1 - Profesora Maribel Arnes

FACULTAD CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS

LABORATORIO ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA. PLAN COMÚN AGRONOMÍA E INGENIERÍA FORESTAL

TRABAJO PRÁCTICO Nº3 CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA DEL EXTRACTO CRUDO DE PAPA I.- INTRODUCCIÓN Los catalizadores son agentes capaces de acelerar una reacción química disminuyendo la energía de activación y sin formar parte de los productos finales ni degradarse en el proceso. Las enzimas son macromoléculas de gran interés en los sistemas biológicos, al ser los catalizadores en las transformaciones químicas intracelulares. Casi todas las enzimas conocidas son proteínas, sin embargo, existen moléculas de RNA que son activas catalíticamente, pero corresponden a casos muy especiales. La función de una enzima es aumentar la velocidad de la reacción y para ello posee tres características importantes: 1. Son los catalizadores biológicos más eficientes conocidos; pudiendo acelerar una reacción hasta 107 veces, con concentraciones muy pequeñas de enzima (µmoles). 2. La mayoría de las enzimas se distinguen por una especificidad de acción en que virtualmente, cada conversión de sustrato a un producto es catalizada preferencialmente por una enzima. 3. La acción de muchas enzimas está regulada, ya sea por proteínas reguladoras, modificación covalente ó retroinhibición, siendo capaces de cambiar de un estado de baja a uno de alta actividad.

Aunque algunas enzimas tienen nombres no descriptivos, tales como: tripsina, pepsina, renina, lisozima, entre otras; la mayor parte es denominada agregando el sufijo “-asa” al nombre del sustrato sobre el cual actúan ó basándose en el tipo de reacción que catalizan. Existen seis grandes grupos de clasificación internacional para las enzimas: 1. Oxidoreductasas: Catalizan reacciones de oxido-reducción.

Están asociadas a

coenzimas. Ej.: Lactato deshidrogenasa (oxidación lactato a piruvato, utilizando NAD como coenzima). 2. Transferasas: Catalizan transferencias de grupos funcionales (amina, carboxilo, carbonilo, metilo, fosforilo, entre otros) desde un sustrato a otro. Ej.: Transaminasas (permiten ceder un grupo amina).

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Diseño y creación : Hans Krautwurst y Jorge Martínez

3. Liasas: Catalizan ruptura de uniones C=C, C=S, y C=N de la molécula del sustrato. Ej.: fructosa bifosfato aldolasa (fructosa 1,6-bifosfato en dos triosas fosfato). 4. Ligasas - Sintetasas: Catalizan la formación de enlaces entre C y O, N, S. Ej.: Glutamina sintetasa (ácido glutámico + amoniaco, forman glutamina). 5. Isomerasas: Interconvierten isómeros (ópticos, geométricos, de posición). Ej.: Triosa fosfato isomerasa (interconversión de Dihidroxiacetonafosfato a Dgliceraldehido-3-fosfato). 6. Hidrolasas: Catalizan la ruptura de enlaces C-O, C-N, C-S y O-P por adición de una molécula de agua. Ej.: Fosfatasas.

Las fosfatasas están presentes en prácticamente todos los organismos animales y tienen un rol importante dentro del metabolismo de los hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos, entre otros.

Las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de fosfato mono éster con la

consecuente liberación de fosfato inorgánico, según la siguiente reacción general:

Nota: donde, R-OH puede ser una variedad de alcoholes orgánicos.

Algunas de éstas enzimas solamente actúan sobre ciertos sustratos, por lo que, usualmente se le asigna su nombre de acuerdo a la reacción fisiológica que realizan. Por ejemplo, fructosa bisfosfato fosfatasa (fructosa 1,6- bisfosfato → fructosa 6- fosfato + Pi) cataliza una reacción intermediaria en la gluconeogénesis. Sin embargo, otro grupo de fosfatasas está también presente en las células de muchos organismos. Estas enzimas tienen una amplia especificidad de sustratos y son generalmente clasificadas como fosfatasas ácidas ó fosfatasas alcalinas, sobre la base de su pH óptimo de funcionamiento. 1.- Medición de la actividad enzimática 1.1.- Ensayo de una enzima: La presencia de una enzima se demuestra generalmente siguiendo la desaparición del sustrato ó la aparición del producto de la reacción. La enzima se incuba con el sustrato bajo condiciones cuidadosamente controladas (pH, temperatura, etc.) y se sacan alícuotas a intervalos de tiempo apropiados para ser analizadas. Siempre hay que realizar controles para conocer la posible contaminación del medio de ensayo con productos. controles típicos son:

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Diseño y creación : Hans Krautwurst y Jorge Martínez

Los

a) Tiempo cero de la reacción enzimática: mide el producto presente en el medio de ensayo antes de comenzar la incubación a la temperatura determinada, este control se hace sin incubación a la temperatura determinada. b) Control no enzimático: además del producto contaminado presente inicialmente, mide el producto generado no enzimáticamente durante la incubación a una temperatura determinada. Una unidad enzimática es la cantidad de enzima que produce la liberación de un µmol del producto por unidad de tiempo en las condiciones de ensayo enzimático determinadas. La actividad enzimática de una solución de enzima se expresa en unidades (U) por mL y es una medida de la concentración de enzima en solución:

