischen Information durch inelastische Streuprozesse, bei welchen elementcharakteristische Energieverluste entstehen. C,D: Beispiele für eine Phosphor-spezifische Abbildung durch Elektronenspektroskopie simultan absorbierten TYMV und TMV Viruspartikeln. C: Typisches P-spezifisches Absorptionskantenbild bei 150 eV, der maximalen P-L2,3 Absorptionskante. Zusätzlich zu der Information über die spezifische P-Verteilung enthält dieses Bild auch Signalbeiträge aus dem „unspezifischen“ Untergrund. D: Differentiell errechnetes Bild der spezifischen P-Verteilung in TYMV und TMV Viren.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung tierte Ultradünn-Schnitte durch fixierte Zellen. An diesen Präparaten soll die Elementverteilung von Struktur gebundenem Phosphor quantitativ dargestellt werden [1-4]. II. Schritte zur Quantifizierung des Phosphor (P)Gehalts definierter viraler Genome. Ein besonderes Problem bei der Quantifizierung von Phosphor Signalen ist die Definition des Präparat Untergrund Signals. Um die Relation der Beiträge von spezifischem Phosphat (P) Signal gegenüber dem unspezifischen UntergrundSignal zu definieren, haben wir verschiedenen Virale Proben auf EM-Träger Kohlenstoff Membranen adsorbiert. Hierbei konnte ein speziell konfigurierter Präparatetyp entwickelt werden, der es erlaubt Virus Partikel, die DNA oder RNA in einer Packungsdichte von 3-5 P-Atomen/um² enthalten, in Bezug auf das P-spezifische Signal reproduzierbar zu analysieren [1-4, 7,8]. III. Entwicklung neuer Verfahren zur Elementspezifischen Darstellung von Immunogold markierten Ultradünnschnitten. Das gegenwärtig intensivst genutzte EM-Markierungsverfahren besteht in der Verwendung von zum Antikörper gekoppelter Nanogoldpartikeln. Abgesehen von den bekannten Problemen der Erreichbarkeit der Antigene für die verwendeten gekoppelten Immuno-Gold-Proben ergibt sich sehr häufig das Problem, daß die genaue Position der spezifisch gebundenen Gold Partikel in vielen Fällen nicht genau definiert werden kann, da der Präparatuntergrund partikuläre Bereiche ähnlich hoher Elektronendichte aufweist, wie die der zur Immundedektion verwendeten Nanogold Partikel. Durch die von uns entwickelte Methode kann der Kontrastbeitrag der Nanogoldpartikel selektiv gegenüber dem Präparatkontrast reproduzierbar ermittelt werden. Hiermit ist eine neue Möglichkeit gegeben, Immunogold markierte EM-Präparate quantitativ auszuwerten. Eine weitere, entscheidende Verbesserung der Detektion konnte kürzlich durch den Einsatz einer speziell konfigurierten 2k Slow Scan CCD Kamera erreicht werden [2,4-6, 10] IV. Einsatz der EM Spektroskopie für die Lokalisation speziell konfiguirieter Bor-Verbindungen in Patienten Tumoren. Seit mehreren Jahren wird das Verfahren der BorNeutronen Einfang Therapie (BNCT: boron neutron capture therapy) im Rahmen eines EG-Vorhabens weiterentwickelt. In den letzten Jahren werden mehr und mehr speziell konfigurierte Borverbindungen (vgl. Feakes et. al. PNAS 96, 6406,1999) eingesetzt. In Zusammenarbeit mit der Abt. Molekulare Toxikologie gelang es vor kurzem, ein für die EM-Detektion besonders geeignetes Borkonstrukt zu synthetisieren [4,6,7,9]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Crucifix, C., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Trendelenburg, M.F., Probst, W., Haking, A., Tröster, H.: Electron spectroscopic imaging (ESI) if viral DNA- and RNA-distribution using a new method of background substraction. Microscopy & Microanalysis (1999) Vol. 5, Suppl. 2, 216-220 Proc. Micr. Soc. America (Portland, OR, USA)

A0600 Biomedizinische Strukturforschung [2] Haking A., Tröster, H., Richter, K., Crucifix, C., Spring, H., Trendelenburg, M.F. An approach to an objektive background substraction for elemental mapping with core-edges down to 50 eV: description, evaluation and application. Ultramicroscopy (1999) 80:163-182 [3] Crucifix, C., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Trendelenburg, M.F., Probst, W., Haking, A., Tröster, H.: Electron spectroscopic imaging (ESI) if viral DNA- and RNA-distribution using a new method of background substraction. Acta Microscopia (1999) 8, Suppl. B: VI-X [4] Tröster, H., Crucifix, C., Haking, A., Spring, H., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Raddatz, S., Wiessler, M., Probst, W., Trendelenburg, M.F. A Novel Concept for Application of EnergyFiltering Transmission Electron Microscopy in Biomedicine and Biotechnology in Perspective Imaging, 7th APEM Committee Singapore: Life Sciences, pp.127-130, Times Publ. Singapore 2000 [5] Hiller, S.A., Kabius, B., Probst, W., Tröster, H., Trendelenburg, M., Crucifix, C. Tröndle, A. Performance data of a new 2048 x 2048 pixel Slow-Scan CCD camera for TEM. Microsc. & Microanalysis 2000, Vol. 6, Suppl.. 2, pp. 732-735, 2000 [6] Tröster, H., Bub S., Hunziker, A., Trendelenburg, M.F. (2000): Stability of DNA repeats in Escherichia coli dam mutant strains indicates a Dam-methylation-dependent DNA deletion process. Gene 258: 95-08 (2000) [7] Trendelenburg, M. F., Spring, H. Haking, A., Tröster, H., Pawlita, H., Crucifix, C.: From Mille spreads to phosphorus maps of nucleoproteins: Transcription seen by complementary microscopies: EUREM 12, BRNO Czech Repubic, Vol. I, pp. B 283-287, 2000 [8] Crucifix, C., Tröster, H., Pawlita, M., Witz, J., Haking, A., Spring, H., Troendle, A., Probst, W., Trendelenburg, M. F.: Viral vectors in gene therapy: Rapid screening of recombinant viral vector samples using genomic phosphorous (P)-map electron microscopic imaging [ESI]. 40th Annual Meeting Americ. Soc. Cell Biol., San Francisco 2000, Molec. Cell Biol. 11, Suppl., p. 130a, 2000 [9] Raddatz, S., Mark, E. P., Haking, A., Probst, W.,Wiessler, M., Trendelenburg, M.F., Troester, H.: Development of new marker compounds for the detection of chemical element labels by elelctron spectroscopic imaging (ESI). Microscopy & Microanalysis (2001), Vol. 7, Suppl. 2, pp.1038-1041. [10] Monteiro-Leal, L. H., Troester, H., Campanati, L., Spring, H., Trendelenburg, M.: A New Computerised Method of Multiple Labelling Detection and Particle Evaluation. Microscopy & Microanalysis (2002), Vol. 8, Suppl. 2 (in press) Patente: 1.(P:I) Synthese eines Bor-Konstrukts zur Markierung von Oligonukleotiden zur Markierung für die energiefilternde Transmissionselektronenmikroskopie M. Wießler, S. Raddatz (C0300), M.F. Trendelenburg, H. Tröster, E. Spiess (A0600) 2.(P:II) Elementardetektion im energiefilternden Elektronenmikroskop mit Hilfe eines Untergrundmarkers A. Haking, K. Richter (A0600) 3.(P:III) Selektive Kontrastoptimierung für hochauflösende Markerdetektion in biomedizinischen Ultradünnschnitten A. Haking, H. Tröster, K. Richter, M.F. Trendelenburg (A0600) 4.(P:IV) Ein molekularbiologischer Marker mit hochrepetitiven DNA-Elementen für die analytische Elektronenmikroskopie S. Bub, H. Tröster, K. Richter, A. Haking, E. Spiess, M.F. Trendelenburg (A0600) S. Raddatz, M. Wießler (C0300)

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

Strukturelle Genanalyse (A0601) Projektkoordination: M.F. Trendelenburg, H. Spring, L. Campanati-Araujo, L. Monteiro-Leal, A. Marques-Cianciarullo, M. Pelajo-Machado, H. Tröster, C. Crucifix, K. Schwab, R. Fischer

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Zusammenarbeit mit: Intern: Prof. A. Alonso (F0500), Dr. M. Schmidt-Zachmann (A0100), Prof. M. Wießler (C0300), Prof. W. Schlegel (E0400), Dr. M. Pawlita (F0200), Prof. G. Sczakiel (F 0200) Extern: Dr. N. Angelier (CNRS/Univ. Paris, Frankreich) Prof. W. Ansorge, EMBL. Heidelberg,Prof. M. Hafner, (FH Mannheim) Dr. S. Fakan (Univ. Lausanne, Schweiz),Prof. Prof. O.L. Miller (Univ. Virginia, USA), Prof. P. Oudet, Dr. P. Schultz, (CNRS, INSERM, Univ. Strasbourg, Frankreich), Prof. O.V. Zatsepina (Moscow State University, Moskau, Russland), Prof. S. A. Gerbi (Brown Univ. Providence, RI, USA)

1. Hochauflösende Lichtmikroskopie transkriptionell aktiver Genbereiche und Transkripttransport aus dem Zellkern Das von G. Blobel vorgestellte ‘gene gating‘ Konzept und das von der Arbeitsgruppe Laemmli entwickelte Loop-Modell des Interphase-Chromatins stellen weiterführende Konzepte für die strukturelle Chromatinanalyse dar. In beiden Konzepten ist die räumliche Anordnung aktiver GenDomänen eine wesentliche Komponente. Für die direkte Sichtbarmachung aktiver Genbereiche im Zellkern - bisher vorwiegend mit Elektronenmikroskopie Verfahren untersucht - ergeben sich weitgehende Limitierungen: Zum Einen sind transkriptionell aktive Genbereiche meist von sehr elektronendichten Komponenten umgeben, so daß die eigentliche Gen- und Transkriptstruktur der direkten Beobachtung nicht zugänglich ist. Zum Anderen müßen die vergleichsweise geringen Größen der meisten Genabschnitte berücksichtigt werden. In Anlehnung an die bisher verwendete EM-Methodik haben wir für die Untersuchung der in situ Struktur und der räumlichen Gen-Anordnung im intakten Zellkern neuartige lichtmikroskopische Abbildungsverfahren verwandt: Durch Ausarbeitung auf die Videomikroskopie optimierter Präparationsbedingungen gelang es unserer Gruppe erstmals, transkriptionell aktive rDNA Gene in ihrem ‘nativen‘ d.h. hydratisierten Chromatinzustand darzustellen [6]. Durch Einsatz modernster Video Kamera Technologie können seit kurzem auch rasch ablaufende zelluläre Bewegungsprozesse bei hoher Auflösung dokumentiert werden [9]. Bezüglich der ultrastrukturellen Lokalisation definierter nukleolärer Proteine konnte - in Zusammenarbeit mit der A.v.H. Stipendiatin O. Zatsepina (Moskau) - ein neuartiger Ansatz entwickelt werden: Die extrem kompakte in situ Struktur der Nukleolen konnte erstmals vollständig in vivo dispergiert und die anschließende funktionelle Rekonstitution analysiert werden [6]. Durch das von uns entwickelte Verfahren zur hochaufgelösten Detektion unterschiedlich großer Nanogoldpartikel, wie Sie für die simultane EM Doppel-Immundetektion verwendet werden, kann die bisher vorwiegend durch Konfokale Fluoreszenzmikroskopie erfolgte Lokalisation mit entsprechenden EM Daten korreliert werden [1, 3,4,6,10].

A0600 Biomedizinische Strukturforschung 2. Strukturelle Untersuchungen zur Regulation der Transkription. Eines der sowohl molekularbiologisch als auch strukturell best untersuchten Gen-Systeme stellt das für ribosomale RNA (rRNA) kodierende rDNA Gen aus Xenopus laevis Oocyten dar. Unter Verwendung des oben beschriebenen Videomikroskopie Verfahrens an ‘nativen’ hydratisierten rRNA Genen konnte für die Regulation der Transkription dieser Gene eine erhebliche Diskrepanz in der Interpretation molekularbiologischer und struktureller Daten aufgeklärt werden. Das lange Zeit gültige Modell der Transkriptionskontrolle besagte folgendes: Die Transkription des 40 S pre-rRNA kodierenden Bereichs stoppt an der Stelle T1/T2 und nicht an der Terminationssequenz T3. Aus molekularbiologischen in vitro Untersuchungen war von mehreren Arbeitsgruppen das Modell einer konstitutiven Terminierung ausschließlich an der T3-Stelle postuliert worden, das eine vollständige Transkription des NTSrDNA-Bereichs voraussetzt. Unter Verwendung von Daten aus Videomikroskopie, Elektronenmikroskopie und S1 Transkript Analyse unter in vivo Bedingungen konnten wir zeigen, daß in vivo, tatsächlich an der Position T1/T2 korrekt und effizient terminiert wird [6]. Unsere gegenwärtigen Untersuchungen konzentrieren sich auf die folgenden Fragestellungen: 1. In situ Detektion der nukleolären DNA während unterschiedlicher Transkriptionszustände [1-3, 6]. 2. Ergänzung dieser Untersuchungen durch in situ Lokalisation der hauptsächlichen Komponenten des Transkriptionskomplexes, wie RNA-Polymerase I Partikel und ‘upstream binding factor’ (UBF) [3,6]. Aufgrund der kürzlich erzielten Fortschritte beim Phosphor-Mapping durch die analytische Elektronenmikroskopie (vgl. Abb.1) soll dieses Verfahren auch zur Phosphordetektion in naszierenden pre-rRNA Transkripten eingesetzt werden. [1,3,4,6].

3. Analyse der Integration und Expression injizierter Gene während der Frühembryogenese. Mikroinjektionsexperimente unter Verwendung viraler und nicht-viraler DNA Sequenzen in Oocyten und/oder befruchtete Eizellen von Xenopus laevis bieten eine Vielfalt experimenteller Ansätze für detaillierte Untersuchungen zu Transkriptions-Kontrollfaktoren, Chromatin-Rekonstitution und Gen-Replikation]. Neben Mikroinjektionsexperimenten werden vermehrt Inkubationsexperimente unter Verwendung von Protein Extrakten aus Xenopus Eizellen für die experimentelle Analyse von Chromatin-Rekonstitution und DNA-Replikation verwendet. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von G. Sczakiel konnten wir einen neuartigen methodischen Ansatz zur spezifischen Selektion karyophiler DNA cis Elemente durch Mikroinjektion in Xenopus Oocyten entwickeln [8]. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten ist die detaillierte Untersuchung der rDNA Topologie in intakten Oocyten Nukleolen. Ziel ist es, Veränderungen der rDNA Topologie mit dem Beginn der extrem hohen Transkriptionseffizienz dieser rDNA zu korrelieren. Durch einen kombi-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung nierten Einsatz von UV-Laser-Scan Mikroskopie, Elektronenmikroskopie und S1 Transkript Analyse, konnten wir zeigen, daß die beobachtete massive Umordnung der rDNA Anteile in den Oocyten Nukleolen korreliert ist einem plötzlichen Start der massiven pre-rRNA Transkription [6]. In weiterführenden Untersuchungen sollen derartige Lokalisationen [6] vergleichend auch für Nukleolen während der Xenopus Früh-Embryogenese durchgeführt werden.

A0600 Biomedizinische Strukturforschung chungen unter Verwendung folgender EM-Techniken durchgeführt werden: Negativ-Kontrastierung, DNASpreitung, EM von Ultradünnschnitten inkl. Immuncytochemie. Publikationen(* = externe Koautoren) [1] Nehls, P., Keck, Th., Greferath, R., Spiess, E., Glaser, T., Rothbarth, K., Stammer, H., Werner, D.: cDNA cloning, recombinant expression and characterization of polypeptides with exceptional DNA affinity. Nucl. Acids Res. 26, 1160-1166, (1998)

Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Haking A., Tröster, H., Richter, K., Crucifix, C., Spring, H., Trendelenburg, M.F. An approach to an objektive background substraction for elemental mapping with core-edges down to 50 eV: description, evaluation and application. Ultramicroscopy (1999) 80:163-182 [2] Crucifix, C., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Trendelenburg, M.F., Probst, W., Haking, A., Tröster, H.: Electron spectroscopic imaging (ESI) if viral DNA- and RNA-distribution using a new method of background substraction. Acta Microscopia (1999) 8, Suppl. B: VI-X [3] Tröster, H., Crucifix, C., Haking, A., Spring, H., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Raddatz, S., Wiessler, M., Probst, W., Trendelenburg, M.F., A Novel Concept for Application of EnergyFiltering Transmission Electron Microscopy in Biomedicine and Biotechnology in Perspective Imaging, 7th APEM Committee Singapore: Life Sciences, pp.127-130, Times Publ. Singapore 2000 [4] Hiller, S.A., Kabius, B., Probst, W., Tröster, H., Trendelenburg, M., Crucifix, C. Tröndle, A. Performance data of a new 2048 x 2048 pixel Slow-Scan CCD camera for TEM. Microsc. & Microanalysis 2000, Vol. 6, Suppl.. 2, pp. 732-735, 2000 [5] Tröster, H., Bub S., Hunziker, A., Trendelenburg, M.F. (2000): Stability of DNA repeats in Escherichia coli dam mutant strains indicates a Dam-methylation-dependent DNA deletion process. Gene 258: 95-08 (2000) [6] Trendelenburg, M. F., Spring, H. Haking, A., Tröster, H., Pawlita, H., Crucifix, C.: From Mille spreads to phosphorus maps of nucleoproteins: Transcription seen by complementary microscopies: EUREM 12, BRNO Czech Repubic, Vol. I, pp. B 283287, 2000 [7] Crucifix, C., Tröster, H., Pawlita, M., Witz, J., Haking, A., Spring, H., Troendle, A., Probst, W., Trendelenburg, M. F.: Viral vectors in gene therapy: Rapid screening of recombinant viral vector samples using genomic phosphorous (P)-map electron microscopic imaging [ESI]. 40th Annual Meeting Americ. Soc. Cell Biol., San Francisco 2000, Molec. Cell Biol. 11, Suppl., p. 130a, 2000 [8] Marcello, M., Fischer, R., Troester, H., Trendelenburg, M., Sczakiel, G.,: Selecting karyophilic DNA cis elements in Xenopus laevis oocytes: a new approach. Int. J. Dev. Biol. (2002), in press [9] Campanati, L., Holloschi, A., Troester, H., Spring, H., de Souza, W., Monteiro Leal, L.H.: Video-microscopy observations of fast dynamic processes in the protozoan Giardia lamblia. Cell Motility, 51, 213-224, (2002). [10] Monteiro-Leal, L. H., Troester, H., Campanati, L., Spring, H., Trendelenburg, M.: A New Computerised Method of Multiple Labelling Detection and Particle Evaluation. Microscopy & Microanalysis (2002), Vol. 8, Suppl. 2 , in press.

Service Betriebs Einheit (A0603) Konventionelle Elektronenmikroskopie E. Spiess Für Service-Leistungen im Bereich der TransmissionsElektronenmikroskopie steht ein Transmissions-Elektronenmikroskop zur Verfügung. Hiermit können Untersu-

Modellversuche zur Invasion und Metastasierung (A0602) F. Bestvater, E. Spiess In Zusammenarbeit mit: Dipl. Phys. T. A. Knoch, DKFZ; Dr. B. Werle, Med. Klinik und Poliklinik, Universität Heidelberg; Prof. Dr. W. Ebert, Thoraxklinik Rohrbach, Heidelberg; Dr. T. Porwol und Prof. Dr. H. Acker, MPI für Molekulare Physiologie, Dortmund; Dr. A.-R. Strohmaier, Nikon GmbH, Düsseldorf; Dr. T. Feurer, Institut für Quantenphysik und Optik, Universität Jena; Prof. Dr.T. Lah, National Institute of Biology, Ljubljana, Slowenien; Dr. J. Kos, KRKA, Nove Mesto, Ljubljana, Slowenien. Unterstützt durch Mittel der „Deutschen Krebshilfe“ und dem „Internationalen Büro des BMBF“

Cathepsin B Invasion von Zellen durch Gewebsgrenzen und intrazelluläre Räume ist ein in der Embryogenese und in der Homoeostase von höheren Organismen ein ständig wiederkehrender komplexer, in Raum und Zeit strikt programmierter Vorgang. Bei Tumorzellen kann diese Regulation ausfallen was schließlich zur Entstehung der Metastasen mit all ihren Komplikationen für das Überleben betroffener Patienten führen kann. Wichtige zelluläre Werkzeuge für invasive Prozesse sind Proteasen, über die extrazelluläre Matrix der Basalmembran und der interstitiellen Räumesoweit aufgelöst werden kann, daß Tumorzellen passieren können. Hierbei arbeiten mehrere Proteasen in einer Aktivierungskasade zusammen. Bestimmten Cathepsinen und den ihre Aktivität regulierenden Inhibitoren (Cystatine) kommt dabei möglicherweise eine Schlüsselfunktion zu als Aktivatoren anderer Enzyme bzw. direkt beim Abbau der extrazellulären Matrix. Diese Annahmen beruhen insbesonders auf einer erhöhten Aktivität des Cathepsin B in Tumoren und isolierten Tumorzellen. Dies ist inzwischen eine für zahlreiche Tumorarten beschriebene Erscheinung, so auch für Lungentumoren, wie unsere früheren Untersuchungen gezeigt haben. Die Frage, ob dieses Phänomen für klinische Zwecke genutzt werden kann, ist bereits in unseren vorangegangenen Untersuchungen angegangen worden. In einer ausgedehnten immunhistochemischen Studie haben wir jetzt belegt, daß Cathepsin B ein unhabhängiger prognostischer Faktor für die Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten mit Plattenepithelkarzinom ist: hohe Expression ist mit geringer Überlebenswahrscheinlichkeit korreliert[1]. Eine Kernfrage ist die Beteiligung der verschiedenen Zelltypen, die ein Tumor enthält, an der Produktion der Cathepsine. Dazu analysieren wir gegenwärtig routinemäßig anfallendes Schnittmaterial über Immunhistochemie und In-situ Hybridisierungstechniken mit Genson-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung den die Expression von Cathepsin B auf mRNA- und Proteinebene mit einem morphometrischen Verfahren. Dadurch werden Aussagen Zelltypspezifität und räumliche Muster der Expression in einem Tumor möglich. In Verbindung mit klinischen Daten soll darüber eine Verbesserung der Diagnosemöglichkeiten im Hinblick auf die Metastasierungskapazität von Tumoren erreicht werden [1].

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Die Untersuchungen auf zellulärer Ebene haben eine über die Lysosomen hinausgehende Lokalisation des Cathepsin B in Tumorzellen ergeben. Die dabei benutzten computergestützten mikroskopischen Aufnahme- und Auswerteverfahren haben wir weiter verfeinert [3]. Solche Untersuchungen wurden auf lebende Zellen ausgedehnt. Dies wurde durch die Kopplung autofluoreszierender Proteine (Green Fluorescent Protein = GFP) ermöglicht. Über die Transfektion einer Reihe unterschiedlicher Molekülvarianten des Cathepsin B in Tumorzellen untersuchen wir so gegenwärtig ihre Expression, ihre intrazelluläre Verteilung und ihre mögliche Funktion [4].

Zwei-Photonen Mikroskopie In den letzten 10 Jahren sind in der Fluoreszenzmikroskopie zahlreiche neue Verfahren eingeführt worden, die eine Untersuchung von Prozessabläufen in molekularen Dimensionen in lebenden Zellen erlauben. Dazu ghört die Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM). Bei biologischen Proben ist dieSituation momentan noch durch einen Mangel an Grundwissen gekennzeichnet. In einer Kooperation mit Gruppen am MPI in Dortmund und der Universität Jena haben wir Absorptionsspektren und Emissionsspektren zahlreicher Fluorochrome vermessen, die für Physiologie, Zell-, und Entwicklungsbiologie bedeutsam sind. Diese Erkenntnisse führen zur Möglichkeit einer effektiven Vielfarben-Markierung zellulärer Komponenten und ihrer Abbildung. Mit der Abbildung 1 wird ein Doppelfärbung mit zwei unterschiedlichen „grün fluoreszeierenden Proteinen“, eGFP und eCFP, in lebenden Zellen vorgestellt.

A0600 Biomedizinische Strukturforschung [2] Baumhäkel, J.-D.*, Kayser, K.*, Kalman, E.*, Kos, J.*, Lah, T.*, Spiess, E., Ebert, W.*, Fiehn, W.*, Werle, B.* (2001) Histological and thermodynamic features of cathepsin B-positive tumors of non-small cell lung cancer obtained by syntactic structure analysis. Electronic Journal of Pathology and Histology 7: 011-06. [3] Strohmaier, A.-R.*, Porwol, T.*, Acker, H.* Spiess, E. (2000) Three-dimensional organization of microtubles in tumor cells studied by confocal laser scanning microscopy and computer assisted deconvolution and image reconstruction. Cells Tissues Organs, 167, 1 - 8. [4] Bestvater, F., Knoch, T.A., Langowski, J., Spiess, E. (2002) Construct conversions caused by simultaneous cotransfection: „GFP-Walking“. BioTechniques 34, 720-729.

Abbildung 1: Drei-dimensionale Rekonstruktion einer TPM Schnittserie durch lebende Lungentumorzellen. Eine Zelllinie welche konstitutiv die Histon-GFP Chimaere (H2A-eGFP) exprimiert, wurde mit einem Cytoplasma-Membranmarker (mem-eCFP) supertransfiziert. Aufgrund der hohen Auflösung erscheint die Zelloberfläche stark profiliert. Die Membran (grau) ist transparent abgebildet, so dass ein Blick auf die fein strukturierte Verteilung des Histon H2A (blau) im Kern der Zellen möglich wird. Das rekonstruierte Volumen beträgt 99x99x32 µm3.

Publikationen (*externer Koautor) [1] Werle, B.*, Kraft, C.*, Lah, T.T.*, Kos, J.*, Schanzenbächer, U.*, Kayser, K.,* Ebert, W.*, Spiess; E. (2000) Cathepsin B in Infiltrated Lymph Nodes Is of Prognostic Significance for Patients with Nonsmall Cell Lung Carcinoma. Cancer 89, 2282-2291.

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

A0700 Epigenetik

Arbeitsgruppe Epigenetik (A0700) Leiter: Dr. Frank Lyko Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Susanne Lankenau (04/01-09/01) Dr. Joachim Marhold (12/01-) Doktoranden Regine Garcia Boy (03/01-) Frank Weißmann (05/01-)

Charakterisierung methylierungsabhängiger Chromatinstrukturen in Drosophila J. Marhold, M. Zbylut, F. Lyko In Zusammenarbeit mit B. Mechler, DKFZ

Technische Assistentin Tanja Musch (01/01-) Studenten Natascha Kunert (11/01-) Cora Mund (04/01-) Marcin Zbylut (01-10/01)

Die epigenetische Regulation der Genexpression spielt eine zentrale Rolle in der Säugerentwicklung sowie in der Entstehung von Krebs. Die Forschungsaktivitäten der Arbeitsgruppe Epigenetik konzentrieren sich auf die zentralen epigenetischen Mechanismen, die epigenetische Programme etablieren und aufrechterhalten. Dies geschieht im wesentlichen durch DNA-Methylierung und bestimmte höhergeordnete Chromatinstrukturen. Diese Mechanismen werden in verschiedenen Modellorganismen untersucht. An zentraler Stelle steht dabei die funktionelle Charakterisierung von DNA-Methyltransferasen in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. In diesem System lassen sich wesentliche Aspekte der epigenetischen Regulation im Menschen in zahlreichen Details und mit hoher Effizienz untersuchen. Darüber hinaus werden auch die DNAMethylierungsmuster von Krebspatienten eingehend analysiert und Verbindungen zur spezifischen Inhibition menschlicher DNA-Methyltransferasen synthetisiert. Diese Projekte sollen die Entwicklung neuartiger Ansätze zur Diagnose und Therapie von Krebs erlauben.

Methyl-DNA-bindende Proteine fungieren als Bindeglieder zwischen methylierter DNA und repressorischen Chromatinstrukturen. Wir verwenden mehrere Ansätze, um methylierungsabhängige Chromatinstrukturen in Drosophila zu untersuchen. Unsere Forschungsaktivitäten konzentrieren sich derzeit auf das dMBD2/3 Protein, das signifikante Homologien zu den methyl-DNA-bindenden Proteinen MBD2 und MBD3 aus der Maus aufweist [4]. Unsere Resultate haben gezeigt, dass dMBD2/3 hochspezifisch mit den Chromosomen interagiert. Diese Interaktionen werden nun genauer untersucht, um die genaue Funktion von dMBD2/3 und seiner Interaktionspartner aufzuklären. Von den Ergebnissen erhoffen wir uns wichtige Aufschlüsse über die Integration epigenetischer Signale während der Drosophila-Entwicklung.

Funktionelle Charakterisierung des Drosophila dDnmt2-Gens N. Kunert, S. Lankenau, F. Lyko In Zusammenarbeit mit D. Lankenau, Universität Heidelberg

Genomische DNA von Drosophila wird spezifisch während der frühen Embryonalentwicklung methyliert [3]. Die Sequenzierung des kompletten Drosophila-Genoms führte zur Identifikation des dDnmt2- Gens, das signifikante Sequenzhomologien mit funktionellen DNA- Methyltransferasen aufweist. dDnmt2 wird spezifisch während der frühen Embryonalentwicklung exprimiert, was mit dem beobachteten DNA-Methylierungsmuster übereinstimmt [2-4]. Um die Funktion der DNA-Methylierung in Drosophila aufzuklären, sollen mutante Allele des dDnmt2 Gens untersucht werden. Derartige Allele sind bislang noch nicht verfügbar und müssen deshalb erst hergestellt und isoliert werden. Dazu werden wir das dDnmt2 Gen durch die Insertion einer Markerkassette gezielt inaktivieren. Diese Experimente werden ergänzt durch die gezielte Überexpression von dDnmt2 in einem transgenen System. Die detaillierte Untersuchung mutanter Fliegen wird einen entscheidenden Beitrag zum funktionellen Verständnis der DNA-Methylierung für die Fliege leisten und auch Aspekte der Rolle der DNA-Methylierung im Menschen klären.

Vergleichende Charakterisierung von DNAMethyltransferasen aus der Maus F. Weißmann, C. Mund, T. Musch, F. Lyko In Zusammenarbeit mit R. Paro, Universität Heidelberg und J. Walter, Universität des Saarlandes

Im Rahmen einer vergleichenden Charakterisierung von DNA-Methyltransferasen haben wir transgene DrosophilaSysteme zur Überexpression aller bekannten Methyltrans-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

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ferasen aus der Maus etabliert. Dies erlaubt uns nun eine detaillierte Analyse ihrer biologischen Funktion. Beispielsweise führt die Überexpression der de novo Methyltransferase Dnmt3a zu schweren Entwicklungsstörungen in der Fliege. Diese Entwicklungsstörungen sind auf die Hypermethylierung des Genoms zurückzuführen. Unsere Experimente zeigen, dass die Hypermethylierung zu einem verzögerten Zellzyklus führt. Darüber hinaus konnten wir auch definierte strukturelle Chromosomenabnormalitäten sowie eine Fehlregulation der epigenetischen Histon-Modifikationen nachweisen. Diese Resultate zeigen, wie Zellen auf die Methylierung ihrer DNA reagieren. Damit können weit reichende Schlussfolgerungen bezüglich der molekularen Wirkungsweise von DNA-Methylierung und ihrer Rolle in der Krebsentstehung gezogen werden.

Untersuchung der DNA-Methylierung in Tumorpatienten T. Musch, F. Lyko In Zusammenarbeit mit M. Wießler, DKFZ, A. Benner, DKFZ, und S. Stilgenbauer, Universität Ulm

Die genomischen Methylierungsmuster von Tumoren unterscheiden sich erheblich von denen gesunder Gewebe. Da die DNA-Methylierung die epigenetische Programmierung der Genexpression reflektiert, würde ein Nachweis von tumorspezifischen DNA-Methylierungsmustern eine sehr frühe und präzise Krebsdiagnose erlauben. Die Untersuchung von genomischen DNA-Methylierungsmustern wird weiterhin durch die chemische Stabilität der Methylierung sowie durch die allgemein hohe Sensitivität der Nachweisverfahren erleichtert. In einer ersten Serie von Experimenten zur Untersuchung von Methylierungsmustern in Krebspatienten haben wir in Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Toxikologie die DNA-Methylierung von Leukämie (B-CLL)-Patienten untersucht. Die Ergebnisse führten zur Identifikation einer Subgruppe von Patienten bei denen verhältnismäßig starke DNA-Methylierung mit aggressiveren Krankheitsverlaufsformen assoziiert ist. Die Therapie dieser Patienten könnte möglicherweise mit Hilfe von Methyltransferase-Inhibitoren gezielt unterstützt werden.

A0700 Epigenetik Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Biophysik verwenden wir deshalb 3-dimensionale Modelle von DNAMethyltransferasen zur Synthese neuer Inhibitor-Moleküle. Darüber hinaus derivatisieren wir das 5-aza-Cytidin (in Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Toxikologie) mit dem Ziel einer weniger toxischen Wirkweise. Die von uns hergestellten Substanzen werden dann in verschiedenen Testsystemen auf ihre Wirksamkeit hin untersucht. Positiv getestete Substanzen sollen schließlich die Grundlage für eine epigenetische Krebstherapie bilden. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] *Ramsahoye, B.H., *Biniszkiewicz, D., Lyko, F., *Clark, V., *Bird, A., *Jaenisch, R.: Non-CpG methylation is prevalent in ES cells and may be mediated by Dnmt3a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 5237-5242. [2] Lyko, F., *Whittaker, A.J., *Orr-Weaver, T.L., and *Jaenisch, R.: The putative Drosophila methyltransferase gene dDnmt2 is contained in a transposon-like element and is expressed specifically in ovaries. Mech. Dev. 95 (2000) 215-217. [3] Lyko, F., *Ramsahoye, B.H., and *Jaenisch, R.: DNA methylation in Drosophila melanogaster. Nature 408 (2000) 538540. [4] Lyko, F. DNA methylation learns to fly. Trends Genet. 17 (2001) 169-172.

Synthese neuartiger DNA-MethyltransferaseInhibitoren R. Garcia Boy, F. Lyko In Zusammenarbeit mit S. Suhai, und M. Wießler, DKFZ

Die Hypermethylierung des Genoms stellt einen wichtigen Schritt in der Entstehung einer Vielzahl von Tumoren statt. Diese Hypermethylierung führt zu Epimutationen, die in einer Fehlsteuerung der epigenetischen Programmierung resultieren. Im Gegensatz zu genetischen Mutationen sind Epimutationen aber reversibel und können beispielsweise durch die Inhibition der DNA-Methylierung wieder ausgelöscht werden. Dies eröffnet völlig neuartige Möglichkeiten in der Krebstherapie. Leider ist der derzeit gebräuchlichste Inhibitor, das 5-aza-Cytidin, äußerst toxisch und kann daher nur in sehr beschränktem Maße eingesetzt werden. In

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung

R0800 Zentrale Proeinanalytik

Zentrale Proteinanalytik (R0800) Leiterin: Dr. Martina Schnölzer Analyse von Peptiden und Proteinen

Wissenschaftl. Mitarbeiter Dr. Tore Kempf Dr. Ulrike Korf (09/00-03/01)

T. Kempf, M. Schnölzer

Gastwissenschaftler Dr. Andrea Urbani , Rom, Italien (07/01 -) Doktoranden Wilma Dormeyer (11/00 -) Technische Mitarbeiter Sabine Fiedler ( - 06/00, 03/01 - 4Std. pro Woche) Gerda Baumann (01/01 - ) Silke Klee (12/00 - 06/01)

Das Hauptinteresse der Einheit „Zentrale Proteinanalytik“ gilt der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen und ihrer posttranslationalen Modifikationen. Für die Analytik stehen der Einheit folgende Geräte zur Verfügung: ein MALDI-TOF-Massenspektrometer (Reflex II, Bruker), ein ESI-Iontrap-Massenspektrometer (LCQ, Thermo Finnigan) und ein Edman-Sequenzer (Procise cLC, Applied Biosystems). Mit Hilfe von Peptidmassenfingerprints und Sequenzinformationen werden die Proteine identifiziert. Die gewonnenen Informationen dienen als Grundlage für die Synthese von Peptiden und Oligonukleotiden, welche als Werkzeuge für weitere Studien eingesetzt werden können. Für Arbeitsgruppen innerhalb und außerhalb des DKFZ werden proteinanalytische Serviceleistungen erbracht. In Forschungskooperationen werden umfangreiche Projekte bearbeitet und neue analytische Verfahren entwickelt. Innnerhalb des angegebenen Zeitraums konnten auf verschiedenen Gebieten Ergebnisse erzielt werden. Neben der Identifizierung und Charakterisierung einzelner Proteine konnten Proteinmodifikationen lokalisiert werden. Im Rahmen weiterer Arbeiten konnten Proteininteraktionen funktionelle Bestandteile von Proteinkomplexen und Proteome analysiert werden.

Identifizierung von Proteinen In Kooperation mit: T. Davis, Arizona Cancer Center, Tucson AZ, USA

Alpha (6) Integrin ist ein Laminin Rezeptor mit einem Molekulargewicht von 140 kDa. Durch massenspektrometrische Analyse, Edman Sequenzierung und die Kombination beider Methoden konnte eine neue 70kDA Variante, das Alpha(6)p Integrin, identifiziert und charakterisiert werden. Die neue Variante konnte in verschiedenen Prostatakrebs- und in einer Lungenkrebs-Zellinie nachgewiesen werden und besitzt eine stark veränderte extrazelluläre Domäne [1]. In Kooperation mit: AM. Estevez, ZMBH, Heidelberg

Das Hefe Exosom ist ein Komplex aus wenigstens 10 3’-5’ Riboexonukleasen. Exosomale Proteine, die in Eukaryonten bei der Reifung vieler RNA Species eine Rolle spielen, finden sich auch in dem einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei, der sich schon sehr früh in der Evolution von anderen Eukaryonten abgespalten hat. Es konnten 8 Proteine identifiziert werden, die zu exosomalen Proteinen aus der Hefe homolog sind. Doch nur einige von diesen sind in einem Komplex assoziiert. Entsprechend ist das Exosom in T. brucei kleiner. Für die Lebensfähigkeit von T.brucei sind sowohl komplexassoziierte als auch freie Homologe essentiell [2]. In Kooperation mit: M. Schmidt-Zachmann, DKFZ A0100

Das Protein NO145 konnte als Hauptkomponente des nukleolaren Cortex in Xenopus laevis Oocyten identifiziert werden. Es ist in einer käfigartigen Struktur rund um den Nukleolus lokalisiert. Während der Ausbildung des Eis kommt es zur spezifischen und schnellen Degradation des Proteins [3]. In Kooperation mit: J. Kuhn, Herz- und Diabetes Zentrum, Bad Oeynhausen

Durch die Übertragung von UDP-Xylose auf ein Serin des Proteoglykan Core Proteins beta-D-Xylosyltransferase wird die Synthese von lateralen Glykosaminoglykanketten in Proteoglykanen angeschaltet. 11 Peptide, die in keiner Datenbank vorhanden waren, konnten sequenziert werden und dienten als Ausgangsbasis zur Produktion spezifischer Antikörper und zur Synthese spezifischer Oligonukleotide [4]. In Kooperation mit: D. Werner, DKFZ B0300

3 Proteine aus Proteinase K- und SDS- und Hochsalz-resistentem Chromatinmaterial konnten als die Serpine spi-1, spi-2 und spi-3 identifiziert werden [5]. In Kooperation mit: S. Schneider, J. Trotter, Universität Heidelberg

Das Oberflächen-Glykoprotein AN2 wird in unreifen Schwannschen Zellen in vitro und in vivo exprimiert und wird herunterreguliert, wenn die Myelingene hochreguliert werden. Damit ist AN2 ein neuer Marker für die Abstammung von Schwannschen Zellen. Durch massenspektro-

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Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung metrische Analysen konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem AN2-Glykoprotein aus Maushirn und NG2 Proteoglykan aus Ratte um homologe Proteine handelt [7].

A0700 Epigenetik

Methodenentwicklung In Kooperation mit: T. Rabilloud, Grenoble, Frankreich

Entwicklung einer Silberfärbemethode, die für den Einsatz in der Massenspektrometrie geeignet ist [13].

Interaktion von Proteinen In Kooperation mit: C. Mertens, I. Hofmann, DKFZ A0100

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Plakophilin 1 und 2 werden in den meisten VertebratenZellen konstitutiv exprimiert. Sie treten in den zwei Splicevarianten a und b auf. Sie kommen im Zellkern und bei epithelialen Zellen an der Plasmamembran innerhalb der desmosomalen Plaques vor. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analyse konnten die Interaktionen von Plakophilin 1a mit intermediären Filamenten und mit Desmoplakin untersucht werden [6]. Als Interaktionspartner von Plakophilin 2 in Kernpartikeln wurden Untereinheiten der RNA Polymerase III und der Transkriptionsfaktor TFIIIB identifiziert [8].

Modifikation von Proteinen In Kooperation mit: R. Benavente, Universität Würzburg

Lamin C2 wird während der Säuger Spermatogenese exprimiert und ist in der Kernhülle lokalisiert. Durch massenspektrometrische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der Aminoterminus von Lamin C2 durch Myristoylierung modifiziert ist. Deletion des aminoterminalen Glycins verhindert die Lokalisation an der Kernhülle [9].

Proteomanalyse In Kooperation mit: R. Hermann, R. Frank, ZMBH, Heidelberg

Mycoplasma pneumoniae ist ein humanpathogenes Bakterium, dessen Genom 816 Kilobasenpaare umfasst und 688 offene Leseraster enthält. Mit Hilfe von 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischen Analysen konnte eine zweidimensionale Proteomkarte mit 350 Proteinen erstellt und diese 224 Genen zugeordnet werden [10]. In Kooperation mit: D. Schadendorf, DKFZ D0900, P. Sinha, Charité, Berlin

Bei einem differentiellen Vergleich des Proteinmusters parentaler Melanomzelllinien mit daraus abgeleiteten chemoresistenten Zelllinien konnten Proteine identifiziert werden, die in chemoresistenten Melanomzelllinien überexprimiert waren [11]. Ein Vergleich des Proteinmusters parentaler humaner Magencarcinom Zelllinien mit daraus abgeleiteten thermoresistenten Zelllinien führte zur Charakterisierung thermoresistenzspezifischer Proteine [12].

Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Davis, T.L.*, Rabinovitz, I.*, Futscher, B.W.*, Schnölzer, M., Burger, F.*, Liu, Y.*, Kulesz-Martin, M.*, Cress, A.E.* (2001) Identification of a novel structural variant of the alpha 6 integrin. J. Biol. Chem. 276(28), 26099-106. [2] Estevez, A.M.*, Kempf, T., Clayton, C.* (2001) The exosome of Trypanosoma brucei. EMBO J. 20(14), 3831-3839. [3] Kneissel, S., Franke, W.W., Gall, J.G., Heid, H., Reidenbach, S., Schnölzer, M., Spring, H., Zentgraf, H., Schmidt-Zachmann, M.S. (2001) A Novel Karyoskeletal Protein: Characterization of Protein NO145, the Major Component of Nucleolar Cortical Skeleton in Xenopus Oocytes. Mol. Biol. Cell 12(12), 3904-3918. [4] Kuhn, J.*, Götting, C.*, Schnölzer, M., Kempf, T., Brinkmann, T.*, Kleesiek, K.* (2001) First Isolation of human UDP-D-Xylose: Proteoglycan Core Protein ß-D-Xylosyltransferase secreted from cultured JAR choriocarcinoma cells. J. Biol. Chem. 276(7), 49404947. [5] Rothbarth, K., Kempf, T., Juodka, B.*, Glaser, T.*, Stammer, H., Werner, D. (2001) Intracellular location and nuclear targeting of the Spi-1, Spi-2 and Spi-3 gene-derived serine protease inhibitors in non-secretory cells. Eur. J. Cell Biol. 80, 341-348. [6] Schneider, S.*, Bosse, F.*, D’Urso, D.*, Müller, H.W.*, Sereda, M.W.*, Nave, K.A.*, Niehaus, A.*, Kempf, T., Schnölzer, M., Trotter, J.* (2001) The AN2 protein is a novel marker for the Schwann cell lineage expressed by immature and nonmyelinating Schwann cells. J. Neurosci. 21, 920-933. [7] Hofmann, I., Mertens, C., Nimmrich, V., Schnölzer, M., Brettel, M., Herrmann, H. (2000) Interaction of plakophilins with desmoplakin and intermediate filament proteins: an in vitro analysis. J. Cell Sci. 113, 2471-2483. [8] Mertens, C., Hofmann, I., Wang, Z., Teichmann, M., Sepehri Chong, S., Schnölzer, M., Franke, W.W. (2001) Nuclear particles containing RNA polymerase III complexes associated with the junctional plaque protein plakophilin 2. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98(14), 7795-800. [9] Alsheimer, M.*, Glasenapp, E. v.*, Schnölzer, M., Heid, H., Benavente, R.* (2000) Meiotic lamin C2: The amino-terminal hexapeptide is myristoylated and essential for the nuclear envelope association. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1312013125. [10] Regula, J.T.*, Ueberle, B.*, Boguth, G.*, Görg, A.*, Schnölzer, M., Herrmann, R.*, Frank, R.* (2000) Towards a two-dimensional proteome map of Mycoplasma pneumoniae. Electrophoresis 21, 3765-3780. [11] Sinha, P.*, Kohl, S.*, Fischer, J.*, Hütter, G.*, Kern, M.*, Köttgen, E.*, Dietel, M.*, Lage, H.*, Schnölzer, M., Schadendorf, D. (2000) Identification of novel proteins associated with the development of chemoresistance in malignant melanoma using two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 21, 3048-3057. [12] Sinha, P.*, Poland, J.*, Schnölzer, M., Celis, J.E.*, Lage, H.* (2001) Characterization of the differential protein expression associated with thermoresistance in human gastric carcinoma cell lines. Electrophoresis 22(14), 2990-3000. [13] Sinha, P.*, Poland, J.*, Schnölzer, M., Rabilloud T* (2001) A new silver staining apparatus and procedure for matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis of proteins after two-dimensional electrophoresis. Proteomics 1(7), 835-40.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Übersicht

Forschungsschwerpunkt Tumorzellregulation Sprecher: Prof. Dr. Friedrich Marks (- 03/02) Pathochemie (B0100) Prof. Dr. med. Volker Kinzel  06221 42-3253, FAX 06221 42-3259 e-mail: [email protected] Biochemische Zellphysiologie (B0200) Prof. Dr. rer. nat. Walter Pyerin  06221 42-3254, FAX 06221 42-3261 e-mail: [email protected] Biochemie der Zelle (B0300) Prof. Dr. rer. nat. Dieter Werner (- 09/01)  06221 42-3407, FAX -3457 e-mail: [email protected] Molekulare Biologie der Mitose (B0400) Prof. Dr. phil. Herwig Ponstingl  06221 42-3408, FAX 06221 42-3460 e-mail: [email protected] Biochemie der gewebsspezifischen Regulation (B0500) Prof. Dr. rer. nat. Friedrich Marks  06221 42-4531, FAX 06221 42-4406 e-mail: [email protected] Differenzierung und Carcinogenese in vitro (B0600) Prof. Dr. med. Norbert Fusenig  06221 42-4507, FAX 06221 42-4551 e-mail: [email protected] Tumorbiochemie (B0700) Prof. Dr. med. Dietrich Keppler  06221 42-2400, FAX 06221 42-2402 e-mail: [email protected] Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) Dr. rer. nat. Peter Angel  06221 42-4570, FAX 06221 42-4554 e-mail: [email protected] Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) PD Dr. rer. nat. Petra Boukamp  06221 42-4516, FAX 06221 42-4551 e-mail: [email protected] Zentrale Spektroskopie (R0400) William E. Hull PhD  06221 42-4515, FAX 06221 42-4554 e-mail: [email protected]

Im Zentrum der Arbeit des Forschungsschwerpunktes Tumorzellregulation steht der Prozess der zellulären Signalübertragung und -verarbeitung. Eine Schlüsselreaktion der zellulären Signalverarbeitung ist die Proteinphosphorylierung. Die dabei beteiligten Enzyme, die Proteinkinasen und Phosphatasen, werden von mehreren Abteilungen untersucht. Auch das Gebiet der Lipidmediatoren, die nahezu jeden zellulären Prozess beeinflussen, werden von mehreren Abteilungen des Schwerpunktes bearbeitet. Die für die Biosynthese von Lipidmediatoren verantwortlichen Enzyme werden zunehmend als Angriffspunkte für krebsverhütende Ansätze diskutiert. Einen speziellen Aspekt der zellulären Signalübertragung stellen Transportkomplexe dar, die u.a. auch für das Ausschleusen von Giftstoffen aus der Zelle verantwortlich sind und deren Überaktivierung eine Ursache für die in der Klinik so gefürchtete Resistenzentwicklung von Tumoren gegen Chemotherapeutika sein kann. Grundlegende Eigenschaften dieser Transportkomplexe sowie Aspekte der sogenannten Multidrogenresistenz werden in mehreren Abteilungen des Schwerpunktes untersucht, wobei das vordringliche Ziel die therapeutische Überwindung der Zytostatikaresistenz darstellt. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten konzentriert sich auf die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen der Zell-Zell und Zell-MatrixWechselwirkungen und ihrer Rolle in der normalen Geweberegeneration sowie der Tumorentstehung und Progression. Funktionelle Analysen von Transkriptionsfaktoren in genetisch veränderten Mäusen und Zellkultursystemen sind ein weiterer wichtiger Bestandteil des wissenschaftlichen Programms des Forschungsschwerpunktes. Die Abteilung Pathochemie befaßt sich mit folgenden Aspekten der zellulären Signaltransduktion: (1) Molekulare Mechanismen und funktionelle sowie strukturelle Konsequenzen von Proteinphosphorylierung/Dephosphorylierung; (2) Mechanismen der Katalyse, Regulation und Hemmung von Proteinkinasen mit dem Ziel der Entwicklung und Verbesserung klinisch anwendbarer Proteinkinase-Inhibitoren; (3) Struktur und Dynamik aktuell interessanter Proteindomänen, speziell die Wechselwirkung des HIV Glykoproteins 120 (gp 120) mit dem T-Zellrezeptor CD4, mit dem Ziel, diese zu hemmen. Hier befinden sich HIV-Hemmstoffe zu therapeutischen Zwecken in Entwicklung. Die Arbeiten der Abteilung Biochemie der Zelle zielen auf die Analyse von zellulären Strukturen und Ereignissen, die für die Proliferation von Zellen von Bedeutung sind. Hierzu gehören die Identifizierung und die molekulare Charakterisierung von Proteinen, die am Proliferationsprozess beteiligt sind oder Bestandteile von Zellzyklus-relevanten Zellstrukturen sind. Dabei gilt das Hauptinteresse den Proteinen des Centrosoms und den chromosomalen Verpakkungsproteinen vom Nicht-Histon-Typ. Der Leiter Prof. Werner ging 2001 in Ruhestand. Weitergeführte Arbeiten gelten der zellbiologischen und funktionellen Identifizierung, Analyse und Revertierung

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation von Zytostatikaresistenz, auch im Rahmen klinischer Kooperationen.

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Die Abteilung Biochemie der gewebsspezifischen Regulation untersucht die molekularen Mechanismen der Tumorentwicklung. Ab März 2002 ist sie auf zwei Arbeitsgruppen aufgeteilt. Die Arbeitsgruppe Differenzierung normaler und neoplastischer Epidermis untersucht die Differenzierungswege des menschlichen Haarfollikels, des größten und komplexesten Anhangsorganes der Epidermis. Die Untersuchungen konzentrieren sich auf die Differenzierung des Follikels unter normalen Bedingungen, und schließen die Veränderungen bei erblichen Haaranomalien sowie bei der Entstehung haarfollikel-abgeleiteter Tumoren ein. Als Differenzierungsmarker dienen die epithelialen Keratine, die Haarkeratine, sowie ihre assozierten Proteine. Die Arbeitsgruppe Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung untersucht molekulare Mechanismen der Eicosanoidwirkung in einfachen und stratifizierten Epithelien des Menschen und der Maus. Insbesondere interessieren in diesem Zusammenhang die physiologische Wundheilung, pathologische, entzündlich-degenerative Erkrankungen und die Entwicklung von Haut-, Brust- und Pankreastumoren. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Funktion und Regulation von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen, den Schlüsselenzymen der Eicosanoidbiosynthese, deren Expression und Aktivität bei diesen Prozessen transient oder permanent gestört ist sowie auf Eicosanoid-abhängige Genexpressionsmuster. Darüber hinaus werden Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen auf ihre Eignung als Zielproteine für chemopräventive Maßnahmen geprüft. Die Untersuchungen der Abteilung Differenzierung und Carcinogenese konzentrieren sich auf Fragen zum molekularen Mechanismus der Zell-Zell Interaktion in der normalen Haut und ihrer Veränderungen im Rahmen der Hautcarcinogenese, insbesondere zur Tumor-StromaWechselwirkung. Im Rahmen der Untersuchungen von Epithel-Mesenchym-Wechselwirkungen bei der Geweberegeneration konnte ein neuer Mechanismus wechselseitiger Regulation über die Induktion parakriner Faktoren aufgezeigt werden. Die Detailanalyse dieser Steuerungsmechanismen und ihrer zunehmenden Entgleisung bei der Tumorprogression soll helfen, das autonome Wachstum von Tumorzellen in vivo besser verstehen und beinflussen zu können. An einem von uns entwickelten Hautcarcinogenese-Modell wird die Wachstumsregulation und TumorStroma-Wechselwirkung an verschiedenen Tumor-Entwicklungsstadien an Transplantations- und ZellkulturModellen untersucht. Derzeit im Vordergrund stehen Arbeiten zum Mechanismus der Tumor-Angiogenese und deren Blockade als Tumor-therapeutisches Prinzip. Diese neuen Tumortherapieverfahren werden in Zusammenarbeit mit anderen Gruppen und Industriefirmen mechanistisch analysiert und für den praktischen Einsatz vorbereitet. Das Forschungsprogramm der Abteilung Tumorbiochemie konzentriert sich auf die molekulare und kinetische Charakterisierung von Membrantransportern. Die Hemmung von Transportern der MRP-Familie, die für eine

Übersicht Mehrfachresistenz gegen Zytostatika verantwortlich sind, ist ein wichtiges Ziel bei der Verbesserung der klinischen Chemotherapie von Tumoren. Die Produkte von Resistenz-Genen und die Produkte der MRP-Genfamilie, welche mehrere Konjugat-Exportpumpen normaler und maligner Zellen umfaßt, werden nach gezielter Mutagenese mit zellbiologischen und transportkinetischen Methoden untersucht. Die Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung von Membrantransportern umfaßt auch Proteine, die für die Aufnahme physiologischer und zytotoxischer Substanzen in die Zelle verantwortlich sind und zur Familie der „organic anion transporting polypeptides“ (OATPs) zählen. Die Abteilung Molekulare Biologie der Mitose hat sich zum Ziel gesetzt, molekulare Mechanismen nachzuweisen, die den Ablauf von Zellteilungen regeln, ihre Störungen in Tumoren aufzuklären und neue Wege zur therapeutischen Hemmung unkontrollierter Zellteilungen zu finden. Den Schwerpunkt dieser Arbeiten bildet die Analyse des sogenannten RCC1-Ran-Regulationsweges (RCC = regulator of chromosome condensation). Dieser Signalübertragungsweg ist an der Kontrolle der DNA-Replikation und der Zellteilung sowie am Kerntransport von Proteinen und an der Prozessierung von mRNA beteiligt. Die Klärung der Regulationsmechanismen sowie ihrer Störungen soll dazu beitragen, Möglichkeiten zur gezielten Hemmung dieses Regulationsweges zu finden. Die Projektgruppe Biochemische Zellphysiologie arbeitet an der Aufklärung von Pathomechanismen proliferativer Prozesse. Zum einen werden Mechanismen untersucht, die durch Proteinkinase CK2 (Caseinkinase II) kontrolliert werden, einer lebenswichtigen, hoch konservierten Phosphotransferase, die an Signalvorgängen und Genexpressionen beteiligt und deren ungestörte Gegenwart Voraussetzung für das (Wieder)Eintreten von Zellen in den Zellzyklus ist. Insbesondere wird systematisch und genomumfassend nach Genen gesucht und ihre funktionelle Bedeutung charakterisiert, deren Expression von CK2 kontrolliert wird und die mit dem Auslösen der Zellproliferation verknüpft ist. Um zu erfahren, wie der Kontrolleur selbst kontrolliert wird, werden molekularphysiologisches Verhalten der CK2 sowie Struktur und Transkriptionskontrolle der CK2-kodierenden Gene analysiert. Zum anderen hat die Gruppe mit Untersuchungen zur zellulären und molekularen Biologie normaler und entarteter Knochenzellen begonnen und versucht mittels Chips-basierter Verfahren Gene zu identifizieren und in ihren zellulären Rollen zu charakterisieren, deren Expression mit Tumor-assoziierten Knochenerkrankungen und Knochenschmerz korrelieren. Damit sollen Ansatzpunkte für individualisierte Diagnose- und Therapieverfahren gefunden werden. Die Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle untersucht die Mechanismen der Signalübertragung von physiologischen und pathologischen extrazellulären Signalen (Strahlung und andere genotoxische

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Übersicht

Substanzen mit kanzerogenen oder tumorpromovierenden Eigenschaften) und die dadurch ausgelösten Veränderungen in der Expression spezifischer Gene. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Funktion und Regulation von Untereinheiten des Transkriptionsfaktors AP-1 (Fos/Jun) und der Identifizierung und funktionellen Analyse von AP-1 Zielgenen durch Genom-weite Expressionsanalyse. Es werden sowohl genetisch veränderte Mäuse (transgene und knockout Mäuse) als auch davon abgeleitete in vitro Zellkultursysteme eingesetzt, um die spezifische Funktion dieser Untereinheiten bei der Zellproliferation, Transformation, Apoptose, Embryonalentwicklung, Angiogenese und Regeneration der Haut aufzuklären. Durch die Etablierung krankheitsrelevanter Tiermodelle und davon abgeleitete in vitro Systeme versuchen wir die molekularen Ereignisse der Krebsentstehung auf der Ebene der Genregulation zu verstehen. Seit Oktober 1999 ist der Abteilung eine selbständige Arbeitsgruppe Hormonwirkung und Signaltransduktion angegliedert, die von Frau PD Dr. Doris Mayer geleitet wird und sich mit dem Einfluß von Steroidhormonen auf die Entstehung von Tumoren befaßt. Das Ziel der neu gegründeten Abteilung Genetik der Hautcarcinogenese ist, genetische Veränderungen zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren, die bei der Entwicklung von UV-bedingten Hautcarcinomen eine Rolle spielen. In der dem Forschungsschwerpunkt angegliederten Zentralen Spektroskopie (ZS) wird, neben der routinemäßigen analytischen Dienstleistung (Aufklärung von Molekülstrukturen mittels Kernspinresonanz (NMR), Massenspektrometrie (MS) sowie IR- und UV-Spektroskopie), an der Entwicklung und Anwendung neuer Analyse-Verfahren in der Krebsforschung gearbeitet. Die Schwerpunkte der MSAnwendungen sind Phospholipid-, Protein- und Peptidanalytik. Mit der MR-Spektroskopie bzw. Hochfeld-MRBildgebung in vivo werden u.a. Pharmakokinetik, Tumormetabolismus und Metastasenwachstum untersucht. Im Bereich „molecular modeling“ wird ein über das Internet benutzbares Informationssystem bereitgestellt und Untersuchungen zur Konformation und Dynamik von Oligosacchariden und Glykoproteinen, sowie über denen Wechselwirkungen werden durchgeführt.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0100 Pathochemie

Abteilung Pathochemie (B0100) Leiter: Prof. Dr. Volker Kinzel

Proteinkinasen der Zelloberfläche und extrazelluläre Proteinphosphorylierung

Senior Wissenschaftler Dr. Dirk Bossemeyer PD Dr. Dieter Kübler Prof. Dr. Jennifer Reed

D. Kübler, D. Gosenca In Zusammenarbeit mit Prof. I. Friedberg, Universität Tel Aviv, Israel; W.D. Lehmann, M. Wind, H. Heid, DKFZ Zusatzfinanzierung: DKFZ-Israel Kooperation

Post-docs Dr. Michael Gaßel (01-) Dr. Dan Mihailescu (00Gastwissenschaftler Dr. Saturnino Herrero (01-)

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Doktoranden Karin Bettinger (01-) Frank Gesellchen Darko Gosenca Anna Lisa Picciolo (- 00) Andreas Schlosser (zusammen mit R0400) Thorsten Schneider (- 01) Techniker/innen Hannelore Horn (1/2) Norbert König James Richards Ursula Stanior Die Abteilung befaßt sich mit molekularen Aspekten der zellulären Signaltransduktion: - mit Liganden/Rezeptor-Wechselwirkungen, der Steuerung des Zellzyklus durch exogene Faktoren und schwerpunktmäßig - mit Proteinkinasen, deren Hemmung und Aspekten der Proteinphosphorylierung. Die reversible Proteinphosphorylierung ist ein universelles Werkzeug zur schnellen Steuerung der biologischen Aktivität von Proteinen. Auch beim Wachstum von Krebszellen spielt sie eine große Rolle. Das Verständnis dieser Reaktion erfordert die Kenntnis der für Proteinphosphorylierung verantwortlichen Schlüsselenzyme - der Proteinkinasen - auf molekularer Ebene bis hin zu ihrer Regulation, Funktion und Hemmung bei der lebenden Zelle. Proteinkinase-Hemmstoffe werden bereits zur Therapie verschiedener Krebsformen eingesetzt. Überraschend wenig ist über die reversiblen Konsequenzen der Proteinphosphorylierung für die Struktur von Peptiden bekannt. Als Beitrag dazu interessieren uns Teilaspekte, die sich z.B. aus dem Vergleich von Dephosphound Phosphopeptiden ergeben. Um eine ebenfalls reversible Strukturveränderung bei Peptiden und dafür verantwortliche Faltungsmotive geht es in einem HIV-Projekt, bei der Milieu-bedingte Veränderungen, wie sie bei LigandenRezeptor-Wechselwirkungen stattfinden, eine Rolle spielen.

An Zellentwicklung und Einbindung in die zelluläre Umgebung sind enzymatische Aktivitäten der Zelloberfläche beteiligt. Durch diese Enzyme können sowohl gebundene Substrate auf der Zelloberfläche als auch fremde Substrate aus der Zellumgebung verändert werden. Die von uns in den letzten Jahren an vielen Zellen nachgewiesenen Ser/Thr Proteinkinasen an der Zelloberfläche (Ekto-PK) besitzen Eigenschaften cAMP-abhängiger PK (PKA) und von Proteinkinasen CK1 und CK2. Ekto-CK1 und CK2 können im Tandem von intakten Zellen in das extrazelluläre Kompartiment freigesetzt werden, womit der Wirkungsbereich der enzymatischen Aktivität erweitert ist. Ekto-PK ermöglichen es Zellen, Substratproteine in ihrer biologischen Wirkung spezifisch zu verändern. Damit zeigen unsere Befunde, dass das mächtige Werkzeug der Proteinphosphorylierung auch außerhalb der Zellen genutzt wird und als Mechanismus der extra-intrazellulären Signalvermittelung wirkt. Eine inzwischen große Zahl von Literaturdaten zu normalen und maligne veränderten Prozessen unterstreicht diese zentrale Rolle extrazellulärer Proteinphosphorylierung. Ekto-PK und ihre Substrate bieten somit vermutlich wichtige pharmakologische und therapeutische Ziele. Ekto-PK-Substrate der Zelloberfläche können mittels radioaktiver Markierung sichtbar gemacht werden. und zeigen sich nach SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie als Zelltyp-spezifische Spektren von Phosphoproteinen. Einzelne dieser Ekto-Substrate sind relativ hoch markiert und kommen häufig bei Zellen vor. Durch biochemische und immunologische Analysen einschließlich Mikrosequenzierung und Massenspektroskopie-Daten ist es uns gelungen, pp120 als ein weiteres dieser stark phosphorylierten Zelloberflächenproteine zu charakterisieren [1]. Es wurde als Homologes eines bisher nur intrazellulär (besonders im Nukleolus) nachgewiesenen Proteins enttarnt. Die funktionelle Charakterisierung dieses sowie anderer Ekto-Substrate, die Mechanismen ihrer Expression als Zelloberflächenproteine und vergleichende Untersuchungen an Normal- und Tumorzellen sind Ziele laufender Arbeiten. Zu den Substraten der Ekto-PK gehören Moleküle mit unterschiedlichen Funktionen wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Entzündungsmediatoren oder Komponenten der extrazellulären Matrix. In Zusammenarbeit mit I. Friedberg (Tel Aviv) wurden Untersuchungen zur Funktion von extrazellulären Nukleotiden (ATP) als Zellproliferationshemmer von transformierten und Tumorzellen durchgeführt. Die ATP-induzierte Zellwachstumshemmung korreliert mit der Inaktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptor gekoppelter

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Tyrosinkinase-Aktivität und nachgeschalteter Signalwege. Die durch Ekto-PK katalysierte Phosphorylierung eines extrazellulären kleinen Proteins, das als Abkömmling eines Plasma-Glykoproteins identifiziert wurde, ist für die Zellwachstumshemmung entscheidend. Untersuchungen zur Herstellung dieses Wachstumsinhibitors aus Vorstufen, seine (Phospho-)Aktivierung sowie die Suche nach Rezeptoren auf Zielzellen und nachgeschalteter Signalwege sind Schwerpunkte für das Verständnis der Mechanismen der ATP-induzierten Tumorzellhemmung.

Bioregulation der cAMP-abhängigen Proteinkinase D. Bossemeyer, S. Herrero de Vega, M. Gassel, N. König, V. Kinzel In Zusammenarbeit mit Dr. R.A. Engh, Roche-Diagnostics Penzberg; Prof. Dr. R. Huber und Dr. T. Holak, MPI für Biochemie, Martinsried; Prof. Dr. F.W. Herberg, Ruhruniversität Bochum; W.-D. Lehmann, A. Schlosser, DKFZ Zusatzfinanzierung: Roche-Diagnostics, Penzberg

Die Mehrzahl aller menschlichen Krebserkrankungen und viele andere Krankheiten sind eng mit der Fehlregulation von Proteinkinasen verknüpft. Proteinkinasen als zentrale Schalter der zellulären Regulation und Signaltransduktion phosphorylieren Proteine, wodurch deren Funktionszustand reversibel geändert wird. Der Grundzustand der meisten Proteinkinasen ist allerdings der der Inaktivität, ihre pathologischen Wirkungen resultieren in der Regel aus ihrer Überexpression oder Daueraktivierung. Hemmstoffe für die Aktivität von Proteinkinasen sind daher äußerst vielversprechende Agenzien in der Tumortherapie mit z. t. überwältigenden therapeutischen Erfolgen bei nur geringen Nebenwirkungen. Dies zeigt eindrucksvoll das Beispiel des Proteinkinaseinhibitors STI571 (Gleevec) bei der Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie. Dieser wurde auf der Basis der Struktur der ATP-Bindestelle von Proteinkinasen, wie sie von uns für die cAMP-abhängige Proteinkinase 1993 mit als erstes vorgelegt wurde, maßgeschneidert. Ein großes Hindernis bei der strukturbasierten Entwicklung von selektiven Proteinkinaseinhibitoren ist der Mangel an Kristallstrukturen therapeutisch relevanter Proteinkinasen. Von den über 600 verschiedenen Proteinkinasen des menschlichen Genoms sind bisher noch nicht einmal 5% kristallisiert. Die Arbeitsgruppe versucht daher, auf zwei Wegen räumliche Strukturinformationen von Proteinkinasen für die Inhibitorentwicklung zu gewinnen. Der direkte Weg führt über die rekombinante Expression, Reinigung und Kristallisation von Proteinkinasen, z. Z. überwiegend aus der Gruppe der AGC-Kinasen, zu der u. a. so wichtige Vertreter wie PKA, PKC, PDK1, PKB gehören. Hierzu werden sowohl bakterielle als auch eukaryontische (Insektenzell-) Expressionsysteme eingesetzt. Der indirekte Weg führt über die katalytische Untereinheit der PKA. Kokristallisationsstudien mit Proteinkinaseinhibitoren lassen Rückschlüsse darauf zu, welche Faktoren und Eigenschaften für die Bindung von Inhibitoren eine Rolle spielen [2]. Hierzu wurden von uns schon in der Vergangenheit eine Reihe von Kristallstrukturen von Proteinkinase/Inhibitorkomplexen veröffentlicht. Wegen der

Abteilung B0100 Pathochemie hohen Konserviertheit des katalytischen Kerns von Proteinkinasen lassen sich bestimmte Eigenschaften und strukturelle Charakteristika anderer, verwandter Kinasen durch gerichtete Mutagenese von PKA nachahmen (dabei entstehen sogenannte Surrogatkinasen). Dieser Weg bietet den Vorteil der leichten Gangbarkeit, da für PKA vielfältige Aktivierungs- Reinigungs- und Kristallisationssysteme entwickelt wurden, die sich längst im Routineeinsatz bewährt haben. Um eine möglichst breite und solide Basis für die Entwicklung neuer Hemmstoffe zu schaffen, versuchen wir darüber hinaus, die strukturellen und funktionellen Mechanismen der Katalyse und der zellulären Inaktivierungsprozesse von Proteinkinasen zu verstehen. Hierzu kombinieren wir strukturelle Analysen [3], gerichtete Mutagenesen von ausgewählten Aminosäureresten und konservierten Strukturelementen und funktionelle sowie kinetische Studien, z. B. mittels Surface Plasmon Resonanz. Ein natürlicher Regelmechanismus von Proteinkinasen führt über die Phosphorylierung dieser Enzyme. PKAc z. B. verfügt, je nach Isoform, über mindestens 4 Phosphorylierungsstellen. Mit diesen Phosphorylierungen haben wir uns in einer Reihe von massenspektrometrischen Untersuchungen beschäftigt [4,5]. Außerdem gelang es uns, die unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften dieser Phosphorylierungsstellen mittels NMR-Spektroskopie zu verstehen [6]. Die Wirkung zahlreicher Hormone wird über Änderungen des intrazellulären cAMP-Spiegels vermittelt. Hauptwirkort dieses sekundären Botenstoffes ist ein einziges Enzym, PKA. Die vielfältigen und für das jeweilige Hormon spezifischen zellulären Antworten lassen sich nur durch subzellulär unterschiedliche Verfügbarkeiten und individuell besondere Eigenschaften von PKA und PKA-Isoenzymen erklären. Genetisch kennt man Cα, Cβ, Cγ, sowie Cβ2 (entdeckt und kloniert in der Abteilung), und einige andere Splicevarianten. Cβ2 ist insofern ungewöhnlich, als es eine aminoterminale Extradomäne aufweist. Gegenwärtig untersuchen wir die Rolle von Cβ2 und seiner Extradomäne im Hinblick auf biochemische und biologische Wirkungen, wie Regulation, Protein-Proteinwechselwirkung, Translokation und Substraterkennung. Wir haben gefunden, dass Cβ2, welches ubiquitär in Säugern und auch in Vögeln vorkommt, funktionell einen Mangel an Cα ausgleichen kann [7]. Auf der Proteinebene wurden zwei isoelektrische Ladungsvarianten der Proteinkinase A detektiert und in der Abteilung charakterisiert. Dies führte zur Entdeckung einer konservierten in vivo Deamidierungsstelle am Aminoterminus aller myristoylierten PKAc Isoformen, möglich nur unter Einsatz massenspektrometrischer Techniken, wie bereits zuvor publiziert. Unser Verständnis der funktionellen Rolle dieser Deamidierungsstelle beginnt sich aus der Untersuchung lebender Zellen abzuzeichnen. Die intrazelluläre Verteilung und Lokalisation wird demnach in hohem Maße durch diese posttranslationale Modifikation bestimmt. Als Folge wird die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB (cAMP-responsive element binding protein) durch PKA beeinflusst. Darüber hinaus wurde der eigentliche Prozess der Deamidierung von PKA, der von

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Razemisierungen begleitet wird, von uns bis ins Detail untersucht [8,9,10,11].

wirkungen im allgemeinen betrifft, zum anderen, wie posttranslationale Strukturveränderungen die biologische Aktivität beeinflussen.

Kontrolle des Zellzyklus am G2/Mitose Übergang

Der Konformations-Schalter im HIV1 Hüllprotein

V. Kinzel, N. König, J. Richards In Zusammenarbeit mit W. D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind DKFZ

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Abteilung B0100 Pathochemie

Bei vielzelligen Organismen wird die Vermehrung der Zellen durch meist reversible Hemmung an physiologischen Restriktionspunkten im Zellzyklus, teils in G0, teils in G2 Phase vor der Zellteilung (Mitose, M) kontrolliert. ProteinPhosphorylierungs- und Dephosphorylierungsvorgänge spielen dabei eine Schlüsselrolle und damit implicite die dafür verantwortlichen Katalysatoren, Proteinkinasen und Proteinphosphatasen. Die Kenntnis deren Regulation auf molekularer Ebene ist daher Voraussetzung für das Verständnis der normalen sowie der gestörten Zellzykluskontrolle. Wir befassen uns mit der Regulation der Proteinphosphatase 2A (PP2A) am Übergang von G2 Phase in die Mitose. Dazu gab es bisher in der Literatur nur indirekte Hinweise. Es gelang erstmals, die Hemmung der PP2A am G2-M Übergang und in Mitose direkt zu zeigen [Klingler M. Dissertation 1999]. Vermutlich wird dabei die katalytischen Untereinheit der PP2A (PP2Ac) phosphoryliert , wie mit Antikörpern erhaltene Befunde andeuten.

Der Befund dieser Gruppe, daß die CD4 Bindungsdomäne des Glykoproteins gp120 von HIV1 einen konservierten Konformations-Schalter enthält, d.h. einen Abschnitt, der eine kooperativen Umfaltung von einer β-Struktur zu einer 310 Helix bei Membranbindung erfährt, ermöglichte zwei Ansätze für eine neue Form anti-viraler Therapie. Beide zielen auf die Blockade des initialen Infektionsschrittes, der Bindung des Virus an den CD4 Rezeptor von Wirtszellen. Die Tatsache, daß die kooperative Umfaltung der Schalterdomäne absolut nötig ist zur Bindung an CD4, führte zur Suche nach Verbindungen, die diese Kooperativität hemmen. Die Suche war erfolgreich. Diese Substanzen verhindern in der Tat die Rezeptorbindung des gp120 Fragments an CD4 exprimierende Zellen. Im Zuge der Verfeinerung mit Hilfe von QSAR und Molekülmodellierung wurden Umfalt-Hemmer hergestellt mit einer ID50 im niedrigen nanomolaren Bereich, die auch nicht toxisch waren in Zellkulturen. An diesem Punkt schien das Projekt reif für eine industrielle Weiterentwicklung, die mit einer Steinbeis GMBH eingeleitet wurde (Transferzentrum für angewandte Biologische Chemie und Transferzentrum Glykoconjugate).

In Zusammenarbeit mit: Prof. J.C. Smith, Universität Heidelberg, Prof. Dr. Langosch, Technische Universität München Zusatzfinanzierung: HGF Strategiefond, VW-Stiftung

Das hohe Maß der Konservierung der Faltungseigenschaften der CD4 Bindungsstelle von gp120 - trotz einer erheblicher Sequenzvariabilität - eröffnet zusätzlich einen neuen immunologischen Ansatz. Die Strategie besteht in der präzisen Bestimmung des Peptid-Rückgrats dieser Domäne in freier, d.h. nicht an CD4 gebundener Form. Die diversen Aminosäuresequenzen in diesem Bereich der verschiedenen HIV1 Stämme kann dann auf die konservierte Rückgratstruktur aufmodelliert und die so erzeugten, Molekül-Oberflächen auf Ähnlichkeiten bezüglich der Ladungsverteilung, Hydrophobizität, sterische Charakteristika etc. überprüft werden. Sofern sich dann Regionen mit konservierten Oberflächeneigen-schaften identifizieren lassen, könnten sie als Schablone zur Herstellung eines Antigens dienen, das eine vom Virus-Stamm unabhängige Immunantwort auslösen kann.

In jüngster Zeit wurde immer deutlicher, daß in einer Reihe von Fällen Domänen eines Proteins, die für eine bestimmte Funktion verantwortlich sind, in isolierter Form - ohne den Kontext der nativen Proteinmatrix - sowohl ihre Struktur als auch ihre Funktion bewahren. Dies erleichtert Untersuchungen von Struktur-Funktionsbeziehungen bei solchen Domänen ganz erheblich, weswegen solche Studien heute in der medizinischen Grundlagenforschung sowie bei der gezielten Entwicklung von Medikamenten üblich sind. Diese Gruppe benützt biophysikalische Techniken wie Cirkulardichroismus- (CD) und magnetische Kernresonanz-spektroskopie (NMR) in Verbindung mit computergestützter Molekülmodellierung zur Analyse kritscher Kontrollaspekte bei Proteindomänen von medizinischem Interesse - zum einen, was Liganden-Rezeptor Wechsel-

Die starke Tendenz zur Aggregation erlaubte bisher keine NMR Messungen der Rückgrat-Struktur der verschiedenen CD4 Bindungsdomänen unter polaren Bedingungen (Lindemann et al., eingereicht). Wir haben dieses Problem dadurch gelöst, daß wir den unter apolaren Bedingungen ermittelten NMR Strukturen mit Hilfe molekulardynamischer Berechnungen erlaubten, in simuliertem Wasser zu relaxieren [12] (Mihailescu et al., submitted). Sie mündeten alle in dieselbe Grundstruktur, die dann für die Modellierung der Molekül-Oberflächen unterschiedlicher Sequenzen ( 19 von insgesamt 8 HIV1 clades, der Gruppen M und O) herangezogen wurden. Dabei ergab sich ein übereinstimmendes, zum Pharmakophor geeignetes Phantom für den Entwurf eines stammübergreifenden Antigens zur Vakzine-Entwicklung.

Ziel ist nun, zu zeigen, ob Immunreaktivität und an Protein gebundenes Phosphat einander entsprechen, d.h. der physikalische Nachweis. Dafür ist isolierte PP2Ac nötig, deren Reinigung aus synchronen Zellen inzwischen annährend quantitativ in einem Schritt gelingt. Sobald die auf Phosphorylierung hinweisende Immunreaktivität dieser PP2Ac stabil gehalten werden kann, soll das Protein mit Hilfe der Massenspektrometrie analysiert werden.

Strukturdeterminanten von Proteinen J. Reed, K. Bettinger, D. Mihailescu

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Post-translationale Modifikationen Obwohl post-translationale Modifikationen bekannterweise ganz entscheidend sind für die Regulation von ZellWachstum und Stoffwechsel, so ist doch nur in ganz wenigen Fällen die Art und Weise bekannt, wie sie die Funktion von Proteinen ändern. Deshalb haben wir untersucht, wie solche Modifikationen, speziell Phosphorylierung, die Protein-Struktur lokal wie auch global beeinflussen [13]. Mit Hilfe von CD- und NMR-Messungen wurden an nativen wie auch künstlichen Peptidsequenzen die strukturellen Konsequenzen von Phosphorylierung, Deamidierung und Myristoylierung gemessen. Dabei ergab sich erstmals, daß Phosphorylierung direkt den bevorzugten Dihedral-Winkel des Peptid-Rückgrats am modifizieten Aminosäurerest verändert. Untersuchungen der interaktiven Effekte multipler Modifikationen am N-Terminus der katalytischen Untereinheit der PKA als Modell haben gezeigt, wie diese in synergistischer Weise Struktur und Membran-Affinität beeinflussen [14].

Fusionsfördernde Peptide Die Fusion von biologischen Membranen ist essentiell bei zahlreichen zellulären Prozessen und unterliegt vielen mikrobiellen Infektionen. Meist wird sie in gezielter Weise durch einen Satz spezialisierter Peptide induziert. Es wäre medizinisch nützlich, diesen Vorgang kontrollieren zu können, doch ist nicht bekannt, wie fusionsfördernde Peptide arbeiten. In einem von der VW Stiftung geförderten Projekt versuchen wir herauszufinden, welche Eigenschaften dieser ziemlich kurzen Peptide für die Fusion verantwortlich sind. Mit Hilfe synthetischer Peptide, die die fusionsfördernden Signale von Synaptobrevin II und Syntaxin 1A nachahmen, konnten wir zeigen, daß die fusionsfördernde Wirkung mit deren Fähigkeit gekoppelt ist, 1) selbst mit einander zu assoziieren und 2) dabei β-Struktur anzunehmen [15]. Helix-fördernde Maßnahmen verringerten die fusionsfördernde Wirkung. Diese Untersuchungen sollen auf fusionsfördernde Sequenzen des vesicular stomatitis Virus ausgedehnt werden, um zu sehen, ob hier ein allgemeiner Mechanismus vorliegt. Die Aufklärung der zur Membranfusion erforderlichen Sequenzeigenschaften könnte die Entwicklung von Peptiden erlauben, mit deren Hilfe eine spezifisch gezielte, liposomale Applikation von Medikamenten möglich wird.

Peptidsequenzen mit Schaltereigenschaften Der Konformations-Schalter der CD4 Bindungsdomäne von HIV1 gp120 ist kein Einzelfall. Wir haben in zahlreichen anderen Proteinen spezifische Sequenzen mit polaritätsgesteuertem Konformations-Schalter identifiziert. Wir sind nun dabei zu untersuchen, ob solche Schalter einen allgemeinen Mechanismus zur Förderung von ProteinMembran- und Protein-Protein-Wechselwirkungen darstellen und wie sie identifiziert werden könnten. Die Fähigkeit, zu benennen, welche Eigenschaften eine Schaltersequenz als solche kennzeichnen und welche Wechselwirkungen dadurch gesteuert werden, würde die Vorhersage von Proteinfunktionen allein aus Kenntnis der Sequenz stark erweitern - ein vitaler Aspekt in der Post-Genom Ära.

Abteilung B0100 Pathochemie Kooperationen Die Erfahrungen auf dem Gebiet der CD-Analysen der Sekundärstruktur von Proteinen haben zu einer Reihe Kooperationen geführt, die alle innerhalb des oben skizzierten Forschungsrahmens angesiedelt sind [16,17,18,19]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Kübler, D. (2001) Ecto-protein kinase substrate p120 revealed as the cell-surface-expressed nucleolar phosphoprotein Nopp140: A candidate protein for extracellular Ca2+-sensing. Biochem. J. 360, 579-587 [2] *Engh, R.A., Bossemeyer, D. (2002) Structural aspects of protein kinase control - role of conformational flexibility. Pharmacology & Therapeutics, in press [3] *Engh, R.A., Bossemeyer, D. (2001) The protein kinase activity modulation sites: Mechanisms for cellular regulation - targets for therapeutic intervention. Adv. in Enzyme Regulation 41, 121-149 [4] Schlosser, A., Lehmann, W.D. (2000) Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low energy collision-induced dissociation of peptides. J. Mass Spectrom. 35, 1382-1390 [5] Schlosser. A., Pipkorn, R., Bossemeyer. D., Lehmann, W.D. (2001) Analysis of protein phosphorylation by a combination of elastase digestion and neutral loss tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry 73, 170-176 [6] *Seifert, M.H., *Breitenlechner, Ch., Bossemeyer. D., *Huber, R., *Holak, T.A., *Engh, R. (2002) Phosphorylation and flexibility of cyclic-AMP dependent protein kinase (PKA). using 31P NMR spectroscopy. Biochemistry, in press [7] Thullner, S., Gesellchen, F., Wiemann, S., Pyerin, W., Kinzel, V., Bossemeyer, D. (2000) Cß2 - A splice variant ofthe Cß subunit ofthe cAMP-dependent protein kinase characterized at the protein level. Biochem. J. 351, 123-132 [8] Pepperkok, R., Hotz, A., König, N., Girod, A., Bossemeyer, D., Kinzel, V. (2000) Intracellular distribution ofmammalian protein kinase A catalytic subunit altered by conserved Asn2 deamidation. J. Cell Biol. 148, 715-726 [9] Lehmann, W.D., Schlosser, A., Erben, G., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Kinzel, V.(2000) Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Protein Science 9, 22602268 [10] Kinzel, V. , König, N., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Lehmann, W.-D. (2000) The amino terminus of PKA catalytic subunit - a site for introduction of posttranslational heterogeneities by conserved deamidation: D-Asp2 and D-isoAsp2 containing isozymes: Protein Science 9, 2269-2277 [11] *Eberle, H.B., *Serrano, R.L., *Radke, S., *Füllekrug, J., Schlosser. A., Lehmann, W.D., *Lottspeich, F., *Kaloyanova, D., *Wieland, F.T., *Helms, J.B. (2002) Identification and characterization of a novel human plant-pathogenesis related protein that localizes to lipid-enriched microdomains in the Golgi complex. J. Cell Sci., in press [12] Mihailescu, D., *Smith, J.C., Reed, J. (2002) Solution structure of a putative HIV1 immunogenic peptide: Computer simulation of the principal CD4 binding domain of gp120. J. Med. Chem. 45, 1019-1025 [13] *Eidenmüller, J., *Fath, T., *Pool, M., *Hellwig, A., Reed, J., *Sontag, E., *Brandt, R. (2000) Structural and functional implications oftau hyperphosphorylation: Information from paired helical filament (PHF)-like tau phosphomutants. Biochemistry 39, 13166-13175 [14] Tholey, A., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Kinzel, V., Reed, J. (2001) Influence of myristoylation, phosphorylation and deamidation on the structural behaviour of the N-terminus of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. Biochemistry 40, 225-231

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0100 Pathochemie

[15] *Langosch, D., *Crane, J.M., *Brosig, B., *Hellwig, A., *Tamm, L.K., Reed, J. (2001) Peptide mimics of SNARE transmembrane segments drive membrane fusion depending on their conformational plasticity. J. Mol. Biol. 311,709-721 [16] Hofmann, I., Mücke, N., Reed, J., Herrmann, H., Langowski, J. (2000) Physical characterization of plakophilin 1 reconstituted with and without zinc. Eur. J. Biochem 267, 4381-4389 [17] *Schneikert, J., *Hübner, S., *Langer, G., *Petri, T., *Jäättelä, M., Reed, J., *Cato, A.C.B. (2000) Hsp70-RAP46/chaperonecochaperone interaction in downregulation ofDNA binding by the glucocorticoid receptor. EMBO J.19, 6508-6516 [18] Pfrepper, K.-I., Reed, J., *Rackwitz, H.-R., Schnölzer, M., Flügel, R.M. (2001). Characterization of peptide substrates and viral enzyme that affect the cleavage site specificity of the human spumaretrovirus protease. Virus Genes 22, 61-72

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[19] *Simons, A., *Ruppert, T., *Schmidt, C., *Schlicksupp, A., Pipkorn, R., Reed, J., *White, A.R., *Bayer, T.A., *Cappai, R., *Multhaupt, G. (2002) Copper binding of APP-family members in an evolutionary reconstruction. J. Biol. Chem., in press

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

B0200 Biochemische Zellphysiologie

Biochemische Zellphysiologie (B0200) Leiter: Prof. Dr. Walter Pyerin Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Karin Ackermann Dr. Andreas Krehan, (-07/00) Dr. Bernd Sorg Doktoranden Thomas Barz Oliver Böcher (-06/01) Gaelle Dubois (gem. m. Dr. R. Eils, H0900, DKFZ) Sabine Eisenberger Godehard Hoppe Kerstin Knerr Diplomanden Patrizia Bastone (-11/01) Jochen Gerber (-12/01) Tanja Neidhart Elke Schultz (-08/01) Anja Strasser (-03/01) Techniker Michael Emmenlauer Andrea Waxmann

Wir untersuchen Pathomechanismen proliferativer Prozesse in zwei miteinander verzahnten Schwerpunkten. Zum einen analysieren wir einen konkreten Steuerungsmechanismus zellulärer Funktionen, den Proteinkinase-CK2Komplex, zum anderen Zusammenhänge von Genexpressionen mit Tumor-assoziierten Knochenerkrankungen. Proteinkinase CK2 ist eine hoch konservierte tetramere Ser/Thr-Phosphotransferase bestehend aus zwei katalytischen Untereinheiten (CK2α und/oder CK2α‘) und zwei regulatorischen Untereinheiten (CK2β). CK2 verhält sich janusköpfig. Einerseits lebenswichtig, kann CK2 andererseits Onkogencharakter entwickeln. Störungen von Aktivität oder Struktur ändern das Proliferationsverhalten von Zellen und in Modellsystemen wie Hefe oder Maus den Phänotyp. Zusammen mit der breiten Palette bekannter oder vermuteter CK2-Interaktionspartner, weist dies auf Beteiligung an einer großen Zahl zellulärer Funktionen hin. Trotz intensiver Arbeit in verschiedenen Laboratorien ist es bisher nicht gelungen, die erzielten Ergebnisse in eine eindeutige Vorstellung umzusetzen, welchen physiologischen Zweck CK2 besitzt und wie die Janusköpfigkeit zustande kommt. Es ist unser Ziel, zur Lösung dieses Rätsels beizutragen. Wir wollen Gene identifizieren und funktionell charakterisieren, deren Expression von CK2 kontrolliert wird und die an der Proliferationsauslösung beteiligt sind, und wir wollen zugehörige transkriptionsbestimmende CK2-Interaktionspartner finden [Grein und Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem. 191, 121-128; Li et al. 1999 J. Mol. Biol. 293, 1067-1084]. Untersucht werden die Transkriptome des Menschen sowie der Modellsysteme Maus und Hefe. Darüberhinaus wollen wir wissen, wie die Expression des Kontrolleurs CK2 selbst kontrolliert wird. Im Berichtzeitraum konzentrierten wir uns auf CK2-abhängige Genexpressionen des Hefegenoms, weil dieses komplett entschlüsselt und damit in seiner Gesamtheit untersuchbar ist sowie auf Bau und Transkriptionskontrolle der Gene, die die Untereinheiten menschlicher CK2 kodieren. Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen sind eine volkswirtschaftlich bedeutende Belastung; der Knochen ist nach Leber und Lunge das am dritthäufigsten von der Filialisierung maligner Tumore betroffene Organsystem. Das Wissen über die molekularen Hintergründe seiner tumorspezifischen Kolonisierung und die Pathogenese des begleitenden Knochenschmerzes ist lückenhaft und widersprüchlich. Proteinkinase CK2 spielt im Knochen wichtige intra- und extrazelluläre Rollen. Ziel unserer Arbeiten ist es, einen Beitrag zu liefern zu einer patientenspezifischen, DNA-Chips-gestützten, diagnose- und therapierelevanten molekularen Taxonomie von Metastasierung und Tumorschmerz. Mit den Arbeiten haben wir im Berichtzeitraum begonnen. Sie erfolgen im Rahmen des Tumorzentrums Heidelberg-Mannheim.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Proteinkinase CK2-Komplex im Kontext proliferativer Prozesse W. Pyerin, K. Ackermann, T. Barz, G. Dubois, T. Neidhart In Kooperation mit: U. Wirkner, EMBL Heidelberg; H. Ansuini, Universita Perugia, Italien; O. Filhol, C. Cochet, INSERM Grenoble, Frankreich; C. V. C. Glover, University of Georgia, Athens, USA; J. DeRisi, University of California, San Francisco, USA; P. Lichter, R. Eils, DKFZ. Gefördert von: HGF-Strategiefonds III.

CK2-kontrollierte Genexpression

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Ob eine Zelle den Weg der Proliferation, Differenzierung oder Apoptose einschlägt, entscheidet sich in der Zellzyklus-Anfangsphase und ist das Resultat spezifischer, temporärer Programme der Expression und Repression von Genen. Störungen sind häufige Ursache von Krankheiten, einschliesslich Krebs. Wir konnten zeigen, dass ohne die ungestörte Gegenwart des Proteinkinase-CK2-Komplexes menschliche Zellen die Zellzyklus-Anfangsphase nicht oder nicht korrekt durchlaufen [Pepperkok et al. 1994 J. Biol. Chem. 269, 6986-6991; Lorenz et al. 1999 FEBS Letters 448, 283-288], CK2 also an der Realisierung der dafür verantwortlichen Expressionsprogramme beteiligt ist. Mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie, die ein Erstellen von Expressionsprofilen von hunderten und tausenden von Genen gleichzeitig und unter identischen Bedingungen erlaubt, versuchen wir herauszufinden, welche der Gene in CK2-abhängiger Weise exprimiert werden. Wir ermitteln Genexpressionsprofile an Zellen, deren ProteinkinaseCK2-Komplex wir gezielt verändern (Nukleinsäure- und Proteinebene). Wenn wir CK2-Gene im Modellsystem Hefe mutieren oder deletieren, finden wir eine Reihe von Genen signifikant in ihrer Expression erhöht oder erniedrigt. Ein Grossteil davon lässt sich zu Gengruppen ordnen, die ganze Regulone repräsentieren. Zwei davon, das Phosphatregulon und das Flockungsregulon, haben wir bisher näher untersucht. Insgesamt zeigen etwa 5-10% aller Gene des Hefegenoms in der einen oder anderen Weise Abhängigkeit von CK2 in ihrer Expression [1]. Das Phosphatregulon interessiert, weil die Versorgung mit Phosphat essentiell ist für alle Zellen jeden Typs. Phosphatmangel hemmt Zellwachstum und löst Zellteilungsstop aus. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt für die Aufrechterhaltung der Phosphatversorgung den PHOStoffwechselweg, der transkriptionsreguliert ist und der sich aus einer Gruppe von etwa 20 Genen zusammensetzt. Die gezielte genetische Perturbation der vier Gene, die in Hefe die CK2-Untereinheiten kodieren, führt, wenn wir die Genexpressionsprofile beim Eintritt in den Zellzyklus erfassen (Übergang G0/G1-Phase; frühe G1-Phase), zu einer massiven Transkriptionsänderung der PHO-Gene. Ein Fehlen der regulatorischen CK2-Untereinheiten verursacht eine signifikante Depression der Gene, die für die Phosphat-versorgenden Phosphatasen (PHO5, PHO11, PHO12) und Phosphattransporter (PHO84, PHO89) kodieren sowie deren zentralen Transkriptionsaktivator (PHO4). Im Gegensatz zu diesen exekutiven PHO-Komponenten bleibt die CK2-Manipulation für die Komponenten des zentralen PHO-Regulationskomplexes aber ohne Konsequen-

B0200 Biochemische Zellphysiologie zen: Die Gene PHO85, PHO80 und PHO81, die jeweils für eine Cyclin-abhängige Kinase (CDK), ein Cyclin, und einen CDK-Inhibitor kodieren, bleiben in ihrer Expression unverändert. Mit unseren Daten zeigen wir erstmals, dass die Gegenwart ungestörter CK2 für den PHO-Stoffwechselweg von essentieller Bedeutung ist. Störung reprimiert auf Dauer die Expression der Komponenten der Phosphatversorgung und des Phosphatsensoriums und entkoppelt sie damit von ihrem zentralen Cyclin-CDK-Kontrollkomplex, der CK2-unabhängig und Zellzyklus-verknüpft ist [2]. Das Flockungsregulon ist für massive Änderung der Lebensäusserung von Hefezellen verantwortlich. Hefen, die unter optimalen Kulturbedingungen ohne die Bildung flockender Verbände leben, flocken aus, wenn die Bedingungen ungünstig werden. Die Gene, die für Flockungsproteine und mit ihnen kooperierende Faktoren der Zellmembran kodieren, sind unter Optimalbedingungen reprimiert. Unsere Untersuchungen zeigen, dass diese Repression aufgehoben wird, wenn CK2 genetisch gestört wird. Folgerichtig führt dies unter Optimalbedingungen zum Ausflocken der Hefezellen. Wir finden dann eine signifikant erhöhte Expression der Flockungsgene (FLO1, FLO5, FLO9, FLO10, FLO11) und von Genen, die bestimmte Zellwandkomponenten und Kohlenhydrat-Stoffwechselfaktoren kodieren (AMS1, YDL223W, SKN1, FIT1, YMR317W) sowie einen zugehörigen Transkriptionsaktivator (SSN5). Interessanter Weise sind nicht nur Expressionsstärken verändert. Vielmehr wird die Expressionserhöhung etwa von FLO11 von einer neuen TranskriptSpezies verursacht, wahrscheinlich einem bisher unbekannten Splice-Produkt. Anders als bei den PHO-Genen (s.o.), bleiben Änderungen an den regulatorischen Untereinheiten der CK2 aber ohne Folgen für die Flockung, ebenso die Deletion einer der beiden katalytischen Untereinheiten. Flockung wird nur beobachtet, wenn nicht lebensfähige Doppelmutanten der katalytischen Untereinheiten (cka1 cka2) durch temperatursensitive Allele von CKA1 oder CKA2 gerettet wird und dabei die CK2-Aktivität unterhalb eines bestimmten, das Überleben gerade noch zulassenden Niveaus bleibt. Unsere Daten zeigen, dass der Proteinkinase CK2 im Flockungsregulon eine essentielle Gen-reprimierende Funktion zukommt, ohne die flockungsfreie Verbände nicht existieren können [3]. Unsere Daten weisen ferner aus, dass die CK2-Isoformen α und α‘ funktionell unterschiedliche Rollen spielen können, und dass der Untereinheit ß nicht immer dieselbe Bedeutung zukommt. Während im Falle der FLO-Gene die Expressionskontrolle eher von der Höhe der Kinaseaktivität abhängt als davon, durch welche Isoform sie zustande kommt, und eine Deletion der regulatorischen Untereinheiten folgenlos bleibt [3], ist bei der Expressionskontrolle der PHO-Gene eine deutliche Isofom-Spezifität der katalytischen Untereinheiten und eine starke Abhängigkeit von den regulatorischen Untereinheiten zu finden [2]. Obwohl gegensätzlich in der Wirkung auf die Transkription und unterschiedlich in der Wirkungsqualität auf die FLO- und PHO-Regulone, scheint derselbe zellphysiologische Zweck sichtbar zu werden, der eines Überlebensfaktors

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation (cell survival factor; vgl. auch [Ahmed et al. 2002 Trends in Cell Biology 12, 226-230]). Hefe ist nicht nur als zelluläres Modell interessant. Vielmehr können Hefezellen auch als „biologische Retorte“ vorteilhaft eingesetzt werden, etwa beim Studium menschlicher Genexpressionsmechanismen unter in vivo-Bedingungen im 1H-System (one hybrid system) mittels Reportergen-Expressionen. Wir haben damit beispielsweise die Frage beantworten können, ob der zu beobachtende stimulierende Effekt von CK2α auf die Expression des menschlichen Aromatase-Gens direkt oder indirekt ausgeübt wird [Ackermann and Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem. 191, 129-134]. Die neue Generation von 1H-Systemen verwendet eine Variante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Reporter anstatt HIS3/lacZ. Das ist zeit- und arbeitssparend. Diese Alternative hat in seiner kommerziell erhältlichen Form allerdings das Manko einer fehlenden positiven Bezugsgrösse. Wir haben deshalb ein Kontrollvektor-Konstrukt mit Maus-p53-cDNA und seiner Bindungssequenz sowie Distanz-Modifizierungen zwischen Klonierungsstelle und Reportergen-Promotor entworfen und erfolgreich experimentell umgesetzt. Das Resultat ist eine positive Kontrollvektor-Kombination für GFP-1H-Systeme, eine notwendige Voraussetzung für genaue DNAProtein-Interaktionsstudien [4].

Die Kontrolle des Kontrolleurs: Die CK2-Gene des Menschen und ihre Transkriptionsregulation. Das menschliche Genom besitzt vier CK2-Gene, zwei Gene für α and je ein Gen für α’ und β [Pyerin et al. 1996 in: Protein Phosphorylation. F. Marks ed, VCH Weinheim, 117-147]. Wir konnten bisher drei der vier menschlichen Gene isolieren und ihre Strukturen entschlüsseln, das CK2β-Gen und die beiden CK2α-Gene, von denen allerdings nur eines aktiv ist, während das andere ein prozessiertes Pseudogen darstellt. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen im Berichtzeitraum standen vergleichende Promotoranalysen des aktiven CK2α-Gens und des CK2βGens. Darüberhinaus versuchten wir, das noch ausständige CK2α’-Gen zu isolieren und zu charakterisieren. Im Promoterbereich des etwa 70 kb grossen und aus 13 Exonen zusammengesetzten CK2α-Gens [Wirkner et al. 1998 Genomics 48, 71-78] fallen GC-Boxen auf, eine CpG-Insel, zwei Transkriptionsstarts (Positionen +1 and 50) und das Fehlen einer TATA-Box. Das Gen endet 3’wärts mit sechs potentiellen Poly-A-Stellen, wovon nur zwei verwendet zu werden scheinen. Stark Promotor-aktive Bereiche finden sich zwischen den Positionen -256 und 144 [Wirkner and Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem 191, 5964]. Wir haben diese Region mit Hilfe eines Bündels von Methoden im Detail analysiert, darunter ReportergenAssays (Luciferase; HeLa-, JEG-3-, SaOs-Zellen), ortsgerichtete Mutagenese, elektrophoretische Mobilitätsshifts und Supershifts, UV-Quervernetzung, Westernblots und DNA-Affinitätschromatographie. Die höchste Transkriptionsaktivität konnte auf den Abschnitt –9 bis 46 eingeengt und die Transkriptionsfaktoren Sp1, Ets1 und NF-κB als Interaktionspartner identifiziert werden. Mutationsanalyse einzelner ihrer Bindestellen und simultane Mutationen von zwei und mehr dieser Stellen, weisen wechselseitige

B0200 Biochemische Zellphysiologie funktionsbestimmende Einflussnahmen aufeinander nach, und die Anwesenheit der Faktoren in den Kernen der verwendeten Zellen konnte experimentell bestätigt werden. Interessanterweise stellte sich mindestens einer der Faktoren, Sp1, als phosphorylierbar durch das CK2-Holoenzym (α2β2) heraus, nicht jedoch durch individuelles CK2α, dem Genprodukt. Die Phosphorylierung vermindert signifikant die Promotorbindung von Sp1. Bei Verfügbarkeit von CK2β ergibt sich daraus die Möglichkeit einer steuernden Rückwirkung des Genprodukts auf die Expression des eigenen Gens, indem das entstehende CK2α mit CK2β CK2-Holoenzym bildet, das dann Sp1 phosphorylieren und damit dessen Promotor-Bindung und/oder Interaktion mit Ets1 verändern und so die Transkriptionsaktivität des CK2α-Gens absenken kann [5]. Die Verfügbarkeit von CK2β für eine solche Regulation könnte sich aus einer synchronen Steuerung des CK2ßGens mit dem CK2α-Gen ergeben. Die vergleichende Analyse des Promotor-Bereichs des CK2β-Gens, das wir als ein 4.2 kb umfassendes und aus 7 Exonen bestehendes Gen charakterisiert haben [Voss et al. 1991 J. Biol. Chem. 266, 13706-13711], ergab tatsächlich starke Hinweise dafür. Wie das CK2α-Gen, besitzt auch das CK2βGen mehr als nur einen Transkriptionsstart, nämlich drei (Positionen +1, 33 und 113), und der Promotorbereich weist ebenfalls GC-Boxen auf, eine CpG-Insel und besitzt keine TATA-Box. Unter Anwendung des o.g. Methodenbündels fanden wir, dass auch hier den Transkriptionsfaktoren Ets1 und Sp1 herausragende Rollen in der Transkriptionsregulation zukommen. Und noch mehr: Im Bereich maximaler Promotoraktivität findet sich ein 12 BpHomologiebereich kompletter Sequenzidentität in beiden Genen, ein Ets1-Doppelmotiv. Mutationen in diesem Motiv haben vergleichbare negative Expressionseffekte auf beide Gene, während die Überexpression von Ets1 in beiden Fällen positive Effekte hat [6,7]. Wie in Fig.1 skizziert, scheinen diese Daten anzuzeigen, dass die Expression humaner CK2α und CK2β transkriptionell koordiniert wird, und dass diese Koordination massgeblich über das Ets1-Doppelmotiv und sein Zusammenwirken mit Sp1-Motiven gesteuert wird, die in den Promotoren der CK2-Gene zu finden sind. Die entstehenden Genprodukte, keines für sich befähigt auf die Transkription des jeweiligen Gens zurückzuwirken, werden nach Komplexierung zu CK2-Holoenzym in die Lage versetzt, Sp1 (und Ets1?) zu phosphorylieren und dadurch die Transkription beider Gene nach unten zu regulieren. Als Folge einer solchen negativen Rückkopplung sollte sich eine stabile zelluläre CK2α- und CK2ß-Transkripte-Situation ergeben. Tatsächlich finden wir zwar unterschiedliche Transkriptespiegel in unterschiedlichen Zelltypen, aber konstante Spiegel in jedem der Zelltypen, und das unabhängig vom Differenzierungs- und Proliferationszustand [6-8]. Im Berichtzeitraum gelang es uns, die Struktur auch des vierten der CK2-Gene des Menschen, CK2α’, weitgehend aufzuklären, die in der Literatur vorhandene chromosomale Lokalisierung zu korrigieren und einen ersten Satz an Daten zur Transkriptionskontrolle zu erarbeiten [Manuskript in Vorbereitung]. Ausserdem waren Mitglieder der

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

B0200 Biochemische Zellphysiologie zu etablieren und an Hand ausgewählter Gene vergleichend abzuschätzen. Ein Beispiel gibt der RT-PCR-Nachweis von Aromatase-mRNA bei sehr geringen TranskriptMengen [11].

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Abbildung 1. Hypothese einer Transkriptionskoordination der menschlichen Proteinkinase-Gene CK2α und CK2β. Die Promotoren der Gene, die für die katalytische Untereinheit CK2α und die regulatorische Untereinheit CK2β kodieren, enthalten in den transkriptionsaktivsten Abschnitten (Regionen -9 bis 46 und -42 bis 14) dasselbe Ets1-Bindeelement (gelb; Doppelmotiv) und Ansammlungen benachbarter Sp1-Bindeelemente (grau). Die Transkriptionsaktivierung benötigt Ets1-Sp1-Interaktion. Generierte CK2α- und CK2β-mRNAs werden in die entsprechenden CK2Untereinheiten translatiert (CK2α, rot ausgefüllter Kreis; CK2β, blau ausgefülltes Oval) und diese komplexieren zu tetramerem CK2-Holoenzym. Das Holoenzym, nicht hingegen katalytische Untereinheit alleine, kann Sp1 (und Ets1?) phosphorylieren und so allmählich die Transkription beider Gene hemmen (negative Rückkopplung).

Gruppe an der Analyse von Varianten anderer Proteinkinasen beteiligt [9] sowie an der Strukturaufklärung von Naturstoffen mit karzinogenem Potential [10].

Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen K. Ackermann, S. Eisenberger, G. Hoppe, K. Knerr, B. Sorg, W. Pyerin In Kooperation mit: Ch. Kasperk, G. Nöldge, P.J. Meeder, H.J. Bardenheuer, S. Kaul, Universitätsklinik Heidelberg; B. Korn, ResourcenZentrum Heidelberg; W. Weinig, J. Tuckermann, DKFZ; N. Schütze, Universitätsklinik Würzburg; J. Schmidt, GSF München. Gefördert von: Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim.

Osteomimikry (Metastasierung). Metastasierende Tumorzellen ändern das Verhalten von Knochenzellen und ihr Verhalten wird, umgekehrt, von Knochenzellen verändert. Kolonisierung das Knochens sollte demnach mit metastasierungstypischen Genexpressionsmustern verbunden sein. Wir wollen daher umfassende Genexpressionsprofile (s.o.) an Mikrodissektaten schmerzverursachender und schmerzfreier Metastasen und Osteoporosen erheben und sie vergleichend unter Einbeziehung klinischer Parameter sowie Daten aus Modellversuchen analysieren. Da aus Mikrodissektaten, anders als aus Zellkulturen, nur begrenzte, meist äusserst geringe Mengen an RNA zu gewinnen sind, haben wir Wert darauf gelegt, verschiedene Amplifikationsverfahren

Knochen ist u.a. bevorzugtes Ziel von Tumorabsiedelungen der Prostata. Damit sie im Knochen überleben und zu Metastasen anwachsen können, nehmen Prostatakarzinomzellen Eigenschaften von Knochenzellen an (Osteomimikry). Wir haben daher primäre Osteoblasten mit Prostatakarzinomzellen co-kultiviert und die Genexpressionsprofile der beiden Zelltypen mit Hilfe von Microarrays (cDNA-Chips) erfasst. Während das Genexpressionsprofil der Osteoblasten kaum verändert wurde (10.000 erfasste Gene), war das bei Prostatakarzinomzellen auffallend anders. Unabhängig vom Progressionsgrad und Metastasierungspotential der Zellen (LNCaP-Zellen; PC-3-Zellen), war die Expression von 78 Genen in einem Kollektiv von 1.600 Genen signifikant verändert. Zusätzlich waren weitere, Zelltyp-spezifische Expressionsänderungen zu sehen: 12 Gene waren nur in den LNCaP-Zellen, 39 andere Gene nur in den PC-3-Zellen verändert exprimiert. Unter diesen Genen finden sich solche, die für Adhäsions-spezifische Komponenten des Desmosomen-Adhäsions-Netzwerkes kodieren, beispielsweise desmosomale Cadherine (Desmocollin-1; Desmoglein-2), für das metastasierungs- und tumorprogressionsassoziierte N-Cadherin oder für Zelladhäsionskinasen. Darüberhinaus zeigen die Prostatakarzinomzellen deutliche Expression von Osteoblasten-spezifischen Genen, die beispielsweise für Kollagene, Biglykan, CBFA2, M-CSF-2-Rezeptor, Sonic hedgehog, u.a. kodieren und eindrücklich zeigen, wie das von Osteoblasten erzeugte Mikromilieu zur Osteomimikry-Basis der Prostatakarzinomzellen wird und damit wesentlich zu deren Fähigkeit beiträgt, sich im Knochen anzusiedeln [12].

Zelluläre und molekulare Biologie normaler und entarteter Knochenzellen. Knochenzellen können auch selbst zu Tumorzellen entarten. Um diese Osteotransformation zu charakterisieren, haben wir mit dem Studium unterschiedlicher Proliferations- und Differenzierungsstadien primärer Osteoblasten (Maus) begonnen und Vergleiche zu Osteosarkomzellen in Kultur (SaOS-2) angestellt. Neben morphologischen Parametern und Osteoblasten-spezifischen Markern, haben wir erste Genexpressionsprofile (cDNA-Arrays, 10.000 Gene) ermittelt. Es finden sich, wie zu erwarten, deutliche Expressionsunterschiede zwischen proliferierenden und differenzierten Osteoblasten, zwischen verschiedenen Stadien der Differenzierung, und zwischen differenzierten Osteoblasten und Osteosarcomzellen. Die Analysenauswertung ist im Gange. Darüberhinaus untersuchen wir den Einfluss der Proteinkinase CK2 auf Genexpression und Proliferationsverhalten (Zellzyklus-Eintritt; Zellvermehrung) von Osteoblasten und Osteosarkom-Zellen in Perturbationsansätzen (Transfektion katalytisch inaktiver CK2). Die knochenaufbauenden Osteoblasten stehen in permanentem Wechselspiel zu den knochenabbauenden Osteoklasten. Störungen dieses Gleichgewichtes führen zu Knochenerkrankungen, etwa der volkswirtschaftlich hoch signifikanten Osteoporose. Daher interessieren wir uns ex-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation perimentell auch für diesen Zelltyp. Wir haben bereits Knochenmark-Vorläuferzellen erfolgreich zu Osteoklasten differenziert und charakterisiert (Morphologie; Osteoklasten-spezifische Marker; Knochenmatrix-Resorption), und wir konnten alle drei Untereinheiten der Proteinkinase CK2 auf Transkriptions- und Proteinebene nachweisen [Manuskript in Vorbereitung]. Knochenwachstum und -stabilität hängen wesentlich von der Versorgung mit Östrogenen ab (ÖstrogenmangelOsteoporose). Andererseits sind Östrogene Wachstumsfaktoren für Tumoren, die bevorzugt in den Knochen metastasieren, beispielsweise für Mammatumoren. Einfaches Ändern des Körper-Östrogenspiegels kann hier untaugliches therapeutisches Konzept sein. Daher beschäftgen wir uns mit der Transkriptionskontrolle des AromataseGens in der Hoffnung, in Knochenzellen und Mammazellen therapeutisch nutzbare Unterschiede (Antisense-Technologie) in den Kontrollmechanismen zu finden. Das Produkt dieses Gens, Aromatase, ist Schlüsselenzym der Östrogensynthese. Interessanterweise besitzt dieses Gen, im Gegensatz zu den meisten Genen, ein ganzes Bündel von Promotoren (Exone 1), die mehr oder weniger weit vom Transkriptionsstart entfernt liegen und zu gewebsspezifischen 5’-Enden der Transkripte, aber stets demselben Genprodukt führen. Wir haben daher die PromotorVerwendung des Aromatase-Gens in Proben aus verschiedenen Knochen-Arealen und -Typen analysiert sowie in primären Knochenzell-Kulturen (verschiedene Auswüchse) und permanenten Knochenzelllinien. Die erhaltenen Promotor-Verwendungen haben wir mit denen in Mamma-Zellen verglichen. Wir finden sowohl in Knochen wie auch in Mamma mehrere Promotorverwendungen und -shifts. Im Gegensatz zu Literaturangaben zeigt unsere Analyse, dass die Verwendungsmuster nicht eindeutig Zelltyp-spezifisch sind, sondern eher überlappend und damit nur bedingt als therapeutischer Ansatzpunkt für gegenläufige Aromatase-Expression in Knochen- und Mamma-Zellen taugen [13].

B0200 Biochemische Zellphysiologie [7] Pyerin, W., Ackermann, K. (2001) Transcriptional coordination of the genes encoding catalytic (CK2α) and regulatory (CK2β) subunits of human protein kinase CK2. Mol. Cell. Biochem. 227, 45-57 [8] Pyerin, W., Ackermann, K. Protein kinase CK2-linked gene expression control. (Review) Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 73, in press [9] Thullner, S., Gesellchen, F., Wiemann, S., Pyerin, W., Kinzel, V., Bossemeyer, D. (2000) The protein kinase A catalytic subunit Cß2: molecular characterization and distribution of the splice variant. Biochem. J. 351, 123-132 [10] *Zayed, S.M.A.D., *Farghaly, M., *Soliman S.M., *Gotta, H., Sorg, B., Hecker, E. (2001) Dietary cancer risk from conditional cancerogens (tumor promoters) in produce of livestock fed on species of spurge (Euphorbiaceae): V. Skin irritant and tumorpromoting diterpene ester toxins of the tigliane and ingenane type in the herbs Euphorbia nubica and Euphorbia helioscopia contaminating fodder of livestock. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127, 40-47 [11] Knerr, K., Ackermann, K., Pyerin, W. (2001) RT-PCR detection of aromatase mRNA with small amounts of template. QIAGEN News 4, 21-22 [12] Knerr, K., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) Osteomimicry of prostate carcinoma cells: Co-cultured osteoblasts provoke altered expression of adhesion-related genes. [13] Hoppe, G., Ackermann, K., *Kasperk, Ch., Pyerin, W. (2002) Transcriptional control of the human aromatase gene (CYP19): Comparative promoter usage analysis in cells derived from bone and mamma.

Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Ackermann, K., Waxmann, A., *Glover, C.V.C., Pyerin, W. (2001) Genes targeted by protein kinase CK2: A genome-wide expression array analysis in yeast. Mol. Cell. Biochem. 227, 59-66 [2] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) Perturbation of protein kinase CK2 uncouples phosphate maintenance pathway from cyclin-CDK control. [3] Ackermann, K., *Glover C.V.C., *DeRisi, J., Pyerin, W. (2002) Genome-wide transcript profiling of deletion mutants demonstrates protein kinase CK2 to control flocculation-linked gene expression in Saccharomyces cerevisiae. [4] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) A positive control for the green fluorescent protein-based one-hybrid system. Analyt. Biochem. 304, 117-121 [5] Krehan, A., *Ansuini, H., Böcher, O., Grein, S., Wirkner, U., Pyerin, W. (2000) Transcription factors Ets1, NFκB and Sp1 are major determinants of the promoter activity of human protein kinase CK2α gene. J. Biol. Chem. 275, 18327-18336 [6] Krehan, A., Schmalzbauer, R., Böcher, O., Ackermann, K., Wirkner, U., Brouwers, S., Pyerin, W. (2001) Ets1 is a common element in directing transcription of the α and β genes of human protein kinase CK2. Eur. J. Biochem. 268, 3243-3252

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0300 Biochemie der Zelle

Abteilung Biochemie der Zelle (B0300) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Dieter Werner (- 09/01) Wissenschaftliche Mitarbeiter Prof. Dr. med. Christof Granzow Dr. rer. nat. Marijana Kopun-Granzow Dr. rer. nat. Karsten Rothbarth ( - 05/02) Examensarbeiten Tobias Baumbusch, medizinische Dissertation Debora Greco, medizinische Dissertation Michael Heuser, medizinische Dissertation

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Technische Mitarbeiter Barbara Liebetrau, TA (1/2) Ilona Jung, TA (1/2; - 09/01) Maika Schubert, TA (1/2;-01/02) Hermann Stammer, BTA (-09/01)

Die Abteilung bestand aus zwei Gruppen, der Kern-Protein-Gruppe, geleitet von Prof. Werner und der Zellpharmakologie-Gruppe, geleitet von Prof. Granzow. Prof. Werner ist in Ruhestand gegangen. Im Zentrum der Arbeiten der Zellpharmakologie-Gruppe steht die Identifizierung und Modulation der Resistenzentwicklung durch antineoplastische Pharmaka, sowie die Entwicklung eines verlässlichen Tests für Chemoresistenz bzw. Chemosensibilität.

Genomveränderungen multidrogenresistenter Tumorzellen (B0301) C. Granzow, M. Kopun In Zusammenarbeit mit Manfred Wiessler, DKFZ

Induktion von Glufosfamid-Resistenz in menschlichen Tumorzellen Glufosfamid ist ein neuartiges Zytostatikum, dessen zytostatisch wirkender Anteil zum Zwecke einer spezifischeren Adressierung von Tumorzellen mit Glucose gekoppelt wurde. Der Glucoseanteil wird von glucosetransportierenden Proteinen der Zellmembran erkannt und akzeptiert. Da Tumorzellen mehr Glucose verbrauchen als normale Zellen, nehmen sie auch mehr zytostatische Aktivität auf und werden infolgedessen stärker als normale Zellen geschädigt. Im Rahmen einer klinischen Phase I-Studie zeigte Glufosfamid beträchtliche antineoplastische Wirksamkeit bei guter Verträglichkeit für die Patienten. Es ist zu erwarten, dass diese innovative Substanz in naher Zukunft große klinische Bedeutung erlangen wird.

existierten und imstande sind, die Zytostatika sehr effizient aus den resistent gewordenen Zellen zu entfernen. Im Falle von Glufosfamid dagegen benutzt das Zytostatikum ein vorbestehendes Transportsystem der Zellmembran, auf das die Tumorzellen für ihr Funktionieren angewiesen sind. Insofern fehlen hier die Voraussetzungen für die üblicherweise sehr früh einsetzende und äußerst nachhaltige, transportervermittelte Resistenzentwicklung. Es erschien deshalb sowohl unter zellbiologischen als auch unter klinischen Aspekten interessant, ob und gegebenenfalls mit welchem Aufwand Resistenz gegen Glufosfamid in glufosfamidempfindlichen menschlichen Tumorzellen erzeugt werden kann. Die Experimente wurden unter in vitro-Bedingungen durchgeführt. Bei epithelialen KB-Zellen gelang es unter größten Schwierigkeiten nach sechs Monaten Glufosfamidexposition lediglich, ein sehr niedriges Resistenzniveau zu etablieren und aufrechtzuerhalten. Nach Absetzen von Glufosfamid kehrte die ursprüngliche Sensibilität der Zellen gegenüber der Substanz rasch zurück. Bei CEMLeukämiezellen war die Resistenzinduktion noch weniger effizient. Anfangs wurde bei beiden untersuchten Zellstämmen keine Kreuzresistenz gegenüber weiteren Zytostatika beobachtet. Nach monatelanger Weiterkultivierung mit Glufosfamid entstand jedoch das von Glufosfamidanaloga bekannte Kreuzresistenzmuster. Der molekulare Mechanismus der induzierten low level-Resistenz ist noch unbekannt. Der geschilderte Verlauf der Resistenzentwicklung läßt erwarten, daß bei vorübergehender Anwendung von Glufosfamid beim Patienten Resistenzentwicklung keine Rolle spielen dürfte. Falls es dennoch dazu kommt, sind allenfalls geringgradige Minderungen der Sensibilität gegenüber Glufosfamid mit ausgeprägter Rückbildungstendenz zu erwarten. Dadurch unterscheidet sich Glufosfamid sehr vorteilhaft von konventionellen Zytostatika. Publikation: C. Granzow, M. Wiessler, M. Heuser und M. Kopun: Induction of glufosfamide resistance in human tumor cells without development of cross resistance to other cytostatic drugs. Proc. Amer. Ass. Cancer Res. 42, 323 (2001).

Für eine Beurteilung der klinischen Wertigkeit von Zytostatika ist neben der Toxizität die Neigung zur Resistenzentwicklung besonders bedeutsam, weil diese eine Limitierung der Wirksamkeit zur Folge hat. Üblicherweise werden bei der Resistenzentwicklung starke Transportaktivitäten in den Tumorzellen induziert, die zuvor nicht

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose

Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (B0400) Leiter Prof. Dr. Herwig Ponstingl

Das Ran-System im nucleocytoplasmatischen Transport

Wissenschaftliche Mitarbeiter Priv.-Doz. Dr. Ralf Bischoff Dr. Simon Fernandez (BMBF) Dipl.-Ing. Klaus Leibe (BMBF) Dr. Gernot Maier Dr. Hans-Peter Zimmermann

R. Bischoff, M. Sjölinder, L. Moiseenko, W. Wu, H. Ponstingl

Gastwissenschaftler Dr. Alexander Marmé, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg Dr. Mikael Sjölinder, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden

In Zusammenarbeit mit: D. Görlich, Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg; E. Hurt, Biochemiezentrum der Universität Heidelberg; U. Kutay, Institut für Biochemie der Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich, Schweiz; I. Mattaj, EMBO Laboratorium Heidelberg; G. Schlenstedt, Institut für Biochemie der Universität des Saarlandes, Homburg.

Die kleine GTPase Ran regelt mit ihren Kontrollfaktoren und Bindungspartnern den Transport von Proteinen und Ribonukleinsäuren durch die Porenkomplexe der Kernmembran. Wir haben die Hauptkomponenten des Systems und mehrere Transportfaktoren isoliert und die Rolle von Ran bei der Bildung von Transportkomplexen am Ausgangspunkt und ihrem Zerfall am Ziel untersucht. Danach liegt Ran auf der cytoplasmatischen Seite der Kernmembran vorwiegend als inaktives RanGDP vor, im Kern hingegen als aktives RanGTP. RanGAP, ein Aktivator der Nukleotidhydrolyse, ist verantwortlich für die Inaktivierung im Cytoplasma, die Aktivierung im Kern bewirkt ein Nukleotid-Austauschfaktor, RanGEF [6,7].

Doktoranden Kathrin Dellas-Kloor Lilia Moiseenko (DFG) Kerstin Weigl Weilin Wu Techniker Jürgen Kretschmer Olga Keberlein Antje Koppe Claudia Müller (DFG) Sabine Seib Sekretariat Sabine Hughes

Die Forschungsarbeiten der Abteilung haben zum Ziel: • Die Aufklärung des Transports von Makromolekülen durch die Hülle des Zellkerns, um zu verstehen, wie Transportdefekte zur Entstehung von Tumoren beitragen, und um Transportwege therapeutisch zu nutzen. • Die Identifizierung neuer Tumormarker und Tumorsuppressoren in Ovarialkarzinomen durch systematische Analyse des Ablese-Profils von Genen. • Die Entwicklung hochkomplexer Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen.

Die Transportfaktoren reagieren auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von RanGTP mit der Bildung von Komplexen mit der Fracht oder mit dem Zerfall solcher Komplexe. Importine und Exportine verhalten sich dabei gegensätzlich: Frachtproteine im Cytoplasma mit einem Kernlokalisations-Signal (NLS) binden in Abwesenheit von RanGTP an Importin, das Vehikel für den eigentlichen Import. Der Transport durch die Kernpore folgt einem bisher ungeklärten Mechanismus, der offenbar ohne energieliefernde Nukleotidspaltung auskommt. Im Kern wird der Import durch Zerfall des Komplexes beendet. Dabei bindet RanGTP sehr fest an das Importin und löst dort eine Änderung der Molekülgestalt aus, die das Transportgut freisetzt. Gleichzeitig wird dadurch verhindert, daß sich die Importkomplexe wieder bilden. Es gibt fast zwei Dutzend Transportfaktoren, die sich in ihrer Struktur ähneln [2, 3]. Im Gegensatz zu den Importinen binden Exportine ihre Frachten, die ein nukleäres Exportsignal (NES) besitzen, im Kern unter Ausbildung eines Komplexes mit RanGTP [2, 4]. Dieser sehr feste Exportkomplex wird ohne Hydrolyse des gebundenen GTP ins Cytoplasma befördert. Dort sind die Komplexe zunächst nicht für RanGAP zugänglich, das den Zerfall anregt. Hier greifen das kleine cytoplasmatische RanBP1 [1, 4] und das RanBP2 der cytoplasmatischen Fasern an den Kernporen ein: Sie binden an RanGTP an einer anderen Stelle als die Transportfaktoren und ändern die Gestalt des Exportkomplexes. Nun erst wird die Inaktivierung des Rangebundenen GTP durch RanGAP und damit der Zerfall des Komplexes angeregt. So wird verhindert, daß sich der exportierte Komplex wieder zurückbildet. Damit sind die beteiligten Faktoren wieder für eine neue Transportrunde bereit. Inaktives RanGDP schließlich wird durch einen be-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation sonderen Importfaktor NTF2 in den Kern zurückgebracht, um dort durch Nukleotidaustausch an RanGEF aktiviert zu werden. Während RanBP1 und RanBP2 auf der cytoplasmatischen Seite der Kernporen beim Entladen der Exportkomplexe aktiv sind, haben wir im Zellkern das RanBP1-ähnliche Protein RanBP3 gefunden, das die Bildung von Exportkomplexen steuert: durch Bindung von RanBP3 an den Exportfaktor Expo1 wird dessen Spezifität für unterschiedliche Frachten bestimmt [5].

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Wir identifizierten auch ein humanes Homologes zu RCC1, DelGEF, das zwar die wesentlichen bekannten Strukturmerkmale mit diesem Austauschfaktor gemeinsam hat, Ran aber trotzdem nicht aktivieren kann. Es wird im Chromosomenabschnitt 11p14 codiert, auf dem man ein Gen für erbliche Formen von Taubheit und Retinitis pigmentosa vermutet. Mit 2-Hybrid-Studien wurden für DelGEF Bindungspartner gefunden, die auf eine Rolle in intrazellulären Transportprozessen hinweisen.

Systematische Analyse der Genexpressionsmuster in Ovarialkarzinomen K. Dellas-Kloor, G. Maier, A. Marmé, K. Weigl, H.-P. Zimmermann, H. Ponstingl In Zusammenarbeit mit G. Bastert, M. Lindner, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg; D. Wallwiener, R. Kurek, B. Gückel, Universitäts-Frauenklinik Tübingen.

Ovarialkarzinome sind die gefährlichsten unter den gynäkologischen Tumoren, da sie ohne charakteristische Frühsymptome sind und in der Regel erst in Spätstadien erkannt werden. Die Abteilung vergleicht die Genexpressionsmuster von Tumorzellen und gesunden Epithelzellen jeweils derselben Patientin. Anhand wiederkehrender Merkmale werden diese Tumoren molekularbiologisch charakterisiert, mit dem Ziel, neue Kennzeichen von diagnostischer Bedeutung zu finden, Therapien an den Einzelfall anzupassen und die molekularen Ursachen der Tumorentwicklung zu verstehen. Mit Antikörpern gegen charakteristische Strukturen an den Zelloberflächen und mit pharmazeutisch veränderten Signalmolekülen sollen auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnet werden. Das Differential Display ist das bisher empfindlichste Verfahren zur systematischen Analyse von Unterschieden in der Genexpression. Es erlaubt in der Form von cDNAFragmenten den Vergleich, die Identifizierung und die Isolierung von mRNAs, die in Tumorzellen erheblich stärker oder geringer repräsentiert sind als in den entsprechenden gesunden Zellen. Etwa die Hälfte der bisher gefundenen Gene, deren Expressionsspiegel sich um mindestens eine Größenordnung unterschied, codieren für bereits bekannte Proteine [8], darunter einen Tumorsuppressor und Komponenten von Signalwegen. Die übrigen, bisher unbekannten, sind anhand ihrer Strukturmerkmale Signalwegen oder Zell-Zell-Kontakten zuzuordnen. Dieses aufwendige Verfahren kann immer nur mit Material aus einzelnen Patientinnen durchgeführt werden. Um diagnostisch brauchbare Marker zu erhalten, müssen

Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose Expressionsunterschiede aber rasch und an möglichst vielen Patientinnen bestimmt und mit den histopathologischen Befunden und dem klinischen Verlauf der Erkrankung verknüpft werden. Dies geschieht zur Zeit durch quantitative PCR und durch cDNA-Chips, die noch in Entwicklung stehen. Gleichzeitig werden die Proteine, die von den interessierenden Genen codiert werden, in Bakterienzellen exprimiert, um gegen sie gerichtete Antikörper für schnellere Diagnosen zu gewinnen. In Tumoren überexprimierte Proteine werden auch auf ihre Eignung als Angriffspunkte für Immuntherapien geprüft.

Hochkomplexe Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen R. Bischoff, S. Fernandez, K. Leibe In Zusammenarbeit mit Dr. Frank Breitling und Dr. Volker Stadler, DKFZ.

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von hochkomplexen Peptid-Arrays entwickelt. Es beruht auf einem modifizierten Laserdrucker, der statt des normalen Farbtoners Partikel druckt, in welche die Grundbausteine für die Peptidsynthese eingebettet sind. Durch Zufuhr von Wärme werden die Partikel geschmolzen, die darin eingeschlossenen Monomere freigesetzt und die Kopplungsreaktion gestartet. Die Partikel stellen somit eine stabile Transportform für die Monomere dar und liefern darüber hinaus den Reaktionsraum für die chemische Kopplung am Bestimmungsort. Durch wiederholtes Bedrucken desselben Trägers und nachfolgendes Koppeln der Monomere kann so eine große Zahl von unterschiedlichen Peptiden simultan auf einer Trägerfolie synthetisiert werden. Die Anzahl der nacheinander auszuführenden Druckvorgänge ergibt sich dabei aus der Zahl von Grundbausteinen, welche die fertigen Oligomere enthalten sollen. Die Möglichkeit, alle Teilschritte des Syntheseverfahrens kontrollieren zu können, ergibt eine einfache, robuste, schnelle und auch preiswerte Technologie zur Herstellung von komplexen PeptidArrays. Es gibt vielfältige Möglichkeiten, die Gestaltung der Peptid-Arrays an die Bedürfnisse des Anwenders anzupassen. Beispielsweise können Proteine in Form von überlappenden Bruchstücken (15-20mere) auf dem Array präsentiert werden. Es ist gezeigt worden, daß in vielen Fällen die Strukturinformation zur Wechselwirkung mit Bindungspartnern auch in den Peptiden erhalten bleibt. Dies gilt in besonderem Maße für die Bindung von Antikörpern, die oft nur kurze Abschnitte auf dem antigenen Protein erkennen. Ferner ist es möglich, „vollständige“ Bibliotheken von Lund D-Peptiden zu erstellen, die alle theoretisch möglichen Aminosäure-Kombinationen enthalten. Das so geschaffene Repertoire von unterschiedlichen Oberflächen kann für die Bindung von Makromolekülen jeglicher Art genutzt werden. Der Einsatz dieser Arrays kann Muster hervorbringen, die je nach Anwendung auch diagnostisches Potenzial haben [9, 10].

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose

69 Abb.

Vergleich eines normalen Tonerpartikels mit einem AminosäurenPartikel

Publikationen (* = externe Koautoren) und Preise [1] Künzler*, M., Gerstberger*, T., Stutz*, F., Bischoff, F.R. & Hurt*, E. (2000) Yeast Ran-binding protein 1 (Yrb1) shuttles between nucleus and cytoplasm and is exported from the nucleus via a CRM1 (XPO1)-dependent pathway. Mol. Cell. Biol. 20, 4295-4308. [2] Lipowsky*, G., Bischoff, F.R., Schwarzmaier*, P., Kraft*, R., Kostka*, S., Hartmann*, E., Kutay*, U. &Görlich*, D. (2000) Exportin 4: a mediator of a novel nuclear export pathway in higher eukaryotes. EMBO J. 19, 4362-4371. [3] Kutay*, U., Hartmann*, E., Treichel*, N., Calado*, A., CarmoFonseca*, M., Prehn*, S., Kraft*, R., Görlich*, D., & Bischoff, F.R. (2000) Identification of two novel RanGTP-binding proteins belonging to the importin b superfamily. J. Biol. Chem. 275, 40163-40168. [4] Maurer*, P., Redd*, M., Solsbacher*, J., Bischoff, F.R., Greiner*, M., Podtelejnikov*, A.V., Mann*, M., Stade*, K., Weis*, K. & Schlenstedt*, G. (2001) The nuclear export receptor Xpo1p forms distinct complexes with NES transport substrates and the yeast binding protein 1 (Yrb1p). Mol. Biol. Cell 12, 539 - 549. [5] Englmeier*, L., Fornerod*, M., Bischoff, F.R., Petosa*, C., Mattaj*, I. & Kutay*, U. (2001) RanBP3 influences interactions between CRM1 and its nuclear protein export substrates. EMBO Rep 2, 926 - 932. [6] Bischoff, F.R., Scheffzek*, K. & Ponstingl, H. (2001) How Ran is regulated. In „Nuclear Transport“. K. Weis (Ed.),Results and Problems in Cell Differentiation 35, 49-66. Springer, Heidelberg, New York. [7] Bischoff, F.R. & Ponstingl, H. (2001) Ran regulation by RanGEF and RanGAP. In „The small GTPase Ran“. Mark Rush & Peter d’Eustachio (Eds.) pp163-176. Kluver, Boston, Dordrecht, New York. [8] Weigl, K., Ponstingl, H., Zimmermann, H.-P., Marmé, A., Bastert*, G., Kurek*, R., & Wallwiener*, D. (2001) Ovarial-Karzinom-Marker.Europäische Patentanmeldung 02 005 445.8. [9] Bischoff, F.R., Breitling, F., Saffrich, R., Poustka, A., Hoffmann, Th., Groß, K. & Breitling, F. (2001) Genius Biotech Award des Landes Baden-Württemberg. [10] Bischoff, F.R., Breitling, F., Wallich*, R., Poustka, A., Stadler, V. & Breitling, F. (2001) Förderpreis Medizintechnik für das Projekt „Borrelien Peptidomarrays“ im Rahmen des Innovations-Wettbewerbs 2001 des Bundesministeriums für Bildung und Forschung.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

B0401 Peptidsyntheseeinheit

Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit (B0401) Leiter: Dr. Rüdiger Pipkorn Publikationen: (* = externe Koautoren)

Mitarbeiter Mario Koch

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Aufgabe der Einheit ist die Synthese unterschiedlichster funktionaler Peptide zur Durchführung von Studien zum Verständnis der Wechselwirkung von Struktur und Aktivität [6,7]. Spezielle Fragen hinsichtlich Identifiaktion von AntiEpitopen innerhalb Proteinsequenzen können mittels individuell synthetisierter Peptide beantwortet werden. Dynamische zelluläre Prozesse auf DNA-, RNA- und auf Proteinebene [2,3,5] können mittels spezifischer funktionaler Peptideeinheiten simuliert und verstanden werden im Zusammenhang von inter-und intrazellulärem Transport von Proteineinheiten (‘Bioshuttle’, siehe Schema) [1]. Moderne Diagnostikverfahren wie beispielsweise ‚Molecular Imaging‘ in der MRT bzw. PET sind mittels speziell synthetisierter Peptideinheiten möglich. Molecular Modeling und Biocomputing Methoden an synthetischen Peptiden tragen zum Verständnis für Struktur und Funktion bei. Die Entwicklung von Therapieansätzen auf molekularer Ebene (Antisense- und Anti-Gen) ist in gleicher Weise zu verwirklichen. Die Synthese sämtlicher Peptide erfolgt vollautomatisiert auf dem AMS 422 Multiple Peptide Synthesizer (Abimed Analysentechnik) [4], Charakterisierung und Aufreinigung mit HPLC-, MALDI Massenspektrometrie-Methoden.

[1] Braun K; Peschke P; Pipkorn R; Lampel S*; Wachsmuth M; Waldeck W; Friedrich E*; Debus J; A biological transporter for the delivery of peptides to the nuclear compartment in living cells. J Mol Biol in press (2002) [2] Schlosser, A., Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Lehmann, WD. Analysis of protein phosphorylation by combination of elastase digest and neutral loss tandem mass spectrometry. Protein Sci 11: 2260-8, 2000 [3] Kinzel,V ., König, N.,Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Lehmann, W-D. Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray mass spectrometry. Prot. Sci 11: 2269-77, 2000 [4] Pipkorn R, Boenke C*, Gehrke M*, Hoffmann R*. Highthroughput peptide synthesis and peptide purification strategy at the low micromol-scale using the 96-well format. J Peptide Res. 59: 105-114, 2002 [5] Lehmann, W-D, Schlosser, A., Erben, G., Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Kinzel, V. Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Prot Sci 9: 2260- 2268, 2000 [6] Langosch, D*, Brosig, B* and Pipkorn, R. Peptide mimics of the vesicular stomatitis virus G-protein transmembrane segment drive membrane fusion in vitro. J Biol Chem 276: 32016-32021, 2001 [7] Tholey, A, Pipkorn, R, Bossemeyer, D. and Kinzel, V. and Reed, J. Influence of myristoylation, phosphorylation and deamidation on the structural behavior of the N-terminus of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. Biochemistry 40: 225- 231, 2001

“Bioshuttle” - Strukturschema [1] Transport Modul

Transportpeptid,

-S%S- Adress Modul

Adresspeptid,

Spacer

Substanz

Wirk Substanz

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation

Abteilung Biochemie der Gewebsspezifischen Regulation (B0500) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Friedrich Marks ( - 03/02) Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. rer. nat Gerhard Fürstenberger PD Dr. rer. nat. Peter Krieg PD Dr. rer. nat. Karin Müller-Decker Dr. rer. nat. Michael A. Rogers Dr. Kirsten Scholz Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schweizer Dr. rer. nat. habil. Hermelita Winter Gastwissenschaftler Dr. Tsevtomir Lukanov (Univ. Sofia, Bulgarien, 04 - 07/00) Dr. Nao Qiao (Kanazawa University, Kananzawa, Japan, 11/00 - 11/01) Dr. Svetlana Zoubova (St. Petersburg, Russland, 05/01 05/02) Doktoranden Thorsten Lau Karsten Müller Melanie Neumann Malte Siebert Anette Zagorski Diplomanden Wolfgang Hirschner

Gwendolin Manegold Gitta Neufang Jin Kyun Park Lius-Felipe Jave-Suarez

Fey-Yin Cheang

Technische Mitarbeiter Dagmar Kucher (Teilzeit) Ina Kutschera Sandra Pfrang Andrea Pohl-Arnold (Teilzeit) Brigitte Steinbauer (Teilzeit) IngeborgVogt Ulrike Beckhaus Claudia Ehman Auszubildende (Stand 12/01) Sabrina Balaguer Jutta Bulkescher Sarah Wolf Sekretariat

Wiltrud S. Bockemühl

Andere technische Dienste Roswitha Epp Die Abteilung war in drei Arbeitsgruppen unterteilt: Gruppe 1: Eisosanoide und Tumorentwicklung (Dr. Gerhard Fürstenberger) Gruppe 2: Proteinkinase C (Dr. Michael Gschwendt, ausgeschieden) Gruppe 3: Differenzierung von normaler und pathologisch veränderter Epidermis (Dr. Jürgen Schweizer) Die Forschungsprojekte gehen auf die langjährigen Arbeiten der Abteilung über die Regulation von Wachstum und Differenzierung sowie Krebsentwicklung in der Haut zurück. In diesem Zusammenhang konzentrieren sich die Untersuchungen auf die Regulation des epidermalen Arachidonsäurestoffwechsels und die molekularen Mechanismen der Eicosanoid-Wirkung bei diesen Prozessen. Als Differenzierungsmarker der normalen Epidermis und ihrer Anhangsorgane, sowie der daraus entstehenden Tumore, dienen die Keratine Nach dem Ausscheiden von Prof. Marks in den Ruhestand werden nur die Gruppen von Dr. G. Fürstenberger und Dr. J. Schweizer als selbständige Einheiten weitergeführt.

Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung Leiter: Dr. rer. nat Gerhard Fürstenberger Unter den aus Arachidonsäure gebildeten Eicosanoiden sowie den entsprechenden Octadecanoiden (aus Linolsäure) finden sich zahlreiche hochaktive Wirkstoffe, die als Agonisten mit spezifischen Oberflächenrezeptoren sowie mit Transkriptionsfaktoren des Typs PPAR reagieren. Eicosanoide sind u.a. Entzündungsmediatoren und Wundfaktoren und werden von gereiztem Gewebe vorübergehend gebildet. Eine dauernde Überproduktion von Eicosanoiden findet man dagegen bei chronisch-degenerativen Prozessen (rheumatische Arthritis, Atherosklerose und Alzheimersche Demenz) sowie bei epithelialen Tumorerkrankungen. Die biologische Aktivität der Eicosanoide und Octadecanoide wird aufgrund ihrer Kurzlebigkeit in der Regel über die Biosynthese reguliert, welche von zwei Enzymfamilien, den Cyclooxygenasen und den Lipoxygenasen, beherrscht wird. Beide Stoffwechselwege können zugleich eine Quelle von reaktiven (gentoxischen) Sauerstoffspezies sein, die bei der enzymatischen Fettsäureoxidation als Nebenprodukte entstehen und zu „oxidativem Stress“ beitragen [1, 16-21]. Wir untersuchen die Rolle von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen in normalen Epithelien und bei der Tumorentwicklung in der Haut, Kolon, Brustdrüse, Pankreas und der Prostata von Mäusen. Durch flankierende Studien an Operationsmaterial versuchen wir eine Brücke vom Tierversuch zur Klinik zu schlagen. Unsere Arbeiten haben das Ziel, das Verständnis der normalen und pathologischen Funktionen des Stoffwechsels ungesättigter Fettsäuren zu vertiefen. Die so gewonnenen Kenntnisse über Mechanismen sollen als rationale Ansätze für die Verbesserung bestehender und die Entwicklung neuer Methoden zur Krebsprävention bzw. -therapie dienen. Für die beschriebenen Untersuchungen kommen transgene Mausmodelle mit gewebs- und differenzierungsspezifischer Überexpression oder Inaktivierung von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen und entsprechende Zellkultursysteme zum Einsatz, um die spezifischen Funktionen dieser Proteine bei der Entwicklung epithelialer Tumore im Kontext der jeweiligen Gewebe bzw. des Gesamtorganismus zu untersuchen.

1. Cyclooxygenasen K. Müller-Decker, W. Hirschner, T. Lau, G. Neufang, M. Neumann, A. Zagorski, F. Marks, G. Fürstenberger Zusammenarbeit mit der dermatologischen Universitätsklinik Mannheim (Dr. C. Bayerl), dem Pathologischen Institut der Universität Heidelberg, (Dr. I. Berger), der Mahodi Universität Bangkok (Prof. V. Sirikulchayanonta), der University of California, Los Angeles (Dr. H.R. Herschman), dem Institut für Pharmakologie der Universität Frankfurt (Dr. M. Kaszkin), dem Institut für Tumorbiologie der Universität Wien (Prof. Dr. B. Marian) und dem M.D. Anderson Cancer Center, Smithville Division (Prof. D. S.M. Fi-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation scher), sowie der Pharmacia, St. Louis, USA und der Bayer AG, Leverkusen. Zusatzfinanzierung: Industrikooperation, Deutsche Krebshilfe

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Cyclooxygenasen (COX) katalysieren die Oxidation von Arachidonsäure zu einem Prostaglandin-Endoperoxid (PGH ), das durch weitere Enzyme in die eigentlichen 2 Prostaglandine sowie in Prostacycline und Thromboxane umgewandelt wird. Einige dieser Wirkstoffe sind entscheidend an der Tumorentwicklung beteiligt: sie hemmen terminale Differenzierung und Apoptose, fördern Zellproliferation, Angiogenese und Metastasierung und wirken immunsuppressiv. Von den beiden bekannten COX-Isoenzymen wird COX-1 in praktisch allen Organen konstitutiv exprimiert, COX-2 dagegen in der Regel nur vorübergehend bei Stress-Situationen (Verwundung, Infektion, Entzündungen) induziert Eine permanente Überexpression von COX-2 wurde in allen bisher untersuchten epithelialen Neoplasien des Menschen und der Maus beobachtet [1, 8, 21]. Tierversuche und klinische Studien haben eine z.T. dramatische Reduktion der Tumorentwicklung durch Hemmung der COX-2Aktivität gezeigt. Unseren Untersuchungen am Maushautmodell zufolge geht die konstitutive Überexpression von COX-2 im proliferationsaktiven Kompartiment von prämalignen Tumoren mit einer extremen Überproduktion der Prostaglandine PGE2 und PGF2α einher, wobei PGF2α als endogener Tumorpromotor wirkt [1, 8, 21]. Auch Tumore von Menschen erzeugen erhebliche Mengen an Prostaglandinen, und eine Hemmung der Prostaglandinsynthese durch COX-Inhibitoren unterdrückt die Tumorentwicklung [1, 8, 21]. Hierauf beruht die bereits klinisch angewendete Chemoprävention des kolorektalen Karzinoms durch Entzündungshemmer vom Typ der nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID) mit Aspirin als Prototyp.

COX-Isoenzyme und epitheliale Wundheilung Die Heilung epithelialer Wunden geht einher mit einer transienten Induktion der COX-2-Expression. Im Modell der Maushaut zeigte sich, dass die Heilung von Schnittwunden bei systemischer Verabreichung von COX-1- oder COX-2-selektiven Inhibitoren allein nicht beeinträchtigt wird. Auch die gleichzeitige Hemmung beider Isoenzyme verzögert die Wundheilung nicht [19]. Diese Beobachtung ist von Bedeutung im Hinblick auf den Einsatz von COXInhibitoren, insbesondere COX-2-selektiver Inhibitoren zur postoperativen Prävention von kolorektalem Krebs. Zusatzfinanzierung: Industriekooperationen, Deutsche Krebshilfe.

COX-Isoenzyme und epitheliale Tumorentwicklung: Untersuchungen an menschlichen Gewebeproben. In Zusammenarbeit mit dem Nationalen Krebsinstitut von Thailand haben wir eine Studie über menschlichen Gallengangkrebs durchgeführt. Dieser Tumor ist besonders häufig in Südostasien und wird vermutlich durch chronische Gewebsschäden, verursacht durch einen Leberegel, promoviert. Dieser Effekt entspricht der tumorpromovierenden Wirkung von chronischer Gewebsirritation im Mäusehautmodell. Gallengangtumoren unterscheiden sich von Hauttumoren dadurch, dass bei ihnen beide COX-Enzyme übermäßig gebildet werden. Im normalen Gallenganggewebe findet sich jedoch auch hier keine COX-2 [9,20].

Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation Eine Überexpression von COX-2 wurde auch in hepatozellulären Leberkarzinomen, die in Südostasien ebenfalls sehr häufig sind, beobachtet. Diese Untersuchungen sollen zur Klärung der Frage beitragen, ob eine generelle Prävention von Gallengang- und Leberkrebs mit Hilfe von Entzündungs-hemmern in Südostasien möglich ist. Funktion von COX-2 in Maushaut in vivo: Transgene Mausmodelle. Um einerseits die normalen Funktionen von COX-2, andererseits die Rolle dieses Enzyms bei der Tumorentwicklung genauer analysieren zu können, haben wir transgene Mauslinien entwickelt, die COX-2 unter Kontrolle des Keratin-5-Promotors im proliferativen Kompartiment der Epidermis und verwandter Epithelien konstitutiv exprimieren [13]. Der ausgeprägte transgene Phänotyp dieser Tiere hängt von der Expressionsstärke des Transgens und der COX-2-Aktivität ab und wird durch selektive COX-2-Inhibitoren vollständig unterdrückt. Auffallend sind Störungen der Haarfollikelentwicklung, eine starke Talgdrüsenhyperplasie und eine massive epidermale Hyperplasie als Folge einer gestörten epidermalen Differenzierung und Kompartimentalisierung. Die epidermalen Dysplasien gleichen präneoplastischen Veränderungen bei der chemisch induzierten Maushautkarzinogenese und bei seborrhoischen Keratosen des Menschen. Eine starke Gefäßneubildung in der unmittelbaren Umgebung der Dysplasien zeigt zudem einen proangiogenen Effekt des Transgens, der mit einer verstärkten Bildung des proangiogenen Prostaglandins PGE2 bei gleichzeitiger Verminderung des anti-angiogenen 15-Desoxy-PGJ2 korreliert. Durch das COX-2-Transgen wird die Krebsanfälligkeit extrem erhöht. So bilden sich Hauttumore allein nach Initiation, d.h. unter Bedingungen, bei denen bei Wildtyp-Tieren überhaupt keine Tumore entstehen. Dieser Befund belegt einen Kausalzusammenhang zwischen COX-2 und Tumorpromotion, indem er zeigt, dass die Haut COX-2-transgener Mäuse auto-promoviert ist. Darüber hinaus entwickeln transgene Tiere - nicht aber Wildtyp-Tiere - im Karzinogeneseexperiment zahlreiche Tumore in anderen das Transgen exprimierenden Epitehlien (unveröffentliche Ergebnisse). Die äußerst niedrigen Karzinogendosen, die bei COX-2Überexpression für eine Krebsentstehung ausreichen, dürften denen in unserer täglichen Umwelt entsprechen. Danach wäre eine aberrante COX-2-Überexpression, wie sie sich nicht nur in manifesten Neoplasien sondern auch in zahlreichen Präneoplasien des Menschen findet, ein Krebsrisikofaktor ersten Ranges, zugleich aber auch ein vielversprechender Angriffspunkt für Chemoprävention. Ziele zukünftiger Untersuchungen sind: 1. die Charakterisierung der COX-2-abhängigen Tumorentwicklung in der Brustdrüse, der Prostata und dem Pankreas der transgenen Mauslinien 2. die Identifizierung und Charakterisierung von „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ von COX-2 plazierten Enzymen des Arachidonsäurestoffwechsels und Prostanoid-Rezeptoren, die an der COX-2-regulierten Prostaglandinsynthese bzw. der Prostanoidfunktion beteiligt

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation sind und deren Expression mit der COX-2-Überexpression gekoppelt ist (z.B. Phospholipasen vom A2-Typ (Freisetzung von Arachidonsäure) und Prostaglandinsynthasen sowie G-Protein-gekoppelte Oberflächenrezeptoren für Prostaglandine und Kernrezeptoren der PPAR-Transkriptionsfaktorfamilie. 3. die Analyse COX-2-abhängiger Protein-Expression

2. Lipoxygenasen P. Krieg, M. Heidt, K. Müller, M. Siebert, A. Zagorski, F. Marks, G. Fürstenberger Kooperation mit Prof. Dr. H. Bartsch und Dr. Nair, Prof. Dr. W. D. Lehmann, Dr. von der Lieth, DKFZ sowie Prof. Dr. B. Marian, Institut für Tumorbiologie der Universität Wien, Österreich; Prof. Dr. Hartmut Kühn, Institut für Biochemie der Charité, Berlin; Prof. A. Brash, Vanderbilt University, Nashville, USA; Prof. K. Honn, Wayne State University, Detroit, USA; Dr. P.L. Grover, Institute of Cancer Research, Haddow Laboratories, Sutton, UK und der Firma L’Oreal, Paris, Frankreich. Zusatzfinanzierung DFG, Deutsche Krebshilfe

Lipoxygenasen (LOX) katalysieren die Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren und stellen so zusammen mit weiteren Enyzmen eine Reihe von bioaktiven Lipidmediatoren wie Hydroxyeicosatetraensäuren (HETE), Leukotriene u.a. bereit [1, 6, 18]. Die LOX- Reaktion ist zugleich eine Quelle für reaktive (gentoxische) Sauerstoffspezies und damit eine mögliche Ursache für „oxidativen Stress“ [1, 2].Im Maushautmodell zeigen Lipoxygenasehemmstoffe eine ähnliche Antitumorwirkung wie die Cyclooxygenaseinhibitoren. Damit werden auch die Lipoxygenasen zu potentiellen Angriffspunkten für Krebschemoprävention. Charakterisierung epidermaler Lipoxygenasen Ausgehend von cDNA aus normaler, hyperplastischer und neoplastischer Haut haben wir sechs verschiedene LOXFormen kloniert und charakterisiert. Zwei davon, die Blutplättchen- und die Leukozyten-12S-LOX (p12S-LOX und l12S-LOX) waren bereits bekannt, die anderen wurden erstmals von uns beschrieben. Dabei handelt es sich um eine e12S-LOX, eine 8S-LOX, eine 12(R)-LOX (die erste Säuger-LOX mit R-Chiralität!) und eine Epidermis-LOX-3. Mit diesen LOX haben wir eine Unterfamilie der LOX, die sog. Epidermis-Typ LOX (eLOX) entdeckt [1, 6, 12, 18]. Die entsprechenden Gene dieser Unterfamilie befinden sich eng benachbart in einem Cluster auf dem zentralen Abschnitt des Mauschromosoms 11, die orthologen menschlichen Gene auf dem syntenen Locus 17p13.1 [12]. Den epidermalen LOX gemeinsam ist, dass sie die konventionellen LOX-Substrate Arachidonsäure und Linolsäure nur mit sehr geringer Effizienz umsetzen [3, 11]. Vermutlich sind komplexere Lipide, wie sie speziell in der Haut vorkommen, Substrate dieser LOX-Familie.

Expression epidermaler Lipoxygenasen. Die Haut von Mäusen zeigt ein charakteristisches, von der terminalen Keratinozyten-Differenzierung abhängiges Expressionsmuster von LOX, das sich bei Gewebsreizung und Tumorbildung ändert [6, 8]). So werden z.B. nach TPA-Behandlung die konstitutiv exprimierten p12S-LOX, e12S-LOX, 12R-LOX und Epidermis-LOX-3 sowie die in

Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation normaler Epidermis nicht nachweisbare 8S-LOX transient induziert, und in Hauttumoren sind 8S- und p12S-LOX aberrant exprimiert und für die massiv erhöhten Spiegel der Eicosanoide 8- und 12-HETE im Tumorgewebe verantwortlich [1, 8, 18]. Diese hohen HETE-Spiegel korrelieren mit der Bildung von Nukleotid-Etheno-Addukten in der DNA der Tumore [2] und in primären Keratinozyten induzieren 8- und 12-HETE chromosomale Aberrationen [1, 18]. Danach wären 8S- und Blutplättchen-12S-LOX gentoxische und somit evtl. „prokarzinogene“ Enzyme. Im Gegensatz dazu wird die Expression von e12-LOX, Epidermis-LOX-3 und 12R-LOX bei der Tumorgenese unterdrückt. Hierbei könnte es sich also um „antikarzinogene“ Enzyme handeln.

Funktion epidermaler LOX in vivo: Transgene Mausmodelle Hinweise auf pro- und antikarzinogene LOX-Wirkungen haben wir bei der Analyse von transgenen Tieren erhalten, die e12S-LOX unter Kontrolle des Keratin-6-Promotors konstitutiv überexprimieren. Bei solchen Tieren hängt die Tumorentwicklung von der Expressionsstärke des Transgens und einer dadurch veränderten Expression anderer LOX-Isoenzyme ab. So kommt es bei niedriger TransgenExpression zu einer Induktion der l12S-LOX und zu einer Akkumulation ihres Linolsäure-Produktes 13-Hydroxyoctadecadiensäure (13-HODE), was mit einer im Vergleich zum Wildtyp geringeren Tumorbildung korreliert. Dagegen führt eine hohe Expression des Transgens zu einer verstärkten Expression der p12S-LOX gepaart mit einer Akkumulation des Arachidonsäure-Produktes 12-HETE. Dieses korreliert mit einer verstärkten Tumorbildung. Unsere Beobachtungen unterstützen damit nicht nur Berichte anderer Autoren über eine antagonistische Wirkung von 12HETE und 13-HODE bei der epithelialen Tumorentwicklung, sondern auch zahlreiche Untersuchungen, denen zufolge eine Linolsäure-reiche (pflanzliche) Ernährung eher krebsverhütend, eine Arachidonsäure-reiche (tierische) Diät dagegen eher krebsfördernd wirkt. Wie es zu dem beobachteten „Cross-talk“ zwischen den verschiedenen LOX-Formen kommt, ist allerdings noch völlig unklar [22]. Zu den potentiell „antikarzinogenen“ LOX könnte auch die 12R-LOX gehören, da deren Expression bei der Tumorentwicklung ebenfalls unterdrückt wird. Die Rolle dieser Isoform bei der Karzinogenese soll mit Hilfe von Mauslinien untersucht werden, bei denen das 12R-LOX-Gen gewebsspezifisch (in der Epidermis) ausgeschaltet werden kann. Das entsprechende konditionale12R-LOX-KnockoutKonstrukt wurde bereits hergestellt. Ziele künftiger Untersuchungen sind: 1 Identifizierung der Substrate und Produkte der epidermalen LOX 2. Analyse der LOX-Funktion in Keratinocyten mit Hilfe von induzierbaren Expressionsystemen (TET-on/off) 3. Charakterisierung des „Cross-talk“ zwischen LOXIsoenzymen in vivo nach gewebesspezifischer Überexpression oder Ausschaltung individueller LOX in der Epidermis von Mäusen 4. Identifizierung von LOX-Isoenzymen als potentielle Targets für Krebschemoprävention.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Marks, F., Fürstenberger, G.: Cancer chemoprevention through interruption of multistage carcinogenesis: The lessons learned by comparing mouse skin carcinogenesis and human large bowel cancer. Europ. J. Cancer 36, 314-329 (2000). [2] Nair, J., Fürstenberger, G., Bürger, F., Marks, F., Bartsch, H.: Promutagenic etheno-DNA adducts in multistage mouse skin carcinogenesis: correlation with lipoxygenase-catalyzed arachidonic acid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 13, 703-709 (2000). [3] Bürger, F., Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: Positional and stereo selectivity of fatty acid oxygenation catalyzed by murine 12S-lipoxygenase isozymes. Biochem. J. 348, 329-335 (2000).

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[4] Müller, K., Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: Expression of PGF2? receptor mRNA in normal, hyperplastic, and neoplastic skin, and in other mouse tissues. Carcinogenesis 21, 1063-1066 (2000). [5] *Schadow, A., *Scholz-Pedretti, K., *Scholz, K., *Lambeau, G., *Gelb, M.H., Fürstenberger, G., *Pfeilschifter, J., *Kaszkin, M.: Characterization of group X phospholipase A2 as the major enzyme secreted by human keratinocytes and its regulation by the phorbol ester TPA. J. Invest. Dermatol. 116, 31-39 (2001). [6] Heidt, M., Fürstenberger, G., Vogel, S., Marks, F., Krieg, P.: Diversity of murine lipoxygenases: identification of subfamily of epidermal isozymes exhibiting a differentiation-dependent mRNA expression pattern. Lipids 35, 701-707 (2000). [7] Manzow, S., Richter, K.H., Stempka, L., Fürstenberger, G., Marks, F.: Evidence against a role of general protein kinase C downregulation in skin tumor promotion. Int. J. Cancer 85, 503507 (2000). [8] Marks, F., Müller-Decker, K., Fürstenberger, G.: A causal relationship between unscheduledeicosanoid signaling and tumor development: cancer chemoprevention by inhibitors of arachidonic acid metabolism. Toxicology 153, 11-26 (2000) [9] *Chariyalertsak, S., *Sirikulchayanonta, V., Mayer, D., KoppSchneider, A., Fürstenberger, G., Marks, F., Müller-Decker, K.: Aberrant cyclooxygenase isozyme expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Gut 48, 80-86 (2001) [10] *Richter, M., *Weiss, M., *Weinberger, I., Fürstenberger, G., *Marian, B.: Growth inhibition and induction of apoptosis in colorectal tumor cells by cyclooxygenase inhibitors. Carcinogenesis 22, 17-25 (2001). [11] Siebert, M., Krieg, P., Lehmann, W.D., Marks, F., Fürstenberger, G.: Enzymatic characterization of epidermisderived 12-lipoxygenase isoenzymes. Biochem J. 355, 97-104 (2001). [12] Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: A gene cluster encoding human epidermis-Type lipoxygenases at chromosome 17p13.1: Cloning, physical mapping, and expression. Genomics, 73, 323-330 (2001). [13] Neufang, G., Fürstenberger, G, *Heidt, M., Marks, F., MüllerDecker, K.: Abnormal differentiation of epidermis in transgenic mice constitutively expressing cyclooxygenase-2 in skin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 98, 7629-7634 (2001). [14] Breitenbach, U., Tuckermann, J.P., Gebhardt, C., Richter, K.H., Fürstenberger, G., *Christofori, G., Angel, P.: Keratinocytespecific onset expression in experimental of serine protease BSSP carcinogenesis. J. Invest. Dermatol. 117, 634-640 (2001). [15] Marks, F.: Cancer-linked genes. Meeting Report. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126, 661-666 (2000). [16] Marks, F.: Der Stoffwechsel der Arachidonsäure: ein riskantes Bravourstück der biochemischen Evolution. Biologie in unserer Zeit 30, 342-352 (2000). [17] Marks, F.: Krebs- und Alzheimer-Prävention mit nichtsteroidalen Entzündungshemmern. Deutsche Medizin. Wschr. 126, 308-314 (2001).

Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation [18] Fürstenberger, G., Marks, F., Krieg, P.: Arachidonate 8(S)Lipoxygenase. Prostaglandins and other lipid mediators. J. Lipid Med. Cell Signalling, in press [19] Müller-Decker, K., Hirschner, W., Marks, F., Fürstenberger, G.: The effects of COX isozyme inhibition on incisional wound healing in mouse skin. J. Invest. Dermatol., in press [20] Müller-Decker, K., Chariyalertsak, S., Albert, C., Reinerth, G., Marks, F., Fürstenberger, G.: Cyclooxygenase-2: A molecular target for chemoprevention of epithelial tumors of skin and colon. In: Eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases, 6 (Ed. Honn et al.) Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. In press [21] Marks, F., Fürstenberger, G., Müller-Decker, K.: COX-2, an endogenous tumor promoter and target for the chemoprevention of colorectal cancer and other neoplastic diseases. In: „Hormone Replacement Therapy and Cancer“. In press. [22] Müller, K. Siebert, M., Heidt, M., Marks, F., Krieg, P., Fürstenberger, G.: Modulation of epidermal tumor development caused by targeted overexpression of epidermis-type 12Slipoxygenase. Cancer Res., in press

Differenzierung von normaler und neoplastischer Epidermis Leiter: Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schweizer Die Proteinfamilie der Keratine umfaßt die epithelialen Keratine, die in Zellen der verschiedenen Epitheltypen das 10 nm Intermediärfilamentnetz ausbilden, und die Haarkeratine, die am Aufbau von Haaren und Nägeln beteiligt sind. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen steht die Charakterisierung der komplexen Multigenfamilien menschlicher Haarkeratine sowie Untersuchungen zu deren Expression und Regulation im normalen und pathologisch veränderten Haarfollikel. Darüberhinaus beginnen wir mit der Charakterisierung der Multigenfamilien Haarkeratin-assoziierter Proteine, KAP, die die Matrix für Haarkeratin-IFs bilden. In beiden Fällen untersuchen wir ebenfalls die Beziehungen zwischen erblichen Haaranomalien und Mutationen in den Mitgliedern der Multigenfamilien.

1. Aufklärung der humanen Haarkeratin- und KAP-Multigenfamilien J. Schweizer, M.A. Rogers, H. Winter In Zusammenarbeit mit Dr. L. Langbein, DKFZ; Drs. N. Aoki, Y. Shimomura, Hautklinik Niigata, Japan Zusatzfinanzierung DFG.

Der Haarfollikel ist das morphologisch komplexeste Anhangsorgan der Epidermis. Am Aufbau seiner unterschiedlichen Gewebekompartimente spielen sowohl epitheliale Keratine als auch Haarkeratine als zelluläre Strukturproteine eine wesentliche Rolle. Mit Hilfe genomischer und cDNA-Banken konnten wir die gesamte Multigenfamilie der humanen Haarkeratine aufklären. Sie umfasst insgesamt 20 Gene, die in zwei Subfamilien auf Chromosom 12q13 (Typ II: 6 funktionelle Gene, 4 Pseudogene) bzw. Chromosom 17q12-21 (Typ I: 9 funktionelle Gene, 1 transkribiertes Pseudogen) geklustert sind [1, 2, 3]. Mit Hilfe spezifischer Antikörper und cDNA-Sonden konnten wir die exakte Abfolge der Haarkeratinexpression im haarbildenden Kompartiment des Follikels ermitteln und einen Katalog humaner Haarkeratine erstellen [1, 2, 3]. Im Verlauf der genomischen Untersuchungen gelang es uns, mehre-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation re neue Gene epithelialer Keratine zu identifizieren, von denen einige spezifisch in der inneren Wurzelscheide des Haarfollikels exprimiert werden [4]. Darüberhinaus konnten wir innerhalb der Typ I Keratingendomäne auf Chromosom 17 fünf KAP-Multigenfamilien charakterisieren und die Expression ihrer Mitglieder im Haarkortex nachweisen [5].

2. Haarkeratin- und KAP-Mutationen und Haaranomalien J. Schweizer, H. Winter, M.A. Rogers In Zusammenarbeit mit Dr. P. Vabres, Hautklinik Poiters, Frankreich; Dr. A. Taieb, Hautklinik Bordeaux, Frankreich; Dr. D. Schissel, US Army Hospital, Heidelberg; Drs. M. Krawczak, D.N. Cooper, Humangenetik Cardiff, UK; Dr. P.Heidt, Primatenzentrum Nijmwegen, Niederlande. Zusatzfinanzierung DFG.

In klinischen Kooperationsprojekten über Mutationen in Haarkeratingenen und erbliche Haaranomalien wurden die Untersuchungen der Haaranomalie Monilethrix abgeschlossen. Monilethrix stellt bisher die einzige bekannte Haarkeratinkrankheit dar [6]. Untersuchungen an Patienten, die am sogenannten „Loose Anagen Hair“ Syndrom leiden, ergaben Hinweise für die mögliche Involvierung eines mutierten epithelialen Keratins der inneren Wurzelscheide, das für die gestörte Verankerung des Haarschaftes im Follikel verantwortlich sein könnte [8]. Die Untersuchungen an der Haaranomalie Pseudofollicultis barbae, die in Zusammenarbeit mit der US Army Heidelberg erfolgen, stehen kurz vor dem Abschluß. An der Ausbildung der für diese Anomalie typischen entzündlichen Prozesse im Gesichtsbereich, die durch einwachsende Haare verursacht werden, scheint neben dem Haarphänotyp, die Beteiligung einer Mutation im epithelialen Keratin K6hf gesichert. Letzteres wird im sogenannten Companion layer, zwischen der äußeren und inneren Wurzelscheide exprimiert. In mutierter Form könnte es zu einer Destabilisierung des wachsenden Haares beitragen. Schließlich konnten wir nachweisen, daß das im Typ I Haarkeratin-Genlokus auftretende Pseudogen ϕhHaA , das durch eine Punktmutation inaktiviert wurde, im Schimpansen und Gorilla intakt ist. Augenblicklich untersuchen wir ob es in den Primatenhaaren auch zur Expression eines funktionellen Haarkeratins kommt.

Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation

3. Regulation der Haarkeratinexpression L.F. Jave-Suarez, H. Winter, J. Schweizer In Zusammenarbeit mit Dr. B. Cribier, Hautklinik Strassburg, Frankreich

Mit der Aufklärung der Gene der humanen Haarkeratine waren die Voraussetzungen für Studien zur Regulation der Hairkeratinexpression gegeben. Ihm Rahmen einer Doktorarbeit konnten wir nachweisen, daß des das Homöobox-Protein HOXC13 an der Expressionskontrolle von Haarkeratingenen beteiligt ist, die während der frühen Differenzierungsphase im haarbildenden Kompartimente exprimiert werden. Die Expressionskontrolle verläuft dabei über mehrere Bindungselemente im proximalen Promotorbereich der Gene, von denen eines nicht von anderen HOX13 Paralogen erkannt wird. Es bestehen Evidenzen, daß der ß-Catenin/LEF-1 Transkriptionskomplex an der Regulation der Expression von Kortexkeratin-Genen beteiligt ist. Die Untersuchungen über die Expressionskontrolle eines in der Medulla von Sexualhaaren exprimierten Keratins durch den Androgenrezeptor stehen kurz vor dem Abschluß. Im engen Zusammenhang mit diesen Studien stehen Untersuchungen zur Expression von Haarkeratingenen und Transkriptionsfaktoren in humanen haarfollikelabgeleiteten Tumoren, die in Zusammenarbeit mit der Hautklinik Straßburg durchgeführt werden und deren Ziel eine verbesserte Klassifizierung dieser Tumoren ist [7]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Rogers M. A, Winter H, Langbein L, Schweizer J. Characterization of a 300 kpb region of human DNA containing the type II hair keratin gene locus. J. Invest. Dermatol. 114, 464472, 2000 [2] Langbein L, Rogers M. A, Winter H, Praetzel S, Schweizer J. The catalog of human hair keratins - II. Expression of the six type II members in the hair follicle and the combined catalog of human type I and II keratins. J. Biol. Chem. 276, 35123-35132, 2001 [3] Rogers M. A. Keratins and keratin diseases. In: Encyclopaedia of the Human Genome, Nature Publishing Group, Macmillan Press, Hampshire, England. Im Druck [4] Langbein L, Rogers M. A, Praetzel S, Winter H, Schweizer J. A novel epithelial keratin, hK6irs1, is expressed differentially in all layers of the inner root sheath, including specialized Huxley cells (“Flügelzellen”) of the human hair follicle. J. Invest. Dermatol, Im Druck [5] Rogers M. A, Langbein L, Winter H, Ehmann C, Praetzel S, Korn B, Schweizer J. Characterization of a cluster of human high/ ultrahigh sulfur keratin-associated protein genes embedded in the type I keratin gene domain on chromosome 17q12-21. J. Biol. Chem. 276, 19440-19451, 2001 [6] Winter H, Rogers M A, Vabres , P*. Larrègue M*, Schweizer J. A novel missense mutation, A118E, n the the helix initiation motif of the type II cortex keratin hHb6 causing monilethrix. Hum. Heredity 50, 322-324, 2000 [7] Cribier B*, Peltre B*, Langbein L, Winter H, Schweizer J, Grosshans E*. Expression of type I hair keratins in follicular tumors. Brit. J. Dermatol. 144, 977-982, 2001 [8] Chapalain, V, Winter H, Langbein L, LeRoy JM,* Labrèze C*, Nikolic M*, Schweizer, J, Taieb A*. Is the loose anagen hair syndrome a keratin disorder? A clinical and molecular study. Arch. Dermatol. Im Druck

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro

Abteilung Differenzierung und Carcinogenese (B0600) Leiter: Prof. Dr. med. Norbert E. Fusenig Wissenschaftliche Mitarbeiter PD. Dr. Dirk Breitkreutz Dr. Nicole Maas-Szabowski Dr. Margareta Müller Dr. Hans-Jürgen Stark Dr. Silvia Vosseler Gastwissenschaftler Dr. Nicole Mirancea, Rumänien (01-12/00; 06-12/01)

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Doktoranden Nicole Daum Lars Langeloh Joachim Mertens Martina Oehme Anja Stärker

Claudia Gutschalk Wiltrud Lederle Eva Obermüller Cathrine Schmidt Michael Willhauck

Diplomanden Martina Koci Technische Angestellte Regina Beck (50%) Angelika Krischke Heinrich Steinbauer Eva Goedecke Sekretariat Martina Kegel

Silke Haid (25%) Iris Martin Elke Tomakidi Alexandra Krämer

Im Mittelpunkt der Untersuchungen der Abteilung stehen zelluläre und molekulare Mechanismen der Zell-Zell und Zell-Matrix-Wechselwirkungen von Hautzellen und ihre steuernde Rolle für die Regeneration und Differenzierung des normalen Hautepithels einerseits und andererseits für die Entwicklung und Progression von epithelialen Hauttumoren. Die ebenfalls durchgeführten Arbeiten zum Mehrstufenprozess der Hautcarcinogenese sind im Bericht der Abteilung B0900 von der ehemaligen Mitarbeiterin Frau PD Dr. Petra Boukamp dargestellt. Ziel der Forschungsarbeiten ist ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge der Transformation humaner Epithelzellen zu Carcinomzellen und deren veränderter Wachstumsregulation im Vergleich zu den Steuerungsmechanismen im normalen Gewebe. Für diese überwiegend in Zellkultur durchgeführten Studien haben wir zelluläre Modelle und komplexe Kultursysteme entwickelt, die der natürlichen Situation im Organismus weitgehend entsprechen. Ausgehend von normalen Epithelzellen der adulten menschlichen Haut (Keratinozyten) wurde eine spontan immortalisierte Zellinie (HaCaT) entwickelt und als weitestgehend normal funktonierende Keratinozytenlinie charakterisiert. Ihre überwiegend regulären epidermalen Eigenschaften qualifizierten diese Zellen i) als Paradigma für humane Keratinozyten und machten sie ii) auch auf Grund ihrer vielfältigen Manipulierbarkeit zu einem weltweit begehrten Modellsystem, das derzeit in weit mehr als 2000 Laboratorien für verschiedene Fragestellungen verwandt wird. Nach genetischen (Transfektion des Ha-ras Onkogenes und von Wachstumfaktoren) und epigenetischen Manipulationen der HaCaTZellen (Stresseinwirkung, extensive Passagierung in vitro) konnten tumorigene Klone mit benignen, malignen und metastasierenden Wachstumseigenschaften identifiziert werden. Wenn auch die Entstehung von Tumoren sowie ihr autonomes Wachstumsverhalten ursächlich auf genetischen Veränderungen einer Einzelzelle begründet sind, ist das komplexe Phänomen des Tumorwachstums (mit Invasion und Metastasierung) nur im Rahmen der veränderten Wechselwirkung von Tumorzellen und ihrem umgebenden Gewebe im Organismus zu verstehen. Ohne die spezifische Interaktion mit Bindegewebe und Blutgefäßen ist das Wachstum auch der aggressivsten Tumorzellen auf mikroskopisch kleine Tumor-Knoten limitiert. Ebenso wird die Homöostase eines normalen Gewebes wie der Epidermis, d.h. die Balance zwischen Wachstum und Differenzierung der Epithelzellen, über komplexe Zell-Zell und Zell-MatrixWechselwirkungen gesteuert. Die zellulären und molekularen Mechanismen dieser epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen, durch die Wachstum, Differenzierung und Gewebestrukturierung normaler Keratinozyten, aber auch das Wachstumsverhalten von Tumorzellen gesteuert werden, waren und sind Gegenstand der Untersuchungen in den einzelnen Arbeitsgruppen der Abteilung.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

I. Mechanismen der Epithel-MesenchymWechselwirkungen zur Steuerung von Wachstum und Differenzierung normaler Keratinozyten Für den Erhalt der Funktion und Struktur von Geweben ist das Gleichgewicht zwischen Wachstum und Differenzierung, die Gewebe-Homöostase, unabdingbare Voraussetzung. Dies wird maßgeblich über Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen gesteuert, wobei insbesondere den EpithelMesenchym-Wechselwirkungen eine herausragende Rolle zukommt. Im Fall der Haut erfolgt dieser Austausch zwischen der Epidermis und der Dermis als dem zugehörigen Bindegewebe über die Basalmembran, einer speziellen Struktur der extrazellulären Matrix. Entsprechend hatten unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, daß zur Kontrolle epidermaler Wachstums- und Differenzierungs-Vorgänge zwischen beiden Gewebekompartimenten äußerst komplexe Regelkreise existieren. Als experimentelle Basis zur Analyse dieser Wechselwirkungen waren zunächst epidermale Keratinozyten und Fibroblasten aus verschiedenen Hautbereichen isoliert und die Expressionsprofile von relevanten Cytokinen und zugehörigen Rezeptoren in konventionellen Mono- und Kokulturen erfaßt worden [1, 2]. Im Gegensatz zu diesem herkömmlichen Ansatz konnte in organotypischen Zellkulturen eine der Haut ähnliche Situation rekonstruiert werden. Hierbei wachsen Epithelzellen auf einer extrazellulären Matrix (Kollagen Typ 1) in enger Nachbarschaft zu hierin eingebetteten Bindegewebszellen. So bilden unter dem Einfluß dermaler Fibroblasten die epidermalen Keratinozyten geschichtete und differenzierende Oberflächenepithelien, die im Gegensatz zu konventionellen Kulturen eine definierte Struktur und Polarität aufweisen. Dabei werden spezifische Gewebecharakteristika in Struktur und Funktion augebildet, vergleichbar mit dem Ursprungsgewebe der Epidermis [3, 4, 5]. Als experimentelles Bezugssystem für das Wachstumsund Differenzierungspotential individueller Zellpopulationen unter in vivo Bedingungen diente standardmäßig das etablierte Oberflächen-Transplantations-Modell auf der Nacktmaus. Mit retransplantierten normalen Keratinozyten hatten wir eine vollständige Wiederherstellung der epidermalen Gewebestruktur und Funktion erzielen können [6]. Dieser Prozeß erfolgte ähnlich der Wundregeneration über definierte Stadien und offensichtlich ohne direkte mesenchymale Zellkontakte, war also weitgehend über diffusible Faktoren reguliert. Während hierbei die Evidenz noch überwiegend morphologisch gestützt war, ermöglichten in neueren Arbeiten die organotypischen Kokulturen einen direkten funktionellen Nachweis von Regelkreisen über lösliche Mediatoren. Die getrennte Analytik des Epithelbzw. Bindegewebeanteils der dreidimensionalen organotypischen Kokulturen erlaubte hierbei eindeutige Aussagen über den wechselseitigen Steuerungsprozess zwischen Keratinozyten und Fibroblasten auf molekularer Ebene und damit über die regulatorische Bedeutung des dermalen Parts für die Steuerung der Epidermis-Struktur und -Funktion.

Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro

1. Paracrine Regulation der Proliferation und Differenzierung normaler Keratinozyten N. Maas-Szabowski, H.-J. Stark, A. Stärker, M. Willhauck Kooperationen mit P. Angel, DKFZ; R. Wolber, Beiersdorf AG, Hamburg; Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terme, Italien

Nach früheren ersten Hinweisen, daß die Steuerung der epidermalen Proliferation und Differenzierung maßgeblich über diffusible Faktoren aus dermalen Zellen erfolgt, konnten wir in Kokulturen epidermaler Keratinozyten mit dermalen Fibroblasten einen neuen Mechanismus von doppelt-parakrinen Regelkreisen aufzeigen [6]. So konnte in organotypischen Kokulturen ein bisher nicht bekanntes Zusammenspiel einiger diffusibler Faktoren identifiziert werden. In Kultur sezernieren Keratinozyten verstärkt Interleukin 1 (IL-1), in etwa vergleichbar der Wundsituation in vivo. IL-1 induziert dann in Fibroblasten, neben Proliferation, die vermehrte Expression seines Signalempfängers, des IL-1-Rezeptors, sowie die Expression und Synthese verschiedener Wachstumsfaktoren und Interleukine. Unter anderem werden KGF (keratinocyte growth factor) und GM-CSF (granulocyte macrophage colonie stimulating factor) verstärkt exprimiert [7]. Während die Stimulation der Keratinozyten-Proliferation durch KGF bereits bekannt war, konnten wir in unserem System dies auch für den hämatopoietischen Faktor GM-CSF zeigen. Wie wir weiter in heterologen Kokulturen mit Mausfibroblastenlinien, die Defizienzen in AP-1-Transkriptionsfaktor-Untereinheiten aufwiesen, zeigen konnten, wird die Expression von KGF und GMCSF nach IL-1-Induktion antagonistisch von den AP-1-Untereinheiten c-Jun und Jun-B gesteuert. Hierbei induziert c-Jun die Transkription beider Cytokine, wohingegen JunB die transkriptionelle Aktivität von KGF und GM-CSF unterdrückt. In Hautäquivalenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, daß KGF und GM-CSF die Proliferation der Keratinozyten stimulieren und GM-CSF zusätzlich in den Differenzierungsprozess der Epithelregeneration eingreift [8, 9]. Neben KGF und GM-CSF spielen jedoch noch weitere Cytokine eine essentielle Rolle bei der Epithelbildung sowie der Aufrechterhaltung der Hautstruktur, da beide Faktoren gemeinsam die Abwesenheit von Fibroblasten in organotypischen Kulturen nicht kompensieren konnten. In heterologen Kokultursystemen mit genetisch veränderten Fibroblasten werden deshalb zur Zeit weitere Faktoren der dermal-epidermalen Kommunikation identifiziert. Darüberhinaus werden die molekularen Mechanismen eingehend analysiert, die KGF und GM-CSF in den Keratinozyten auslösen, insbesondere die von ihnen induzierten Zielgene, die für die Entwicklung einer normalen Epidermisstruktur verantwortlich sind. Der derzeitige Stand bei der Herstellung organotypischer Keratinozyten-Fibroblasten-Kokulturen erlaubt ihre reproduzierbare Bereitstellung für experimentelle Zwecke und hat es somit ermöglicht, grundlegende Phänomene der epidermalen Regeneration in vitro zu untersuchen. Wichtige Standardisierungsmaßnahmen an diesem Kulturmodell

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waren hierbei einmal die Einstellung auf definiertes Kulturmedium und zum anderen die Kontrolle der Fibroblastenpopulation durch Verwendung postmitotischer Zellen erreicht werden, ohne daß funktionelle Einbußen eintraten [3]. Weiterhin konnten neuerdings durch Verwendung von biokompatiblen Gerüstmaterialien und dermalen Fibroblasten Dermisäquivalente in vitro produziert werden, die sich durch autonome Produktion extrazellulärer Matrix auszeichnen und eine gut geeignete mesenchymale Unterlage für Keratinozyten in Kokultur bieten. Neben verbesserter mechanischer Stabilität liegt ihr Vorteil auch darin, daß sie im Hinblick auf klinische Anwendung (Tissue Engineering von Hautersatz) ein immunologisch völlig humanisiertes System ohne artfremdes Strukturprotein wie tierisches Kollagen darstellen. In derartigen Hautäquivalenten werden derzeit die Einflüsse des Epithels auf die ECM-Synthese untersucht, was auch im Kontext der Charakterisierung von (Wund- und Tumor-) Stromabildung in vivo von Bedeutung ist. Aufgrund ihrer genetischen Veränderungen, aber auch ihres in vitro Wachstumsverhaltens repräsentieren die Zellen der immortalen humanen Keratinozytenlinie HaCaT ein Frühstadium der Hautcarcinom-Entwicklung. Die detaillierte Analyse ihrer funktionellen Kompetenz unter optimalen, d.h. in vivo Bedingungen, hatte eine weitgehend normale Epithelbildung, allerdings mit verzögerter Kinetik gezeigt. Alle Differenzierungsmarker wurden regelrecht exprimiert, wobei allerdings der strukturelle Aufbau des neu gebildeten Epithels weniger geordnet war und erst nach drei Wochen eine weitgehend normale (othokeratotische) Hornschicht erkennen ließ [10]. Diese regulatorischen Defizite wurden in dem in vitro Modell der organotypischen Kokultur noch deutlicher. Obwohl HaCaT Zellen in konventionellen Kulturen eine größere Wachstumspotenz zeigen als normale Keratinozyten, war dies bei Kultivierung auf Kollagenmatrix und in Anwesenheit von Fibroblasten reduziert [11]. Die Analyse der molekularen Mechanismen dieser gestörten Epithel-Mesenchym-Wechselwirkung, insbesondere der für die Proliferation normaler Keratinozyten aufgezeigten Regelkreise, ist von großem Interesse und wird derzeit intensiv verfolgt.

2. Epithel-mesenchymale Wechselwirkungen in der Produktion der Basalmembran D. Breitkreutz, C. Schmidt, N. Daum, N. Mirancea Kooperation R. Nischt und T. Krieg, Dermatologie, Universität Köln; U. Werner und M. Gerl, Aventis Deutschland

Entsprechend der Wachstumsregulation von Keratinozyten konnte auch die postulierte interaktive Bildung der Basalmembran (BM) durch Keratinozyten und Fibroblasten in organotypischen Kokulturen schlüssig demonstriert werden. Die separate Analyse beider Gewebekompartimente auf mRNA und Proteinebene hatte bereits die wechselseitige Induktion und Dynamik der Synthese der BM-Komponenten gezeigt [12]. Zellspezifisch erfolgte hierbei lediglich die Synthese der Laminin-Isoform LN-5 in Keratinozyten und von Nidogen in Fibroblasten. Darüberhinaus konnten wir unter Verwendung definierter Medien (ohne Serum

Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro oder Gewebeextrakte) direkte Effekte externer Faktoren nachweisen. Dabei zeigte sich ein ausgeprägter Synergismus zwischen TGFß und Vitamin A-Säure, die beide auf der Regulation der epithelialen Differenzierung eher antagonistisch wirken. Eine weitere Regulationsebene bei der BM-Bildung stellt die reguläre Verknüpfung ihrer Einzelkomponenten zu stabilen Co-Polymeren (BM-Assembly) dar, ein wesentlicher Vorgang für die funktionelle BM-Stabilität. Mit einem definierten Laminin-Fragment konnten wir gezielt die Interaktion von Laminin-10 mit der Quervernetzungs-Komponente Nidogen unterbinden und damit die Polymerisation einzelner BM-Komponenten völlig blockieren. Konventionelle sowie Immun-Elektronenmikroskopie machten dabei deutlich, daß neben dem Verlust distinkter BM-Strukturen und der aberranten Lokalisation von BMMolekülen auch Matrix-Verankerungsstrukturen (Hemidesmosomen) der basalen Keratinozyten völlig fehlten. Entsprechend war ebenfalls die Organisation des KeratinCytoskeletts erheblich gestört. Die Effekte waren dosisabhängig und reversibel. Außerdem waren Epithelwachstum und epidermale Differenzierung nicht nachhaltig beeinflußt, was die Spezifität dieses Eingriffs in BM-Organisation und Zell-Matrix-Interaktion klar unterstreicht. Spätere Stadien der Zelltransformation in Richtung Krebszelle, wie sie nach Onkogen-Transfektion an dem HaCaTModellsystem in Form von benignen und malignen Tumorzellen charakterisiert werden konnte, zeigten weitergehende Veränderungen in der Mesenchym-Wechselwirkung und extrazellulären Matrixproduktion. Besonders deutlich wurde dies in Oberflächentransplantaten auf der Nacktmaus, bei denen benigne Zellen differenzierte, leicht dysplastische Epithelien auf aktiviertem Granulationsgewebe bildeten, während maligne Zellen invasives Tumorwachstum zeigten. Dies korrelierte mit einem massiven Verlust der Zellpolarität, erkenntlich an der stark expandierten Zone von proliferierenden Zellen mit BasalzellCharakter sowie aberranten Keratinmustern [13]. Ein weiterhin typisches Merkmal maligner Zellen waren erhebliche Störungen in der Produktion von BM-Strukturen, wobei BM-Komponenten auch diffus in das benachbarte Tumorstroma diffundierten (bestätigt durch Immun-Elektronenmikroskopie). Entsprechend waren im Elektronenmikroskop nur marginal BM-Strukturen sichtbar, einschließlich defekter Zellverankerungs-Komplexe (Hemidesmosomen) an der Zell-Matrix-Interphase. In Analogie zur Keratinozyten-Rekrutierung bei der Wundheilung mit ähnlichen Veränderungen dürften diese wesentlich zur erhöhten Mobilität der Tumorzellen - vor allem bei invasivem Wachstum - beitragen. Eine Schlüsselrolle fällt hierbei den Matrixrezeptoren der Integrin-Familie, insbesondere Integrin α6β4 zu, das ein integraler Bestandteil der Hemidesmosomen ist. Der Beitrag dieses Integrins zur normalen sowie gestörten Signaltransduktion in Tumoren unter Protein Kinase C ist Gegenstand derzeitiger Untersuchungen.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

3. Parakrine und autokrine Mechanismen in Tumorprogression und Stromamodulation M. Müller, C. Gutschalk, E. Obermüller, M. Oehme, M. Koci Kooperation mit Ch. Herold-Mende, HNO Klinik (Dr. C. Reisser) und Neurochirurgie Heidelberg (Dr. H.-H. Stein); A. Marmé, Universitätsfrauenklinik, G. Neufeld, Technion Haifa, Israel

Tumorprogression, d.h. die Entwicklung zunehmend malignerer Varianten, ist durch eine verstärkte Wachstums-Unabhängigkeit der Tumorzellen von ihrer Umgebung (Stroma) charakterisiert, großteils bedingt durch eine veränderte Wachstumsfaktorexpression. In dieser Gruppe ist es kürzlich gelungen, einen bisher unbekannten Weg der autonomen Wachstumsregulation von besonders aggressiven (metastasierenden) HaCaT Tumorzellen zu entschlüsseln und auch dessen Bedeutung für humane Tumore, wie Glioblastome, Meningiome und Kopf-Hals-Tumore zu belegen. Unabhängig von der Art der tumorigenen Transformation der HaCaT Zellen (H-ras Onkogen oder Kultur-Stress) konnte, durch in vivo Passage als s.c. Nacktmaustumore, reproduzierbar die Malignität (Aggressivität) von HaCaT Tumorzellen bis hin zur Metastasierung gesteigert werden [14]. Mit dieser Tumorprogression geht stets eine de novo Expression der hämatopoietischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF einher [15]. Beide, ursprünglich als regulierende Faktoren des hämatopoietischen Systems identifizierte Proteine, wurden von uns erstmals als Progressions-assoziierte Faktoren für epitheliale und neuronale Tumorzellen nachgewiesen. Während die Expression der Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF bereits in nicht tumorigenen HaCaT Zellen zu finden ist, werden die Faktoren ausschließlich in hochgradig malignen Zellen exprimiert. Benigne Tumorzellen, die normalerweise zystische Tumore bilden, konnten durch die Transfektion mit beiden Faktoren zu malignen Tumorzellen transformiert werden. Die Neoexpression von G-CSF und GM-CSF steuert die Tumorprogression durch eine autokrine Stimulation von Tumorzellproliferation und Migration, aber auch über eine verstärkte Induktion von Tumorstroma und Angiogenese in vivo. Darüberhinaus wirken beide Faktoren chemotaktisch für Leukozyten und könnten auf diesem Wege auch für die Expression und Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen in Makrophagen und Granulozyten und damit für die Gewebedegradation im Rahmen der Invasion eine entscheidende Rolle spielen. In Weiterführung dieses Projekts gilt unser Interesse jetzt besonders den Veränderungen in der Tumor-Stroma-Interaktion, die in den hochgradig malignen Zellen durch die de novo Expression von G-CSF und GM-CSF bewirkt werden. Zur weiteren Analyse der veränderten Wachstumsregulation in Früh- versus Spät-Stadien der HaCaT-Tumorzellen finden derzeit cDNA-Array Studien zur Identifizierung zusätzlicher verändert exprimierter Wachstumsfaktoren statt. Den Daten zur Wirkung von G-CSF und GM-CSF auf Tumorwachstum und Progression steht die zunehmende klinische Verwendung beider Faktoren in der adjuvanten Tumortherapie zur Vermeidung von Strahlen und Chemotherapie-induzierter Neutropenie und Mucositis gegenüber, die daher möglicherweise kritisch bewertet werden

Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro muß. Dies wird unterstützt durch die von uns nachgewiesene funktionelle Rolle von G-CSF und GM-CSF als autokrine Stimulatoren von Tumorzell-Proliferation und Migration in humanen Gliomen und Meningiomen [16, 17]. Der Beitrag beider Faktoren zur Tumorprogression spiegelt sich außerdem in einer statistisch signifikanten Korrelation der Expression beider Faktoren in Gliomen und Kopf-Hals-Tumoren mit einer kürzeren Überlebenszeit für die Patienten sowie in einem Überlebensnachteil mancher Patienten bei G-CSF unterstützter Therapie von KopfHals-Tumoren. Daher wollen wir in Fortführung dieser Studien die funktionelle Bedeutung von G-CSF und GM-CSF für Tumorprogression, Invasion und Metastasierung dieser Tumortypen in vivo im Nacktmausmodell verifizieren.

4. Tumor-Stroma-Wechselwirkungen steuern Invasion und Angiogenese S. Vosseler, H.-J. Stark, W. Lederle, M.M. Müller, M. Willhauck, J. Mertens In Kooperation mit J.M. Foidart, Universität Lüttich, Belgien; E. Fink, Universität München, V.M. Kähäri, Universität Helsinki, Finnland, W. Hartschuh, Universität Heidelberg

Zahlreiche Arbeiten aus jüngster Zeit belegen die entscheidende Rolle von stromalen Zell- und Matrix-Elementen für Tumorentstehung, Invasion und Metastasierung. Neben der bekannten induzierenden Rolle von Tumorzellen auf Stromaveränderungen wird die Bedeutung von stimulierenden und hemmenden stromalen Einflüssen auf das Tumorwachstum zunehmend erkannt. Epitheliale Tumore wie Hautcarcinome weisen große Ähnlichkeiten mit der Wundheilungssituation auf, bei der sich der mesenchymale Gewebeanteil in spezifischer Weise zu Granulationsgewebe umbildet. Daher liegt ein Schwerpunkt unserer Forschungsaktivitäten auf der Analyse und funktionellen Charakterisierung solchen Granulationsgewebes. Erste Ergebnisse zeigten, daß die Stroma-Modulation durch Induktion einer Fremdkörperreaktion das invasive Wachstum maligner Tumorzellen entscheidend beeinflußt, je nach chemischer Zusammensetzung der verwendeten Materialien. Von der weiteren eingehenden Untersuchung dieses Phänomens sind wertvolle Erkenntnisse über stromale Parameter, die den Tumorphänotyp kontrollieren, zu erwarten. In vitro Ansätze, bei denen Tumor-Stroma-Äquivalente durch dreidimensionale Kultivierung von isolierten Zellen aus dem Stroma von Plattenepithelkarzinomen hergestellt und mit malignen und prämalignen Zellen kombiniert werden, sollen über die tumorregulierenden Mechanismen der stromalen Zellen Aufschluß geben und diese einer detaillierten Analyse zugänglich machen. Eines der wesentlichsten Elemente der veränderten Tumor-StromaWechselwirkung ist die durch Tumorzellen induzierte Angiogenese. Neben ihrer Bedeutung für die Ernährung und Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes werden der Gefäßneubildung zusätzliche, für das Tumorwachstum wesentliche Funktionen zugesprochen. Dementsprechend konnten wir im Transplantationssystem eine

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bisher nicht bekannte Interaktion von Angiogenese und Tumorinvasion nachweisen. Durch Blockade der Tumor-induzierten Angiogenese mittels Antikörper-vermittelter Inaktivierung eines Rezeptors (VEGF-R2) des potentesten Angiogenesefaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) wurde nicht nur ein Einsprossen der Gefäße in den Tumor (Vaskularisierung), sondern überraschenderweise auch die Invasion der Tumorzellen unterbunden. Dieser bedeutende Befund einer so entscheidenden Wechselwirkung zwischen Gefäßsystem und Tumorinvasion ließ sich inzwischen auch an aggressiven Tumorvarianten, sowohl im Transplantationssystem als auch nach konventioneller subcutaner Injektion, erhärten. Wenn auch die mechanistischen Zusammenhänge noch unklar sind, belegen diese Ergebnisse eindeutig die essentielle Rolle der Gefäßneubildung, d.h. von aktivierten Endothelien, für die Tumorinvasion [18]. In einer Kooperationsstudie mit Prof. Hartschuh (Universitätshautklinik, Heidelberg) konnten wir zeigen, daß eine verstärkte Vaskularisierung von epithelialen Hauttumoren erst in Spätstadien auftritt [19]. Erst bei einem größeren Tumordurchmesser erfolgt die verstärkte Induktion von Angiogenese in diesen Tumoren, nicht jedoch in Frühstadien (aktinische Keratose), wie dies bei anderen Organtumoren berichtet wurde. Interessanterweise korreliert die verstärkte Vaskularisierung von Plattenepithelcarcinomen der Haut mit der ansteigenden Metastasierungshäufigkeit. Ein weiterer bedeutender funktioneller Aspekt der TumorStroma-Interaktion ist die Produktion und Regulation von Matrix-degradierenden Proteinasen, denen eine besondere Rolle bei der Tumorinvasion zukommt. So konnte die Expression verschiedener Proteasen, insbesondere Matrix Metalloproteinasen (MMPs) in unterschiedlichen Transformationsstadien von HaCaT Zellen nachgewiesen und ihre Induktion über verschiedene Signalwege belegt werden [20-23]. Eine funktionelle Korrelation zu dem Transformations-Stadium der Zellen, d.h. zu ihrem invasiven Verhalten, war jedoch nicht zu belegen. Andererseits konnten wir zeigen, daß die Expression von MMPs in benignen und malignen Tumorzellen durch Stromazellen in vitro und in vivo reguliert wird [24]. Außerdem scheinen nur maligne Tumorzellen in der Lage, bestimmte MMPs im benachbarten Stroma zu induzieren, nicht jedoch benigne, wie derzeit laufende Studien zeigen. Weitere Befunde aus einer Kooperation weisen darauf hin, daß nicht die Proteaseproduktion an sich Invasions-fördernd ist, sondern ihre balancierte Expression und Aktivierung. In Fortführung dieser Zusammenarbeit konnte nachgewiesen werden, daß das Fehlen eines natürlichen Inhibitors des Plasmin-Protease-Systems (PAI-1) sowohl Tumorvaskularisierung wie Invasion völlig hemmt [25]. Die in drei verschiedenen Systemen mit unterschiedlichen Komponenten nachgewiesene Rolle der einsprossenden Gefäße für die Tumorinvasion spricht für einen komplexen multifaktoriellen Mechanismus der Wechselwirkung, wobei Wachstumsfaktoren, Proteasen und ECM-Komponenten synergistisch wirken, um Tumorinvasion zu ermöglichen [18, 25, 26].

Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro Alle diese Befunde lassen erkennen, daß nicht nur in normalen, sondern auch in Tumorgeweben wechselseitige Interaktionen zwischen Epithelzellen und Zellen des Bindegewebes stattfinden, die Proliferation, Differenzierung und möglicherweise Migration von normalen und Tumorzellen, aber auch die Synthese und Aktivierung von Proteasen steuern. Die detaillierte Analyse dieser Wechselwirkungen und ihrer Rolle bei der Regulation der Invasion ist Aufgabe laufender Untersuchungen, die sowohl an in vivo (Oberflächentransplantaten) wie an in vitro Modellen (organotypischen Hautkulturen) erfolgen. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Maas-Szabowski, N., *Shimotoyodome, A, Fusenig, N.E.: Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. Journal of Cell Science 12:18431853 (1999) [2] Fusenig, N.E.: Culture of specific cell types: keratinocytes. In: Culture of animal cells (R.A. Freshney, ed.) Wiley, New York, Chichester, pp. 346-349 (2000) [3] Stark, H.-J., *Baur, M., Breitkreutz, D., *Mirancea, N., Fusenig, N.E.: Organotypic keratinocyte cocultures in defined medium with regular epidermal morphogenesis and differentiation. Journal of Investigative Dermatology 112:681-691 (1999) [4] *Tomakidi, P., *Schuster, G., Breitkreutz, D., *Kohl, A., *Ottl, P., *Komposch, G.: Organotypic cultures of gingival cells: an epithelial model to assess putative local effects of orthodontic plate and occlusal splint materials under more tissue-like conditions. Biomaterials 21:1549-1559 (2000) [5] Stark, H.-J., Maas-Szabowski, N., *Smola, H., Breitkreutz, D., *Mirancea, N., Fusenig, N.E.: Organotypic keratinocyte-fibroblast cocultures: in vitro skin equivalents to study the molecular mechanisms of cutaneous regeneration. In: Cultured human keratinocytes and tissue engineered skin substitutes (R.E. Horch, A.M. Munster, B.M. Achauer, eds.), Thieme Verlag, Stuttgart, New York, pp. 163-172 (2001) [6] Maas-Szabowski, N., Stark, H.-J., Fusenig, N.E.: Cell interaction and epithelial differentiation. In: Culture of epithelial cells. Second Edition. (R.I. Freshney, M.G., Freshney, eds.) Wiley, New York, in press (2002) [7] Maas-Szabowski, N., Stark, H.-J., Fusenig, N.E.: Keratinocyte growth regulation in defined organotypic cultures through IL-1induced keratinocyte growth factor expression in resting fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology 114:1075-1084 (2000) [8] Szabowski, A., Maas-Szabowski, N., Andrecht, S., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Fusenig, N.E., Angel, P.: c-Jun and JunB antagonistically control cytokine-regulated mesenchymalepidermal interaction in skin. Cell 103:745-755 (2000) [9] Maas-Szabowski, N., Szabowski, A., Stark, H.-J., Andrecht, S., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Angel, P., Fusenig, N.E.: Organotypic cocultures with genetically modified mouse fibroblasts as a tool to dissect molecular mechanisms regulating keratinocyte growth and differentiation. Journal of Investigative Dermatology 116:816-820 (2001) [10] Breitkreutz, D., Schoop, V.M., *Mirancea, N., *Baur, M., Stark, H.-J., Fusenig, N.E.: Epidermal differentiation and basement membrane formation by HaCaT cells in surface transplants. European Journal of Cell Biology 75:273-286 (1998) [11] Schoop, V., *Mirancea, N., Fusenig, N.E.: Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology 112:343-353 (1999) [12] Smola, H., Stark, H.-J., Thiekötter, G., Mirancea, N., Krieg, T., Fusenig, N.E.: Dynamics of basememt membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Experimental Cell Research 239:399-410 (1998)

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro

[13] Tomakidi, P., *Mirancea, N., Fusenig, N.E., *Herold-Mende, C., *Bosch, F.X., Breitkreutz, D.: Defects of basement membrane and hemidesmosome structure correlate with malignant phenotype and stromal interactions in HaCaT-ras transplants. Differentiation 64:263-275 (1999) [14] Müller, M., Fusenig, N.E.: Constitutive expression of G-CSF und GM-CSF in human skin carcinoma cells with functional consequence for tumor progression. International Journal of Cancer 83:780-789 (1999) [15] Müller, M.M., Peter, W., Mappes, M., Hülsen, A., Steinbauer, H., Boukamp, P., *Vaccariello, M., *Garlick, J., Fusenig, N.: Tumor progression of skin carcinoma cells in vivo promoted by clonal selection, mutagenesis, and autocrine growth regulation by granulocyte colony-stimulating factor and granulocytemacrophage colony-stimulating factor. American Journal of Pathology 159:1567-1579 (2001) [16] Müller, M.M., *Herold-Mende, C.C., *Riede, D., *Lange, M., *Steiner, H.-H., Fusenig, N.E.: Autocrine growth regulation by granulocyte colony-stimulating and granulocyte macrophage colony-stimulating factor in human gliomas with tumor progression. American Journal of Pathology 155:1557-1567 (1999) [17] *Braun, B., *Lange, M., *Oeckler, R., Müller, M.M.: Expression of G-CSF and GM-CSF in human meningiomas correlates with increased tumor proliferation and vascularization and thus with tumor progression. Submitted (2002) [18] Fusenig, N.E., Skobe, M., Vosseler, S., Hansen, M., Lederle, W., Airola, K., *Tomakidi, P., Stark, H.-J., Boukamp, P., Breitkreutz, D.: Tissue models to study tumor-stroma interactions. In: Proteases and their inhibitors in cancer metastasis. (R.J. Muschel, J.-M. Foidart, eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, in press (2002) [19] Strieth, S., Hartschuh, W., Pilz, L., Fusenig, N.E.: Angiogenic switch occurs late in squamous cell carcinomas of human skin. British Journal of Cancer 82:591-600 (2000) [20] *Ala-aho, R., *Johansson, N., *Grénman, R., Fusenig, N.E., *Foschi, M., *López-Otín, C., *Kähäri, V.-M.: Inhibition of collagenase-3 (MMP-13) expression in transformed human keratinocytes by interferon-γ is associated with activation of extracellular signal-regulated kinase-1,2 and STAT1. Oncogene 19:248-257 (2000) [21] *Bachmeier, B.E., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., Fusenig, N.E., *Fink, E.: Matrix metalloproteinases-2, -3, -7, -9, and -10, but not MMP-11, are differentially expressed in normal, benign tumorigenic and malignant human keratinocyte cell lines. Biological Chemistry 381:497-507 (2000) [22] *Johansson, N., *Ala-aho, R., *Uitto, V.-J., *Grénman, R., Fusenig, N.E., *López-Otín, C., *Kähäri, V.-M.: Expression of collagenase-3 (MMP-13) and collagenase-1 (MMP-1) by transformed keratinocytes is dependent on the activity of p38 mitogen-activated protein kinase. Journal of Cell Science 113:227-235 (2000) [23] *Baumann, P., *Zigrino, P., *Mauch, D., Breitkreutz, D., *Nischt, R.: Membrane-type 1 matrix metalloproteinase-mediated progelatinase activation in non-tumorigenic and tumorigenic human keratinocytes. British Journal of Cancer 83:1387-1393 (2000) [24] *Airola, K., Fusenig, N.E.: Differential stromal regulation of MMP-1 expression in benign and malignant keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology 116:85-92 (2001) [25] *Bajou, K., *Masson, V., *Gerard, R.D., *Schmitt, P.M., *Albert, V., *Praus, M., *Lund, L.R., *Frandsen, T.L., *Brunner, N., *Dano, K., Fusenig, N.E., *Weidle, U., *Carmeliet, G., *Loskutoff, D., *Collen, D., *Carmeliet, P., *Foidart, J.M., *Noel, A.: The plasminogen activator inhibitor PAI-1 controls in vivo tumor vascularization by interaction with proteases, not vitronectin: implications for anti-angiogenic strategies. Journal of Cell Biology 152:777-784 (2001) [26] Fusenig, N., Vosseler S.: Bedeutung der Angiogenese für die Tumorinvasion. Med-Report 21:2 (2000)

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0700 Tumorbiochemie

Abteilung Tumorbiochemie (B0700) Leiter: Prof. Dr. med. Dietrich Keppler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. sc. hum. Yunhai Cui Dr. med. Markus Donner (- 01/01) Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Hagmann Dr. sc. hum. Gabriele Jedlitschky Dr. rer. nat. Jörg König Dr. sc. hum. Inka Leier (U12/00) Dr. rer. nat. Anne Nies

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Gastwissenschaftler/Stipendiaten Dr. med. H. Kojima (Japan, Humboldt-Stipendium, 08/01 -) Dr. M. Komatsu (Ph.D.) (Japan, Forschungsstipendium der Kagoshima Universität Japan, 10/01 -) Doktoranden/innen Renata Gologan (- 03/00) Verena Keitel Young-Min Lee (07/01 -) Christoph Michalski (04/01 -) Dipl. Pharmazeut. Maria Rius Montraveta (12/00 -) Dipl. Biol. Birgit Stöckel (- 03/00) Technische Assistentinnen Manuela Brom Ulrike Buchholz (halbtags) (- 09/00) Johanna Hummel-Eisenbeiß (halbtags) Marion Pfannschmidt (Gast) Jana Schubert (03/00 -) Bettina Walter (halbtags) (11/00 -) Sekretariat Friederike Kremp

Der Transport körpereigener und körperfremder Substanzen über Zellmembranen wird durch Transportproteine kontrolliert. Zahlreiche Gene kodieren für die Proteine, welche die Aufnahme von Substanzen in die Zelle und die Abgabe aus der Zelle vermitteln. ATP-abhängige Membranproteine transportieren körpereigene Substanzen, Toxine, Kanzerogene, Zytostatika und deren Konjugate über die Plasmamembran aus normalen und malignen Zellen in den extrazellulären Raum. Untersuchungen in der Abteilung Tumorbiochemie haben zur Entdeckung der molekularen Identität von ATP-abhängigen Transportern für Konjugate und Komplexe lipophiler Verbindungen mit Glutathion, Glucuronat oder Sulfat geführt. Eine Überexpression dieser Transportproteine der Plasmamembran, zu denen die Mitglieder der Multidrug Resistance-Proteine (MRPProteine) zählen, kann zur Resistenz von Tumoren gegenüber verschiedenen Zytostatika führen. Die Proteine der MRP-Familie (MRP1-9) unterscheiden sich erheblich in ihrer Sequenz und Substrat-Spezifität vom MDR1-P-Glykoprotein, welches ebenfalls eine Zytostatika-Resistenz bewirken kann. Hemmstoffe des Transports von ZytostatikaKonjugaten und -Komplexen durch MRP-Proteine können dazu dienen, diese neuen Formen der Zytostatika-Resistenz zu überwinden. Zu den physiologischen Substraten von Konjugat-Exportpumpen der MRP-Familie zählen unter anderem das Glutathionkonjugat Leukotrien C4, Glucuronide von Bilirubin, Gallensäuren und Steroidhormonen, sowie zyklische Nukleotide (cGMP und cAMP). Die fehlende Lokalisation der MRP2-kodierten Konjugat-Exportpumpe in der apikalen Membran der Hepatozyten ist die Ursache des erblichen Dubin-Johnson-Syndroms des Menschen, das durch eine konjugierte Hyperbilirubinämie charakterisiert ist. Die Klonierung von MRP2, MRP3, MRP5 und MRP6 ermöglichte die Herstellung stabil transfizierter Zellen und spezifischer Antikörper. Durch Immunfluoreszenz- und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde die dynamische intrazelluläre Verteilung von MRP2, die basolaterale Lokalisation von MRP3 und die apikale Lokalisation von MRP2 in verschiedenen Geweben bestimmt. Die MRP2-Expression und –Lokalisation wurde auch im klarzelligen Nierenzellkarzinom und im hepatozellulären Karzinom nachgewiesen. Unsere Untersuchungen zeigen, dass MRP2 zur lange bekannten Chemoresistenz dieser malignen Tumoren beitragen kann. Zusatzfinanzierung: DFG über SFB 352 und SFB 601; Forschungsschwerpunkt Transplantation; Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim; Deutsch-Israelische Zusammenarbeit (DKFZ/ NCRD); Fonds der Chemischen Industrie.

Homepage: www.dkfz.de/tumorbiochem/

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Identifikation und genomische Organisation von hepatozellulären Aufnahmetransportern für organische Anionen J. König, Y. Cui, A. Nies, D. Keppler Auf Grund der Ähnlichkeit mit der Sequenz eines bekannten Aufnahmetransporters für organische Anionen konnten wir die gesamte cDNA eines neuen Aufnahmetransporters, OATP2 (Gensymbol SLC21A6), klonieren. Die OATP2cDNA ist 2073 Basenpaare lang, was einem Translationsprodukt von 691 Aminosäuren entspricht [1]. Ausgehend von dieser DNA-Sequenz konnte eine weitere homologe Sequenz identifiziert werden, welche 85 % Nukleotidsequenz-Identität mit der OATP2-Sequenz aufwies. Das entsprechende Protein wurde als OATP8 (Gensymbol SLC21A8) bezeichnet. Die Identität zwischen OATP2 und OATP8 auf Proteinebene beträgt 80 % [7]. Weitere bekannte Familienmitglieder der SLC21A-Familie (OATP-A; OATP-B; OATP-D; und OATP-E) weisen eine AminosäureIdentität von weniger als 40 % im Vergleich zu OATP2 und OATP8 auf [7]. Mit Hilfe von Antikörpern, welche gegen verschiedene Epitope der Transporter gerichtet waren, konnten sowohl OATP2 als auch OATP8 in der basolateralen Membran humaner Hepatozyten nachgewiesen werden. Diese Lokalisation stimmte überein mit der vorhergesagten Funktion dieser Proteine als Aufnahmetransporter für anionische Substanzen aus dem Blut in die Hepatozyten [1, 7, 12, 19]. In Cholangiozyten, den Epithelzellen der Gallenwege, konnten beide Transporter nicht nachgewiesen werden. Mittels molekularbiologischer Techniken konnte die Messenger-RNA für beide Transporter nur in Hepatozyten nachgewiesen werden. Die genomische Organisation von OATP2 und OATP8 konnte zusammen mit der genomischen Organisation von OATP-A, dem dritten, gut charakterisierten Aufnahmetransporter der SLC21A-Familie mit Hilfe von Sequenz-Datenbanken etabliert werden. Trotz der geringen Aminosäure-Identität zwischen den Transportern (40 % zwischen OATP8 und OATP-A) zeigten sich bei der Analyse der genomischen Organisation erstaunliche Übereinstimmungen [7]. Alle drei Gene wurden auf Chromosom 12 lokalisiert. Ein Vergleich der genomischen Organisationen zeigte, dass alle drei Transportergene aus 14 Exons bestehen und die mittlere Exonlänge 150 Basenpaare beträgt. Zwischen allen drei Genen stimmen 9 Exons in der Länge überein, zwischen OATP2 und OATP8 sind sogar 13 der 14 Exons in der Länge identisch. Werden die Exon-Intron-Grenzen auf die entsprechende Aminosäure-Sequenz übertragen, so zeigt sich, dass sich alle Grenzen an identischen Stellen in dieser Anordnung der drei Sequenzen befinden. Dies deutet auf ein hohes Maß an evolutionärer Verwandtschaft hin.

Abteilung B0700 Tumorbiochemie

Funktionelle Charakterisierung der Aufnahme-Transporter OATP2 und OATP8 Y. Cui, J. König, D. Keppler Die funktionelle Charakterisierung der Aufnahme-Transporter OATP2 (SLC21A6) und OATP8 (SLC21A8) wurde mit Hilfe von stabil transfizierten Zellen durchgeführt [1, 7, 12]. Beide Transportproteine weisen ein breites Spektrum an Substraten auf. Das humane OATP2 transportiert sowohl endogene Metaboliten, wie z. B. Bilirubin, Mono- und Bis-glucuronosyl-bilirubin, 17β-Glucuronosyl-estradiol, Dehydroepiandrosteronsulfat, Triiodthyronin, Cholyltaurin, Leukotrien C4 und Prostaglandin E2 als auch Arzneimittel wie Pravastatin, einem Inhibitor der Cholesterol-Biosynthese, und Enalapril, einem ACE-Hemmer. Sulfobromophthalein, eine zur Testung der Transport-Funktion der Leber verwendete Substanz, ist ein hoch-affines Substrat für OATP2 mit einer Michaelis-Menten-Konstanten (Km) von 140 nM. Die Substrat-Spezifität des humanen OATP8 ist ähnlich wie die des OATP2, was der nahe verwandten Aminosäuren-Sequenz beider Proteine entspricht. Wir haben jedoch deutliche Unterschiede der Transportkinetik und in der Substrat-Spezifität festgestellt [12]. Von physiologischer Bedeutung ist der Unterschied beim BilirubinTransport: Im Gegensatz zu OATP2, kann OATP8 unkonjugiertes Bilirubin nicht transportieren [12].

Regulation der apikal lokalisierten Exportpumpe MRP2 (ABCC2) und der basolateral lokalisierten Exportpumpe MRP3 (ABCC3) B. Stöckel, J. König, A. Nies, Y. Cui, M. Brom, D. Keppler Einige Mitglieder der MRP-Familie werden zwar in Hepatozyten synthetisiert, sind aber in verschiedenen Membrandomänen lokalisiert: MRP2 (ABCC2) befindet sich in der apikalen Domäne und transportiert Substanzen in die Galle, wogegen MRP3 (ABCC3) in der basolateralen Membran lokalisiert ist und Substanzen aus dem Hepatozyten zurück ins Blut pumpt. Da das Substratspektrum beider Transporter überlappend ist, kommt einer Regulation der Transporterexpression für eine geordnete Funktion große Bedeutung zu. Untersuchungen an den homologen Transportern der Ratte zeigten, dass unter normalen Bedingungen MRP2-mRNA hoch exprimiert ist, MRP3-mRNA aber nur schwach nachweisbar ist. Unter Bedingungen einer gestörten Transportfunktion von MRP2, mit verminderter Expression der MRP2-mRNA, wird die MRP3-Expression induziert. Zur genaueren Untersuchung dieser Regulation klonierten wir die 5´-reglatorischen Bereiche des MRP2-Gens und des MRP3-Gens in ein Reportergenplasmid und untersuchten die Promotoraktivitäten beider Transportergene unter Normalbedingungen und nach Zugabe verschiedener Substanzen [4]. Unter Normalbedingungen ist die basale MRP2-Promotoraktivität hoch, jedoch beträgt die basale Aktivität des MRP3-Promotors unter den gleichen Bedingungen nur 4 % der MRP2-Promotoraktivität. Nach der Behandlung der transfizierten Zellen mit Nocodazol, einem Inhibitor der

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Bildung der Mikrotubuli, vermindert sich die Aktivität des MRP2-Promotors um 50 %, die Aktivität des MRP3-Promotors hingegen verstärkt sich um mehr als 1000 %. Unsere Ergebnisse zeigen eine geregelte, jedoch inverse Regulation der Aktivität beider Promotoren.

Funktionelle Rekonstitution von gereinigtem MRP2

Vektorieller Transport durch doppel-transfizierte polarisierte Zellen

Die Reinigung von MRP2 ist eine unabdingbare Voraussetzung zur genauen Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften dieses Transporterproteins. Nach erfolgreicher Klonierung und Reinigung von MRP2 mit Hilfe einer carboxy-terminal eingefügten His6-Sequenz konnten wir zeigen, dass dieses gereinigte Protein nach Rekonstitution in Proteoliposomen funktionell insoweit intakt war, als es Substrat-stimulierbare ATPase-Aktivität aufwies (Hagmann et al., Eur. J. Biochem. 265: 281-289, 1999). Die intakte Rekonstitution von transport-aktivem MRP2 erforderte eine Optimierung der Solubilisations- und Rekonstitutionsbedingungen. Damit konnten wir zeigen, dass MRP2 als Protein allein in der Lage ist, in der geeigneten Lipidvesikelumgebung als Transporter zu funktionieren. Die Transportrate für LTC4 in rekonstituierten MRP2-Proteoliposomen betrug 2.7 pmol x min-1 x mg MRP2-1 [26], die KmWerte für ATP und LTC4 beliefen sich dabei auf 560 µM bzw. 450 nM. Dieser Transport durch gereinigtes MRP2 war durch den Inhibitor MK571 hemmbar (IC50 = 12 µM). Bindungs- und Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass MRP2 mit dem Chaperon Calnexin assoziieren kann. Allerdings konnten wir in Rekonstitutionsversuchen mit gereinigtem Calnexin und MRP2 keinen Einfluss dieses Chaperons auf die Transportfunktion von MRP2 feststellen [26]. Das gereinigte MRP2 wird in weiteren Studien eingesetzt, um mögliche Partner zu finden, die in Wechselwirkung mit MRP2 dessen zelluläre Lokalisation und Funktion als Transporter beeinflussen.

Y. Cui, J. König, D. Keppler

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Abteilung B0700 Tumorbiochemie

Rekombinante Transportproteine wurden bisher einzeln untersucht. Der vektorielle Transport durch Epithelzellen erfordert aber sowohl Protein-vermittelte Aufnahme-Prozesse als auch Export-Prozesse. Um diesen vektoriellen Transport besser verstehen zu können, haben wir eine doppel-transfizierte Zell-Linie hergestellt [19]. In polar wachsende MDCK-Zellen wurden die cDNAs von MRP2 und OATP8 stabil transfiziert. Immunfluoreszenz-Untersuchungen zeigten, dass OATP8 in der basolateralen Membran, MRP2 dagegen in der apikalen Membran der transfizierten MDCK-Zellen lokalisiert ist. Der Vergleich von doppel-transfizierten Zellen mit einzel-transfizierten Zellen zeigte, dass ein transzellulärer Transport von Sulfobromophthalein, einem Substrat für OATP8 und MRP2, nur dann mit ausreichender Geschwindigkeit stattfand, wenn der Aufnahme-Transporter OATP8 und die Exportpumpe MRP2 gleichzeitig in den Zellen exprimiert wurden. Auch andere Substrate beider Transportproteine wurden nur durch die doppel-transfizierten MDCK-Zellen vektoriell transportiert. Die doppel-transfizierten MDCK-Zellen stellen ein zelluläres Modellsystem dar, um Arzneimittel und Arzneimittelkandidaten auf deren Wechselwirkung mit dem vektoriellen Transport von organischen Anionen zu untersuchen. Ferner kann dieses Modellsystem die Suche nach Inhibitoren für MRP2, einem Zytostatika-Resistenz-vermittelnden Transporter, erleichtern.

W. Hagmann, J. Schubert, J. König, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: M. Schnölzer und T. Kempf, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Expression und Lokalisation von MRP-Isoformen im Hepatozellulären Karzinom des Menschen A. Nies, J. König, M. Pfannschmidt, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: W. J. Hofmann, Universität Heidelberg und E. Klar, Universität Heidelberg

Die ausgeprägte Resistenz des hepatozellulären Karzinoms (HCC) des Menschen gegenüber verschiedensten Zytostatika ist ein wichtiger Grund für das häufige Versagen einer Chemotherapie dieses bösartigen und weltweit sehr häufigen Tumors. Wir konnten durch semi-quantitative RT-PCR zeigen, dass MRP2 und MRP3 mRNA im HCC stark exprimiert werden [18]. Beide MRP-Isoformen können Resistenz gegenüber Zytostatika vermitteln, indem sie diese über die Plasmamembran aus den Zellen heraustransportieren, so dass keine wirksamen Zytostatikakonzentrationen erreicht werden [11, 21]. Durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen mit Isoform-spezifischen Antikörpern lokalisierten wir MRP2 in der apikalen Membran von Tumorzellen; hierbei wurden häufig trabekuläre oder pseudoglanduläre Strukturen beobachtet. MRP3 war hingegen in der basolateralen Plasmamembran lokalisiert [18]. In einigen HCC-Proben wurde auch MRP1 mRNA detektiert, allerdings wurde MRP1-Protein ausschließlich in intrazellulären Membranstrukturen nachgewiesen. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die Lokalisation von MRP2 in der apikalen und MRP3 in der basolateralen Membran von Tumorzellen zur Zytostatika-Resistenz des HCC beitragen kann. Expression und Lokalisation von MRP2 und MRP3 wurde auch in HepG2-Zellen nachgewiesen [2].

Zellbiologische Charakterisierung eines MRP2-Proteins mit einer Mutation, die zum Dubin-Johnson Syndrom führt V. Keitel, A. Nies, M. Brom, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: J. Kartenbeck, Zellbiologie, DKFZ (Immun-Elektronenmikroskopie von MRP2); H. Spring, Strukturanalyse, DKFZ (Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie)

Mutationen im MRP2-Gen, die zum Verlust des MRP2Proteins in der apikalen Membran führen, sind die molekulare Basis für das Dubin-Johnson Syndrom, welches mit einer konjugierten Hyperbilirubinämie einhergeht [21], da MRP2 die ATP-abhängige Exportpumpe für Bilirubin-Konjugate in der apikalen Membran von Hepatozyten ist [10, 11, 21, 24]. Eine 6-Nukleotide umfassende Deletion im MRP2-Gen führt zum Verlust von Arg1392 und Met1393 (MRP2DR,M) in der carboxy-proximalen ATP-Bindungsdomäne und zum Fehlen des MRP2-Proteins in der apikalen Membran von Hepatozyten des Menschen (Tsujii et al., Gastroenterology 117: 653-660, 1999). Wir haben diese 6Nukleotide umfassende Deletion in die MRP2-cDNA eingebracht und nach Expression der mRNA die Lokalisation des mutierten MRP2-Proteins in polarisierten HepG2-Zellen untersucht [9]. HepG2-Zellen, die von einem Hepatoblastom des Menschen abgeleitet sind, eignen sich gut für die Untersuchung der domänenspezifischen Sortierung

Abteilung B0700 Tumorbiochemie von MRP-Isoformen [2]. Die mRNA wurde in HepG2-Zellen exprimiert und führte zur Synthese eines mutierten MRP2DR,M-Proteins, welches nur unvollständig glykosyliert war. Das mutierte Protein akkumulierte im endoplasmatischen Retikulum und wurde nicht zur apikalen Membran transportiert [9]. Der Abbau des unreifen MRP2-Proteins erfolgte in Proteasomen. Unsere Untersuchungen klärten erstmalig den Pathomechanismus einer MRP2-Mutation auf, die zum Verlust von MRP2 in der apikalen Membran von Hepatozyten des Menschen und zum Dubin-Johnson Syndrom führt.

Charakterisierung von MRP5 (ABCC5) als ATP-abhängige Exportpumpe für zyklische Nukleotide G. Jedlitschky, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: B. Burchell, University of Dundee, Schottland, UK

Der zelluläre Export von zyklischen Nukleotiden (3'-5'cGMP und 3'-5'-cAMP) wurde in einer Vielzahl von Geweben und Zellen beobachtet und kann zur Regulation der intrazellulären Konzentration der zyklischen Nukleotide beitragen. Unsere Untersuchungen haben erstmals die physiologische Funktion von rekombinantem MRP5, das in V79-Zellen exprimiert wurde, identifiziert [8]. Dementsprechend ist MRP5 eine ATP-abhängige Exportpumpe für 3'5'-zyklisches GMP mit einem Km-Wert von 2,1 µM [8]. Der ATP-abhängige Export von 3'-5'-zyklischem AMP erfolgt mit niedrigerer Affinität (Km = 379 µM). Verschiedene Substanzen, die als Hemmstoffe der Zyklonukleotid-Phosphodiesterase bekannt waren, wurden als wirksame Hemmstoffe des MRP5-vermittelten Transports von cGMP identifiziert, wobei die Hemmkonstante Ki für Sildenafil 267 nM und für Trequinsin 250 nM betrug [8]. MRP5 könnte demnach ein neues pharmakologisches Zielmolekül sein, um durch dessen Hemmung die intrazellulären Konzentrationen an zyklischem GMP zu steigern [8]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] König, J.; Cui Y.; Nies, A.T.; Keppler, D.: A novel human organic anion transporting polypeptide localized to the basolateral hepatocyte membrane. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology 278 (2000) G156-G164. [2] Cantz, T.; Nies, A.T.; Brom, M.; *Hofmann, A.F.; Keppler, D.: MRP2, a human conjugate export pump, is present and transports Fluo 3 into apical vacuoles of Hep G2 cells. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology 278 (2000) G522-G531. [3] Leier, I.; Hummel-Eisenbeiss, J.; Cui, Y.; Keppler, D.: ATP-dependent para-aminohippurate transport by apical multidrug resistance protein MRP2. Kidney International 57 (2000) 1636-1642. [4] Stöckel, B.; König, J.; Nies, A.T.; Cui, Y.; Brom, M.; Keppler, D.: Characterization of the 5'-flanking region of the human multidrug resistance protein 2 (MRP2) gene and its regulation in comparison with the multidrug resistance protein 3 (MRP3) gene. European Journal of Biochemistry 267 (2000) 1347-1358. [5] Uemura, M.; Lehmann, W.-D.; *Schneider, W.; *Seitz, H.K.; Benner, A.; *Keppler-Hafkemeyer, A.; *Hafkemeyer, P.; *Kojima, H.; *Fujimoto, M.; *Tsujii, T.; *Fukui, H.; Keppler, D.: Enhanced urinary excretion of cysteinyl leukotrienes in patients with acute alcohol intoxication. Gastroenterology 118 (2000) 1140-1148.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation [6] *Timár, J.; *Rásó, E.; *Döme, B.; *Li, L.; *Grignon, D.; *Nie, D.; *Honn, K.V.; Hagmann, W.: Expression, subcellular localization and putative function of platelet-type 12-lipoxygenase in human prostate cancer cell lines of different metastatic potential. International Journal of Cancer 87 (2000) 37-43.

[22] König, J.; Cui, Y.; Nies, A.T.; Keppler, D.: New organic aniontransporting polypeptides in the human hepatocyte basolateral membrane. In: Biology of Bile Acids in Health and Disease. Eds.: G.P. van Berge Henegouwen et al. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2001) 88-94.

[7] König, J.; Cui, Y.; Nies, A.T.; Keppler, D.: Localization and genomic organization of a new hepatocellular organic anion transporting polypeptide. Journal of Biological Chemistry 275 (2000) 23161-23168.

[23] *Beuers, U.; *Bilzer, M.; *Chittattu, A.; *Kullak-Ublick, G.A.; Keppler, D.; *Paumgartner, G.; *Dombrowski, F.: Effects of tauroursodeoxycholic acid on protein kinase C isoforms and on canalicular Mrp2 in experimental cholestasis. In: Biology of Bile Acids in Health and Disease. Eds.: G. P. van Berge Henegouwen et al. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2001) 245-248.

[8] Jedlitschky, G.; *Burchell, B.; Keppler, D.: The multidrug resistance protein 5 functions as an ATP-dependent export pump for cyclic nucleotides. Journal of Biological Chemistry 275 (2000) 30069-30074.

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Abteilung B0700 Tumorbiochemie

[9] Keitel, V.; Kartenbeck, J.; Nies, A.T.; Spring, H.; Brom, M.; Keppler, D.: Impaired protein maturation of the conjugate export pump multidrug resistance protein 2 as a consequence of a deletion mutation in Dubin-Johnson syndrome. Hepatology 32 (2000) 1317-1328. [10] Keppler, D.; Kamisako, T.; Leier, I.; Cui, Y.; Nies, A.T.; Tsujii, H.; König, J.: Localization, substrate specificity, and drug resistance conferred by conjugate export pumps of the MRP family. Advances in Enzyme Regulation 40 (2000) 339-349. [11] Keppler, D.; König, J.: Hepatic secretion of conjugated drugs and endogenous substances. Seminars in Liver Disease 20 (2000) 265-272. [12] Cui, Y.; König, J.; Leier, I.; Buchholz, U.; Keppler, D.: Hepatic uptake of bilirubin and its conjugates by the human organic anion transporter SLC21A6. Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 9626-9630. [13] *Hirrlinger, J.; König, J.; Keppler, D.; *Lindenau, J.; *Schulz, J.B.; *Dringen, R.: The multidrug resistance protein MRP1 mediates release of glutathione disulfide from rat astrocytes during oxidative stress. Journal of Neurochemistry 76 (2001) 627636. [14] Kamisako, T; Leier, I.: Characterization of ATP-dependent monoglucuronosyl bilirubin transport across rat canalicular membrane vesicles. Hepatology Research 19 (2001) 103-107. [15] *Cuff, R.L.; *Wade, L.T.; *Rychlik, B.; Jedlitschky, G.A.; *Burchell, B.: Characterization of glucuronidation and transport in V79 cells co-expressing UGT1A1 and MRP1. Toxicology Letters 120 (2001) 43-49. [16] *Beuers, U.; * Bilzer, M.; *Chittattu, A.; *Kullak-Ublick, G.A.; Keppler, D.; *Paumgartner, G.; *Dombrowski, F.: Tauroursodeoxycholic acid inserts the apical conjugate export pump, Mrp2, into canalicular membranes and stimulates organic anion secretion by protein kinase C-dependent mechanisms in cholestatic rat liver. Hepatology 33 (2001) 1206-1216.

[24] Keppler, D.; Cui, Y.; Keitel, V.; Nies, A.T.; König, J.: Canalicular conjugate export and the hepatobiliary elimination of bilirubin. In: Hepatobiliary Transport: From Bench to Bedside. Eds.: S. Matern, J. Boyer, D. Keppler, P.J. Meier-Abt. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2001) 49-53. [25] *Burchell, B.; *Ethell, B.; *Coffey, M.J.; *Findlay, K.; Jedlitschky, G.; *Soars, M.; *Smith, M.; *Hume, R.: Interindividual variation of UDP-glucuronosyltransferases and drug glucuronidation. In: Interindividual Variability in Human Drug Metabolism. Eds.: G.M. Pacifici, O. Pelkonen. London: Taylor & Francis (2001) 358-394. [26] Hagmann, W; Schubert, J; König, J; Keppler, D.: Reconstitution of transport-active multidrug resistance protein 2 (MRP2;ABCC2) in proteoliposomes. Biological Chemistry, Juni 2002.

Schlagworte (alphabetisch) Aufnahmetransporter cGMP Dubin-Johnson-Syndrom Membrantransport MRP1 MRP2 MRP3 MRP5 Multidrug Resistance-Proteine OATP2 OATP8 Promotor-Regulation Transportproteine vektorieller Transport zyklische Nukleotide Zytostatika-Resistenz

[17] Donner, M.G; Keppler, D.: Up-regulation of basolateral multidrug resistance protein 3 (Mrp3) in cholestatic rat liver. Hepatology 34 (2001) 351-359. [18] Nies, A.T.; König, J.; Pfannschmidt, M.; Klar, E.; *Hofmann, W.J.; Keppler, D.: Expression of the multidrug resistance proteins MRP2 and MRP3 in human hepatocellular carcinoma. International Journal of Cancer 94 (2001) 492-499. [19] Cui, Y.; König, J.; Keppler, D.: Vectorial transport by doubletransfected cells expressing the human uptake transporter SLC21A8 and the apical export pump ABCC2. Molecular Pharmacology 60 (2001) 934-943. [20] Rost, D.; König, J.; *Weiss, G.; *Klar, E.; *Stremmel, W.; Keppler, D.: Expression and localization of the multidrug resistance proteins MRP2 and MRP3 in human gallbladder epithelia. Gastroenterology 121 (2001) 1203-1208. [21] Keppler, D.; König, J.; Nies, A.T.: Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRP) family in liver. In: The Liver: Biology and Pathobiology. Eds: I. M. Arias et al. New York: Lippincott Williams & Wilkins (2001) 373-382.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle

Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) Leiter: Peter Angel, Ph.D. Wissenschaftliche Mitarbeiter: Dr. Marina Schorpp-Kistner Dr. Hartmut Richter Dr. Bettina Hartenstein (07/99 -) * Dr. Jochen Hess (01/00 -) Dr. Niamh Keon (- 07/00) * Dr. Ute Breitenbach (- 03/01) Dr. Sabine Gack (03/01 -) Doktoranden Christine Munz *(- 08/00) Sven Andrecht * (- 11/01) Axel Szabowski Dirk Schmidt * (- 01) Hanna Bierbaum* Nicola Viebig (04-10/00) Bernd Dittrich (11/00 -)* Regina Müller (11/01 -) Lore Florin (12/01 -) Medizin Studenten Christoffer Gebhardt (- 06/00) Christian Krause (08-12/00) Diplomanden: Jens Eberlein (- 04/00) Technische Angestellte Sibylle Teurich Susanne Adams (- 09/00) Melanie Sator-Schmitt Auszubildende Tanja Raubinger (09/00 -) Daniel Sandmaier (- 08/00) Sven Rüffer (10/00 -) Nicole Echner (10/01 -) Steffen Baumert (10/01 -) Zentral Sabrina Zahner, Sekretärin (halbtags) *) Drittmittel

Die Funktion und Regulation von Transkriptionsfaktoren und deren Zielgene in der Regulation von physiologischen und pathologischen Prozessen In der Abteilung „Signaltransduktion und Wachstumskontrolle“ werden die Reaktionen von Organismen und ihren Zellen auf Umwelteinflüsse (Strahlung, chemische Karzinogene) untersucht und mit den Reaktionen auf körpereigene Substanzen verglichen. Ziel dieser Arbeiten ist es, verstehen zu lernen, über welche Mechanismen die Zellen auf diese äußeren Signale mit Veränderungen in der Expression spezifischer Gene reagieren, und welche Funktion die dabei involvierten Genprodukte spielen. Dies beinhaltet auch das Verständnis der molekularen Ereignisse auf der Ebene der Genregulation, die eine „normale“ Zelle in eine Krebszelle umwandelt. Die Arbeiten der Abteilung konzentrieren sich in erster Linie auf die Funktion und Regulation des Transkriptionsfaktors AP-1 und der Identifizierung AP-1-regulierter Zielgene. AP-1 ist der Sammelbegriff für verschiedene homound heterodimere Proteinkomplexe, deren Untereinheiten sich aus den Mitgliedern der Fos, Jun und CREB/ATF Proteinfamilien zusammensetzten. Da sich zum einen die Sequenzspezifität der verschiedenen Dimere leicht unterscheidet, und zum anderen die Transkription der fos und jun Gene als auch die Transaktivierungsfunktion der davon abgeleiteten Proteine Unterschiede aufweist, geht man heute davon aus, daß die verschiedenen Dimer-Kombinationen spezifische Funktionen bei komplexen biologischen Prozessen wie Zellproliferation, Transformation, Differenzierung, Angiogenese, Immunantwort, Apoptose und Protektion gegenüber DNA-schädigenden Substanzen spielen [1,2]. Schwerpunkte der Arbeiten der Abteilung sind das Verständnis der: a) Mechanismen der Aktivitätskontrolle von AP-1 in Abhängigkeit von extrazellulären Signalen b) Aufklärung der Funktion der verschiedenen Jun und Fos Proteine bei physiologischen und pathologischen Prozessen c) Isolierung, Regulation und Funktionsanalyse von AP-1abhängigen Zielgene d) Klonierung und Charakterisierung neuer Tumor-assoziierter Gene Für die beschriebenen Fragestellungen kommen sowohl in vivo Mausmodelle als auch in vitro Zellkultursysteme zum Einsatz, um die spezifischen Funktionen dieser zellulären Regulatoren der Genexpression und deren Zielgene im Gesamtorganismus bei komplexen Prozesse zu definieren und um informative Modelle für menschliche Krankheiten zu entwickeln.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Zell-autonome Funktionen von c-Jun bei der Regulation von Zellproliferation und Antwort auf genotoxische Substanzen A. Kolbus, A. Szabowski, P. Angel In Kollaboration mit Ingrid Herr, Klaus-Michael Debatin, Sven Baumann, Sören Eichhorst, Sabine Kirchhoff, Peter Krammer, DKFZ Heidelberg; Martin Schreiber und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich; Stefan Scherer, Manfred Schartl, Universität Würzburg; Michael Karin, UC San Diego, La Jolla, USA

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Die Synthese der Fos und Jun Proteine wird nach Behandlung von Zellen mit DNA-schädigenden Substanzen (Strahlung, chemische Karzinogene, z.B. alkylierende Agenzien) stark erhöht [1,2]. Dies läßt darauf schließen, daß diese Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der zellulären Antwort auf solche Streßfaktoren spielen könnten. Durch Untersuchungen mit Fibroblasten, die aus c-Jun oder c-Fos Knockout-Mäusen etabliert wurden, konnte diese Annahme experimentell bestätigt werden. Während c-Fos-defiziente Zellen eine Hypersensitivität gegenüber UV Strahlung und chemischen Mutagenen (z.B. Alkylantien) aufweisen, verlieren c-Jun-defiziente Zellen die Fähigkeit, nach Behandlung mit UV Strahlung oder chemischen Mutagenen in Apoptose zu gehen [3]. Obwohl c-Jun, in Kooperation mit p53, für die UV-induzierte Expression des DNA Reparaturgens MSH2 benötigt wird [4], können die Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutantenzelle nicht durch Unterschiede in der Fähigkeit der Zellen, die entstandenen DNA Schäden zu reparieren, erklärt werden [3]. Vielmehr beruht dies auf dem Verlust der Induktion von Fos/Jun-abhängigen Genen, was am Beispiel der fehlenden transkriptionellen Aktivierung zweier bekannter AP-1 Zielgene, Kollagenase und Stromelysin, exemplarisch sichtbar wurde [3]. Neben diesen bekannten Zielgenen konnten wir das CD95-L Gene als neues c-Jun/AP1 Zielgen definieren. CD95-L bindet an das Zelloberflächenantigen CD95 und es kommt nachfolgend zur Aktivierung einer Serie von Caspasen, an deren Ende die DNA Fragmentierung und Zelltod steht. Die Induktion der CD95-L Expression und die nachfolgende autokrine oder parakrine Aktivierung des CD95 Signalwegs scheint in den untersuchten Zellen für die Induktion der Apoptose durch UV und chemische Mutagene essentiell zu sein, da neutralisierende CD95-L Antikörper mit diesem Prozess interferieren, und in c-Jun-defizienten Zellen durch die Zugabe von rekombinantem CD95-L sehr effizient Apoptose ausgelöst werden kann. Dies bedeutet, daß c-Jun eine essentielle Rolle bei der Synthese von Apoptose-auslösenden Proteinen (z.B. CD95-L) spielt. Die Komponenten des CD95-spezifischen Signalwegs, der zur Auslösung von Apoptose führt, werden jedoch unabhängig von c-Jun exprimiert [3]. Neben der “Stress”-induzierten Apoptose in Fibroblasten spielt AP-1-abhängige Induktion von CD95-L auch bei der (durch Chemotherapeutika) induzierten Apoptose in Hepatokarzinomzellen [5] und in aktivierten TZellen [6] eine wichtige Rolle. Mit Hilfe der c-Jun-defizienten Fibroblasten konnten wir auch die Funktion von c-Jun bei der Regulation der Zellproliferation aufklären. Es zeigt sich, daß der Verlust von

Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle c-Jun zu einer erhöhten Rate von p53 und p21 führt, wodurch die Aktivität von Cyclin-assoziierten Protein Kinasen gehemmt wird und die Zellen nur sehr ineffizient durch die G1/S Phase des Zellzyklus gehen. Alle diese Effekte werden durch zusätzliche Deletion des p53 Gens revertiert. Dies bedeutet, daß die Hauptfunktion von c-Jun bei der Regulation der Proliferation in der Repression der p53 Expression liegt [7]. Die Repression der p53 Expression wird dabei über eine AP-1-ähnliche Erkennungssequenz im p53 Promotor vermittelt, an die c-Jun mit einem bisher noch nicht genau definierten Partner bindet und als Inhibitor agiert [7,8].

Funktion von JunB in vivo und in vitro S. Andrecht, D. Schmidt, B. Hartenstein, N. Keon, S. Gack, H. Bierbaum, M. Sator-Schmitt, T. Raubinger, S. Adams, P. Angel, M. Schorpp-Kistner In Kollaboration mit Zhao-Qi Wang, Emanuelle Passegue und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich

Die Ergebnisse unserer bisherigen Arbeiten ergaben deutliche Hinweise darauf, daß die verschiedenen Mitglieder der Jun Proteinfamilie (c-Jun, JunB, JunD) spezifische, zum Teil nicht-überlappende Funktionen in AP-1-abhängigen Prozessen spielen. Diese Annahme wurde durch den spezifischen Phänotyp der JunB knockout Mäuse unterstrichen, der sich deutlich von denjenigen unterscheidet, die durch den Verlust anderer AP-1 Untereinheiten (z.B. c-Jun, JunD, Fos Proteine) hervorgerufen werden [2]. Tiere mit einem heterozygoten JunB Genotyp (junB+/-), bei denen in allen Zellen noch eine intakte Kopie des junB Gens vorhanden ist, zeigten beim Vergleich mit Wildtyp Mäusen keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede. Die genotypische Analyse der Nachkommen aus der Rückkreuzung von junB+/- Tieren ergab, daß keine lebensfähigen junB -/- Tiere auftraten. Dies bedeutet, daß das Fehlen des JunB Proteins einen letalen Phänotyp der Embryogenese verursacht [9]. Die junB -/- Embryonen entwickeln sich normal bis zum Tag 7.5 der Embryogenese und sterben dann innerhalb von zwei Tagen. Die histologischen und biochemischen Analysen ergaben, daß es zu Fehlentwicklungen bei der Blutgefäßbildung der extraembryonalen Gewebe (Dottersack, Plazenta) kommt, und dadurch der notwendige Transport von Nährstoffe von der Mutter zum Embryo nicht im ausreichenden Umfang stattfindet. Um die kritischen Zielgene zu identifizieren, deren Expression von JunB reguliert wird, und deren Genprodukte eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung von extraembryonalen Geweben spielen, haben wir vor allem ein in vitro Differenzierungssystem mit JunB-defizienten embryonale Stammzellen (ES) einsetzten, das die in vivo Defekte bei der Ausbildung von Blutgefäßen widerspiegelt. Mit Hilfe dieser in vitro generierten sog. “embryoid bodies”, konnten wir VEGF (ein Hauptregulator der Vaskulogenese und Angiogenese) als JunB-abhängiges Zielgen identifizieren, wobei die exogene Zugabe von VEGF die beobachteten Defekte zum großen Teil kompensieren kann [10]. Vorläufige Daten lassen darauf schließen, daß JunB direkt an den VEGF Promotor bindet, und zusammen mit dem Transkrip-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abb. 1: AP-1 abhängige Regulation der Keratinozytenproliferation und Differenzierung. Links: Histologische und Immunfluoreszenzfärbung von in vitro Hautmodellen mit genetisch veränderten Fibroblasten. Rechts: Schematische Darstellung der c-Jun- und JunBabhängigen Regulation der doppelt parakrine Interaktion zwischen Fibroblasten und Keratinozyten. Details siehe [14].

tionsfaktor HIF1α die VEGF Expression positiv reguliert [10].

HE

Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle

Loricrin Keratinozyt

MEF wt

MEF c-jun-/-

Proliferation & Differenzierung KGF GM-CSF

MEF junB-/-

Durch Einkreuzen einer junB transgenen Mauslinie kann der embryonal letale Phänotyp wieder revertiert werden, was die Spezifität des Phänotyps aufzeigt. Diese sog. “rescue” Linie weist ein weitgehend ubiquitäres Muster der junB Transgen Expression auf. In Zellen der myeloiden Subklasse von Immunzellen sind in diesen Tieren jedoch nur geringe Menge an JunB Transgen nachweisbar. Dieser Verlust an JunB ist mit der Entwicklung eines myeloproliferativen Defekts verbunden, der einer chronischen myeloiden Leukämie (CML) beim Menschen ähnelt [11]. Der pathologische Phänotyp ist durch eine erhöhte Anzahl von Granulozyten Vorläuferzellen und reifen neutrophilen Granulozyten gekennzeichnet. Diese Daten weisen JunB als kritischer Regulator der Differenzierung von Blutzellen aus und sind ein weiterer Beleg für die postulierte Funktion von JunB als Tumorsupressor [11]. Obwohl junB-/- Embryonen in der frühen Phase der Embryonalentwicklung sterben, ist es uns gelungen daraus primäre Fibroblasten zu isolieren und durch spontane Immortalisierung permanente Linien zu generieren [12-14]. Diese Zellen wurden dann, analog zur Analyse von c-Jundefizienten Fibroblasten [3,7] für die Aufklärung der Rolle von JunB in der Proliferationskontrolle und Antwort auf Strahlung und Oncoproteine untersucht. JunB greift an zwei Stellen im Zellzyklus regulatorisch ein: zum einen führt das Fehlen von JunB zu einem beschleunigten Übergang der Zellen von der G1 in die S-Phase. Dies beruht sehr wahrscheinlich auf einer reduzierten Expression des CDK Inhibitors p16ink und einer spontan erhöhten Expression von c-Jun. Im weiteren Verlauf der Zellzyklusprogression kommt es in junB-defizienten Zellen zu einem verzögerten Übergang von S nach G2/M was mit einer verringerten Expression und Kinaseaktivität von Cyclin A assoziiert ist. Alle Defekte können durch Einbringen eines JunBER Expressionsvektors Hormon-abhängig revertiert werden [12,13]. Durch den Nachweis i) der Bindung von JunB in vitro an eine CRE Sequenz im Cyclin A Promotor, ii) der CRE-abhängigen transkriptionellen Aktivierung des Zyklin A Promotors durch Überexpression von JunB (zusammen mit ATF2) und iii) der verringerten AP-1 Bindungsaktivität

il-1

IL-1

gm-csf

c-Jun

kgf

JunB

Fibroblast

an das CRE Element in JunB-defizienten Zellen konnten wir erstmals Cyclin A als direktes und positiv reguliertes JunB Zielgen identifizieren [12,13].

Trans-regulatorische Funktion der Jun Proteine in Zellproliferation und Differenzierung A. Szabowski, S. Andrecht, A. Kolbus, M. Schorpp-Kistner, P. Angel In Kollaboration mit Nicole Maas-Szabowski und Norbert Fusenig, DKFZ

Neben der Aufklärung der Zell-autonomen Funktion der Jun Proteine in der Zellzykluskontrolle und bei positiven oder negativen Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren (z.B. Smad Proteine, 15; Glucocorticoid Rezeptor, 16] konnten wir durch Verwendung der junB-/- Fibroblasten erstmals den Einfluß von c-Jun und JunB bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung in trans identifizieren [8,14,17,18]. Dabei haben wir uns im besonderen mit dem Zytokin-abhängigen regulatorischen Wechselspiel zwischen dem dermalen und epidermalen Kompartiment der Haut beschäftigt. Unter Verwendung eines Co-Kultursystems mit primären menschlichen Keratinozyten und murinen Fibroblasten und eines 3-dimensionalen organotypischen in vitro Hautmodells haben wir die Fibroblastenabhängige Proliferation und Differenzierung von primären Keratinozyten untersucht. Durch Verwendung der genetisch veränderten c-jun-/- und junB-/- Fibroblasten wird die Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten massiv verändert. Dies beruht darauf, daß c-Jun und JunB gegenläufig die Expression von KGF und GM-CSF regulieren (s. Abb. 1). Im Gegensatz zu GM-CSF und KGF war die Zugabe anderer Zytokine (EGF, bFGF) nicht ausreichend, den Phänotyp der verringerten Epithelbildung in Gegenwart von c-Jun-defizienten Fibroblasten zu kompensieren [17]. Andererseits sind Zytokine, die c-Jun-unabhängig exprimiert werden, ebenfalls in diesem Regelkreis involviert [8,14,17]. Den direkten Nachweis der kausalen Rolle dieser AP-1-abhängigen Zytokine konnten wir durch Ver-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

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wendung von neutralisierenden GM-CSF Antikörper erbringen, die die Epithelbildung in Gegenwart von Wildtyp Fibroblasten drastisch reduzierte und den pathologischen Phänotyp der junB-/- Co-Kulturen fast völlig aufhob. In Übereinstimmung mit früheren Vermutungen führt die Verwendung von neutralisierenden Antikörper gegen Il-1 ebenfalls zu einer partiellen Reversion des Phänotyps der junB-/- Fibroblasten organotypischen Kultur und Kulturen, die auf Wildtyp Fibroblasten basieren, zeigen nur noch eine geringe Epithelbildung [8,14,17]. Diese Daten unterstreichen noch einmal das Modell des doppelt-parakrinen Wirkmechanismus z.B. bei der Wundheilung, wo durch Synthese und Ausschüttung von Il-1 durch Keratinozyten die Produktion von Zytokinen in Fibroblasten (darunter KGF und GM-CSF) gesteuert wird, die dann parakrin wieder auf Keratinozyten wirken und Proliferation und Differenzierung regulieren. Wir glauben, daß die weiteren Analysen der Jun-defizienten Fibroblasten (und hier vor allem die junB-/- Fibroblasten) in diesem in vitro Hautmodell neben dem Verständnis der physiologischen Prozesse der Haut (Differenzierung, Wundheilung) auch die Etablierung molekularbiologischer Werkzeuge zur Analyse von pathologischen Veränderungen der Haut (Psoriasis, chronische Entzündungen, verzögerte Wundheilung; Tumorerkrankungen) bringen wird.

Regulation und Funktion des AP-1-abhängigen Zielgens Kollagenase: ein Modell zur Analyse regulatorischer Mechanismen der Protein/Protein Wechselwirkung zwischen AP-1, Cbfa1 und dem Glucocorticoid Rezeptor Arbeiten aus unserem Labor und zahlreicher anderer Labors haben Metalloproteinasen (vor allem die interstitielle Kollagenase, Kollagenase-3) als Modellsystem für AP-1abhängige Genexpression in Zellkultur und im Tier etabliert [18-22]. Das Gen der interstitiellen Kollagenase-3 (MMP-13) kodiert für eine Proteinase, die im Zusammenspiel mit anderen Mitglieder der Matrix Metalloproteinase (MMP) Familie und in Abhängigkeit von der Expression von Inhibitoren von MMPs (TIMPs; [23,24] und darin angegebene Referenzen) eine essentielle Rolle bei physiologischen Prozessen (Gewebeumbau bei der Embryogenese, Organogenese) und beim pathologischen Gewebeumbau (chronische Entzündung, Tumor Progression) zugeschrieben wird.

Positive Interferenz zwischen AP-1 und Cbfa1 J. Hess, J. Tuckermann, M. Becker, C. Munz, S. Teurich, P. Angel iIn Kollaboration mit Michael Owen, ICRF, London, UK; J. Labrador und Rüdiger Klein, EMBL Heidelberg; Karen Pittois und J. Merregaert, Universität Antwerpen, Belgien; Jörg Schmidt, Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Neuherberg, Oberschleißheim; Agamemnon Grigoriadis Guy´s Hospital, London UK; Gillian Murphy and Rosalind Hembry, Strangeways Research Laboratory, Cambridge, UK.

Durch den Nachweis der zelltyp-spezifischen Expression von Kollagenase-3 in osteoblastoiden Zellen während der

Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle Embryonalentwicklung der Maus und in adulten Mäusen [19,21,22] konnten wir starke Evidenzen für eine Funktion dieses Proteins bei der Knochenentwicklung und Metabolismus erhalten. In transgenen Mäusen, die das c-fos Gen überexprimieren, korreliert die Lokalisation der verstärkten Kollagenase Expression mit den pathologischen Veränderungen, vor allem der Ausbildung von Knochentumoren (Osteosarkome), die als Konsequenz einer lang anhaltenden Fos Expression auftreten [24]. Da Kollagenase-3 spontan fast ausschließlich im Knochen [21,22,24], die Jun und Fos Proteine jedoch noch in vielen anderen Geweben exprimiert werden, stellt sich die Frage nach dem Mechanismus der Zelltyp-Spezifität. Diese könnte durch Osteoblasten-spezifische Aktivatoren vermittelt werden, die mit AP-1 funktionell kooperieren. Durch Untersuchungen der Aktivierung des Kollagenase Promotors durch Parathormon (PTH, einer der wichtigsten Regulatoren des Knochenmetabolismus) konnten wir zwei ciswirkende Elemente definieren, die zusammen mit AP-1 für die Induktion notwendig sind [19,26]. Diese Elemente dienen als Erkennungssequenz für den Transkriptionsfaktor Cbfa-1. Dieser Faktor wurde kürzlich als essentielle Komponente der Osteoblasten-Differenzierung und der endochondralen Ossifikation beschrieben. Unsere Arbeiten zeigten, dass AP-1 und Cbfa1 direkt miteinander in Wechselwirkung treten, und dass dies über den “Leucine zipper” (Fos, Jun Proteine) bzw. die “Runt”-Domäne (Cbfa1) vermittelt wird [26]. Diese Daten weisen darauf hin, daß neben seiner Funktion bei der Differenzierung von Osteoblasten Cbfa1 im Zusammenspiel mit AP-1 auch eine wichtige Rolle beim Knochenmetabolismus zu spielen scheint.

Negative Interferenz zwischen AP-1 und dem Glucocorticoid Rezeptor J. Tuckermann, J. Eberlein, H. Richter In Kollaboration mit Holger Reichardt, Günther Schütz, G. Fürstenberger, DKFZ; Martin Göttlicher, Falk Weih, Peter Herrlich, Institut für Genetik, Forschungszentrum Karlsruhe

Neben der positiven Regulation von AP-1 durch übergeordnete Proteinkinasen (JNKs) und der Wechselwirkung mit anderen zellulären Proteinen (Smads, Cbfa1; siehe oben) erfährt aber auch die negative Regulation von AP-1 durch Protein/Protein Interaktionen eine zunehmende Beachtung. Bei letzterem gilt unser Interesse vor allem der physiologischen Relevanz der negativen Regulation von AP-1 Aktivität durch aktivierte Glucocorticoid Rezeptoren (GR) im Gesamtorganismus. Anhand einer “knock-in” Maus, die einen mutierten GR exprimiert (GRdim, im Labor von Günther Schütz generiert), konnten wir nachweisen, daß für die Repression von AP-1-abhängiger Kollagenase Expression in primären embryonalen Mausfibroblasten nur die reprimierende, jedoch nicht die aktivierende Funktion des GR (mittels DNA Bindung an “Glucocorticoid-responsive-elements”, GREs) notwendig ist [16,21]. Die Signifikanz dieses Regulationsmechanismus im Gesamtorganismus konnten wir durch die Unterdrückung der TPA-induzierte Expression von Kollagenase-3 in der Maushaut durch gleichzeitige Applikation des synthetischen Gluco-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation corticoids Dexamethason bestätigen. Dabei fanden wir, daß Glucocorticoid Gabe die TPA-vermittelte Induktion von Kollagenase-3 in Wildtyp und GRdim Mäusen mit gleicher Effizienz unterdrückt [20,21]. Wir haben dieses experimentelle System auch benutzt, um die ersten Gene in Haut zu klonieren, deren Expression durch Glucocorticoide induziert werden. In Übereinstimmung mit den Eigenschaften des mutierten GR in der GRdim Maus wird die Expression beider Gene, Plasmaglutathion Peroxidase-3 (PGX-3) und Heat Shock Protein-27 (HSP-27), nur in der Haut von Wildtyp Mäusen, jedoch nicht GRdim Mäusen durch Dexamethason induziert [20,21]. Durch diese Daten konnte belegt werden, daß die Repression der AP-1 Aktivität durch Glucocorticoide in vivo tatsächlich keine Expression von GRE-gesteuerten Gene benötigt. Parallel zu AP-1 wird die Aktivität des Transkriptionsfaktors NFκB in ähnlicher Weise durch den GR negativ reguliert. Da NFκB eine wichtige regulatorische Rolle bei der Immunantwort zugeschrieben wird, haben wir TPA-induzierten Entzündungsreaktionen in der Haut untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl diese Reaktion, als auch andere Parameter (z.B. Zytokin Expression in T-Zellen und Makrophagen) in Wildtyp und GRdim Mäusen mit gleicher Effizienz durch Glucocorticoide unterdrückt werden [27]. Dies bedeutet, dass Glucocorticoid-vermittelte Immunsuppression vor allem durch die DNA Bindungs-unabhängige Funktion des GR vermittelt wird.

Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle von zum Teil völlig unbekannten Genen haben wir als neue Tumor-assoziierte Gene die noch wenig charakterisierte Serin Protease BSSP [28] und Mitglieder der S100 Proteine [29] identifiziert. Zur Zeit wird das Expressionsmuster dieser Gene und der spezifische Transkript-positive Zelltyp in verschiedenen Stadien der chemisch induzierten Hautkarzinogenese (Papillome, Karzinome) bestimmt, um mögliche Anhaltspunkte über die Funktion dieser Proteine im Verlauf der Tumorgenese zu bekommen. In Kollaboration mit Dr. Peter Steinlein, IMP Wien, und Prof. Peter Lichter (DKFZ Heidelberg) haben wir mittlerweile die isolierte cDNA Kollektion auf DNA-Chips aufgebracht und damit die Methodik des “large-scale gene expression profiling” in der Abteilung etabliert. Ziel ist es, zum einen das Expressionsmuster diese cDNAs in Tumoren aus anderen Geweben zu untersuchen. Zum anderen wollen wir die Expression der bisher isolierten, neuen Tumor-assoziierten Gene der Maus in menschlichen Tumoren bestimmen, um mögliche neue, spezifische Markergene für diese Tumore zu etablieren.

Klonierung neuer tumor-assoziierter Gene in der Maus U. Breitenbach, C. Gebhardt, H. Richter, J. Hess, P. Angel In Kollaboration mit Gerhard Fürstenberger, Gunnar Wrobel, Jörg Schlingemann, Peter Lichter, DKFZ; Peter Steinlein, Institut für Molekulare Pathologie, Wien, Österreich; Zena Werb, University of California, San Francisco, USA

Sequentielle Behandlung der Maushaut mit TPA führt zur Ausbildung von Papillomen und nachfolgend zum Auftreten von Karzinomen (Mehrstufenmodell der chemisch-induzierten Hautkarzinogenese). In Zellinien, die sich von den verschiedenen Tumorstadien ableiten, wurde eine Korrelation zwischen basaler Expression von Kollagenase3 und zunehmender Malignität der Tumorzellen gefunden. Dies läßt vermuten, daß dieses Enzym auch zur Ausbildung und Ausbreitung von Hauttumoren beitragen könnte. Durch Herstellung von konditionalen (“floxed”) Kollagenase-3 Maus Mutanten, in denen spezifisch die Expression in Keratinozyten ausgeschaltet werden kann, versuchen wir zur Zeit diese Frage zu beantworten. Basierend auf den experimentellen Bedingungen, die zu einer deutlich erhöhten Expression des Kollagenase-3 Gens in TPA-behandelter Maushaut führen, haben wir im Berichtszeitraum die Anwendung der Methode der subtraktiven cDNA Klonierung (SSH) zur Isolierung differentiell exprimierter Gene im Labor etabliert. Wir haben die isolierte Kollektion von etwa 3000 TPA-induzierten cDNAs auf solche Gene untersucht, die eine konstitutiv hohe Expression in den Hauttumoren aufweisen. In dieser Subgruppe

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Angel, P. (2001) AP-1. In: Encyclopedic Reference of Cancer. M. Schwab (Ed.) pp. 60-67. Springer Verlag, Heidelberg. [2] Schorpp-Kistner, M., *Herrlich, P. and Angel, P. (2002). The AP-1 family of transcription factors: Structure, regulation and functional analysis in mice. N.LeThangue (Ed.) In press [3] Kolbus, A., Herr, I., *Schreiber, M., Debatin, K.M., *Wagner, E.F. and Angel, P. (2000) c-Jun-dependent induction of CD95L is critically involved in the induction of apoptosis by alkylating agents. Mol. Cell. Biol.20, 575-582 [4] *Scherer, S., *Maier, S., *Seidert, M., *Hanselmann, R., *Zang, K.D., *Müller-Hermelink, H.K., Angel, P., *Welter, C. and *Schartl, M. (2000) p53 and j-Jun functionally synergize in the regulation of the DNA repair gene hMSH2 in response to UV. J. Biol. Chem. 275, 37469-37473.

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[5] Eichhorst, S., Müller, M., Li-Weber, M., Schulze-Bergkamen, H., Angel, P. and Krammer P. (2000) A novel AP-1 element in the CD95 ligand promotor is required for induction of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells upon treatment with anticancer drugs. Mol. Cell Biol. 20, 7826-7837. [6] Baumann, S., Eichhorst, S., Hess, J., Krüfer, A., Angel, P., Krammer, P. and Kirchhoff, S. (2002) A novel function for FosB in activation-induced cell death in T cells. Oncogene, submitted for publication. [7] *Schreiber, M., Kolbus, A., *Piu, F., Szabowski, A., *MöhleSteinlein, U., *Tian, J., *Karin, M., Angel, P. and *Wagner, E. F. (1999) Control of cell cycle progression by c-Jun is p53 dependent. Genes Dev., 13, 607-619. [8] Szabowski, A. (2001) Identifikation einer trans-regulatorischen Funktion von c-Jun und JunB bei der Regulation von Zellproliferation und –differenzierung. Dissertation, Universität Saarbrücken [9] Schorpp-Kistner, M., *Wang, Z.Q., Angel, P. and *Wagner, E.F. (1999) JunB is Essential for the Formation of the mammalian Placenta. EMBO J.,18, 934-948 [10] Schmidt, D. (2002) Role of JunB in Hypoxia-mediated Cell Response and Tumour Angiogenesis. Dissertation, Universität Freiburg. [11] *Passegue, E., *Jochum, W., Schorpp-Kistner, M., *MöhleSteinlein, U. and *Wagner, E.F. (2001) Chronic myeloid leukemia with increased granulocyte progenitors in mice lacking JunB expression in the myeloid lineage. Cell, 104, 21-32 [12] Andrecht, S. (2001) Identifikation von positiven und negativen Funktionen des Transkriptionsfaktors JunB bei der Zellzyklusregulation. Dissertation, Universität Hannover. [13] Andrecht,S., Kolbus,A., Hartenstein, B., Angel,P. and Schorpp-Kistner,M. (2002). Positive and Negative Functions of JunB in Cell Cycle Progression. J. Biol. Chem., zur Publikation eingereicht [14] Szabowski, A., Maas-Szabowski, N., Andrecht, A., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Fusenig, N. und Angel, P. (2000) c-Jun and JunB antagonistically control cytokine-regulated mesenchymalepidermal interaction in skin. Cell, 103, 745-755

Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle [18] Angel P., Szabowski, A. and Schorpp-Kistner, M. (2001) Function and regulatrion of AP-1 subunits in skin physiology and pathology. Oncogene, 20, 2413-23. [19] Porte, D., Tuckermann, J., Becker, M., Baumann, B., Teurich, S., *Higgins, S., *Owen, M., Schorpp-Kistner, M., and Angel, P. (1999) Both Ap-1 and Cbfa1-like factors are required for induction of interstitial collagenase by parathyroid hormone. Oncogene, 18, 667-678. [20] Tuckermann, J., Reichardt, H., Arribaz, R., Richter, H., Schütz, G. and Angel, P. (1999) The dimerization-independent function of the glucocorticoid receptor mediates repression of AP1-dependent gene expression in skin, J. Cell Biol. 147, 13651370. [21] J. Tuckermann (2000) In vivo Modulation des Transkriptionsfaktors AP-1 durch Glucocorticoide. Dissertation, Fakultät für Biound Geowissenschaften, Universität Karlruhe. [22] Tuckermann, J., *Pittois, K., Partridge, N.C., *Merregaert and Angel, P.(2000). Collagenase-3 (MMP-13) and integral membrane prtoein 2a (Itm2a) are marker genes of chondrogenic/osteoblastic cells in bone fromation: sequential temporal, and spatial expression of Itm2a, alkaline phosphatase, MMP-13, and osteocalcin in the mouse. J. Bone Res. 15, 1257-65. [23] *Vallon, R. and Angel, P. (2000). Expression of human collagenase I (MMP-1) and TIMP-1 in a Baculovirus based expression system. Meth. Mol. Biol. 151, 203-214. [24] *Dew, G., *Murphy, G., *Stanton, H., *Vallon, R., Angel, P., *Reynolds, J.J. and *Hembry, R.M. (2000) Localisation of matrix metalloproteinases and TIMP-2 in resorbing mouse bone. Cell Tissue Res., 299, 385-94. [25] Tuckermann, J., *Vallon, R., Gack, S., *Grigoriadis, A.E., Porte, D., *Lutz, A., *Wagner, E.F. *Schmidt, J. and Angel, P. (2001) Expression of collagenase-3 (MMP-13) in c-Fos-induced osteosarcomas and chondrosarcomas is restricted to a subset of cells of the osteo/chondrogenic lineage. Differentiation 69, 49-57. [26] Hess, J., Porte, D., Munz, C. and Angel, P. (2001) AP-1 and Cbfa/Runt physically interact and regulate PTH-dependent MMP13 expression in osteoblasts through a new OSE2/AP-1 composite element. J. Biol. Chem. 276, 20029-38. [27] Reichardt, H., Tuckermann, J., *Göttlicher, M., Vujic, M., *Weih, F., Angel, P., *Herrlich, P. and Schütz, G. (2001) Immunosuppression in the absence of DNA-binding by the glucocorticoid receptor in vivo. EMBO J., 20, 7168-713 [28] Breitenbach, U., Tuckermann, J., Gebhardt, C., Richter, K.H., Fürstenberger, G., Christofori, G. and Angel, P. (2001) Keratinocyte-specific onset expression in experimental of serine protease BSSP carcinogenesis. J. Inv. Dermatol., 117, 634-640. [29] Gebhardt, C., Breitenbach, U., Tuckermann, J., Richter, K.H. and Angel, P. (2002) Calgranulins S100A8 and S100A9 are negatively regulated by glucocorticoids in a c-Fos-dependent manner and overexpressed throughout skin carcinogenesis, Oncogene, in press.

[15] *Verrecchia, F., *Tacheau, C., Schorpp-Kistner, M., Angel, P. und *Mauviel, A. (2001) Induction of the AP-1 members c-Jun and by TGFß/Smad suppresses early Smad-driven gene activation. Oncogene, 20, 2205-11 [16] Reichardt, H. M., Kaestener, K.H., Tuckermann, J., Kretz, O., Wessely, O., Bock, R., Gass, P., Schmid, W., *Herrlich, P., Angel, P. and Schütz, G. (1998). DNA-binding of the glucocorticoid receptor is not essential for survival. Cell 93, 531-541. [17] Maas-Szabowski, N., Szabowski, A., Andrecht, S., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Angel, P. und Fusenig, N. (2001) Organotypic Cocultures with genetically modified mouse fibroblasts as a tool to dissect molecular mechanisms regulating keratinocyte growth and differentiation. J. Invest. Dermatol., 116, 816-20

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion

AG Hormonwirkung und Signaltransduktion (B0810) Leiterin: PD Dr. rer. nat. Doris Mayer Wissenschaftlicher Mitarbeiter Dr. rer. nat. Bernd Schnarr ( - 09/00) *

I. Der Insulin / IGF-I Rezeptor-Signalweg in Brustkrebszellen

Doktoranden Barbara De Servi (07/01 - ) * Kathrin Kopplow ( - 12/00) Yongde Liao (10/01 - ) * Senad Medunjanin (01/01 - ) Martina Schmitt (- 2/00) Kathrin Strunz (- 12/00)

Expression von IRS-1 und IGF-I Rezeptor in Mamma-Carcinomen D. Mayer, B. Schnarr, K. Strunz, Y. Niu, J. Ohsam, A. Dreuw In Kooperation mit J. Wacker, Universitätsfrauenklinik, Heidelberg; A. Benner, Zentrale Einheit Biostatistik, DKFZ Zusatzfinanzierung: „Organtumorsystem Mammacarcinom“ des DKFZ

Diplomanden Alexandra Dreuw (10/00 - 05/01) Stephanie Geiger (10/01 - ) Gastwissenschaftler Yun Niu (China, 04/00 - 05/01) Technischer Angestellter Jürgen Ohsam (- 04/01)

* Sonderfinanzierung

Hormone sind körpereigene Substanzen, die bei einer Vielzahl von Wachstums- und Differenzierungsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Synthetisiert in endokrinen Organen erreichen sie ihre Zielorgane auf dem Blutweg. Nach Bindung an spezifische Rezeptoren, die auf der Plasmamembran bzw. im Cytosol oder im Zellkern der Zielzellen lokalisiert sind, wird eine Vielzahl von Signalübertragungsprozessen aktiviert, die u.a. in der Stimulation der Zellproliferation enden. Aufgrund dieser wachstumsfördernden Eigenschaften gelten zahlreiche Hormone als Tumorpromotoren. Dies gilt sowohl für Steroidhormone als auch für Peptidhormone. Die von Steroiden und Peptidhormonen aktivierten Signalkaskaden sind prinzipiell unterschiedlich, Peptidhormone binden an Rezeptoren in der Plasmamembran und setzen dadurch eine Kaskade von Phosphorylierungsreaktionen an Proteinen in Gang. Steroidhormone binden an Rezeptoren, die entweder im Cytoplasma oder im Zellkern lokalisiert sind. Nach Aktivierung und Translokation in den Zellkern werden sie primär als Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Expression von Zielgenen wirksam. Jüngste Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass es vielfältige Interaktionen zwischen Peptidhormon- und Steroidhormon-vermittelten Signalwegen gibt. Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit Mechanismen der Tumorentstehung unter dem Einfluß von Peptid- und Steroidhormonen sowie mit deren Wechselwirkung in epithelialen Mamma- und Leberzellen.

Der Insulin / IGF-I Rezeptor-Signalweg wird aktiviert durch die beiden Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II sowie durch das Hormon Insulin. IGF-I und IGF-II können von verschiedenen Gewebekomponenten menschlicher Brusttumoren, dem Stroma (Bindegewebe) und den epithelialen Carcinomzellen synthetisiert werden. Sie können das Wachstum der Krebszellen parakrin oder autokrin stimulieren. Auch wurden hohe Insulin-Blutspiegel (z.B. bei Typ II-Diabetikerinnen) mit einer erhöhten Brustkrebsinzidenz in Verbindung gebracht. Nach Bindung der Liganden an den Insulinrezeptor bzw. den IGF- I Rezeptor werden diese dimerisiert und durch Autophosphorylierung verschiedener Tyrosinreste durch die intrinsische Rezeptor-Tyrosinkinase aktiviert. Beide Rezeptor-Tyrosinkinasen phosphorylieren das Insulinrezeptor-Substrat-1 (IRS-1), eines der wichtigsten Signalproteine der Zelle. Aus Zellkulturexperimenten ist bekannt [1], dass die Expression des IGF-I Rezeptors und des IRS-1 durch das Steroidhormon Estradiol (E2) induziert werden. Estradiol stimuliert außerdem das Wachstum normaler Brustdrüsenepithelzellen sowie von Brustkrebszellen, sofern diese den Estrogenrezeptor exprimieren. Wir haben uns die Frage gestellt, ob es einen Zusammenhang gibt zwischen dem Differenzierungsgrad von Brusttumoren und der Expression des IGF-I Rezeptors, des Insulinrezeptors und IRS-1 sowie des Estrogenrezeptors. An 69 Brustkrebsproben verschiedenen Differenzierungsgrades und 21 normalen Brustdrüsengeweben wurde immunhistochemisch die Expression von Insulinrezeptor, IGF-I Rezeptor, IRS-1 und Estrogenrezeptor sowie die Zellproliferation (% Ki-67 positive Zellen) bestimmt. IGF-I Rezeptor und IRS-1 wurden in hohen Spiegeln in gut und mäßig differenzierten Carcinomen (Grad I und II) und in geringen Mengen in niedrig differenzierten Tumoren (Grad III) nachgewiesen [Abb.1]. Vorläufige durch in situHybridisierung der entsprechenden mRNA gewonnene Ergebnisse zeigen, dass die Expression der Proteine transkriptional reguliert wird. Die Expression des Insulinrezeptors zeigte keine eindeutige Korrelation mit dem Grad der Tumordifferenzierung. Genaue statistische Analyse zeigte, daß der Verlust an IGF-I Rezeptor und IRS-1 einen genaueren Marker für die Entdifferenzierung der Carcinome darstellt als die bekannte Reduktion der EstrogenrezeptorExpression und die Zunahme der Zellproliferation. Die Befunde zeigen eindeutig, daß die Progression von Brustkrebs von einer Reduktion an IGF-I Rezeptor und IRS-1 begleitet wird, und daß die IGF-I Rezeptor / IRS-1 Expres-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

H&E

IRS-1

IGF-IR

Normalgewebe

G1

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G3

Abb. 1.: Expression von IRS-1 und IGF-I Rezeptor in Brustgewebe und in Mamma-Carcinomen unterschiedlichen Differenzierungsgrades

A-C: normales Brustdrüsenläppchen. D-F: gut differenziertes intraduktales Carcinom (Pfeile) umgeben von Bindegewebe. G-I: niedrig differenziertes duktales Carcinom. A, D, G: HämatoxilinEosin gefärbte Schnitte. Immunhistochemischer Nachweis von IRS-1 (B, E, H) und IGF-IR (C, F, I) in Serienschnitten von A, D und G. Starke Expression von IRS-1 (B) und etwas geringere Expression von IGF-IR (C) in allen epithelialen Zellen des normalen Drüsenläppchens. D-F: Grad-1 Carcinom (Pfeile) zeigt starke Expression von IRS-1 (E) und mäßige bis starke Expression von IGF-IR (F). G-I: Grad-3 Carcinom mit schwacher Expression von IRS-1 (H) und IGF-IR (I). K. Perinukleäre Lokalisation von IRS-1 in Tumorzellen (Pfeile). L und M sind Kontrollen zur Dokumentation der Spezifität der Antikörper.

B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion zellen proliferationssteigernd wirkt und wenn ja, ob diese Wirkung auf die Konversion zu Estrogenen zurückgeführt werden kann. Wir konnten zeigen, daß estrogenabhängige MCF-7 Brustkrebszellen DHEA in physiologisch relevanten Mengen zu Estradiol umwandeln (~200 pM im Medium nach 4-tägiger Inkubation mit 100 nM DHEA). Außerdem wurden Estron und Testosteron identifiziert [3, 4]. Sowohl Estradiol (1 nM) als auch DHEA (100 nM) wirkten proliferationsstimulierend auf MCF-7 Zellen, letzteres mit einer Verzögerung von 2 ½ Tagen, was für eine Notwendigkeit der Konversion des DHEA zu Estrogen spricht. Estrogenunabhängige Brustkrebszellen (MDA-MB-436) wurden nicht stimuliert. Eine von MCF-7 abgeleitete Zellinie, die mit einem Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des Estrogen Responsive Elements und des β-Globulinpromotors (EREluc) stabil transfiziert wurde, wurde eingesetzt, um Effekte von DHEA auf die estrogenabhängige Genexpression zu messen. DHEA zeigte eine deutliche Induktion der Luciferase. Sowohl die Stimulation der Zellproliferation und als auch die Induktion der Luciferase-Expression durch DHEA konnte durch die Anti-Estrogene ICI 182,780 und Tamoxifen gehemmt werden, ebenso durch den Aromatase-Hemmer 4-Hydroxyandrostendion, was die Notwendigkeit der Konversion von DHEA zu Estrogen unterstreicht [4]. Ein androgener Effekt von DHEA auf MCF-7 Zellen konnte durch ein negatives Ergebnis nach Doppeltransfektion von MCF-7 Zellen mit dem Androgenrezeptor und einem ARELuc Reportergen-Konstrukt ausgeschlossen werden. Aus den Ergebnissen wurde geschlossen, daß DHEA auf Brustkrebszellen mitogen wirkt, daß es in erheblichen Mengen zu Estrogenen, insbesondere Estradiol konvertiert wird, und daß die Konversion eine Voraussetzung für den proliferationssteigernden Effekt von DHEA darstellt.

III. DHEA-Effekt auf Leberzellen D. Mayer, K. Kopplow

sion negativ mit der hohen Proliferationsrate in niedrig differenzierten Mammacarcinomen korreliert ist [2]. Aus diesem Grund wurde vorgeschlagen, IGF-I Rezeptor und IRS-1 als neue Marker für das (oft schwierige) Grading von Tumoren einzusetzen.

II. DHEA- Effekt auf Brustkrebszellen D. Mayer, M. Schmitt, B. Schnarr In Kooperation mit R. Morfin, Laboratoire de Biotechnologie, Conservatoire National des Arts et Métiers, Paris, Frankreich ; K. Klinga, Hormonlabor der Universitätsfrauenklinik, Heidelberg; A. Benner, Biostatistik, DKFZ

Das Nebennierenrindenhormon Dehydroepiandrosteron (DHEA) stellt in vivo eine Vorstufe in der Biosynthese von Testosteron und Estradiol in peripheren Organen dar. Epidemiologische Studien haben gezeigt, daß Frauen mit hohem DHEA-Blutspiegel in der Postmenopause ein erhöhtes Brustkrebsrisiko aufweisen. Die Substanz kann in Brustgewebe und Brusttumoren aus dem Blut angereichert werden. Wir haben untersucht, ob DHEA auf Brustkrebs-

In Kooperation mit: G. Hobe, Hans-Knöll-Institut, Jena; J. Swierczynski, Dept. Biochemistry, Medical University Gdansk, Polen; P. Bannasch, Cytopathologie, DKFZ; A. Benner, Biostatistik, DKFZ; K. Forstner, FIMT Asperg.

Die Untersuchungen zur carcinogenen und tumorpromovierenden Wirkung von DHEA auf die Rattenleber wurden fortgesetzt [5-10]. Dabei stand der Befund im Vordergrund, daß DHEA tumorpromovierend wirkt, obwohl es insgesamt die Proliferation präneoplastischer Läsionen hemmt. Die Identifizierung der Tumorvorstufe, die möglicherweise durch DHEA spezifisch promoviert wird, ist Gegenstand aktueller Untersuchungen. Weiterhin wurde der biochemische und molekulare Mechanismus der proliferationshemmenden Wirkung von DHEA weiteruntersucht. Vorläufige Ergebnisse dokumentieren einen Einfluß von DHEA auf die Cytokin- und Wachstumsfaktor-Produktion in der Rattenleber [11].

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion

Publikationen (* = externer Koautor) [1] Dreuw, A.: Wirkung von IGF-I und Estradiol auf die TyrosinPhosphorylierung des Insulin-like Growth Factor-I Rezeptors und auf die estragonabhängige Genexpression in Mammakarzinomzellen. Diplomarbeit, Biologische Fakultät, Universität Heidelberg (2001) [2] Schnarr, B., Strunz, K., Ohsam, J., Benner, A., *Wacker, J., Mayer, D.: Downregulation of insulin-like growth factor-1 receptor and insulin receptor substrate-1 in advanced human breast cancer. Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 89, 506-513 (2000) [3] Schmitt, M., *Klinga, K., Mayer, D.: Dehydroepiandrosterone (DHEA) stimulates proliferation of of MCF-7 cells after being metabolized to estrogens. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41, 139 (2000) [4] Schmitt, M., *Klinga, K., Schnarr, B., *Morfin, R., Mayer, D.: Dehydroepiandrosterone stimulates proliferation and gene expression in MCF-7 cells after conversion to estradiol. Mol. Cell. Endocrinol. 173, 1-13 (2001) [5] Bannasch, P., Metzger, C., Mayer, D.: Hepatocarcinogenesis by dehydroepiandrosterone. I. Sequential cellular changes during neoplastic develoment. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, 237-249 (2000) [6] *Hobe, G., *Hillesheim, H.-G., *Schön, R., *Undisz, K., *Valentin, U., *Reddersen, G., *Ritter, P., Bannasch, P., Mayer, D.: Studies on the metabolism of DHEA in rats and mice. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, 343-362 (2000) [7] Mayer, D., Metzger, C., Bannasch, P.: Hepatocarcinogenesis by dehydroepiandrosterone. II. Biochemical and molecular changes during neoplastic development. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, 251-260 (2000) [8] Mayer, D., Metzger, C., Nehrbass, D., Bannasch, P.: Characteristics of dehydroepiandrosterone-induced hepatocarcinogenesis in the rat. In: Hormonal Carcinogenesis III (Eds. Li, J.J., J.R. Daling, S.A. Li) Springer-Verlag, New York, pp. 477-483 (2000) [9] *Swierczynski, J., *Slominska, E., *Smolenski, R.T., Mayer, D. : Increase in NAD but not ATP and GTP concentrations in rat liver by dehydroepiandrosterone feeding. Pol. J. Pharmacol. 53, 125130 (2001) [10] Mayer, D.: Hormonal and carcinogenic effects of dehydroepiandrosterone on liver. In: Surgical Pathology, Update 2001, 18th European Congress of Pathology (Eds. S. Hauptmann, M. Dietel, M. Sobrinho-Simões), ABW Wissenschaftsverlag Berlin, pp. 363-367 (2001) [11] Kopplow, K. Untersuchung des Einflusses von Dehydroepiandrosteron auf die Proliferationsaktivität von Hepatozyten und die Expression von Zellzyklusparametern in der Rattenleber. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg (2002)

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese

Abteilung: Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) Leiterin: Priv.-Doz. Dr. Petra Boukamp Wissenschaftler: Dr. Susanne Popp Dr. Sabine Rosenberger (05/00 - ) Dr. Vera Vormwald Dogan (05 - 12/00) Dr. Reynel Figueroa ( - 07/00) Dr. Karin Greulich-Bode (10/00 - ) Dr. Sascha Beneke (09/01 - )

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Doktoranden: Ana Cerezo Heike Lindenmaier ( - 04/01) Sharareh Moshir (07/01/ - ) Sibylle Ermler (08/01 - )

1. Genetische Mechanismen der Hautcarcinogenese P. Boukamp, S. Popp, B. Jelinek, A. Jirschik In Kooperation mit: Prof. W. Hartschuh, Dermatologie Heidelberg; Prof. Irenen Leigh, Dermatologie London, UK; Prof. Ingrid Moll, Dermatologie Hamburg; Dr. A. Bürkle, DKFZ Heidelberg (jetzt Newcastle upon Tyne, UK); Dr. A. Jauch, Humangenetik Heidelberg; Dr. Frank de Gruijl (Utrecht, Niederlande); Prof. Karin Scharffetter-Kochanek Dermatologie Köln,

Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Zugewinn von 11q13 wird durch erhöhte Temperatur sowie UV-A Strahlung induziert und ist ein wichtiges genetisches Ereignis in Hautcarcinomen

Techniker: Alena Jirschik (05/01-) Hermann Stammer (10/01 - )

2. Die genetische Analyse über CHG und M-FISH erlaubt die Aufstellung eines genetischen Stammbaums und damit die direkte Ableitung von Metastasen.

Hautcarcinome (Basalzell- [BCC] und Plattenepithelcarcinome [SCC]) sind nicht nur bereits heute die häufigsten Tumortypen, die Zahl steigt auch ständig und dies speziell in immunsupprimierten Patienten. Darüber hinaus kehrt sich das Verhältnis von nahezu nie metastasierenden Basalzell Carcinomenen zu den malignen Plattenepithel Carcinomen um, so dass auch die Mortalitätsrate steigt. Obwohl schon seit langer Zeit bekannt ist, dass übermäßige Sonnenbestrahlung (Sonnenbrände) bei der Entstehung von Hautcarcinomen eine wesentliche Rolle spielt, ist noch wenig über die molekularen Mechanismen bekannt. Das Ziel unserer Studien ist es deshalb, die Rolle von Risikofaktoren (UV-A, erhöhte Temperatur) besser verstehen zu lernen, neue genetische Aberrationen zu identifizieren und deren Funktion aufzuklären. Dies soll einerseits dazu beitragen, die Differentialdiagnose unterschiedlicher Hauttumortypen zu verbessern und andererseits sollen dadurch die molekularbiologischen Grundlagen für neue Behandlungsmöglichkeiten geschaffen werden. Mit Hilfe experimenteller Modellsysteme werden in der Abteilung 2 Hauptthemen bearbeitet: 1) Molekularund funktionelle genetische Studien, um relevante Onkogene und Tumorsuppressorgene zu identifizieren und deren Funktion in der Entstehung bzw. Progression von Hautcarcinomen aufzuzeigen. 2) Eine spezifische Aberration, die für nahezu alle Tumore gilt, ist die erhöhte Expression der Telomerase. Ziel unserer Studien ist es, die Rolle und Regulation der Telomerase und ihre Rolle in der Telomerlängenregulation bei der Hautcarcinomentstehung und in der Hautalterung zu definieren.

Erhöhte Temperatur und UV-A als potentielle „Carcinogene“ für die Entstehung von Hautcarcinomen Um die Rolle der „Umweltfaktoren“ bei der Entstehung von Hautcarcinomen experimentell untersuchen zu können, verwenden wir das von uns etablierte HaCaT in vitro Hautcarcinogenese Modell. Diese Modell repräsentiert unterschiedliche Stadien (Fusenig, N.E. Boukamp, P. Molecular Carcinogenesis, 23: 144-158 (1998)) und erlaubt es somit, gezielt Fragen zur tumorigenen Transformation oder auch malignen Konversion anzugehen. So war es uns möglich, mit Hilfe der HaCaT Zellen zu zeigen, daß Langzeitkultivierung bei 40°C statt 37°C ausreichte, um die Zellen tumorigen zu transformieren [1] d.h. nach s.c. Injektion der Zellen in Thymus-aplastische Nacktmäuse entstanden Tumore. Wie schon zuvor für HaCaT Zellen demonstriert, die das Harvey-ras Onkogen enthielten, war der Tumorphänotyp abhängig von dem Alter der Ausgangskultur (frühe versus späte Passagen der HaCaT Zellen korreliert mit benignem bzw. malignem Tumorphänotyp). Zudem wiesen die rekultivierten Tumorzellen eine erhöhte Tumorigenitätsrate auf, was für eine weitere Selektion durch die in vivo Passage spricht [2]. Mittels Vergleichender genomischer Hybridisierung (CGH) und Multiplex Fluoreszenz in situ Hybridisierung (M-FISH) der rekultivierten Tumore konnten wir zeigen, dass in allen tumorigenen Varianten eine gemeinsame genetische Aberration vorlag, nämlich eine Amplifikation von 11q13 [1]. Erste Versuche, in denen HaCaT Zellen für mehrere Wochen mit UV-A bestrahlt wurden, haben ebenfalls zur tumorigenen Transformation der Zellen geführt. Interessanterweise weisen auch diese tumorigenen Varianten einen Zugewinn von 11q13 auf. Es ist deshalb unsere jetzige Arbeitshypothese, dass erhöhte Temperatur bzw. UV-A Strahlung in den Epidermiszellen der Haut über DNA Strangbrüche für eine bestimmte Art von genetischen Schäden (Amplifikation, Deletionen, Translokation) verantwortlich sind.

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Ein erster Hinweis, daß es sich bei dem Zugewinn von 11q13 um ein für Hautcarcinome häufigeres genetisches Ereignis handelt, kamen durch die genetische Charakterisierung eines neuen in vivo Hautcarcinogenese Modells. Mit dieser, von dem selben Patienten stammenden Tumorsequenz, bestehend aus dem Primärtumor, zwei Rezidiven und einer Lymphknotenmetastase, konnten wir dann zweifelsfrei belegen, dass die Metastase genetisch aus dem Primärtumor hervorgegangen war, während sich die Rezidive parallel dazu und jeweils unabhängig voneinander entwickelt hatten [3]. Dies könnte bedeuten, daß sich die Metastase bereits sehr früh während der Tumorprogression gebildet hatte. Darüber hinaus lag auch hier ein Zugewinn von 11q13 vor und diese Aberration blieb in allen Tumorstadien erhalten, was dafür spricht, daß die Tumorzellen durch sie einen Selektionsvorteil hatten. Derzeit untersuchen wir an einer größeren Zahl von Hautcarcinomen und benignen Hauttumoren i) ob der Zugewinn von 11q13 ein generell relevantes genetisches Ereignis ist, ii) für welches Stadium der Tumorentwicklung er charakteristisch ist und iii) und welche anderen genetischen Aberrationen häufig zu beobachten sind, um damit neue diagnostische und möglicherweise prognostische Marker für die Hautcarcinogenese zu definieren.

Der angiogene Switch, eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Konversion: zur Rolle von Thrombospondin (TSP-1) Zusätzlich zur Amplifikation von 11q13, die für das uneingeschränkte Wachstum aller Tumorzellen (benigne und maligne) wesentlich ist, konnten wir den Verlust von Chromosom 15 als wichtiges genetisches Ereignis für die maligne Progression der HaCaT Zellen und der SCL-I Plattenepithelcarcinomlinie der Haut definieren. Wiedereinführung einer Kopie von Chromosom 15 in die SCL-I Zellen führte nach s.c. Injektion der Zellen in Nacktmäusen zu einer signifikanten, wenn auch temporären Tumorsuppression [4]. Als potentielles Tumorsuppressorgen identifizierten wir TSP-1, ein Matrixglycoprotein, das auf 15q15 lokalisiert ist. Überexpression dieses Gens induzierte die gleiche Tumorsuppression wie das gesamte Chromosom 15 und verursachte eine massive Ablagerung von TSP-1 Matrix an der Tumor/Stroma Grenze um den Tumor herum. Diese Matrix verhinderte das Einwachsen von Blutgefäßen und damit das Expandieren der Tumorzellen in das umgebende Stroma. Diese Tumorsuppression war aber nur temporär und nach 8-10 Wochen wurde Tumorwachstum beobachtet. Da das Tumorwachstum mit der Auflösung der TSP-1 Matrix korrelierte, ist es Ziel weiterer Studien, zu ermitteln, welche Proteasen für die Degradation verantwortlich waren und ob dieses kausal für das Tumorwachstum waren. Erste Studien zur Proteaseexpression der Tumorzellen zeigten, daß die malignen Tumorzellen signifikant mehr Proteasen exprimieren als die benignen bzw. nicht-tumorigenen HaCaT Zellen [5, 6]. Ein wesentlicher Anteil der Proteasen wird zusätzlich aber auch von den Tumor-umgebenden Stromazellen synthetisiert. Wir sind deshalb derzeit dabei die Proteaseexpression im Tumorstroma in vivo zu charakterisieren. Darüber hinaus ist aus der Literatur bekannt,

Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese daß der Transformierende Wachstrumsfaktor TGF-ß1and die TSP-1 Matrix bindet und dadurch aktiviert wird. Da TGF-β1 bekanntermaßen die Expression von Proteasen in Stromazellen induzieren kann, ist es ein weiteres Ziel unserer Studien, die Rolle der Interaktion von TGF-β1 und TSP-1 für dieses Hautcarcinogenese Modell zu ermitteln.

2. Telomeraseaktivierung eine besondere Form der genetischen Aberration: Telomerase-, und Telomerlängenregulation in normalen and transformierten humanen Keratinozyten P. Boukamp, S. Beneke, A. Cerezo, S. Ermler, K. Greulich-Bode, S. Moshir, S. Rosenberger, H. Stammer In Kooperation mit: Dr. J. R. Bickenbach, University of Iowa, Iowa City, USA; Dr. M. Hergenhahn, DKFZ; Kirsten Vang Nielsen, DAKO Dänemark, Prof. Holger Kalthoff, Universität Kiel, Prof. Sabine Werner, ETH Zürich, Schweiz

Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Das Mass der Telomerverkürzung während der zellulären Alterung ist abhängig vom Spenderalters, d.h. es muß Faktoren geben, die die Rate der Telomerverkürzung modulieren können. 2. Der Telomer-bindende Faktor TRF-2 spielt eine Rolle in der zellulären Alterung

Regulation der Telomeraseaktivität und Telomerlänge Ein Enzymkomplex, der als essentiell für das uneingeschränkte Wachstum von Tumorzellen gilt, ist der Ribonucleoproteinkomplex Telomerase. Normale Zellen verlieren Replikations-bedingt kontinuierlich Sequenzen am Ende der Chromosomen, den Telomeren und man geht davon aus, daß dieser Telomerverlust für die begrenzte Lebensspanne normaler Zellen verantwortlich ist. D.h der Verlust von Telomersequenzen ist der Zählmechanismus, die innere Uhr der „zellulären Alterung“. Würde dies auch für Tumorzellen gelten, so würden diese durch ihre Vielzahl von Teilungen eine so kritische Telomerlänge erreichen, dass dies einem Wachstumsstop und schlussendlichen das Absterben der Zellen zur Folge hätte. Telomerase ist nun in der Lage, de novo Sequenzen an die Telomere zu hängen und so eine Stabilisierung der Telomerlänge zu gewährleisten. Im Gegensatz zur ursprünglichen Annahme konnten wir aber schon sehr früh zeigen, dass Telomerase nicht nur in Tumorzellen exprimiert wird, sondern Aktivität auch in der normalen Epidermis der Haut nachweisbar ist [Härle-Bachor, C, Boukamp, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6476-6481 (1996)]. Inzwischen ist klar, dass alle regenerativen Gewebe auch im adulten menschlichen Organismus Telomerase-positiv sind [7]. In der Epidermis, wie auch in anderen Geweben, ist die Telomeraseaktivität eng mit der Proliferation verknüpft und wird mit Beginn der Differenzierung abgeschaltet. Erste Studien zur Telomeraseregulation hatten gezeigt, dass Calcium ein wichtiger Inhibitor der Telomeraseaktivität ist (Bickenbach, J.R. et al. J. Invest. Dermatol., 111: 1045-1052 (1998)).

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Die intrazelluläre Erhöhung des Calciumspiegels führt somit nicht nur zur Induktion der epidermalen Differenzierung, sondern scheint auch vorgeschaltet, die Telomeraseaktivität zu inhibieren. Wir sind derzeit dabei, den Telomerasekomplex im Detail zu charakterisieren, um die Faktoren zu identifizieren, die für die Calcium-bedingte Regulation verantwortlich sind.

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Im Gegensatz zu den Keratinozyten der Epidermis sind die Fibroblasten der Dermis Telomerase-negativ. Erwartungsgemäß findet man auch bei Langzeitkulturen eine kontinuierliche Abnahme der Telomerlänge. Überraschenderweise beobachteten wir jedoch einen vom Spenderalter abhängigen Grad des Telomerverlusts [8]. So war dieser bei Zellen von Kleinkindern deutlich vermindert und die Zellen hörten trotz relativ langer Telomere auf zu proliferieren (Seneszenz). D.h. der Grad der Telomerverkürzung kann moduliert werden und somit ist die Telomerlänge per se kein striktes Mass für die replikative Historie der Zellen. Darüber hinaus scheint auch die Telomerase der Keratinozyten nicht in der Lage zu sein, den Replikationsbedingten Telomerverlust auszugleichen. Da dies gleichermaßen für das hematopoietische System gilt, bleibt nun zu klären, warum Telomerase speziell in diesen Geweben exprimiert wird [9].

TRF2, ein wichtiger Faktor für die zellulären Alterung Ein Faktor, der bei der Telomerlängenregulation eine wichtige Rolle spielen soll und dessen Anwesenheit Voraussetzung für die Chromosomenintegität ist, ist der Telomerrepeat-bindende Faktor TRF-2. Es wird postuliert, dass TRF2 eines der Proteine ist, die das Telomerende vor Degradation schützt. Wir konnten nun zeigen, dass TRF2 im Laufe der zellulären Alterung signifikant hochreguliert wird. Dieses ist offensichtlich von funktioneller Relevanz, da Verminderung des TRF2 Spiegels in alten Zellen mittels anti-sense Oligonucleotiden zu einer verbesserten Proliferation und einer morphologischen „Verjüngung“ der Kulturen führte [8]. Wir sind deshalb derzeit dabei, die Rolle von TRF2 für die zelluläre Alterung im Detail zu charakterisieren.

Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Boukamp, P., Popp, S., Bleuel, K., Tomakidi, E., Bürkle, A., Fusenig, N.E.: Tumorigenic conversion of immortal human skin keratinocytes (HaCaT) by increased temperature. Oncogene, 18: 5638-5645 (1999) [2] 3. Müller MM, Peter W, Mappes M, Huelsen A, Steinbauer H, Boukamp P, Vaccariello M, Garlick J, Fusenig NE.: Tumor progression of skin carcinoma cells in vivo promoted by clonal selection, mutagenesis, and autocrine growth regulation by GCSF and GM-CSF. Am. J. Pathol., 159:1567-1579 (2001) [3] 4. Popp, S., *Waltering, S., *Holtgreve-Grez, H., *Jauch, A., *Proby, C., *Leigh, I.M., Boukamp, P.: Genetic characterization of a human skin carcinoma progression model: from primary tumor to metastasis. J. Invest. Dermatol., 115: 1095-1103 (2000) [4] 5. Bleuel, S., Popp, S., Fusenig, N.E., *Stanbridge, E.J., Boukamp, P.: Tumor suppression in human skin carcinoma cells by chromosome 15 transfer or TSP-1 overexpression through halted tumor vascularization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 2065-2070 (1999) [5] 6. *Bachmeier, B.E., *Nerlich, A.G., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., *Tschesche, H., *Fritz, H., *Fink, E.: Human keratinocyte cell lines differ in the expression of the collagenolytic matrix metalloproteinases-1,-8, and -13 and of TIMP-1. Biol Chem. 381: 509-516 (2000) [6] 7. *Bachmeier, B.E., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., Fusenig, N.E., *Fink, E.: Matrix metalloproteinases-2,-3,-7,-9 and10, but not MMP-11, are differentially expressed in normal, benign tumorigenic and malignant human keratinocyte cell lines. Biol. Chem. 381: 497-507 (2000) [7] 9. Bachor, C., *Bachor, O.A., Boukamp, P.: Telomerase is active in normal gastrointestinal mucosa and not upregulated in precancerous lesions. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: 453-460 (1999) [8] 11. Figueroa, R., Lindenmaier, H., Hergenhahn, M., *Vang Nielsen, K., Boukamp, P.: Telomere erosion varies during in vitro aging of normal human fibroblasts from infant and adult donors. Cancer Res. 60: 2770-2774 (2000) [9] 12. Boukamp P.: Ageing mechanisms: the role of telomere loss. Clin Exp Dermatol. 26:562-565 (2001)

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

R0400 Zentrale Spektroskopie

Zentrale Spektroskopie (R0400) Leiter: Dr. William E. Hull, Spezialist für Kernspinresonanz (NMR) Wissenschaftliche Mitarbeiter Prof. Dr. Wolf-Dieter Lehmann, Spezialist für Massenspektrometrie (MS) Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth, Spezialist für EDV und Modeling Technisches Personal Gabriele Schwebel-Schilling (04.92 -), CL für NMR-Dienstleistung Gerhard Erben (08.93 -), CTA für Dienstleistung (IR, UV, MS) und Methodenentwicklung (MS, HPLC) Sekretariat Sabrina Zahner (1/2) Im Zeitraum 2000-2002 waren folgende zusätzliche Personen über Haus- oder Drittmittel-Zeitverträge (H oder D) in der ZS an verschiedenen Forschungsprojekten tätig: Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Dieter Albert (D 09/98 - 12/00; H 01/01 - 12/02) Dr. Andreas Bohne-Lang (D 01/01 - 12/02) Dr. Martin Frank (D 06/01 - 05/03) Gastwissenschaftler Jaroslav Tóth, Lehrstuhl für Pharmakognosie und Botanik, Fakultät für Pharmazie, Comenius Universität, Bratislava, Slowakische Republik (DFG-Stipendium für Netzbasierte Forschungskooperationen: 10 - 12/01) Doktoranden Andreas Bohne (D - 12/00) Klaus Lohmann (D 05/01 - ) Alexander Loß (D 01/01 - ) Thomas Lütteke (H 10/01 - ) Mogjiboraliman Salek (H 02/01 - ) Andreas Schlosser (H - 03/02; mit Abt. B0100) Mathias Wind (H 01/00 -) Technisches Personal Gerda Baumann, CTA (D 06/98 - 12/00, 1/2)

Neben der vielfältigen analytischen Dienstleistung (Auftragsmessungen zur Bestätigung bzw. Aufklärung von Molekülstrukturen mittels NMR, IR, UV, und MS) wird in der Zentralen Spektroskopie (ZS) an die Einführung bzw. Entwicklung neuer Meß- bzw. Analyse-Verfahren und ihre Anwendung in der Krebsforschung intensiv gearbeitet. Diese Methoden werden bei eigenständigen bzw. kooperativen Forschungsaktivitäten in den Bereichen Biochemie, molekulare Struktur, Dynamik, und Wechselwirkung, sowieTumormetabolismus und Tumortherapie eingesetzt. Die Schwerpunkte der MS-Anwendungen liegen in Protein- und Peptidanalytik mit nano- bis picomol Mengen (präzises Molgewicht, Charakterisierung mittels eines enzymatischen Verdau, Sequenzierung, Bestimmung von Phosphorylierung und anderen post-translationalen Modifikationen) sowie quantitative Bestimmung von zellulären Phospholipidenprofilen. Mit der Hochfeld-MR-Spektroskopie wird die Entwicklung neuartiger Pharmaka und die Identifikation von Naturstoffen mit krebspräventiver Wirkung unterstützt. Mit der 31 P-MR-Spektroskopie werden metabolische Eigenschaften von Tumorzellen in Kultur sowie in vivo (Tiermodell) untersucht (Korrelation des Tumorwachstum mit Phospholipid-Metabolitenprofilen). Die nichtinvasive Hochfeld-MR-Bildgebung wird eingesetzt, um das Wachstum von Tumoren und Metastasen in inneren Organen von tumortragenden Mäusen zu visualisieren und die Wirkung einer Therapie zu untersuchen. Im Internet-Zeitalter ist die Bereitstellung von spektroskopischen Daten und Molekülstrukturen in Form von „benutzerfreundlichen“ Datenbanken und Informationssystemen eine zunehmend wichtige Arbeit. Schwerpunkte in „molecular modeling“ sind die Oligosaccharide (Konformation und Dynamik), Glykoproteine, sowie Protein-Oligosaccharide-Wechselwirkungen (Lektine, Virusinfektion) und die Entwicklung neuer Pharmaka. Die Forschungsaktivitäten der ZS sind in vier Bereichen gegliedert, die im Folgenden näher beschrieben werden. Unsere Internet-Addresse: http://www.dkfz-heidelberg.de/zspek/zshome.htm

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

Entwicklung von WWW-basierten Anwendungen und Datenbanken für strukturbiologische Fragestellungen (Schwerpunkt Glykobiologie) (R0401) C.-W. von der Lieth, A. Bohne-Lang, K. Lohmann, A. Loß

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In Zusammenarbeit mit: Prof. E. Schwarzer, Universität Hildesheim; Prof. Dr. E. Lang, Fachhochschule Darmstadt; Prof. Dr. R. Geyer, Universität Giessen; PD. Dr. U. Zähringer, Forschungszentrum Borstel. Zusatzfinanzierung: DFG-Projekt (D376); Konzeption und Entwicklung einer Web-basierten Arbeitsumgebung von glykowissenschaftliche Fragestellungen und Bereitstellung von fachbasierten Informationsangeboten; für C.-W. von der Lieth; 1 Postdoc (A. Bohne-Lang), 2 Doktoranden (A. Loß, K. Lohmann) 01.01.01 31.12.02.

Die rasche Entwicklung der Möglichkeiten des Internet hat sowohl die Art und Weise, wie Wissenschaftler weltweit miteinander kommunizieren als auch die Möglichkeiten der wissenschaftlichen Informationsbeschaffung entscheidend verändert. Über das WWW sind jetzt auch viele Datenbanken mit strukturellen, biologischen und spektroskopischen Daten mittels standardisierter, graphisch orientierter Benutzerführungen verfügbar. Vorteile sind: der Zugriff auf die aktuellsten Daten, eine für viele Anwendungen sehr ähnliche, graphisch orientierte und intuitiv bedienbare Benutzeroberfläche sowie eine weitgehende Unabhängigkeit von der jeweils vorhandenen Hardware-Konfigurationen, so daß die Anwendungen von praktisch jedem Arbeitsplatzrechner aus durchgeführt werden können. Die inhaltliche Verknüpfung von verteilten, wissenschaftlichen Datenbanken, die im Bereich der biologischen Makromoleküle zumeist über die Sequenzinformation realisiert wird, erlaubt mit hoher Effizienz und aus unterschiedlichen und weltweit verteilten Quellen die rasche Zusammenführung von Informationen, die zu einem Molekül gehören. Aus diesen Gründen sondieren und testen wir kontinuierlich die über das WWW verfügbaren Angebote an spektroskopischen, strukturellen und biologischen Daten und machen sie in Form von Linksammlungen verfügbar [1]. Als Schwerpunkt betreiben wir eigenständige Entwicklungen im Bereich der Glykobiologie, in dem bisher nur wenige Angebote weltweit verfügbar sind [2]. Da Oligosaccharide wesentlich komplexere Strukturen bilden (unterschiedliche Verknüpfungen der Residuen, Verzweigungen) als Oligonukleotide bzw. Proteine, erwies es sich als notwendig, eine einfache, eindeutige lineare Codierung von Kohlenhydratenstrukturen abzuleiten, die der üblichen Sprache der Glykowissenschaftler sehr nahe kommt und die eine einfache Verknüpfung von Einträgen in verschiedenen, verteilten Datenbanken ermöglicht [3] (LINUCS : LInear Notation for Unique description of Carbohydrate Sequences. www.dkfz.de/spec/ linucs/). Exemplarisch wurde die Verwendung der LINUCS-Codierung in der SWEET-DB [4] realisiert (www.dkfz.de/spec/sweetdb) in der momentan Daten aus vier verschiedenen Quellen miteinander über die chemische Struktur miteinander verknüpft werden.

R0400 Zentrale Spektroskopie Oligosaccharide sind hochgradig flexible Verbindungen. Während das Programm SWEET-II die Erzeugung einer möglichen Konformation eines Oligosacchariden erlaubt, kann die Anwendung GLYDICT [5,6] (www.dkfz.de/spec/ glydict/) ein komplettes Ensemble von möglichen Konformationen von N-Glykanen berechnen. Dieses Verfahren beruht auf einem wissensbasiertem Ansatz, bei dem zunächst der konformationelle Raum aller Teilstrukturen (Tri-, Tetra- und Pentasaccharide), aus denen sich N-Glykane aufbauen lassen, durch Langzeit-Molekulardynamik Simulationen systematisch abgetastet werden. Die erhaltenen Konformationskarten für jede glykosidische Bindung im Oligomer werden analysiert und für jeden stabilen Konformer die entsprechende Torsionswinkeln und dazugehörenden Energien in der Wissensbasis abgelegt. Die erzeugten 3D-Strukturen können mittels eines automatisch auf dem lokalen Rechner startenden Programms (Plugins) visualisiert und abgespeichert werden. Ein Algorithmus, der die automatische Verknüpfung der generierten N-Glykan Strukturen mit bestimmten Glykosylierungstellen eines Protein vornimmt (siehe Abb. 1), befindet sich in der Entwicklung [7]. Weitere seit längeren verfügbare und weltweit intensiv genutzte Anwendungen sind: SWEET-II: Erzeugung von verläßlichen räumlichen Strukturen für Oligosacchariden auf der Basis der in der Literatur standardisierten Schreibweise für Kohlenhydratketten (www.dkfz.de/spec/sweet2). PDB2MultiGIF: Darstellung von sich bewegenden bzw. drehenden Molekülen in Standard Web-Browsern. (www.dkfz-heidelberg.de/spec/pdb2mgif/)

Abb. 1: In silico Glykosylierung eines Proteins. Laut Röntgenstruktur hat die Neuraminidase Hemaglutin (Influenza Virus, PDB-Eintrag 1INY) drei Glykosylierungsstellen, aber die Röntgen-Diffraktionsdaten reichen nicht, um die gesamten Zuckerketten darzustellen. Daher wurden neun repräsentativen N-Glykanstrukturen (Konformationen) mit dem Programm GLYDICT erzeugt und an einem der Glykosylierungsstellen verknüpft. Die relativ starre Proteinteile der Strukturen (Band Darstellung links) wurden genau überlagert, so daß der erreichbare konformationelle Raum der flexiblen N-Glykanstrukturen (Stabmodell rechts) dargestellt wird.

GLYPEPS: nutzt die Möglichkeiten mittels MALDI-TOF und ESI MS-Techniken, die Präzisionsmassen von Pep-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation tiden mit hoher Genauigkeit bestimmen zu können, und verwendet die Information zur Auffinden Peptidmodifikationen (z.B. Glykosylierungen).(www.dkfz.de/spec/glypeps) Die aktuelle Nutzungsstatistiken unserer WWW-Datenbanken und Anwendungen können abgerufen werden unter (http://www.dkfz.de/spec/statistik/). In den Jahren 2000/ 2001 hatten wir im Durchschnitt täglich mehr als 500 Aufrufe mit steigender Tendenz zu verzeichnen. Es ist geplant, weitere Anwendungen über WWW-basierte Zugriffe verfügbar zu machen. Dies gilt insbesondere für die den Bereich glykowissenschaftlicher Fragestellungen. Mit unseren WWW-basierten Anwendungen im Bereich der Glykobiologie beteiligen wir uns an dem US amerikanischen Consortium for Functional Glycomics (glycomics.scripps.edu/). Ziel dieses Konsortiums ist, die Funktion von kohlenhydrat-bindenden Proteine bei der inter- und intrazellulären Kommunikation bzw. Signaltransduktion zu entschlüsseln. Aufbauend auf unseren Methoden verschiedene Datenbanken über eine eindeutige Strukturbeschreibung der Kohlenhydrate zu verknüpfen, sind wir intensiv an der konzeptionelle Arbeit für die neu zu schaffenden Datenbanken des Konsortiums beteiligt. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Bohne, A.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: Molecular visualization programs on the web. Drugs of the Future 25 (2000) 489500. [2] Bohne, A.; *Wetter, T.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: Glykowissenschaften, ein neuer Einsatzbereich in der Bioinformatik. In: Informatik 2000 - Neue Horizonte im neuen Jahrhundert. K. Mehlhorn, G. Snelting (Eds.), Springer, Berlin, pp. 181-196 (2000). [3] von der Lieth, C.-W.; Expanding Proteomics to Glycobiology, In: Pacific Symposium on Biocomputing, Vol 7. R.B. Altman, A.K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale T.E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp. 283-284. [4] Bohne-Lang, A.; *Lang, E.; *Forster, T.; von der Lieth, C.-W.: LINUCS: Linear Notation for Unique Description of Carbohydrate Sequences. Carbohydrate Res. 336 (2001) 1-11. [5] Loss, A.; *Bunsmann, P.; Bohne, A.; *Loss, A.; *Schwarzer, E.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: SWEET-DB: an attempt to create annotated data collections for carbohydrates. Nucleic Acids Res. 30 (2002) 405-408. [6] Bohne, Andreas: Ein wissensbasiertes System zur schnellen Erzeugung von 3D-Strukturen biologisch relevanter N-Glykane sowie ihrer mimikrierenden Glykoclusterstrukturen. Dissertation: Medizinischen Fakultät, Univ. Heidelberg (2001). [7] Bohne A. and von der Lieth, C.-W.: Glycosylation of proteins: a computer-based method for the rapid exploration of the comformational space of N-Glycans. In: Pacific Symposium on Biocomputing, Vol 7. R.B. Altman, A.K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale T.E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp. 285-296.

Methodenentwicklung und Anwendung der Massenspektrometrie in der Krebsforschung (R0402) W.D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind, A. Salek, G. Erben In Zusammenarbeit mit: D. Bossemeyer, D. Kübler, V. Kinzel, H. Wesch, A. Alonso, G. Füstenberger, F. Marks, D. Keppler, M. Eisenhut, A. Bohne, W. von der Lieth, R. Pipkorn (DKFZ). B. Brügger, J. B. Helms, F. Wieland, Biochemiezentrum, Universi-

R0400 Zentrale Spektroskopie tät Heidelberg; E. Mayatepek, Kinderklinik, Universität Heidelberg; N. Jakubowski, Inst. f. Angewandte Spektroskopie (ISAS), Dortmund; M. Linscheid, Humboldt-Universität Berlin; E. Nigg, MPI für Biochemie, Martinsried.

Polare Lipide und speziell modifizierte Proteine sind essentielle Bestandteile von zellulären SignalübertragungsProzessen (Kaskaden) und kontrollieren damit zahlreiche zentrale Zellfunktionen. Ihre molekulare Charakterisierung und Quantifizierung ist daher ein essentieller Baustein bei der Erforschung ihrer Funktionen. Aufgrund der technologischen Fortschritte sind in den letzten Jahren viele Signal-aktive Verbindungen der direkten molekularen Analytik mit Massenspektrometrie zugänglich geworden, so daß diese Technik mittlerweile die Methode der Wahl für die Spurenanalytik von polaren Lipiden und modifizierten Peptiden/Proteinen darstellt. Wir haben im Berichtszeitraum dazu die folgenden Ergebnisse erarbeitet.

Analytik Polarer Lipide Hochempfindliche Charakterisierung und Quantifizierung von oxidierten Lipiden in Körperflüssigkeiten [1,2], in in vitro Lipoxygenase-Assays [3] sowie von Membranlipiden [4]. Diese Arbeiten wurden mit Electrospray (ESI) Tandem MS-Methoden durchgeführt, die zuvor überwiegend im eigenen Labor entwickelt wurden. Damit gelingt es z.B. in Membranen von isolierten Zellorganellen, das Cholesterin/ Sphingomyelin-Verhältnis zu bestimmen [4], ein analytischer Parameter bei der Charakterisierung z.B. von sogenannten lipid rafts in Zellmembranen. Weiter wurde mit diesen Methoden eine Strukturanalytik von iodierten lipophilen nuklearmedizinischen Markern durchgeführt [5].

Erkennung und Lokalisation von kovalenten Proteinmodifikationen Theoretische und Mechanistische Arbeiten Bestimmte kovalente Proteinmodifikationen wie Glykosylierung oder Lipidierung sind anhand der Präzisionsmasse eines entsprechend modifizierten Peptidfragments erkennbar. Dieses Phänomen wurde beschrieben und eine Internet-Suchmaschine zur Erkennung abweichender PeptidPräzisionsmassen geschaffen [6]. Bei Kollisions-induziertem Zerfall von modifizierten Peptiden in der Tandem Massenspektrometrie (die MS-Methode zur Strukturanalytik) wurde die Bildung von 5-Ring Strukturen als zentrales Element bei vielen Schlüsselfragmentierungen erkannt [7]. Isoaspartat-Bildung und Racemisierung Die Isoaspartat-Bildung ist eine weit verbreitete spontan ablaufende kovalente Proteinmodifikation, die mit zunehmender Proteinalterung zunimmt und in der Regel zu Funktionsbeinträchtigung oder Funktionsverlust des Proteins führt. Bislang sind nur wenige Analysenmethoden zur Analytik von Isoaspartat in Proteinen verfügbar. Wir haben die Tandem Massenspektrometrie als neue Methode für diesen Zweck erfolgreich eingesetzt [8] und in Rinder-Proteinkinase A neben der Isoaspartat-Bildung am N-terminus zusätzlich eine Racemisierung von L-Aspartat zu D-Aspartat nachweisen können [9]. N-terminale Myristoylierung Eine N-terminale Myristoylierung konnte mit Tandem MSMethoden an einem Golgi-Membranprotein (rekombinant und nativ) eindeutig nachgewiesen werden [10].

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation N-terminale Oxalyl-Modifikation Eine Sauerstoff-induzierte Proteinspaltung mit Nachweis einer N-terminalen Oxalyl-Modifikation am abgespaltenen Peptid-Bruckstück wurde mit Tandem MS nachgewiesen [11].

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Phosphorylierung Die reversible Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der häufigsten und funktionell wichtigsten kovalenten Proteinmodifikationen. Die Verbesserung der Analytik der Proteinphosphorylierung und deren Anwendung steht seit einigen Jahren Im Mittelpunkt unserer Forschungsaktivitäten. Eine vollständige Erfassung aller Phosphorylierungsstellen der Proteinkinase A wurde durch Kombination von Tandem Massenspektrometrie und proteolytischem Abbau durch Elastase erreicht [12]. Der Neutralverlust-Scan Modus wurde systematisch für den Nachweis von Serin- und Threonin-Phosphorylierung optimiert [12]. Die Element-Massenspektrometrie mit Phosphor-Detektion wurde als neue Methode zum Nachweis von Phosphopeptiden eingeführt und erprobt [13]. Mit gleichzeitiger Bestimmung von Schwefel und Phosphor wurde der Phosphorylierungsgrad von Phosphoproteinen bestimmt [14]. Mittlerweile wurde diese neue Methodik zur Charakterisierung bislang unbekannter Phosphorylierungsstellen eingesetzt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Uemura, M.; Lehmann, W.D.; *Schneider, W.; *Seitz, H.K.; Benner, A.; *Keppler-Hafkemeyer, A.; *Hafkemeyer, P.; *Kojima, H.; *Fujimoto, M.; *Tsujii, T.; *Fukui, H.; Keppler, D.: Enhanced urinary excretion of cysteinyl leukotrienes in patients with acute alcohol intoxication. Gastroenterology 118 (2000) 1140-1148. [2] *Mayatepek, E.; *Zelezny, R.; Lehmann, W.D.; *Hammond, J.W.; *Hoffmann, G.F.: Defects of the synthesis of cysteinyl leukotrienes: a new group of inborn errors of metabolism. J. Inherit. Metab. Dis. 23 (2000) 404-408. [3] Siebert, M.; Krieg, P.; Lehmann, W.D.; Marks, F.; Fürstenberger, G.: Enzymic characterization of epidermis-derived 12lipoxygenase isoemzymes. Biochem J. 355 (2001) 97-104. [4] *Brügger, B.; *Sandhoff, R.; *Wegehingel, S.; *Gorgas, K.; *Malsam, J.; *Helms, J.B.; Lehmann, W.D.; *Nickel, W.; *Wieland, F.T.: Evidence for segregation of sphingomyelin and cholesterol during formation of COPI-coated vesicles. J. Cell Biol. 151 (2000) 507-517. [5] Eisenhut, M.; Hull, W.E.; *Mohammed, A.; *Mier, W.; Lay, D.; *Just, W.; *Gorgas, K.; Lehmann, W.D.; Haberkorn, U.: Radioiodinated N-(2-diethylaminoethyl)benzamide derivatives with high melanoma uptake: structure-affinity relationships, metabolic fate, and intracellular localization. J. Med. Chem. 43 (2000) 3913-3922. [6] Lehmann, W.D.; Bohne, A.; von der Lieth, C.-W.: The information encrypted in the accurate mass of peptides improved protein identification and assistance in glycopeptide identification and characteriization. J. Mass Spectrom. 35 (2000) 1335-1341. [7] Schlosser, A.; Lehmann, W.D.: Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low-energy collision-induced dissociation of peptides. J. Mass Spectrom. 35 (2000) 1382-1390. [8] Lehmann, W.D.; Schlosser, A.; Erben, G.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Kinzel, V.: Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Prot. Sci. 9 (2000) 22602268.

R0400 Zentrale Spektroskopie [9] Kinzel, V.; König, N.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Lehmann, W.D.: The amino terminus of the PKA catalytic subunit - a site for introduction of postranslational heterogeneities by deamidation: DAsp2 and D-isoAsp2 containing isozymes. Prot. Sci. 9 (2000) 2269-2277. [10] *Eberle, H.B.; *Serrano, R.L.; *Radke, S.; *Füllekrug, J.; Schlosser, A.; Lehmann, W.D.; *Lottspeich, F.; *Kaloyanova, D.; *Wieland, F.T.; *Helms, J.B.: Identification and characterization of a novel human plant-pathogenesis related protein that localizes to lipid-enriched microdomains in the Golgi complex, J. Cell Sci. 115 (2002) 827-838. [11] *Wagner, A.F.V.; *Schultz, S.; *Bomke, J.; *Pils, T.; Lehmann, W.D.; *Knappe, J.: YfiD of E. coli and Y061 of bacteriophage T4 as autonomous glycyl radical cofactors reconstituting the catalytic center of oxygen-fragmented pyruvate formate-lyase. Biochem. Biophys. Res . Commun. 285 (2001) 456-462. [12] Schlosser, A.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Lehmann, W.D.: Analysis of protein phosphorylation by combination of elastase digestion and neutral loss tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) 170-176. [13] Wind, M.; *Edler, M.; *Jakubowski, N.; *Linscheid, M.; Wesch, H.; Lehmann, W.D.: Analysis of protein phosphorylation by capillary liquid chromatography coupled to element mass spectrometry with 31P detection and to electrospray mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) 29-35. [14] Wind, M.; Wesch, H.; Lehmann, W.D.: Protein phosphorylation degree - Determination by capillary liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) 3006-3010.

Methodische Entwicklung und Anwendung der Hochfeld-Kernmagnetischen-Resonanz(MR)-Spektroskopie und Bildgebung (R0403) W.E. Hull, D. Albert In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, R. Owen, H. Bartsch, J. Debus, P. Krammer, H. Walczak, R. Pipkorn (DKFZ); M. Eisenhut, Abt. Nuklearmedizin der Universität Heidelberg; S. Lebedkin, Forschungszentrum Karlsruhe; T.K. Lindhorst, Universität Hamburg; H. Kunz, Universität Mainz; I. Walter-Sack, Innere Medizin VI, Klinische Pharmakologie und Pharmakoepidemiologie, Universitätsklinikum Heidelberg. Zusatzfinanzierung: BMBF Glycobiotechnology Program (B256); Synthese und Molekulardynamic neuer Saccharid-basierten Dendrimere als Basis für neue Medikamente; für C.-W. von der Lieth und W.E. Hull in Kooperation mit M.Wießler (DKFZ) and Beiersdorf AG; 1 Postdoc (D. Albert), 1/2 CTA (G. Baumann), 01.01.98 - 31.12.00.

In der ZS werden die MR-Forschungsaktivitäten mittels drei Großgeräten durchgeführt: ein 14-Tesla 4-Kanal Spektrometer (600 MHz 1H-Frequenz), hauptsächlich für Strukturforschung im Bereich Proteomics und Glycomics; ein 11,7-Tesla Spektrometer (500 MHz 1H-Frequenz) für die analytische in vitro NMR-Spektroskopie (MRS); ein multifunktionelles 7,0-Tesla System mit 15-cm Magnetbohrung für in vitro Analytik, z.B. an Bioflüssigkeiten, und in vivo MRS und MR-Bildgebung am Tiermodell. Für die routine MR-Analytik steht ein 5.8-Tesla (250 MHz) Gerät zur Verfügung. Die sogenannte in vitro MRS wird für analytische Aufgaben und Molekül-Strukturforschung eingesetzt; sie befaßt sich üblicherweise mit reinen Substanzen in Lösung, Chromatographie-Fraktionen oder Reaktionsgemischen. Es können aber auch biologische Flüssigkeiten wie Urin und

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Plasma (Pharmakokinetik-Studien) oder Suspensionen intakter Zellen bzw. Zellextrakte untersucht werden. Die sogenannte in vivo MRS wird hauptsächlich für nichtinvasive metabolische Untersuchungen an soliden Tumoren im Tiermodell eingesetzt. Mit MR-Bildgebung kann das Wachstum von Tumoren bzw. Metastasen im lebenden Tier visualisiert werden. Einige der aufwendigeren kooperativen Forschungsprojekte, die über die Routine-Analytik hinausgehen, werden im Folgenden beschrieben.

Struktur-Analytik mittels MRS In verschiedenen Kooperationen wurden die Methoden der hochauflösenden 1H- und 13C-MRS intensiv für die Strukturbestimmung und Charakterisierung einzelner Moleküle eingesetzt.

R0400 Zentrale Spektroskopie Projekt war die Bestimmung der für die immunogene Wirkung wichtigen konformationellen Eigenschaften des 12mer MUC1-Peptides mittels zweidimensionaler 1H-NMR Messungen bei 500 MHz und Molecular Modeling. Dazu wurde ein Sialyl-GalNAc-O-Threonin-Derivat dieses Peptids auch untersucht. Die Ergebnisse der Studie (die noch zu veröffentlichen sind) zeigen, daß der MUC1-Peptid eine offene, relativ flexible Struktur besitzt, ohne Bevorzugung einer bestimmten Konformation. Dagegen zeigt das glykosylierte Peptid eine deutlich eingeschränktere Konformation, insbesondere um die Glykosylierungsstelle, (eine geknickte Struktur mit zwei „half turns“). Diese letzteren Eigenschaften könnten für die immunogene Wirkung des Vakzins von Bedeutung sein (siehe Abb. 2).

Fulleren-Chemie. Fullerene sind exotische KohlenstoffMoleküle, die auf mögliche Anwendungen in der Nanotechnologie und Pharmakologie intensiv untersucht werden. Die wichtigsten analytischen Techniken sind Ramanund 13C-NMR-Spektroskopie. Eine dreijährige Kooperation mit dem MPI für Kernphysik, der Universität Heidelberg, und das Forschungszentrum Karlsruhe ging vorläufig zu Ende mit einer Arbeit über den C70-Dimer C140 [1]. Neue Radiodiagnostika. Die Früherkennung von aggressiven, metastasierenden Krebserkrankungen bleibt ein wichtiges Ziel der Diagnostik. Weil Hautkrebs (Melanom) eine steigende Frequenz in der Bevölkerung zeigt, wird intensiv an die Entwicklung neuer melanom-spezifischer Radiodiagnostika für den Nachweis von Tumoren und Metastasen mittels bildgebender Verfahren wie Szintigraphie und SPECT (single-photon emission computed tomography). In der Abt. Nuklearmedizin der Universität Heidelberg wurden eine Reihe neuer radioiodinierter N-(2-Diethylaminoethyl)-Benzamid-Derivate entwickelt und ihre Aufnahme in Melanom-Gewebe untersucht. Für die Charakterisierung und Strukturbestätigung der verschiedenen Substanzen wurden zahlreiche 1H- und 13C-NMR-Spektren analysiert [2]. MGMT Inhibitoren. Eine große Reihe potentieller Inhibitoren des DNA-Repair Proteins O6-Methylguanin-DNAMethyltransferase (MGMT) wurden synthetisiert (Abt. Wiessler, C0300); die Strukturen und ihre Reinheit wurden durch NMR charakterisiert, und ihre in vitro Aktivitäten wurden getestet [3]. Zu dem wurden ausführliche Molekular-Dynamik Studien (siehe R0404 unten) der Protein-Inhibitor-Komplexe unternommen, um die Struktur-Aktivitätsbeziehungen aufzuklären. Die effektivste Substanzen waren ω-[O6-Bromthenyl-Guan-9-yl]-(CH2)n -β-D-Glucoside mit n = 8,10,12. Entwicklung eines synthetischen Antitumorvakzins. In der Arbeitsgruppe von H. Kunz (Uni Mainz) wird ein 12-mer Peptid, GVTSAPDTRPAP, einer Teilsequenz der tumorassoziierten Glykopeptid MUC1 (überexprimiert bei Epithelkarzinomen), über einem Alkyläther-Spacer mit einem T-Zell-Epitop YSYSPFV gekoppelt. Das Konjugat soll eine tumorspezifische T-Zell-Proliferation stimulieren, d.h. als synthetisches Vakzin wirken. Unser Beitrag zu diesem

Abb. 2: Energie-minimierte und durch NMR bestätigte Struktur des glykosylierten MUC1-Peptides mit Wasserstoffbrücken in den „half-turns“ T1-A3 und D5-R7; P4-P10 ist das antigene Epitop.

Chemoprävention Krebspräventive Substanzen in Olivenöl. Das Ernährungsschema im Mittelmeerraum (hohe Anteile von Früchten, Gemüse, Fisch, und Olivenöl) bietet, laut Statistik, eine breite protektive Wirkung gegen Krebs (insbesondere Kolorektalekarzinom und Mammakarzinom) und HerzKreislauf-Erkrankungen. Es gibt zunehmende Hinweise, daß Olivenöl, insbesondere das kaltgepresste „extravirgin“ Produkt, eine große gesundheitsfördernde Rolle spielen kann [4]. In der Abt. Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200: Abt. Bartsch, Gruppe Owen) wird die chemopräventive Wirkung des Mittelmeerdiäts untersucht, und seit 1998 wird die MR-Analytik intensiv eingesetzt, um eine detaillierte Bestandsaufnahme der Antioxidantien (Phenole und Derivate) in Olivenöl zu erstellen [5,6]. Es könnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß, zusätzlich zu den einfachen Phenolen und Secoiridoiden, auch die Lignane (+)-1Acetoxypinoresinol and (+)-Pinoresinol als Hauptkomponenten in nativem Olivenöl vorhanden sind [7]. Die Lignane wirken protektiv gegen Brust-, Kolon-, und Prostatakrebs, sind aber nicht in raffiniertem Olivenöl oder anderen Kern-Ölen vorhanden. Neben Olivenöl wurde das Olivenfruchtfleisch (brined olive drupes) auch untersucht. Durch die NMR-Analytik konnten mehrere phenolische Antioxidantien identifiziert werden [8]. Grüne Oliven enthalten hauptsächlich Hydroxytyrosol während schwarze Oliven eine Vielzahl von interessanten

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Verbindungen aufweisen (Abb. 3): die einfache Phenole tyrosol, dehydrocaffeic acid, dehydro-p-coumaric acid; das Disaccharid Acteosid, sowie die Flavonoide Luteolin und Apigenin. Die Konzentrationen dieser potentiell krebspräventiven Substanzen waren im Fruchtfleisch sogar höher als in den entsprechenden geernteten Ölen. Zimtsäure ist auch ein wichtiger Inhaltstoff in Früchten, Gemusen und chinesischen Medikamenten und zeigt protektive Wirkung gegen reaktiver Sauerstoff in in vitro Assays. Die resultierende hydroxylierten Spezies (Coumarinsäuren) wurden mittels NMR identifiziert.

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Glykobiotechnologie: Thioharnstoff-ZuckerDerivate Die Entdeckung von Harnstoff-gekoppelten Sacchariden in Breitbandantibiotika hat das Interesse an diesen Substanzen und ihren Schwefel-Analoga (Thioharnstoff-Derivaten) geweckt. Solche Moleküle haben interessante chemische und biologische Eigenschaften und können als Bausteine für multivalente Glykodendrimere dienen. Die Thioharnstoff-Verbindungen R-NH-C(=S)-N’H-R’ besitzen N-C und C-N’ Bindungen mit Doppelbindungscharakter (eingeschränkte Rotation) so daß vier Kombinationen von cis (E) oder trans (Z) Bindungen möglich sind (EE, EZ, ZE, ZZ). Die Populationen der verschiedenen Thioharnstoff-Isomeren (Konformationen) sind abhängig von den Substituenten R und R’ (z.B. Methyl, Phenyl, Glucosyl, Mannosyl, usw.), der Temperatur und dem Lösungsmittel und beeinflussen daher die chemischen Reaktionen dieser Substanzen.

R0400 Zentrale Spektroskopie die EE Form auch beobachtet; bei R,R’ = Ethyl oder Phenyl wurde ZZ statt EE als zweite Konformation festgestellt. In einer Kooperation mit T.K. Lindhorst (Uni. Kiel) wurden verschiedene C1-Thioharnstoff-Zucker-Derivate mit der Struktur Pyranose-NH-C(=S)-N’H-R’ mit ein- und zweidimensionaler MRS untersucht (Pyranose = 2,3,4,6-Tetra-Oacetyl Glucose, Mannose, oder Galactose). Bei α-Mannose mit Thioharnstoff in axialer Position wird die EZ Konformation bevorzugt aber EE und ZE wurden auch nachgewiesen. Besonders interessant ist die Tatsache, daß bei ZE die Mannose-Ringkonformation von der gewöhnlichen 4 C1 Sesselform in den selten beobachteten 1C4 Sessel mit equatorialem Thioharnstoff umklappt. Um den stereoelektronischen Effekten hinter diesem Verhalten besser zu verstehen wurden intensiven Molecular Modeling Studien (semi-empirischen sowie ab initio Methoden) durchgeführt - u.a. unter die Nutzung der erweiterten Parallelrechner-Kapazitäten der ZDV. Die Arbeiten an diesem Projekt sind weitgehend abgeschlossen und die Ergebnisse werden im Jahr 2002 veröffentlicht. 19

F-MR-Studien zur Fluorpyrimidin-Chemotherapie Fluorpyrimidin Chemotherapie (z.B. mit 5-Fluoruracil, 5-FU) ist eine der ältesten aber noch weitverbreiteten Behandlungsmethoden, insbesondere für Kolonkarzinom und Lebermetastasen. 19F-MRS bietet die einmalige Möglichkeit die zahlreichen Metaboliten eines Medikamentes wie Fluoruracil z.B. in Blutplasma, Urin, oder Tumorgewebe nachzuweisen und zu quantifizieren. Mehrere Studien dieser Art wurden seit 1986 in der Abteilung erfolgreich durchgeführt. Nach einem Hilferuf aus der Pharmakologie der Universitätsklinikum Heidelberg, haben wir unsere Erfahrung und Meßmethodik zur Verfügung gestellt, um zum ersten Mal eine detaillierte Pharmakokinetik für 5-FU in Blutplasma bei einem Krebspatient mit terminaler Niereninsuffizienz (Hämodialyse-Patient) aufzuzeichnen [9]. Die Behandlung solcher Patienten ist äußerst schwierig weil sie, durch die fehlende Nierenfunktion, keine selbständige Ausscheidung (Clearance) der anfallenden, zum Teil giftigen 5-FU Metaboliten zeigen und daher sehr anfällig für systemische toxische Nebenwirkungen sind.

Abb. 3: Wichtige Antioxidantien im Fruchtfleisch von schwarzen Oliven.

Eine Reihe Modellsubstanzen mit R,R’ = Methyl, Ethyl, oder Phenyl wurden mittels 1H- und 13C-MRS untersucht. Bei Temperaturen unter -50°C ist die Umwandlung der Isomeren langsam, so daß einzelne Konformationen nachweisbar sind. Bei den symmetrischen Molekülen mit R,R’ = Methyl wird die EZ = ZE Konformation (bevorzugt) aber

Die NMR-Daten zeigten, daß nach 5 täglichen Bolus-Infusion von 5-FU, und trotz Hämodialyse jeden zweiten Tag, bedenklich hohe Konzentrationen von dem Hauptkatabolit α-Fluor-β-Alanine (FBAL) in Plasma erreicht wurden. Auch eine Langzeitinfusion führte zu einem sehr hohen FBALSpiegel. Nach weitergehenden NMR-Analysen konnte sogar die FBAL-Metaboliten Fluorhydroxypropionsäure (FHPA) und das Neurotoxin Fluoracetat (FAC) in mikromolare Konzentrationen (Abb. 4) bei den zwei bis jetzt untersuchten Patienten nachgewiesen werden. Beide Patienten zeigten deutliche systemische Nebenwirkungen der Therapie, einer zeigte starke neurologische Störungen. Hier konnte zum ersten Mal die 19F-MRS die Grenzen der 5-FU Therapie bei Dialyse-Patienten deutlich machen. Es

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation wurde damit klar, daß die Anwendung dieser problematischen Therapie eine noch gründlichere, tägliche Dialyse verlangt.

R0400 Zentrale Spektroskopie Produktion und der Export von 5-FU wiederum begrenzt wird. Interessanterweise, funktioniert diese CD/5-FC Gentherapie mit Bystander Effect in einigen anderen Zell- bzw. Tiermodellen doch ausgezeichnet. Unsere MRS-Studie zeigt aber klar und deutlich, warum die Therapie für die gewählte Prostatekarzinom-Linie nicht funktionierte und wie wichtig es ist, die metabolischen Bedingungen einer möglichen Gentherapie durch entsprechende Untersuchungen abzuklären.

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Abb. 4: 282 MHz 19F-MRS of Blutplasma eines Dialyse-Patienten mit Kolonkarzinom, 26 Std. nach Ende einer 5-FU Behandlung (2.9 g Infusion über 21 Std) und vor der Hämodialyse. Durch die fehlende Nierenfunktion wird eine sehr hohe Konzentration von FBAL (311 µM) erreicht; bedenkliche Menge von den FBAL-Metaboliten, die neurotoxische Substanzen FHPA und FAC, werden auch nachgewiesen. Der Patient zeigte starke neurologische Nebenwirkungen. 19

F-MRS Untersuchungen zu einem GentherapieModell In einer Kooperation mit der Abt. Debus (E0500) wurde die 19 F-MRS eingesetzt, um metabolische Fragen zu einem Gentherapie-Modell zu beantworten (Cytosin-Deaminase/ 5-Fluorcytosin Therapie des Dunning Prostatekarzinoms der Ratte). Die Prostatekarzinom Zell-Linie AT-1 wurde mit dem Gen für Cytosindeaminase (CD von E. coli) transfiziert. Diese CD+-Zellen waren empfindlich gegenüber Behandlung mit dem Prodrug 5-Fluorcytosin (5-FC), das intrazellulär durch CD in das hochwirksame Zytostatikum 5Fluoruracil (5-FU) umgewandelt wird. Es wurde aber in Zellkultur und Tierexperimenten festgestellt, daß bei diesem Modell der für eine praktische Therapie so wichtige Bystander Effect (die wirksame Tötung benachbarter, nicht-transfizierter CD--Zellen durch den in den CD+-Zellen produzierten 5-FU) nicht funktionierte. Um den Grund dieser Fehlschlag zu entdecken, wurde 19FMRS Messungen an Suspensionen von intakten CD+-Zellen nach Inkubation mit 5-FC durchgeführt. Die spektroskopische Daten zeigten, daß die Aufnahme des 5-FC in die CD+-Zellen und seine Umwandlung in 5-FU relativ langsam abläuft. Dagegen war die Aktivierung des 5-FU durch Anabolismus zu zytotoxischen Fluor-Nukleotiden (FNuctd) wie FUTP (die die Zelle nicht verlassen) relativ schnell; der Export des produzierten 5-FU in das Medium (notwendig für einen Bystander Effect) war wiederum sehr langsam. Ein hoher negativer Konzentrationsgradient zwischen intra- und extrazellulärem 5-FU blieb erhalten, auch nach 16-Std. Inkubation (Abb. 5). Diese effektives „trapping“ des intrazellulären 5-FU in den CD+-Zellen verhindert einen effiizienten Bystander Effect; durch die Wirkung der in CD+-Zellen produzierten F-Nuctd werden diese Zellen (die 5-FU Fabrik) relativ schnell getötet, so daß die

Abb. 5: 19F-MRS (470 MHz, 4°C) von (A) einer Suspension intakter CD+-Zellen, geerntet nach 16-Std. Inkubation with 774 µM 5FC (4-Std. MRS-Meßzeit) und (B) dem Inkubationsmedium zur Zeit der Ernte (1-Std. Meßzeit). In der Zellsuspension werden drei Signale für intrazelluläres 5-FC (314 µM), 5-FU (52 µM) und eine nicht-aufgelöste Mischung von Fluor-Nukleotiden (163 µM) detektiert. In dem Kulturmedium wird, neben 5-FC, nur eine sehr niedrige Konzentration von 5-FU (6.4 µM) nachgewiesen (sehr schwache Bystander Effect).

NMR-basiertes Screening von Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor In einer Kooperation mit der Abt. Krammer (G0300) und der Gruppe Walczak (G0310) wird seit dem 3. Quartal 2001 mit Hilfe der außerordentlichen Leistung des neuen 600 MHz NMR-Spektrometer an einem neuen Strukturforschungsprojekt im Bereich Apoptose gearbeitet. Durch die NMR-Spektroskopie können die Wechselwirkungen von Liganden und Rezeptoren (Struktur und Dynamik) detailliert auf der molekularen Ebene untersucht werden. NMR-Screening bietet die Möglichkeit, niedermolekularen, peptidischen oder nicht-peptidischen Liganden, welche z.B. die Einleitung der Apoptose beeinflussen können, zu entdecken bzw. zu optimieren, mit folgenden Vorteilen: - hohe Empfindlichkeit, auch für die Erkennung schwach bindender Liganden; - Bestimmung der 3D-Struktur des Liganden im gebundenen Zustand (im Komplex); - Bestimmung der beteiligten Bindungsstellen am Rezeptor; - gezielte, rationale Optimierung der Ligandstruktur. Bei den typischen NMR-Screening Anwendungen werden etwa 0,1 - 1 µmol eines Proteines oder seiner Rezeptor-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

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domäne benötigt. In der Arbeitsgruppe Walczak werden z.Z. entsprechende Mengen eines wasserlöslichen Fusionsproteins, gebildet aus der extrazellulären Domäne von TRAIL-R2 und der Fc-Region des menschlichen IgG, aufbereitet. TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand oder APO-2L), ein neulich identifiziertes Mitglied der TNF-Familie von Liganden kann Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzellen hervorrufen mit minimaler Toxizität gegen normale Zellen. TRAIL induziert Apoptose über zwei Rezeptoren, die eine Todesdomäne enthalten: TRAIL-R1 (DR4) und TRAIL-R2 (DR5). Das Fusionsprotein TRAIL-R2-Fc hemmt spezifisch die TRAIL-induzierte nicht aber die CD95L-induzierte Apoptose. TRAIL-R2-Fc ist daher ein geeignetes Modellsystem, um passende Liganden für den membrangebundenen TRAIL-R2 Rezeptor zu finden. Mit Hilfe der vorliegenden Röntgenstruktur des TRAIL/ TRAIL-R2 Komplexes wurden durch Molecular Modeling kurze Abschnitte (Teilsequenzen) im Ligand gefunden, welche für die Affinität und Spezifizität von TRAIL verantwortlich sein könnten. Die entsprechende Oligopeptide sind bereits synthetisiert (Gruppe Pipkorn) und werden zur Zeit mittels 1H-NMR vollständig charakterisiert. So bald das TRAIL-R2-Fc Fusionprotein bereitgestellt wird, kann das Screening beginnen und die Eigenschaften, die für die Affinität und die Spezifizität der TRAIL/TRAIL-R2 Wechselwirkung verantwortlich sind, näher definiert werden. Zur weiteren Optimierung der Liganden müssen die günstigsten bzw. aktivsten Konformationen der gefundenen Peptide stabilisiert werden, z. B. durch intramolekulare Verknüpfungen. Ein Kandidat-Sequenz ist der 19-mer aus dem Bereich Tyr189 - Val207 der TRAIL-Sequenz - ein Bereich, der wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Spezifizität des Liganden spielt. Im TRAIL-TRAIL-R2 Komplex ist dieser 19-mer in einem konformativ fixierten Loop oder „hairpin“ähnlicher Struktur angeordnet und geht gleichzeitig Wechselwirkungen mit zwei Rezeptormolekülen ein (Abb. 6), wobei die dreidimensionale Ausrichtung der Seitenketten eine entscheidende Rolle spielt. Abb. 6: Wechselwirkung zwischen der Teilsequenz Tyr189 Val207 in TRAIL (mitte) mit zwei Molekülen des TRAIL-R2

R0400 Zentrale Spektroskopie Um die Bindungsaffinität eines Modell-Peptides zu erhöhen, muß der zugängliche Konformationsraum der relativ flexiblen Peptidkette eingeschränkt werden, z.B. durch das Einbringen jeweils einen Cystein-Rest am Anfang und Ende der Teilsequenz und die Zyklisierung durch eine Disulfid-Brücke. Zusätzliche Stabilisierung soll durch Wechselwirkungen zwischen den Aminosäureseitenketten erfolgen. Nach einer in der Literatur aufgestellten These, bildet TRAIL-R2 in Abwesenheit des TRAIL-Liganden einen selbstassoziierten Trimer (mittels sogenannten PLAD-Domäne), der die Apoptose nicht im Gange setzen kann. Die Komplexierung des TRAIL-R2 Trimers mit einem TRAILTrimer führt zu einer Trennung der PLAD-Kontakte und löst schließlich die Apoptose aus. Eine ähnliche Wechselwirkung zwischen dem TRAIL-R2 Trimer und drei Moleküle unseres bivalenten zyklischen Peptides ist evtl. auch möglich. Mit diesem Projekt sollen hochaffine und selektive Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor aufgebaut werden, wobei die Struktur (Konformation) der Liganden (frei und im Komplex mit dem Rezeptor) bezüglich der Bindungsaffinität, -spezifizität und biologischer Wirkung gezielt optimiert werden soll. Dadurch erhoffen wir niedermolekulare Substanzen liefern zu können, die die Apoptose in Krebszellen auslösen und von therapeutischem Interesse sind. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Lebedkin, S.; Hull, W.E.; *Soldatov, A.; *Renker, B.; *Kappes, M.M.: Structure and properties of the fullerene dimer C140 produced by pressure treatment of C70. J. Chem. Phys. 104 (2000) 4101-4110. [2] *Eisenhut; M., Hull, W.E.; *Mohammed, A.; *Mier, W.; *Lay, D.; *Just, W.; *Gorgas, K.; Lehmann, W.D.; Haberkorn, U.: Radioiodinated N-(2-diethylaminoethyl)benzamide derivatives with high melanoma uptake: structure-affinity relationships, metabolic fate, and intracellular localization. J. Med. Chem. 43 (2000) 3913-3922. [3] Reinhard, J.; Hull, W.E.; von der Lieth, C.-W.; *Eichhorn, U.; Kliem, H.-C.; *Kaina, B.; Wiessler, M.: Monosaccharide-linked inhibitors of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT): synthesis, molecular modeling and structure-activity relationships. J. Med. Chem. 44 (2001) 4050-4061. [4] Owen, R.W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Haubner, R.; Würtele, G.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Olive oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Oncology 1 (2000) 107-112. [5] Owen, R.W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Haubner, R.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. Eur. J. Cancer 36 (2000) 1235-1247. [6] Owen, R.W.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Phenolic compounds and squalene in olive oils: the concentration and antioxidant potential of total phenols, simple phenols, secoiridoids, lignans and squalene. Food Chem. Toxicol. 38 (2000) 647-659. [7] Owen, R.W.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Identification of lignans as major components in the phenolic fraction of olive oil. Clin. Chem. 46 (2000) 976-988.

Rezeptorproteins (Oberflächen).

[8] Owen, R.W.; Haubner, R.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: The isolation, structure elucidation and antioxidant potential of the major phenolic and flavonoid compounds in brined olive drupes. Clin. Chem. (2002), submitted.

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

R0400 Zentrale Spektroskopie

[9] *Rengelshausen, J.; Hull, W.E.; *Schwenger, V.; *Göggelmann, C.; *Walter-Sack, I.; *Bommer, J.: Pharmacokinetics of 5-FU and its Catabolites Determined by 19FMRS for a Patient on Chronic Hemodialysis. Am. J. Kidney Dis. 39 (2002) U30 - U36.

wendig, neue Möglichkeiten zur Beschreibung der Aufenthaltswahrscheinlichkeiten von funktionellen Gruppen zu entwickeln.

[10] Corban-Wilhelm, H.; Hull, W.E.; Becker, G.; Bauder-Wüst, U.; Greulich, D.; Debus, J.: Cytosine deaminase gene therapy in a Dunning rat prostate tumour model: characterisation of 5-fluorocytosine metabolism and the bystander effect with 19F-NMR spectroscopy. Gene Therapy (2002) submitted.

Die Untersuchung biologischer Kommunikations -prozesse stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, um Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung in eine rationale Entwicklung von neuen Strategien zur Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen einzubringen. Zunehmend zeigt sich auch die Bedeutung von Kohlenhydraten (Oligosaccharide) heraus. Diese Moleküle werden kovalent an Proteine oder Lipide gebunden, die in der Zellmembran verankert sind. Solche Glykoproteine bzw. Glykolipide stellen wesentliche Komponenten der Zelloberfläche dar und sind somit besonders exponiert, um an Zell-Zell und Zell-Matrix Erkennungs- bzw. Signalprozessen mitzuwirken [4,5]. So wird z.B. der erste Schritt des Anheftens von Leukozyten an die Endothelzellen der Blutgefäße - ein entscheidender Schritt im Entzündungsprozeß - durch Selektine vermittelt, die spezifische Oligosaccharide auf der Zelloberfläche erkennen.

Molecular Modeling (R0404) C.-W. von der Lieth, M. Frank, A. Bohne-Lang In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, H.-C. Kliem, M. Pawlita, P. Altevogt (DKFZ); J.F.G. Vliegenthart, Bijvoet Center for Biomolecular Research, Universität Utrecht, Niederlande; H.-J. Gabius, H.-C. Siebert, Tierärtzliche Fakultät, LMU München, T.K. Lindhorst, Universität Kiel. Zusatzfinanzierung: BMBF Glycobiotechnology Program (B256); Synthese und Molekulardynamik neuer Saccharid-basierten Dendrimere als Basis für neue Medikamente; für C.-W. von der Lieth und W.E. Hull in Kooperation mit M. Wießler (DKFZ) and Beiersdorf AG; 1 Doktorand (A. Bohne); 1 Workstation; 12.02.98 31.12.00. Zusatzfinanzierung: DFN-Projekt (B919); Dynamische Moleküle: Darstellung und Analyse der Dynamik von biologischen Makromolekülen per Internet; für C.-W. von der Lieth; 1 Postdoc (M. Frank), versch. HiWis; 1 Linux-Cluster (Teilfinanzierung); 01.06.01 - 31.05.03.

3D Struktur in Lösung Die möglichst genaue Kenntnis der dreidimensio-nalen (3D) Struktur von biologisch aktiven Verbind-ungen und deren Flexibilität und Dynamik in Lösung ist oft der entscheidende Schlüssel zu einem tieferen Verständnis ihrer Wirksamkeit. Röntgenstrukturanalyse und Neutronenbeugung liefern verläßliche 3D Strukturen von chemischen Verbindungen im kristallinen Zustand. Mit multidimensionalen NMR-Techniken und effektiven Modellierungsprogrammen ist es möglich, die räumliche Strukturen und Dynamik von Molekülen in Lösung zu untersuchen. Die NMR-Daten liefern geometrische Informationen (Atomabstände, Diederwinkel, Stereochemie), die als Eingangsinformationen und/oder Nebenbedingungen z.B. in einer geometrischen Optimierung oder in einer Kraftfeldberechnung verwendet werden können. Die rasche Entwicklung der Computertechnologien erlaubt es, das dynamische Verhalten von zunehmend größeren molekularen Ensembles unter Berücksichtigung der jeweiligen physiologischen Bedingungen zu simulieren. Zur Auswertung werden effiziente Werkzeuge benötigt, die eine weitgehend automatische Analyse der anfallenden riesigen Datenmengen erlaubt. Das in der Arbeitsgruppe entwickelte Programm CAT (Conformational Analysis Tools) [1] ermöglicht eine detaillierte Analyse dynamischer Vorgänge innerhalb von biologischen Markomolekülen und deren Wechselwirkungen untereinander.

Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen

Die Bindung von Kohlenhydraten an Modell-Lektinen wurde mittels Transfer-NOE-NMR-Experimenten und verschiedenen Methoden des Molecular Modeling (Homologie-Modelierung, Berechnung der Wechselwirkungsenergien, systematische Konformationssuche, usw.) in verschiedenen Lösungsmitteln untersucht [5,6,7]. Dabei stellte sich heraus, dass aprotische Lösungsmittel, in denen zusätzlich NOE-Kontakte gemessen werden können, einen starken Einfluß auf die Entropie des Komplexes hat und insgesamt zur Verminderung der Bindungsstärke führen [7]. Intensiven Molekular-Dynamik Simulationen für Komplexe der O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase mit einer Familie neuer synthetischen Inhibitoren wurden durchgeführt. Die Inhibitoren waren Guanin-Derivate, die über unterschiedlich lange Alkylketten mit Glucose gekoppelt wurden. Es gelang uns, ein 3D-Modell zu entwickeln, dass auf atomarer Ebene die unterschiedliche Bindeverhalten der verschiedenen Inhibitoren quantitativ beschreiben konnte [8]. Angewandt wurde hierzu eine neue methodische Entwicklung, die es erlaubt, die Interaktionen zwischen Ligand und Rezeptor (Abb. 7) auf der Basis der einzelnen Aminosäurereste in der Bindungstasche und einzelner Teile des Ligands zu analysieren, d.h. die Wechselwirkung in individuellen Bestandteile zu zerlegen. Dazu konnte auch die interne Dynamik sowohl des Proteins als auch des Inhibitors berücksichtigt werden. Die durch Modeling errechneten Bindungsenergien zeigten eine gute Korrelation mit den gemessen Inhibitionskonstanten.

Intensive Studien zum Abtasten des konformationellen Raumes von flexiblen Molekülen wurden mittels Molekular-Dynamik Simulationen an Glykodendrimeren und NGlykanen durchgeführt [2,3]. Um aussagekräftige Beschreibungen des dynamischen Verhaltens von sehr beweglichen Molekülen zu erhalten, erwies es sich als not-

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Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation

R0400 Zentrale Spektroskopie [5] *Solís, D.; *Jiménez-Barbero, J.; *Kaltner, H.; *Romero, A.; *Siebert, H.-C.; von der Lieth, C.-W.; *Gabius, H.-J.: Towards defining the role of glycans as hardware in information storage and transfer: basic principles, experimental approaches and recent progress. Cells Tissues Organs 168 (2001) 5-23. [6] *Asensio, J.L.; *Siebert, H.-C.; von der Lieth, C.-W.; *Laynez J.; *Bruix, M.; *Soedjanaamadja, U.M.; *Beintema J.J.; *Cañada, F.J.; *Gabius, H.-J.; *Jiménez-Barbero, J.: NMR investigations of protein-carbohydrate interactions: studies on the relevance of Trp/ Tyr variations in lectin binding sites as deduced from titration microcalorimetry and NMR studies on hevein domains. Determination of the NMR structure of the complex between pseudohevein and N,N*,N(-triacetylchitotriose. Proteins: Structure, Function, and Genetics 40 (2000) 218-236.

108 Abb. 7: Das Bild zeigt einen sogenannten Snapshot aus einer Molekular-Dynamik Simulation für den Komplex zwischen MGMT und dem Inhibitor ω-[O6-Bromthenyl-Guan-9-yl]-(CH2)8 -β-D-Glucoside. Die Röntgenstruktur des MGMT (PDB entry: 1QNT) wurde als Templat verwendet. Der Inhibitor (Stabmodell) und die wasserzugängliche Oberfläche des Proteins werden dargestellt (Seitenketten der Aminosäuren sind beschriftet). Die Bromthenyl-Gruppe und Teil des Guanins sind in dem tunnel-ähnlichen Bereich der Bindungstasche zu sehen (vorne, rechts; Arg135, Ser159, Gly160); die Alkylkette und Glucose-Einheit liegen entlang einer hydrophobischen Mulde (nach hinten, links).

[7] *Siebert, H.-C.; *André, S.; *Asensio, J.L.; *Cañada, F.J.; *Dong, X.; *Espinosa, J.F.; Frank, M.; *Gilleron, M.; *Kaltner, H.; *Kozár, T.; *Bovin, N.V.; von der Lieth, C.-W.; *Vliegenthart, J.F.G.; *Jiménez-Barbero, J.; *Gabius, H.-J.: A new combined computational and NMR-spectroscopic strategy for the identification of additional conformational constraints of the bound ligand in an aprotic solvent. ChemBioChem 1 (2000) 181-195. [8] Reinhard, J.; Hull, W.E.; von der Lieth, C.-W.; *Eichhorn, U.; Kliem, H.-C.; *Kaina, B.; Wiessler, M.: Monosaccharide-linked inhibitors of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT): synthesis, molecular modeling and structure-activity relationships. Journal of Medicinal Chemistry 44 (2001) 4050-4061. [9] Oleszewski, M.; Gutwein, P.; von der Lieth, W.; *Rauch U.; Altevogt, P.: Characterization of the L1-neurocan-binding site. Implications for L1-L1 homophilic binding. Journal of Biological Chemistry 275 (2000) 34478-34485.

Modellieren Sequenz-homologer Proteine Die Zahl der experimentell gelösten 3D Proteinstrukturen hat in den letzten Jahren stark zugenommen, so dass auch für viele in der Krebsforschung relevante Moleküle verläßliche Strukturen mit einem wissensbasierten Ansatz modelliert werden können. Zudem hat sich auch die Qualität der verwendeten Algorithmen kontinuierlich verbessert. Da zudem praktisch alle notwendigen Daten und ein Großteil der Programme über das Internet abgerufen werden können, entwickelt sich eine ständig steigende Nachfrage, diese Möglichkeiten auch für Fragestellungen aus dem DKFZ zu nutzen. Aus diesem Grunde bieten wir einerseits Fortbildungskurse an, andererseits versuchen wir in Form von Linksammlungen den interessierten Kollegen einen einfachen Zugang zu den Datenbanken und Programmen zu eröffnen. Werden neben den Standardanwendungen zusätzliche, komplexe Modellierungsschritte [9] erforderlich, so führen wir diese in Kooperation durch. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Frank, Martin: Konformationsanalyse von Oligosacchariden im freien und gebundenen Zustand. Dissertation: Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät, Univ. Heidelberg (2000). < http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/605/> [2] von der Lieth, C.-W.; Frank, M.; *Lindhorst, T.K.: Molecular dynamics simulations of glycoclusters and glycodendrimers, Reviews in Molecular Biotechnology 90 (2002) 311-337. [3] Frank, M.; Bohne, A.; *Wetter, T., von der Lieth, C.-W.: Knowledge-Based Approach for the Rapid Generation of a Representative Ensemble of N-Glycan Conformations, In Silico Biology (2002), in press. [4] *Rüdiger, H.; *Siebert, H.-C.; *Solís, D.; *Jiménez-Barbero, J.; *Romero, A.; von der Lieth, C.-W.; *Diaz-Mauriño, T.; *Gabius, H.J.: Medicinal chemistry based on the sugar code: fundamentals of lectinology and experimental strategies with lectins as targets. Current Medicinal Chemistry 7 (2000) 389-416.

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention

Übersicht

Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Sprecher: Prof. Dr. Helmut Bartsch Cytopathologie (C0100) Prof. Dr. med. Peter Bannasch  06221 42-3202, FAX 06221 42-3222 e-mail: [email protected] Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200) Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch  06221 42-3300, FAX 06221 42-3359 e-mail: [email protected] Molekulare Toxikologie (C0300) Prof. Dr. rer. nat. Manfred Wießler  06221 42-3311, FAX 06221 42-3375 e-mail: [email protected] Wechselwirkungen von Carcinogenen mit biologischen Makromolekülen (C0400) Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Heinz W. Thielmann  06221 42-4508, FAX 06221 42-4553 e-mail: [email protected] Klinische Epidemiologie (C0500) Prof. Dr. Anthony B. Miller  06221 42-2219, FAX 06221 42-2203 e-mail:[email protected] Umweltepidemiologie (C0600) Prof. Dr. sc. math. Jürgen Wahrendorf  06221 42-2201, FAX 06221 42-2229 e-mail: [email protected] Genetische Veränderungen in der Karzinogenese (C0700) Dr. Monica Hollstein PhD  06221 42-3302, FAX 06221 42-3342 e-mail: [email protected]

Die Bedeutung von Krebs als eine der nicht übertragbaren Krankheiten mit der höchsten Sterblichkeitsziffer bei Männern und Frauen in Deutschland wird in den nächsten zwei Jahrzehnten noch weiter dramatisch anwachsen. Die Krebsfälle, die pro Jahr in Deutschland diagnostiziert werden, sollen nach dieser Schätzung statt 330.000 im Jahr 2000 rund 560.000 im Jahr 2040 betragen. Dies trifft für die Mehrzahl der Krebsfälle, vor allen Dingen den Lungenkrebs zu, da bis auf einige relativ seltene Krebsformen nur wenige Fortschritte in der Behandlung von Krebs erzielt worden sind. Dieses Szenario macht es dringend erforderlich, nicht nur die Behandlung von Krebs sondern vor allen Dingen auch die Prävention und Früherkennung voranzutreiben. Nach realistischen Einschätzungen könnten bis zu 30 % der neuen Krebsfälle in einem Zeitrahmen von 20 bis 30 Jahren verhindert werden. Die Anwendbarkeit der Fortschritte, die sowohl für die Behandlung als auch für die Prävention aus dem Human Genom-Projekt resultieren, wird jedoch erst dann möglich sein, wenn diese durch epidemiologische Studien in der Allgemeinbevölkerung bestätigt sind. Unverzichtbare Voraussetzung für präventive Maßnahmen ist die Kenntnis der Hauptursachen und das Verständnis der Mechanismen der Krebsentstehung. Diese Voraussetzung ist jedoch in vielen Fällen noch nicht erfüllt. Im Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention werden Faktoren untersucht, die in der Kanzerogenese eine Rolle spielen und daher die Grundlage für Krebspräventionsprojekte bilden. Hauptforschungsfelder sind (1) die Aufklärung exogener und endogener Krebsrisikofaktoren sowie Risikoabschätzungen durch epidemiologische, pathologische und toxikologische Methoden, (2) Untersuchungen von erblichen genetischen Veränderungen, die eine Krebsdisposition und ein erhöhtes Risiko durch GenUmweltinteraktionen darstellen, (3) Aufklärung von Kanzerogen-induzierten DNA- und Genschäden, (4) Identifizierung und Analyse von präkanzerösen Veränderungen, (5) Mechanismen der Chemoprävention und krebsprotektiver Faktoren, klinische Studien und schließlich (6) Entwicklung von Tumortherapeutika. Die Erkenntnisse aus diesen Untersuchungen tragen zu einer besseren Kenntnis der Ursachen und Mechanismen der Krebsentstehung bei und erlauben das Fortschreiten und Umsetzen von effektiven Präventions-Maßnahmen. Neue Abteilungen im Schwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention werden diese Aufgaben übernehmen: die Abteilungen Molekulargenetische Epidemiologie, Chemoprävention (beide Abteilungen in Planung) und die Klinische Epidemiologie, die bereits im September 1999 gegründet wurde. Die im Januar 2000 gegründete Abteilung Genetische Veränderungen in der Krebsentstehung untersucht Karzinome, frühe neoplastische Veränderungen und menschliche Tumorzell-Linien auf Veränderungen in der DNA-Sequenz und auf Verände-

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention rungen in der Gen-Expression, die mit der Entwicklung von Krebs zusammenhängen.

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Die Abteilung Klinische Epidemiologie besteht aus drei Projektgruppen: der Gruppe Genetische Epidemiologie, die die Rolle von genetischen Faktoren in der Entstehung von Brust- und Eierstockkrebs untersucht und zusammen mit Klinikern und Epidemiologen ein Konsortium für die Untersuchung der Krebsdisposition durch die Gene BRCA1 und BRCA2 bildet. Auch die Projektgruppe “Krebsprävention” wird mit einer Reihe von klinisch orientierten Forschern kooperieren; ihr Ziel ist die Entwicklung einer Brustkrebstherapie auf Hormonbasis. Die Projektgruppe “Ernährung” betreut eine prospektive Studie über Ernährung und Krebs (EPIC), an der 25.000 Personen in der Heidelberger Studie teilnehmen; die Studie wird von der IARC in Lyon, Frankreich, koordiniert. Die Studien zu genetischen Risikofaktoren beziehen sich auch auf die Untersuchung von Genumweltinteraktionen. Ätiologische Aspekte einschließlich sozialer, ökonomischer und medizinischer Aspekte sind in allen Projekten mit eingeschlossen. Die Suche nach Risikofaktoren und Krebsursachen wird mit Hilfe der deskriptiven Epidemiologie einschließlich kartographischer Präsentation der Krebssterblichkeit und der Evaluation neuer statistischer Methoden hinsichtlich arbeitsplatz-epidemiologischer Studien durchgeführt. Zur Zeit sind Studien in Planung, die sich mit der Evaluation von Screening-Methoden für verschiedene Krebslokalisationen befassen, und es werden Maßnahmen zur Verbesserung der Krebsbehandlung diskutiert. Zu den Aufgaben der Einheit Umweltepidemiologie gehören die Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Umweltfaktoren, zum Beispiel elektromagnetischer Felder, ionisierender Strahlung und Berufsrisiken auf die Entwicklung verschiedener Krebsarten. Der derzeitige Hauptschwerpunkt wird auf die Untersuchung elektromagnetischer Felder gelegt, die bei dem Gebrauch von Handys (mobile phones) auftreten und deren Bedeutung auf die Entwicklung von Hirntumoren. In diesem Zusammenhang werden groß angelegte Untersuchungen durchgeführt, um das Verhältnis zwischen möglichen Risikofaktoren und personenbezogenen Abhängigkeiten mit der Hilfe klassischer epidemiologischer Instrumente sowie mit Hilfe von Fragebögen zu erfassen. Weiterhin werden ausgedehnte Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen vermuteten Risikofaktoren und somatischen Gegebenheiten mit Biomarkern, Wirtsfaktoren, genetischer Prädisposition und Co-Sterblichkeit durchgeführt. Desgleichen wird der Einfluss anderer Umweltfaktoren z. B. der Ernährung und des Rauchens auf die Krebsentstehung analysiert. Für den bevölkerungsspezifischen Aspekt ist der weitere Ausbau von statistischen Methoden in der Epidemiologie von ganz besonderer Bedeutung.

Übersicht Die Forschungsaktivitäten in der Abteilung Toxikologie und Krebsrisikofaktoren umfassen die Aufklärung von umweltbezogenen Risikofaktoren und Studien über Wechselwirkungen von kanzerogenen Stoffen mit erworbenen oder geerbten Wirtsfaktoren (genetische Disposition) beim Menschen. Besonderer Wert wird darauf gelegt, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Grundlage von chronischen Infektionen bzw. entzündlichen Prozessen darstellen, die letztendlich zu Krebs führen oder die Krebsentstehung beschleunigen. Dies sollte die Charakterisierung und die Bewertung von DNA-Veränderungen erlauben, die durch andauernden oxidativen Stress und durch Lipidperoxidation in krebsanfälligen Geweben und Zellen des Menschen entstehen und somit neue Einblicke in die Mechanismen und die Veränderungen zulassen, die am Anfang der Umwandlung einer normalen Zelle in eine maligne Zelle stehen. Ein wichtiges Forschungsfeld ist die Entwicklung von hoch sensitiven Methoden für den Nachweis von DNASchäden und von Biomarkern, die Krebsanfälligkeit anzeigen. Diese Methoden sollen in der Krebsepidemiologie und den klinischen Interventionsstudien Anwendung finden. Große Bedeutung haben auch die Pläne zum Aufbau von Studien in der molekularen Epidemiologie, hier speziell zum Auffinden neuer genetischer Polymorphismen und bei der Suche nach weiteren Genen zur Frühdiagnose einer Krebsdisposition. Weiterhin sollen Risikogruppen in der Bevölkerung für Präventionsund Screening-Untersuchungen über Gen-UmweltWechselwirkungen aufgefunden werden, um das Wissen auf diesem Gebiet zu vertiefen. Eine Projektgruppe hat 1996 mit der Suche nach krebschemopräventiven Stoffen und ihren Wirkmechanismen vor dem Hintergrund einer Anwendung in Präventionsstudien beim Menschen begonnen. Durch selektive Synthesen und Testung von Strukturanalogen sollen neue krebspräventive Stoffe erforscht werden. Die Abteilung Genetische Veränderungen in der Krebsentstehung untersucht Tumoren, frühe neoplastische Veränderungen und menschliche Tumorzell-Linien auf Veränderungen in der DNA-Sequenz und auf Veränderungen in der Genexpression, die zur Entwicklung der Tumoren in Verbindung stehen. Das “Molecular Profiling” von Tumoren liefert Erkenntnisse über biologische Abläufe und Vernetzung, welche das Leben und Sterben der Zelle bestimmen und öffnet so neue Wege für moderne diagnostische chemopräventive und therapeutische Strategien. In diesem Zusammenhang werden genetisch veränderte Mausstämme mit genau definierten molekularen Veränderungen erzeugt (zum Beispiel mit einer inaktivierenden Punktmodation im p53-Tumor Suppressorgen), wie sie für Krebszellen typisch sind und zum malignen Wachstum beitragen. Die Mausmodelle sollen die Entwicklung und die in vivo präklinische Evaluation maßgeschneiderter Arzneimittel beschleunigen, welche ganz spezifisch molekulare Veränderungen in menschlichen Tumoren ansteuern können. Verwandte Mäusestämme, welche menschliche DNA-Sequenzen tragen, sollen ebenfalls verwendet werden, um Hypothesen über den Ursprung spezifischer genetischer Defekte

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention

Übersicht

bewerten zu können, welche menschlichen Krankheiten zu Grunde liegen, einschließlich endogener und exogener Krebsrisikofaktoren und Mechanismen, die für die Schäden in der DNA-Sequenz verantwortlich sind. Die Forschungsziele der Abteilung Molekulare Toxikologie konzentrieren sich auf toxikologiesche Fragestellungen und auf die Entwicklung neuer Tumortherapeutika. In der Toxikologie liegt das Schwergewicht auf der Analyse und der Strukturaufklärung von DNA-Addukten, die verwendet werden können, um die Belastung durch Umweltgifte zu erfassen (Biomonitoring). Die derzeit empfindlichste Methode zu diesem Zweck ist die 32PPostlabeling-Analyse, die jedoch den Nachteil hat, dass mit hohen Mengen an Radioaktivität gearbeitet werden muss. Mit einem von uns entwickelten Verfahren können DNA-Addukte jedoch auch mit einem Fluoreszenzmarker versehen und durch Kapillarelektrophorese bestimmt werden. So konnten sogenannte endogene DNA Addukte nachgewiesen werden. In der Abteilung werden neue Arzneimittel entwickelt, welche auf dem Konzept der Kopplung von Tumortherapeutika an Saccharide basieren, um den Transport zum Tumor und die Aufnahme in die Tumorzellen zu erleichtern. Andere neue Strukturen, zum Beispiel Hemmstoffe von DNA-Reparaturenzymen, zeigen ebenfalls vielversprechende Ergebnisse nach Kopplung an Monosaccharide. Die spezifische Aufnahme solcher Glykokonjugate durch Transportsysteme führt zu einer Anreicherung der Substanzen im Zielorgan und reduziert unerwünschte Nebenwirkungen. Komplexe Oligosaccharide sind Liganden für Lektine – wir versuchen, solche tumorassoziierten Lektine mit synthetischen Oligosanchariden anzusprechen und zu isolieren, um sie letztendlich als Transportwerkzeug für Therapeutika zu nutzen. Eine weitere Möglichkeit, Arzneimittel zielgenau an Tumoren zu bringen, ist ihre kovalente Kopplung an humanes Serumalbumin. Tumorzellen nehmen Albuminkonjugate über Endozytose auf, im Lysosom, dem Magen der Zelle, wird das gekoppelte Therapeutikum freigesetzt und tötet die Zelle. Die Leiter der Abteilungen Cytopathologie (Prof. Peter Bannasch) und Wechselwirkungen von Carcinogenen mit biologischen Makromolekülen (Prof. Heinz W. Thielmann) sind in Ruhestand gegangen.

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren

Abteilung: Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Matthias Bartelmann Dr. Walter Beerheide (- 04/ 01) Dr. Barbara Bertram Dr. Heike Dally Dr. Norbert Frank Dr. Clarissa Gerhäuser Dr. Reinhold Klein Dr. Claudia Mayer Dr. Jagadeesan Nair Dr. Urmila Nair Prof. Dr. Hans Osswald Dr. Robert W. Owen Dr. Odilia Popanda Dr. Angela Risch Dr. Margarita Rojas Dr. Hans-Rudolf Scherf Dr. Peter Schmezer Dr. Bertold Spiegelhalder Dr. Gisela Werle-Schneider Gastwissenschaftler Dr. Roger Godschalk Dr. Xin Sun Somkid Sitthimonchai (09/01 - )

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Doktoranden Elisabeth Bertl (09/01 -) Reinhard Ebbeler Kai Gassner Chi Tai Phong (10/01 -) ) Inge Schönffeldt Patrick Schweizer

Isabel Streck Changping Xie

Diplomanden Jörg Hümmerich

Andreas Vogt (03-10/01)

BeateBreitschopf Amira Gamal Eldeen (- 02/02) Elke Heiß (- 08/01) Torsten Schattenberg (10/01-

Assistenz/technisches Personal Ursula Bollow Christel Ditrich Reinhard Gliniorz Roswitha Haubner Michael Huber (- 09/01) Birgit Jäger Claudia Kalla ( - 09/01) Karin Klimo Jutta Knauft Regina Merkel (- 02/02) Ulrike von Seydlitz-Kurzbach Peter Waas Andreas Wölfelschneider Gerd Würtele Otto Zelezny Sekretariat Susanna Fuladdjusch Auszubildende Karin Schüßler (- 02/02)

Kai Doberstein

Die Hauptziele der Abteilung sind: (a) Identifizierung von exogenen und endogenen Krebsrisikofaktoren und Aufklärung ihrer Wirkmechanismen, (b) Charakterisierung krebsvorbeugender Stoffe und Nachweis ihrer Effizienz in vorklinischen und klinischen Studien, (c) Entwicklung und Validierung neuer Methoden und Biomarker für molekularepidemiologische Studien zur Krebsätiologie und -prävention auf der Basis der gewonnenen mechanistischen Erkenntnisse, (d) Initiierung und Beteiligung an solchen Studien durch Beiträge zur Methodik und Planung. Damit sollen die Voraussetzungen für eine effiziente Prävention von Krebserkrankungen durch Eliminierung der Risikofaktoren oder Unterbrechung der

Krankheitsentwicklung (Chemoprävention) geschaffen werden. Viele der Forschungsaktivitäten in der Abteilung fallen unter „Biomarkerentwicklung und deren Anwendung in Humanstudien (Abb. 1). Viele dieser Untersuchungen befinden sich erst in der Anfangsphase neben einigen bereits laufenden, groß angelegten molekularepidemiologischen Studien [4]. Epidemiologische Beobachtungen zu Risiko- und protektiven Faktoren bei Krebserkrankungen ⇓ Mechanistische Studien in experimentellen Systemen zur Bestimmung von Biomarkern/intermediären Endpunkten ans Teil der Kausalkette ⇓ Entwicklung von (nichtinvasiven) Methoden zur Bestimmung von Expositions-/ Risikomarkern ⇓ Validierung in tierexperimentellen/humanen Pilotstudien ⇓ Untersuchung von Markern in groß angelegten epidemiologischen Studien ⇓ Feedback: Ätiologie, Prävention, Diagnose, Prognose Abb. 1 Entwicklung und Validierung von Biomarkern in der Humankarzinogenese zur Anwendung in molekularepidemiologischen oder klinischen Studien [2]

Die Hauptziele auf dem Gebiet der Biomarkerentwicklung und -anwendung beim Menschen bestehen darin, (a) neue Quellen der Karzinogenexposition zu identifizieren [7], insbesondere solche, die durch endogene (entzündliche) Prozesse entstehen [10,18], (b) die Exposition der Bevölkerung mit Hilfe von Markern der Schadstoffexposition und genetischen Disposition abzuschätzen, um damit Hochrisikogruppen zu identifizieren [9,14-17,19] und schließlich (c) die Wirksamkeit präventiver Maßnahmen z.B. durch Intervention mit chemopräventiven Substanzen zu verifizieren [1,4,20]. Mitte 1996 wurden die Aktivitäten zur sekundären Krebsprävention in der Abteilung intensiviert. Da chemopräventive Substanzen strukturell heterogen sind und unterschiedliche Wirkmechanismen aufweisen, werden neue vielversprechende Naturstoffe und synthetische Analoga identifiziert und bewertet [5,6,11-13]. Letztendlich soll der Nachweis ihrer präventiven Wirksamkeit beim Menschen, zuerst z.B. bei Patienten mit Dysplasien und später in der Allgemeinbevölkerung erbracht werden. Eine klinische Interventionsstudie [20] mit Sulindac (ein nicht steroidales Antiphlogistikum) und Biomarkeruntersuchungen [18] bei Patienten mit familiärer adenomatöser Polyposis (FAP) erbrachte den Beweis einer krebspräventiven Aktivität bisher nur bei

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention kolektomierten FAP-Patienten. Des weiteren wurde eine partielle Rückbildung oraler Dysplasien durch Gabe einer Antioxidantienkombination an Patienten mit Leukoplakien bzw. nach chirurgischer Entfernung des Primärkarzinoms in der Mundhöhle erreicht [1]. Eine europäische Interventionsstudie mit Kalzium-Ballaststoffgabe bei Patienten mit sporadischen kolorektalen Adenomen und Placebokontrollen wurde zu Ende geführt [4]. Fernziele sind die Charakterisierung und Erprobung neuer, wirksamer chemopräventiver Substanzen mit geringer Langzeittoxizität und verstärkte interdisziplinäre Forschungsaktivitäten: 1. Durchführung klinischer Versuche an zugänglichen Dysplasien mit wiederholter, direkter Kontrolle nach Behandlung mit bekannten und neuen antidysplastischen Arzneimitteln, 2. Entwicklung und Validierung krebsprädiktiver Biomarker für schwer zugängliche Dysplasien, 3. Entwicklung neuer antidysplastischer Substanzen von hoher präventiver Wirksamkeit bei einer Vielzahl unterschiedlicher Dysplasien. Die Etablierung von zwei neuen Abteilungen für ‘Molekulargenetische Epidemiologie’ (2002) und ‘Klinische Epidemiologie’ (seit 1999) sollte die Aktivitäten dieses Forschungsschwerpunkts verstärken. Zur Intensivierung der Zusammenarbeit zwischen Grundlagenforschern, Klinikern und Epidemiologen auf dem Gebiet der Krebsursachen- und Krebspräventionsforschung wurden 1999-2000 folgende multidisziplinären Veranstaltungen abgehalten: • Third Taiwanese-German Workshop on Cancer Causes and Prevention: Mechanisms, Preclinical and Clinical Studies, Heidelberg, Juli 2000. • International Workshop on Biomarkers in Cancer Chemoprevention, Heidelberg, Februar 2000 (organisiert zusammen mit A.B. Miller, DKFZ und der IARC, Lyon, Frankreich [8]. • Training Course in Environmental Toxicology, Hanoi, November 2001. Sponsoren: UN Environmental Program, Chulabhorn Research Institute, Bangkok, Thailand. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] *Barth, T.J., *Zöller, J., *Kuebler, A., *Born, I.A., Osswald, H.: Redifferentiation of oral dysplastic mucosa by the application of the antioxidants beta-carotene, alpha-tocopherol and vitamin C. International Journal for Vitamin and Nutrition Research 67 (1997) 368-376. [2] Bartsch, H.: Studies on biomarkers in cancer etiology and prevention: a summary and challenge of interdisciplinary research. Mutation Research 462 (2000) 255-279. [3] Bartsch, H., Nair, J.: New DNA-based biomarkers for oxidative stress and cancer chemoprevention studies. European Journal of Cancer 36 (2000) 1229-1234. [4] *Bonithon-Kopp, C., Kronborg, O., *Giacosa, A., Räth, U., *Faivre, J. [Experts: *Milan, C., *Fenger, C., *Piard, F., *Belghiti C., Owen, R. W., *Pignatelli, M.].: Calcium and fibre supplementation in the prevention of colorectal adenoma recurrence: a placebocontrolled intervention trial from the European Cancer Prevention Organisation (ECP). Lancet 356 (2000) 1300-1306. [5] Gerhäuser, C., Alt, A., Klimo, K., Heiss, E., Neumann, I., GamalEldeen, A., Knauft, J., Scherf, H., Frank, N., Bartsch, H., Becker, H.: Xanthohumol from hop (Humulus lupus) as a novel potential cancer chemopreventive agent. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 42 (2001) 18.

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren [6] *Ha, T., Gerhäuser, C., *Zhang, W., *Ho-Chong-Line, N., *Fourasté, I.: New Lanostanoids from Ganoderma lucidum (Polyporaceae) that induce NAD(P)H:quinone oxidoreductase in cultured Hepa1c1c7 murine hepatoma cells. Planta Medica 66 (2000) 681-684. [7] Klein, R.G., Schmezer, P., Amelung, F., *Schroeder, H.-G., *Woeste, W., *Wolf, J.: Carcinogenicity assays of wood dust and wood additives in rats exposed by long-term inhalation. International Archives of Occupational and Environmental Health 74 (2001) 109-118. [8] Miller, A.B., Bartsch, H., *Bofetta, P., *Dragsted, L.O., *Vainio, H.: Biomarker in Cancer Chemoprevention. IARC Sci. Publ. No. 154 (2001) IARC, Lyon, Frankreich pp 1-294. [9] Nair, U., Bartsch, H.: Metabolic polymorphisms as susceptibility markers for lung and oral cavity cancer. In: Biomarkers in Cancer Chemoprevention. Miller, A.B. et al. (eds.), IARC Scientific Publications N° 154 (IARC, Lyon, Frankreich) (2001) 271-290. [10] Nair, J., *Barbin, A., *Velic, I., Bartsch, H.: Etheno DNA-base adducts from endogenous reactive species. Mutation Research 424 (1999) 59-69. [11] Owen, R.W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. European Journal of Cancer 36 (2000) 1235-1247. [12] Owen, R.W., *Mier, W., Hull, W.E., *Giacosa, A., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: (2000). Identification of lignans as major components in the phenolic fraction of olive oil. Clinical Chemistry 46, 976-988. [13] Owen, R.W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Würtele, G., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: Olive oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Oncology 1 (2000) 107-112: [14] *Rajaee-Behbahani, N., Schmezer, P., Risch, A., Rittgen, W., *Kayser, K.W., *Dienemann, H., *Schulz, V., *Drings, P., *Thiel, S., Bartsch, H.: Altered DNA repair capacity and bleomycin sensitivity as risk markers for non-small cell lung cancer. International Journal of Cancer 95 (2001) 86-91. [15] Rojas, M., *Cascorbi, I., *Alexandrov, K., *Kriek, E., *Auburtin, G., *Mayer, L., Kopp-Schneider, A., *Roots, I., Bartsch, H.: Modulation of benzo[a]pyrene diolepoxide-DNA adduct levels in human white blood cells by CYP1A1, GSTM1 and GSTT1 polymorphism. Carcinogenesis 21 (2000) 35-41. [16] Schmezer, P., *Rajaee-Behbahani, N., Risch, A., *Thiel, S., Rittgen, W., *Drings, P., *Dienemann, H., *Kayser, K.W., *Schulz, V., Bartsch, H.: Rapid screening assay for mutagen sensitivity and DNA repair capacity in human peripheral blood lymphocytes. Mutagenesis 16 (2001) 25-30. [17] Schmezer, P., *Rupprecht, T., *Tisch, M., *Maier, H., Bartsch, H.: Laryngeal mucosa of head and neck cancer patients shows increased DNA damage as detected by single cell microgel electrophoresis. Toxicology 144 (2000) 149-154. [18] Schmid, K., Nair, J., *Winde, G., *Velic, I., Bartsch, H.: Increased levels of promutagenic etheno-DNA adducts in colonic polyps of FAP patients. International Journal of Cancer 87 (2000) 1-4. [19] Wikman, H., Risch, A., Klimek, F., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., *Dienemann, H., *Kayser, K., *Schulz, V., *Drings, P., Bartsch, H.: hOGG1 polymorphism and loss of heterozygosity (LOH): significance for lung cancer susceptibility in a caucasian population. International Journal of Cancer 88 (2000) 932-937. [20] *Winde, G., *Schmid, K.W., *Brandt, B., *Mueller, O., Osswald, H.: Clinical and genomic influence of sulindac on rectal mucosa in familial adenomatous polyposis. Diseases of the Colon and Rectum 40 (1997) 1156-1168.

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention

Transkriptionsanalyse und ihre Anwendung in der prädiktiven Toxikologie (C0201) G. Werle-Schneider, K. Schüßler, K. Doberstein, A. Wölfelschneider, M. Bartelmann In Zusammenarbeit mit M.C.v. Brevern, J. Scheel, C. Behrens, T. Storck und A. Bach, Axaron Bioscience AG, Heidelberg; J. Hengstler, M.Ringel, Institut für Toxikologie, Johannes Gutenberg-Universität, Mainz; D. Müller, R. Glöckner, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Schiller-Universität, Jena Drittmittel: Bioregio Projekt BMBF

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Tumorpromotoren oder nicht-genotoxische Karzinogene verursachen keine DNA-Schäden, verändern aber bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Karzinogenese die Genexpression. Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, neue Testsysteme zu entwickeln, die eine schnelle Evaluierung des karzinogenen Potentials von Tumorpromotoren erlauben. Basierend auf der Hypothese, daß nicht-genotoxische Karzinogene anhand ihrer spezifischen Genexpressionsprofile klassifiziert werden können, wurden verschiedene Tumorpromotoren aus 3 unterschiedlichen toxikologisch relevanten Klassen mit Hilfe der cDNA microarray Technologie untersucht. Dabei wurden neben den Enzyminduktoren Phenobarbital, αHexachlorozyklohexan und Cyproteronacetat, die Peroxisomenproliferatoren WY14643 und Ciprofibrat oder Nafenopin, das Hormon Ethinylestradiol sowie Dehydroepiandrosteron, das neben hormonaler vor allem eine peroxisomenproliferierende Wirkung besitzt, verwendet. Durch die Erstellung der für jede Substanz spezifischen Transkriptionsprofile, können sogenannte Markergene identifiziert werden, die für die Wirkung von Tumorpromotoren charakteristisch sind und als prädiktiv eingeschätzt werden können. Untersuchungen in einem in vivo Modell (Rattenleber) und ein hierarchisches Clustering der resultierenden Transkriptionsprofile für ausgewählte Markergene zeigten, daß Substanzen entsprechend ihrer Wirkmechanismen klassifiziert werden können. Für ein high-throughput screening sogenannter Lead-Substanzen in der Frühphase der Wirkstoffentwicklung (z.B. in Pharma und Pflanzenschutz) ist jedoch die Entwicklung eines geeigneten in vitro Testsystems erforderlich. Entwicklung eines in vitro Testsystems zur Analyse von Genexpressionsmustern, die für die Wirkung nichtgenotoxischer Karzinogene charakteristisch sind Zur Entwicklung eines in vitro Testsystems zur Erkennung von karzinogenen Substanzen wurden verschiedene von der Rattenleber abgeleitete Testsysteme untersucht: Eine aus der Rattenleber etablierte Zellinie (C2I [Mayer und Schäfer, Exp Cell Res 138 (1982)1-14]), Leberschnitte und primäre kultivierte Hepatozyten. Als Modellsubstanz wurde zunächst das Barbiturat Phenobarbital eingesetzt. Phenobarbital verändert die Expression einer Vielzahl von Enzymen, die unter anderem bei der Metabolisierung von Fremdstoffen eine Rolle spielen. (I) Zellinien Etablierte Zellinien wären aufgrund ihrer einfachen Handhabung für Routinetests besonders geeignet. Aufgrund

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren der Dedifferenzierung von Zelllinien fehlten jedoch die für Phenobarbital spezifischen Veränderungen der Genexpression. Testsysteme mit etablierten Zellinien erwiesen sich daher als ungeeignet. (II) Primäre kultivierte Hepatozyten In primären kultivierten Hepatozyten können durch bestimmte Kultivierungsbedingungen, z.B. durch die Verwendung von Matrigel (extrazelluläre Matrix) oder des Hormons Dexamethason, für Phenobarbital spezifische Veränderungen der Genexpression ähnlich in vivo erhalten werden [Henstler et al. Drug Metab Rev 32 (2000) 81118]. Es wurden zunächst verschiedene Kulturivierungssysteme und -medien für primäre Hepatozyten der Ratte untersucht: (a) 2-dimensionale Kulturen als Monokultur mit einer Beschichtung der Zellkulturschalen mit Kollagen, Matrigel oder einem Kollagengelsandwitch; als Kokultur mit Rattenleberepithelzellen, sowie eine 3dimensionale Kultur unter Verwendung von CalciumAlginat-Beads; (b) Medien mit fötalem Kälberserum (FCS), mit und ohne Dexamethason als auch chemisch definierte Medien ohne FCS. Die Transkriptionsanalyse der mit Phenobarbital behandelten primären Hepatozyten zeigten im Vergleich zu den in vivo erhaltenen Transkriptionsprofilen je nach Kultivierungsbedingungen unterschiedliche Übereinstimmung. (1) Eine Kultivierung der primären Hepatozyten in Monound Kokultur auf Kollagen- oder Kollagengel-beschichteten Zellkulturschalen führte zu einer Übereinstimmung von 57 bis 70 %, während mit einer Kultivierung auf Matrigel nur eine Übereinstimmung von 40 % erzielt wurde. (2) Dexamethason allein verändert die Expression von knapp 20 % der untersuchten Gene. Ein Vergleich der Transkriptionsprofile mit und ohne Dexamethason mit den in vivo erhaltenen Profilen zeigt jedoch, daß mit Dexamethason etwa 55 % Übereinstimmung erzielt wird, während ohne Dexamethason nur 20 % der untersuchten Gene übereinstimmen. (3) Eine Induktion von für Phenobarbital spezifischen Markergenen wie den Cytochromen P450, UDP-Glucuronosyltransferasen und Glutathionstransferasen konnte in den verschiedenen in vitro Testsystemen beobachtet werden. Die stärkste Induktion wurde für Cytochrom P450 2B1 erhalten, das auch in vivo in der Rattenleber induziert wird. Abhängig vom jeweiligen Testsystem können unterschiedliche Mitglieder einer Enzymfamilie in ihrer Expression verändert sein. Während Cyp 3A1 in der Rattenleber, in primären Hepatozyten und Leberschnitten ähnlich stark induziert wurde, war eine erhöhte Expression von CYP3A2 nur in vivo zu beobachten. (4) Unabhängige Untersuchungen mit unterschiedlichen Tieren zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit der mit cDNA microarrays erhaltenen Ergebnisse (98 % bzw. 95 % bei mehr als 3 bzw. 2 fachen Veränderungen der Genexpression). (5) Mit Rattenleberepithelzellen wurden keine für Phenobarbital spezifischen Veränderungen der Genexpression beobachtet.

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Zur Zeit werden mit einem chemisch definierten Medium und primären Hepatozyten in Monokultur auf Kollagen Untersuchungen mit weiteren Tumorpromotoren aus verschiedenen Klassen durchgeführt. (III) Leberschnitte Als drittes in vitro Testsystem, das in toxikologischen Untersuchungen zunehmend Anwendung findet, wurden Leberschnitte eingesetzt [Kuhn et al. Exp Toxicol Pathol 50 (1998) 4961-496]. Im Unterschied zu primären Hepatozyten bleibt bei Leberschnitten der Gewebeverband erhalten. Nach Behandlung mit Phenobarbital wurde eine ausgeprägte Übereinstimmung (70 %) zwischen den in vitro und den in vivo in der Rattenleber induzierten Transkriptionsprofilen beobachtet. Kryokonservierte Leberschnitte zeigten hingegen nur eine geringe Übereinstimmung (14 %). Clusteranalysen der Transkriptionsprofile ausgewählter Markergene für die Substanzen Phenobarbital, αHexachlorozyklohexan, Ethinylestradiol und Dehydroepiandrosteron zeigen, daß ähnlich den in vivo Studien auch in vitro eine Klassifizierung entsprechend den Wirkmechanismen möglich zu sein scheint. So rufen die Enzyminduktoren Phenobarbital und α-Hexachlorozyklohexan ähnliche Transkriptionsänderungen hervor. Auch weisen die durch Dehydroepiandrosteron erhaltenen Transkriptionsprofile Ähnlichkeiten zu den in vivo untersuchten Peroxisomenproliferatoren auf. Dies deutet darauf hin, daß mit Hilfe eines in vitro Testsystems und der Erstellung von Transkriptionsmustern ein prädiktives Testsytem erhalten werden könnte, mit dem auch bisher unbekannte Substanzen durch eine Analyse auf Zugehörigkeit zu einer dieser Wirkgruppen getestet werden könnten.

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren

1. Identifizierung und Entwicklung neuer chemopräventiver Verbindungen: Programmüberblick Die Krebsentstehung, die grob in eine Initiations-, Promotions-, und Progressionsphase unterteilt wird, kann als kontinuierliche Anhäufung von genetischen oder biochemischen Zellschäden angesehen werden. Wie in Abb. 1 angedeutet bietet diese meist über viele Jahre andauernde Entwicklung eine Vielzahl von Ansatzmöglichkeiten für die Krebs-Chemoprävention, d.h. der Einsatz von chemischen Verbindungen, Naturstoffen oder Nahrungsbestandteilen mit dem Ziel, die Carcinogenese zur verlangsamen, zu hemmen oder rückgängig zu machen. Zur Identifizierung und Beurteilung neuer krebs-chemopräventiver Naturstoffe und synthetischer Verbindungen wurden anhand der oben beschriebenen Mechanismen verschiedene Testmodelle als Markersysteme für chemopräventive Aktivität im Labor etabliert. Diese Modelle, die meist im 96-Lochplatten-Format mit Enzympräparationen oder in Zellkultur mit photometrischer, fluorimetrischer oder radioaktiver Endpunktbestimmung durchgeführt werden, ermöglichen die Untersuchung einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit (1-3 Tage), ohne daß wie im

Die mit den bekannten Tumorpromotoren erstellten Transkriptionsmuster werden in eine Datenbank eingegeben. In dem am besten geeigneten in vitro Testsystem werden weitere neue Testsubstanzen untersucht. Über die charakteristischen Veränderungen des erstellten Transkriptionsmusters zu bereits vorhandenen Transkriptionsprofilen soll eine Risikoabschätzung der neuen Testsubstanzen erfolgen. Publikation (* = externe Koautoren) [1] Werle-Schneider, G., Kalla, C., Hollstein, M., Bollow, U., *Behrens, C.K., *v. Brevern, M.C., *Storck, T., *Müller, D., *Steinmetzer, P., *Bach, A., Beerheide, W.: Comparison of gene expression in rat liver slices and primary hepatocytes after treatment with phenobarbital. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 127 (2001) 30.

Chemoprävention (C0202) C. Gerhäuser, N. Frank, H.-R. Scherf, E. Heiss, A. Gamal Eldeen, C. Xie, E. Bertl, S. Sittimonchai, R. Merkel, K. Klimo, J. Knauft, A. Vogt Drittmittel: Wissenschaftsförderung der Deutschen Brauwirtschaft e.V. 1.11.1999 - 21.12.2001 DM 280.500,- Dr. C. Gerhäuser/Prof. H. Becker (Uni Saarbrücken); 1.1.02 - 1.4.03 Euro 129.011,- Dr. C. Gerhäuser/Prof. H. Becker (Uni Saarbrücken)

Abb. 1: Schematische Gegenüberstellung der stufenweisen Krebsentstehung (links) und möglicher chemopräventiver Mechanismen (rechts)

High-Throughput-Screening die Kontrolle über substanzspezifische Charakteristika (z.B. Löslichkeit, toxische Effekte) verlorengeht. Vorteile sind ein geringer Substanzbedarf, einfache Durchführung, vergleichbar geringe Kosten, und die Generation von Daten in computerisierter Form, die eine schnelle, halbautomatische Auswertung der Ergebnisse ermöglichen. In den Schwerpunktbereichen Metabolismus, Antioxidanzien, Hemmung der Tumor-Promotion, der Zellproliferation und von Entzündungsprozessen wurden folgende Systeme etabliert: 1.1 Modulation des Fremdstoffmetabolismus

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention

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a) Fluorimetrischer Nachweis einer Hemmung von Cyp1A (Phase 1 Enzym) in β-Naphthoflavon induzierten Rattenhepatomzellen (H4IIE) b) Induktion von NAD(P)H: Chinone Oxidoreduktase in Maushepatomzellen (Hepa1c1c7) (Phase 2 Enzym) c) Fluorimetrische Messung von Glutathion und intrazellulären Thiolen nach Derivatisierung und HPLC-Trennung 1.2 Nachweis von Radikalfängern und Antioxidanzien a) Reaktion mit stabilen Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) Radikalen b) Reaktion mit Superoxid Anion Radikalen im Phenazinmethosulfat (PMS)-Nitroblue Tetrazolium (NBT) System (nicht-enzymatisch) oder im Xanthin/ Xanthinoxidase System (XO/NBT) (enzymatisch) c) Hemmung der Superoxid Anion Radikal-Freisetzung in differenzierten HL-60 Zellen 1.3 Entzündungshemmung a) Cyclooxygenase (Cox)-1 und -2 Hemmung b) Hemmung der Induktion der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) in Raw 264.7 Makrophagen 1.4 Tumorpromotionshemmung a) Hemmung der Phorbolester-vermittelten Induktion der Ornithindecarboxylase in 308 Maus Keratinozyten 1.5 Proliferationshemmung a) Induktion der terminalen Zelldifferenzierung in humanen und murinen Leukemiezellen (HL-60, MEL) b) Nachweis östrogener bzw. antiöstrogene Effekte in der Ishikawa humanen Endometriumkrebs Zellinie. Die Behandlung der Zellen mit E2 oder anderen Östrogenen führt zu einer verstärkten Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) als Markerenzym, während die gleichzeitige Behandlung mit einer Testsubstanz und E2 die Untersuchung einer anti-östrogenen Wirkung erlaubt. 1.6 Mouse Mammary Gland Organ Culture (MMOC) Ein Nachteil von Kurzzeit in vitro Testsysteme zur Identifizierung von chemopräventiven Stoffen ist die Gefahr, falsch positive Leitsubstanzen zu identifizieren, d.h. Substanzen, die zwar in vitro aktiv sind, in vivo jedoch keine chemopräventive Aktivität zeigen. Deshalb wurde ein Organkultur Modell mit Brustdrüsen der Maus etabliert, welches die Vorteile eines in vitro Tests (einfache Durchführung, geringer Substanzbedarf, kurze Dauer) mit denen eines in vivo Versuchs (komplexe zelluläre und metabolische Prozesse in einem intakten Organ) vereinigt. Dabei werden Brustdrüsen von Mäusen für 24 Tage in Kultur gehalten. In einer ersten Proliferationsphase (10 Tage) werden die Drüsen mit mammotrophen Hormonen stimuliert, bei Entzug der Hormone folgt eine Regressionsphase (14 Tage). Am Tag drei wird mit 7,12Dimethylbenz(a)anthracen die Entstehung prä-neoplastischer knötchenartiger Läsionen induziert. Nach Behandlung mit Testsubstanzen während der Proliferationsphase (Tag 0-10) kann am Ausbleiben der Läsionen nach Beendigung des Experiments eine chemopräventive Wirkung abgelesen werden. Das Modell eignet sich in Kombination mit immunhistochemischen Nachweis in der Expression von Markerproteinen

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren auch zur Aufklärung von Wirkmechanismen aktiver Verbindungen. Insgesamt wurden seit 1996 über 2000 Naturstoffe, synthetische Analoge, Extrakte von Nahrungsbestandteilen, Heilpflanzen, Algen, Schwämmen, Pilzen, Moosen und Subfraktionen der Extrakte von nationalen und internationalen Kooperationspartner zur Verfügung gestellt und in den oben beschriebenen Testsystemen untersucht. Die Testergebnisse werden in einer umfangreichen Datenbank verwaltet und dienen der Auswahl von Leitstrukturen für den weiteren Nachweis chemopräventiver Wirksamkeit im Tiermodell und für mechanistische Untersuchungen. 2. Beschreibung ausgewählter Projekte 2.1. Identifizierung neuer Leitstrukturen 2.1.1. Antioxidatives Potential von Bier-Polyphenolen in Zusammenarbeit mit A. Alt und H. Becker, Universität des Saarlandes, Saarbrücken

Bier ist eines der weltweit am meisten konsumierten Getränke. Es ist reich an Nährstoffen und Nahrungszusatzstoffen wie Vitamine und Polyphenole, die wegen ihrer antioxidativen Aktivität mit gesundheitsfördernden Aspekten in Zusammenhang gebracht werden. 1996 wurde erstmalig eine anti-mutagene Aktivität von Bier beschrieben. Später konnte dies auf eine Hemmung der Entstehung von Carcinogen-Addukten mit der DNA zurückgeführt werden. Im vorliegenden Projekt (gefördert von der Wissenschaftsförderung der Deutschen Brauwirtschaft e.V.) wurden Inhaltsstoffe aus Bier sowie von Polyphenol-Rückständen, die bei der Bier-Stabilisierung anfallen, auf Radikalfänger- und antioxidative Aktivität in den unter 1.2. beschriebenen Testsystemen und im ORAC (Oxygen Radikal Absorbance Capacity) Test getestet. Wir untersuchten ca. 40 verschiedene Polyphenole aus fünf strukturellen Klassen: Benzoe- und Zimtsäure-Derivate, Acetophenone (nur im Rückstand), Catechine und Flavonoide.

Benzoesäure Derivate Zimtsäure Derivate

Acetophenone

H

Flavonoide (R = H, OH, OCH3)

Catechine (R1= H, OH; R2=H, Gallussäure)

Catechine und Flavonoide zeigten die beste Radikalfängerwirkung gegenüber DPPH-Radikalen. Darüber hinaus waren alle Zimtsäurederivate mit einer 4-OH- und einer zusätzlichen 3-OH- oder 3-OCH3-Substitution potente DPPH Radikalfänder. Protocatechu-, Gallus- und Syringasäure waren aktive Benzoesäurederivate. Basierend auf

DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001

Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention diesen ersten Ergebnissen wurden die Verbindungen unter Verwendung physiologisch relevanter ROS weiter untersucht. Nur Flavonoide und Catechine waren in der Lage, chemisch generierte Superoxide Anion Radikale in einem Konzentrationsbereich unter 100µM zu inaktivieren. Die Aktivität im zellulären System war für alle Substanzen generell niedriger. Antioxidative Kapazität gegenüber Hydroxyl- und PeroxylRadikalen wurde im ORAC Test analysiert. In diesem Modell werden Radikalfängereigenschaften gegenüber Hydroxyl- und Peroxyl-Radikalen und Übergangsmetallen über den radikalvermittelten Fluorezensabfall von β-Phycoerythrin in Relation zu dem Standardantioxidanz Trolox (wasserlösliches Vit. E Analog) berechnet. Dieser Test wurde zur Erhöhung des Probenumsatzes für die Verwendung von 96-Lochplatten modifiziert. Die Abnahme der Fluoreszenz wird über eine Zeit von ca. 100 min bis zum vollständigen Abfall mit Hilfe eines MikrotiterplattenFluorimeters kontinuierlich aufgezeichnet; zur Erhöhung der Aussagekraft werden Proben in 5 Konzentrationen analysiert und die Fläche unter der Dosis-Wirkungskurve als Maß für die Radikalfängerkapazität berechnet. Interessanterweise zeigten fast alle Verbindungen im ORAC Test eine hohe Reaktivität gegenüber Hydroxyl-Radikalen, während die Kapazität, Peroxylradikale abzufangen, durchschnittlich niedriger ausfiel [2] . Diese Ergebnisse könnten einerseits in der Krebs-Chemoprävention Anwendung finden, andererseits könnten sie als Grundlage zur Entwicklung eines polyphenolreicheren Bieres dienen.

2.1.2. Krebs-chemopräventiven Wirkung von Xanthohumol, ein prenyliertes Chalcon aus Hopfen (Humulus lupulus L.) In Zusammenarbeit mit A. Alt und H. Becker, Universität des Saarlandes, Saarbrücken.

Hopfen ist eine reiche Quelle an phenolischen Verbindungen im Bier. Der Anteil an Polyphenolen im Hopfenharz, bestehend aus Phenolcarbonsäuren, prenylierten Chalconen und Flavonoiden, Catechinen und Proanthocyanidinen, liegt bei 4-14%. In früheren Untersuchungen konnte bereits gezeigt werden, daß prenylierte Flavonoide aus Hopfen den Fremdstoffmetabolismus in vitro beeinflussen. Sie hemmen verschiedene Cytochrom P450 Enzyme und induzieren die NAD(P)H:Quinon Reductase (QR) in Maus Hepatomzellen, was auf eine chemopräventive Aktivität hindeutet. Daneben wurden antioxidative, anti-proliferative und cytotoxische Effekte beschrieben. Hopfen wurde immer wieder mit einer phytoöstrogenen Wirkung in Verbindung gebracht; in dieser Hinsicht konnte 8-Prenylnaringenin als aktives Prinzip identifiziert werden. Basierend auf diesen Informationen wurde im Rahmen eines von der Wissenschaftsförderung der Dt. Brauwirtschaft e.V. unterstützten Projektes ein Hopfenextrakt in den oben beschriebenen Testsystemen analysiert. Eine

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren anschließende Aktivitäts-geleitete Fraktionierung führte zur Identifizierung von Xanthohumol, ein prenyliertes Chalcon, und einer Reihe von strukturverwandten Verbindungen. Xanthohumol

Wir konnten zeigen, daß Xanthohumol in der Initiations-, Promotions-, und Progressionsphase in die Krebsentstehung eingreifen kann. Zunächst wurde Xanthohumol als Radikalfänger untersucht und konnte Hydroxyl-, Peroxyl- und Superoxidanion-Radikale besser als Trolox inaktivieren. Eine Hemmung der Tumor-Initiation durch Modulation der Aktivität von Enzymen des Phase 1 und 2 Fremdstoffmetabolismus konnte bestätigt werden. Erstmalig konnte eine entzündungshemmende Wirkung von Xanthohumol nachgewiesen werden. Xanthohumol hemmte die Aktivität der konstitutiv exprimierten Cox 1, aber auch der induzierbaren Cox 2, und verhinderte in LPS-stimulierten Raw Makrophagen die Induktion der iNOS und Produktion von NO. Zellwachstumshemmende Wirkung konnte anti-östrogenen Eigenschaften, der Hemmung der DNA Polymerase α und einer Induktion von Apoptose und Zelldifferenzierung zugeschrieben werden. Als ersten Nachweis einer chemopräventive Wirksamkeit wurde Xanthohumol im MMOC Modell untersucht und verhinderte das Auftreten DMBA-induzierte Läsionen im nanomolaren Bereich [3, 12]. Weiterführende Untersuchungen des Metabolismus, der Bioverfügbakeit und einer Aktivität im Tiermodell sind bereits angelaufen. Diese Ergebnisse könnten einen neuen Markt für Xanthohumol oder Hopfenprodukte öffnen, wenn die Wirksamkeit auch am Menschen nachgewiesen sein wird.

2.1.3. Induktion von Zelldifferenzierung durch Sesquiterpenlactone in Kooperation mit C.A. Klaas1, I. Merfort1, V. Castro2, 1Institute of Pharmaceutical Biology, Albert-Ludwigs-University, Freiburg; 2 Escuela de Quimica, Universidad de Costa Rica, San Jose, Costa Rica.

Ein möglicher Mechanismus der Chemoprävention wird darin gesehen, Krebszellen zur Differenzierung in einen normalen, nicht krebsartigen Zustand anzuregen. Natürlich vorkommende Sesquiterpen Lactone (SLs) besitzen anti-inflammatorische und cytotoxische Wirkung. Die entzündungshemmenden Eigenschaften werden einer Inaktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB durch Alkylierung seiner p65 Untereinheit zugeschrieben. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Hemmung von NF-κB und der Induktion von Zell-Differenzierung zu untersuchen, verwendeten wir die humane promyelozytische Leukämiezelllinie HL-60. Zell-Differenzierung zu morphologisch und funktionell reifen Granulozyten oder Monozyten/Makrophagen wurde durch spezifische zelluläre Eigenschaften nachgewiesen, d..h. die Reduktion des Tetrazoliumsalzes NBT zu einem gefärbten Formazan nach Behandlung mit dem Tumor-Promoter TPA, Nachweis der nicht-spezifischen (NSE) und spezifischen (SE) Säure-Esterase und einem Rückgang der Zellproliferation.

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention

Parthenolid

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Dihydrohelenalin acetate

Bei Sesquiterpenlactonen mit einer reaktiven α-Methylenγ-lakton Gruppe, z.B. Parthenolid, beobachteten wir einen gute Korrelation zwischen der Hemmung der NF-κB DNA-Bindung und der Zellproliferation (r2=0.96), aber keinen direkten Zusammenhang mit der Induktion der ZellDifferenzierung. Andererseits konnten wir schwache NFκB Inhibitoren, einschließlich α-Methylen-butyrolakton als Referenzverbindung, und SLs ohne die α-Methylen-γlakton Gruppe, z.B. Dihydrohelenalin Acetat, als potente Induktoren von Zell-Differenzierungsprozessen identifizieren. Die Expression der nichtspezifischen Säure-Esterase zeigte eine Differenzierung in Richtung MonozytenMakrophagen. Insgesamt konnte die Induktion der ZellDifferenzierung durch SLs als unabhängig von der NF-κB Hemmung angesehen werden [4]. Weiterführende Untersuchungen mit Dihydrohelenalin Acetat unter Verwendung von DNA Makroarrays sollen nun alternative Targets identifizieren.

2.2. Untersuchung molekularer Mechanismen chemopräventiver Aktivität 2.2.1. Aktivierung anti-oxidativer zellulärer Prozesse durch Ellagsäure Unsere Ernährung spielt eine wichtige Rolle bei der Auslösung, aber auch in der Prävention verschiedenen Tumorarten. Chemopräventive Stoffe lassen sich in allen Nahrungskategorien finden, jedoch stellen Obst und Gemüse die Hauptquellen dar. Die Ellagsäure (EA) ist ein Polyphenol, das vor allem in Himbeeren, Erdbeeren und Walnüssen vorkommt. EA besitzt sowohl anti-mutagene als auch anti-carcinogene Eigenschaften. Eine krebspräventive Wirksamkeit konnte in verschiedenen Nager-Karzinogenesemodellen gezeigt werden. EA hemmt Phase 1 Cytochrom P450 Enzyme und verhindert so die Aktivierung von Karzinogenen; ferner werden Phase 2 Enzymen (Glutathion S-Transferasen und QR) induziert, die zu einer verstärkten Entgiftung von Karzinogenen beitragen.

Ellagsäure (EA)

Ziel des vorliegenden Projekts war es zu untersuchen, inwieweit auch antioxidative Mechanismen zur chemopräventiven Wirkung der EA beitragen. Dazu wurde die hepatozelluläre Karzinomzelllinie HUH-7 eingesetzt. EA, aber auch mit EA-behandelte Zellextrakte zeigten im ORAC Test hohe anti-oxidative Kapazität. Dies war zum einen auf die Induktion von Glutathion als einem der wichtigsten niedermolekularen intrazellulären Antioxidantien zurückzuführen, zum anderen wurden aber auch verschiedene antioxidative Proteine durch EA induziert. Wir

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren konnten z.B. einen Dosis- und Zeit-abhängigen Anstieg der Aktivität der Catalase and Thioredoxin Reduktase nachweisen. Mittels kompetitiver RT-PCR Analysen konnten wir zeigen, daß EA die mRNA Expression von Metallothionein I, einem thiol-reichen antioxidativen und Metall-bindenden Protein, signifikant stimuliert und auch die Proteinexpression erhöht. Aus der Induktion des antioxidativen intrazellulären Potentials resultierte insgesamt ein Schutz vor chemisch-induzierter Lipidperoxidation, bestimmt über die Spiegel des Fettsäureabbauproduktes Malondialdehyd mittels HPLC Analytik [1].

κB als molekulares Target der anti2.2.2. NF-κ inflammatorischen Wirkung von Sulforaphan, ein Isothiocyanat aus Broccoli. Erhöhte NO-Werte, die z.B. bei chronischen Entzündungen und Infektionen durch die Aktivität der induzierbaren NO Synthase (iNOS) gebildet werden, können Ursache für Mutationen und letztendlich für Krebs sein. Sulforaphan, ein aliphatisches Isothiocyanat aus Cruciferen, hemmt die Bildung von NO in Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Raw Makrophagen mit einem IC50 von 0.7µM. Sulforaphan interferiert dabei nicht mit der enzymatischen Aktivität der iNOS, sondern hemmt vielmehr die Induktion des Enzyms auf transkriptioneller Ebene, wie durch Western Blot und RT-PCR-Analysen gezeigt werden konnte. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die induzierbare Cyclooxygenase (Cox-2) erhalten. Zudem verhindert Sulforaphan die Bindung von aktiviertem NFκB, einem für die iNOS und Cox-2 Expression entscheidenden Transkriptionsfaktor, an dessen Konsensussequenz in der Promoterregion. Allerdings beeinträchtigt Sulforaphan weder den durch LPS initiierten Abbau des Inhibitors IκB noch die Translokation von NF-κB in den Zellkern. Wir konnten in weiterführenden Untersuchungen zeigen, daß Sulforaphan zu einer transienten Depletion von GSH und damit zu einer Veränderung des Redoxpotentials (GSH/GSSG System) führt und evtl. die NF-κB-Aktivität so beeinträchtigt, daß NF-κB zwar in den Kern gelangt, aber nicht an die DNA bindet und die Expression κB-abhängiger Gene aktiviert [13]. Ferner konnten wir nachweisen, daß Sulforaphan transient die Aktivität der Thioredoxin-Reduktase hemmt. Thioredoxin stellt einen Redox-Modulator dar, der im Zellkern essentiellen Cystein-Gruppen an Redox-sensitiven Transkriptionsfaktoren in einem reduzierten Zustand erhält und damit die Bindung an die DNA ermöglicht. Eine Hemmung der Thioredoxin Reduktase könnte über eine Veränderung des intranukleären Redox-Potentials zu einer Hemmung der NF-κB DNA-Bindung führen.

2.2.3. Induktion von Zell-Differenzierungsprozessen durch Histon Deacetylase Hemmstoffe In Zusammenarbeit mit M. Jung, Universität Münster

Die Entstehung von Darmkrebs kann als kontinuierliche Anhäufung von genetischen (sowohl erbliche als auch erworbene) oder biochemischen Zellschäden angesehen werden. Diese Veränderungen resultieren in

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention hyperproliferativem Wachstum von Darmepithelzellen, das durch ein komplexes Zusammenspiel von Faktoren mit Einfluß auf die Zellzyklusprogression, die Induktion zellulärer Enddifferenzierungsprozesse und Apoptose reguliert wird. Der Acetylierung und Deacetylierung von Histonen wird eine fundamentale Funktion in der Regulation von Transkription und Zell-Proliferation zugeschrieben. Verschiedene Hemmstoffe von Histon-Deacetylasen (HDAC) sind in der Literatur als Differenzierungs-Induktoren in in vitro Zellkultursystemen beschrieben. In unseren Studien wurde v.a. zwei HDAC Inhibitoren untersucht: Natrium Butyrat (SB) und Trichostatin A (TSA). SB ist besonders von Interesse, da es einen Metaboliten von Ballaststoffen aus der Nahrung darstellt, der durch anaerobe Mikroorganismen im Darm produziert wird. Die Differenzierung verschiedener Darmkrebs-Zellinien wurde über die Induktion des Glykoproteins Alkalische Phosphatase (ALP) gemessen. Histon Acetylierung konnte über die AUT Gel-Elektrophorese analysiert werden. Darüber hinaus wurde die Expression eines Inhibitors Cyclin-abhängiger Kinasen, p21, und des Retinoblasomaproteins pRB mittels Western Blotting gemessen. SB induzierte die ALP Aktivität in den DarmkrebsZelllinien LIM1215 und HCT 116 mehr als 10-fach. Eine Hyperacetylierung von Histon H4 konnte bereits nach 6h detektiert werden. Dies war ein Hinweis auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der Hemmung der HDAC und der Induktion von Zelldifferenzierung. Andererseits führte die Behandlung mit dem potenten HDAC Inhibitor TSA zwar zu einer Hyperacetylierung von H4, aber nicht zur Induktion der ALP Aktivität als Marker für Zelldifferenzierungsprozesse. Sowohl SB als auch TSA bewirkten in LIM1215 und HCT 116 Zellen nach einer 6bis 24-stündigen Behandlung eine signifikante Induktion von p21. Diese Induktion war unabhängig von p53, da wir ähnliche Effekte (Induktion der ALP Aktivität und der p21 Expression) nach SB-Behandlung auch in einer p53 (-/-) Variante von HCT 116 messen konnten. Interessanterweise konnte in einer p21 (-/-) Variante durch SB keine Differenzierung mehr induziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß für die Induktion von Zelldifferenzierungsprozesse durch HDAC Inhibitoren p21 notwendig ist, daß jedoch die Hyperacetylierung von Histonen und die p21 Induktion nicht ausreichend sind, um Zell-Differenzierung zu induzieren. Bei der Untersuchung des Phosphorylierungsgrades von pRB zeigten sich Unterscheide zwischen SB und TSA: Nach TSA Behandlung war pRb in HCT 116 Zellen in Übereinstimmung mit der verstärkten Expression von p21 hypo-phosphoryliert, in der p21 (-/-) Variante lag pRB jedoch hauptsächlich in der hyper-phosphorylierten Form vor. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit TSA konnten wir in den p21 (-/-) Zellen nach SB Behandlung Wachstumshemmung und pRB Hypo-Phosphorylierung detektieren. Diese Resultate deuten auf einen Einfluß von SB auf zusätzliche Cyclin-abhängige Kinasen bzw. Kinase-

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Inhibitoren hin und werden unter Verwendung von DNAMakroarrays weiter untersucht [18]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Gamal-Eldeen, A., Gerhäuser, C., Frank, N., Bartsch, H.: Ellagic acid induces antioxidant mechanisms in cultured human hepatocellular carcinoma cells HUH-7. Journal of Cancer Research and Clinical Oncologyy 127 Suppl. (2001). [2] Gerhäuser, C., *Alt, A., Gamal-Eldeen, A., Neumann, I., Frank, N., Chmiel, H., Bartsch, H., and *Becker, H.: Antioxidant and Radical-scavenging Potential of Phenolic Constituents of Beer. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 42 (2001a) 103. [3] Gerhäuser, C., *Alt, A., Klimo, K., Heiss, E., Neumann, I., Gamal-Eldeen, A., Knauft, J., Scherf, H., Frank, N., Bartsch, H., *Becker, H.: Xanthohumol from Hop (Humulus lupulus) as a Novel Potential Cancer Chemopreventive Agent. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 42 (2001b) 94. [4] Gerhäuser, C., Scherf, H.R., *Klaas, C.R., *Castro, V., *Merfort, I.: Induction of HL-60 Cell Differentiation by Sesquiterpene Lactones. Journal of Cancer Research and Clinical Oncologyy 127 Suppl. (2001c). [5] Gerhäuser, C., *Alt, A., Heiss, E., Gamal-Eldeen, A., Klimo, K., Knauft, J., Neumann, I., Scherf, H.-R., Frank, N., Bartsch, H., *Becker, H.: Cancer chemopreventive activity of Xanthohumol, a natural product from hop.Molecular Cancer Therapeutics (2002) [6] Gerhäuser, C.: Flavonoide und andere pflanzliche Wirkstoffe. Was hat praktische Relevanz? Sollen wir unser Essverhalten ändern? Akt. Ernähr. Med. 26 (2001) 1-7. [7] Gerhäuser, C.: Mechanismen der Krebsentstehung - Ansatzpunkte für die Krebs-Chemoprävention. Ernährungs-Umschau 48 (2001) S48 - S51. [8] Gerhäuser, C., Heiss, E., Klimo, K., Neumann, I., *Becker, H., *Eicher, Th., Bartsch, H.: Bibenzyl derivatives as novel lead compounds in chemoprevention. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41 (2000) 412. [9] Gerhäuser, C.: Chemoprävention von Krebs durch Naturstoffe. Pharmazeutische Zeitschrift, (Sonderheft Meran) (2000) 4-8. [10] Gerhäuser, C., Heiss, E., Herhaus, C., Klimo, K.: Potential Chemopreventive Mechanisms of Chalcones. Chapter 4.4 in: Dietary Anticarcinogens and Antimutagens. Chemical and Biological Aspects. Ian Johnson and Roger Fenwick: RCS, Cambridge, UK (2000), pp. 189-192. [11] *Ha, T., Gerhäuser, C., *Zhang, W., *Ho-Chong-Line, N., *Fourasté, I.: New Lanostanoids from Ganoderma lucidum (Polyporaceae) that induce NAD(P)H:quinone oxidoreductase in cultured Hepa1c1c7 murine hepatoma cells. Planta Medica 66 (2000) 681-684. [12] Heiss, E., Klimo, K., Neumann, I., Gerhäuser, C.: AntiProliferative Mechanisms of Xanthohumol from Hop (Humulus Lupulus) in in vitro Breast Cancer Chemoprevention Models. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 127 Suppl. (2001a). [13] Heiss, E., Herhaus, C., Klimo, K., Bartsch, H., Gerhäuser, C.: Nuclear factor-κB is a molecular target for sulforaphanemediated anti-inflammatory mechanisms. Journal of Biological Chemistry 276 (2001b) 32008-32016. [14] *Jung M., *Wittich, S., Xie, C., Scherf, H., Gerhauser, C.: Structure-activity data on inhibitors of histone deacetylase - In vitro enzyme inhibition, induction of differentiation and inhibition of proliferation in leukemic cells. Clinical Cancer Research 6 Suppl. (2000) 336. [15] Spaeth, M., Gerhäuser, C., Schiffter, H., Frank, N., *Nasheuer, N.P., Bartsch, H.: Inhibition of human DNA polymerase α by chemopreventive agents. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41 (2000) 846.

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Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [16] *Wittich, S., Scherf, H.R., Xie, C., *Brosch, G., *Loidl, P., Gerhäuser, C., *Jung, M.: Structure-activity relationships on phenylalanine containing inhibitors of histone deacetylase - Invitro enzyme inhibition, induction of differentiation and inhibition of proliferation in erythroleukemic cells. J. Med. Chem. (2002) [17] *Wollenweber, E., *Stevens, J.F., Klimo, K., Knauft, J., Frank, F. and Gerhäuser, C.: Cancer Chemopreventive in vitro Activities of Isoflavones Isolated from Iris germanica. [18] Xie, C.P., Scherf, H.R., Neumann, I., Gerhäuser, C.: Potential Mechanisms of Induction of Cell Differentiation by Histone Deacetylase Inhibitors. Journal of Cancer Research and Clinical Oncologyy 127 Suppl. (2001). Patente Nr. 100 15 525.1. Synthetische Derivate von Lunularsäure, Arzneimittel enthaltend diese Verbindungen, Verfahren zur Herstellung der Lunularsäurederivate sowie deren Verwendung. Erf. Gerhäuser, *Eicher, *Pick. Patentanmeldung eingereicht beim Deutschen Patentamt am 30.3.2000. Internationale Anmeldung 31.1.2001.

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Genetische Toxikologie und DNA Reparatur (C0203) P. Schmezer Die meisten beim Menschen und viele im Tierversuch krebserzeugende Stoffe besitzen in vitro eine DNA schädigende (gentoxische) Wirkung. Häufig ist jedoch eine (Gewebe)-spezifische Verstoffwechslung notwendig, um die ultimalen, DNA-reaktiven Metabolite zu bilden. Wir setzen deshalb aus verschiedenen Geweben des Menschen oder von Versuchstieren frisch isolierte, metabolisch kompetente Zellen ein, um die gentoxische Wirkung von Stoffen zu untersuchen [1]. Dieses Ziel kann jedoch nur dann effektiv erreicht werden, wenn experimentelle Methoden zur Verfügung stehen, die den Nachweis einer gentoxischen Wirkung an wenigen Zellen erlauben. Mit einer derartigen Methode können auch Zellen untersucht werden, die aus kleinen durch Biopsie beim Menschen gewonnenen Gewebestücken isoliert werden. Hierfür ist die Methode der Einzelzell-Mikrogel-Elektrophorese (alkalischer Comet Assay) besonders geeignet. Wir haben diese Methode optimiert und zur allgemeinen Untersuchung von Gentoxizität sowie zur Analyse spezifischer (z.B. oxidativer) DNA Schäden eingesetzt [2,3]. Zusätzlich verwenden wir die Mikrogel-Elektrophorese zur Untersuchung von DNA Reparaturprozessen. Unsere Forschungsarbeiten beinhalten Untersuchungen von gentoxischen und cancerogenen luftgetragenen Schadstoffen, vorwiegend im Respirationstrakt [4]. Zur Identifizierung möglicher DNA schädigender und krebserzeugender Noxen wurden auch in vivo Mutationsanalysen bei transgenen Nagetieren (BigBlue, MutaMouse) [5,6] sowie mittels ‚hprt T-cell cloning’ beim Menschen durchgeführt [7]. In den letzten Jahren haben wir einen Schwerpunkt unserer Arbeiten darauf ausgerichtet, in populationsbasierten Studien Personen mit hohem individuellem Risiko gegenüber gentoxischen Noxen zu identifizieren: In Zusammenarbeit mit Epidemiologie und Klinik setzen wir eine optimierte Version des Comet Assay ein, um sowohl die zelluläre Mutagensensitivität als auch die DNA Reparaturkapazität in peripheren Blutlymphozyten zu ermitteln [11, 14]. Zusätzlich werden PCR-gestützte Verfah-

Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren ren zur Bestimmung von Polymorphismen bei DNA Reparatur- [20] und Fremdstoffmetabolismus-Genen [13,19] angewandt. Schließlich führen wir Untersuchungen zur Expression dieser Gene durch, wobei sowohl selbst entwickelte cDNA Arrays als auch quantitative RT-PCR (realtime) zum Einsatz kommen [6]. Die Identifizierung von sogenannten Hochrisikopersonen, die eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber gentoxischen Stoffen oder Strahlung, eine reduzierte DNA Reparaturkapazität oder spezifische Defekte bei DNA Reparaturenzymen aufweisen, kann einen wichtigen Beitrag zur Krebsprävention leisten: Diese Personen können einem engmaschigen Screening zur Krebsfrüherkennung zugeführt werden, und sie stellen geeignete Kandidaten für chemopräventive Interventionsstudien dar. Schließlich besteht eine neue Aktivität der Arbeitsgruppe in der Suche und Bewertung von Stoffen, die in der Lage sind, das zelluläre DNA Reparaturvermögen zu verbessern.

1. DNA-Reparaturkapazität und Mutagensensitivität als Risikofaktoren für das nicht-kleinzellige Bronchialcarcinom P. Schmezer, C. Mayer, O. Popanda, N. Rajaee-Behbahani, A. Risch, R. Gliniorz, O. Zelezny, P. Waas In Zusammenarbeit mit: W. Rittgen, Biostatistik, DKFZ; P. Drings, H. Dienemann, K.W. Kayser, V. Schulz, Thoraxklinik HeidelbergRohrbach

Die Fähigkeit zur DNA-Reparatur ist eine wesentliche Voraussetzung für die Erhaltung der Erbinformation und für den korrekten Ablauf zellulärer Funktionen. Störungen in der DNA-Reparatur können das individuelle Krebsrisiko erhöhen. Daher ist es wichtig, Methoden für den Einsatz in molekular-epidemiologischen Studien zu entwickeln, mit denen es verlässlich möglich ist, solche Risikoindividuen zu identifizieren, die spezifische genetische Veränderungen tragen (Polymorphismen in DNAReparaturgenen), oder die eine verminderte Reparaturfunktion (DNA-Reparaturkapazität) aufweisen. Für letzteres haben wir eine Mikrogel-Elektrophorese-Technik entwickelt, mit der die individuelle DNA-Reparaturkapazität an peripheren Blutlymphozyten bestimmt werden kann [14]. Diese Methode wurde in einer Fall-Kontroll-Studie mit Patienten validiert, die am nichtkleinzelligen Bronchialcarcinom erkrankt waren [11]. Hierzu wurden periphere Blutlymphozyten von 160 Krebspatienten und 180 Kontrollpersonen gewonnen. Letztere waren zum Zeitpunkt der Blutentnahme nicht an Krebs erkrankt, befanden sich jedoch zur Behandlung anderer Lungenerkrankungen im selben Krankenhaus. Die Zellen wurden bei -80° C gelagert. Nach dem Auftauen wurden sie mit PHA stimuliert und anschließend mit Bleomycin behandelt (20µg/ml über 30 min). Danach wurden sowohl die Bleomycin-(Mutagen-)sensitivität als auch die DNA-Reparaturkapazität der Zellen bestimmt: Patienten mit Bronchialkarzinom zeigten im Durchschnitt eine deutlich erhöhte Mutagensensitivität gegenüber den Kontrollpatienten (p