El grado de purificación de la enzima se determina generalmente con la actividad específica, que mide la cantidad de enzima por mg de proteínas totales. Por lo tanto, la pureza de una preparación enzimática puede expresarse arbitrariamente con U/mg de proteína:

En este trabajo práctico se trabajará con la enzima fosfatasa ácida proveniente de un extracto crudo de la papa. Este extracto crudo será utilizado para determinar la actividad enzimática y estudiar las propiedades cinéticas de la enzima fosfatasa ácida. El ensayo a utilizar, toma la ventaja de la amplia especificidad de la fosfatasa ácida por el sustrato artificial denominado pnitrofenilfosfato (pNPP). El grado de hidrólisis de este sustrato es determinado por medidas espectrofotométricas del p-nitrofenol liberado en la reacción. En solución alcalina el ión pnitrofenolato absorbe luz fuertemente en la región de 405 nm ( Figura 1).

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Figura 1.- Reacción catalizada por la Fosfatasa ácida (1) cuyo producto, el p-nitofenol, es detectado espectrofotométricamente a los 405 nm.

II.- OBJETIVOS 1.- Objetivo General Conocer las propiedades de las enzimas, a través del estudio cinético de éstas, utilizando métodos de espectrofotometría. 2.- Objetivos Específicos - Medir actividad enzimática de la Fosfatasa ácida. - Determinar el pH óptimo de la Fosfatasa ácida. III.- PARTE EXPERIMENTAL 3.1.- Curva de calibración con p-nitrofenol. 1) Preparar una serie de 6 tubos de ensayo adicionando los volúmenes de los compuestos, según la siguiente tabla: Volumen asignado a cada tubo (mL)

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Compuesto

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

p-nitrofenol 60 µM

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

NaOH 0,02 M

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

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2) Rotular cada tubo con su número correspondiente y taparlos con parafilm para mezclarlos por inversión. 3) Transferir la muestra del tubo Nº 1 al tubo del espectrofotómetro, hasta completar aproximadamente ¾ de su capacidad. 4) Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia, utilizando el tubo Nº 1 (blanco), a una longitud de onda de 405 nm. 5) Retirar el contenido del tubo del espectrofotómetro, repetir el paso Nº 3 con el resto de los tubos en orden creciente. Cada vez registre el valor de absorbancia obtenido. 6) Graficar los datos de absorbancia registrados para las muestras versus la concentración del pnitrofenol de cada tubo. 3.2.- Efecto del pH en la reacción enzimática. Para determinar el efecto del pH en la actividad enzimática, se medirá la reacción de la enzima a distintos valores de pH, para lo cual se utilizará tampón citrato a los siguientes valores de pH: 3,0; 4,0; 4,8; 5,2; 5,7 y 6,2.

1) Preparar una serie de tubos adicionando los volúmenes de los compuestos, según la siguiente tabla: Volumen asignado a cada tubo (mL) Compuesto

B

C

1

2

3

4

5

6

p-nitrofenilfosfato 12,5 mM

-

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

MgCl2 25 mM

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Tampón citrato

-

-

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

Agua

4,5

3,5

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

pH del Tampón citrato

-

-

3,0

4,0

4,8

5,2

5,7

6,2

B: Blanco (no contiene sustrato) C: Control (no contiene enzima y mide la hidrólisis química del sustrato) MgCl2 (cofactor): La enzima es dependiente del magnesio para su actividad.

2) Agregar 1 mL del extracto enzimático a cada tubo, excepto al tubo control (C). 3) Agitar suavemente cada tubo e incubar a 37 ºC por 15 minutos. 4) Durante la incubación, preparar 8 tubos que contengan 5 mL de NaOH 0,1 M y rotule. 5) Terminada la incubación, transferir rápidamente una alícuota de 1 mL de cada tubo incubado a un tubo con NaOH 0,1 M. 6) Ajustar a cero de absorbancia usando el tubo B (blanco), a una longitud de onda de 405 nm. 7) Retire el contenido del tubo del espectrofotómetro, mida la absorbancia para el resto de los tubos como se realizó anteriormente.

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8) Con los datos de absorbancia obtenidos de cada tubo proceda a interpolar estos en la curva de calibración elaborada anteriormente, de modo de obtener la concentración de producto (pnitrofenol) y así determinar la actividad enzimática de la fosfatasa ácida. NOTA La actividad enzimática para cada tubo se determina con la siguiente fórmula:

En este caso particular tenemos:

9) Graficar en papel milimetrado la actividad enzimática versus el pH.

IV.- REFERENCIAS 1.- Química Biológica. Antonio Blanco. Séptima Edición. 2001. Editorial El Ateneo. 2.- Bioquímica. Lubert Stryer. Tercera Edición. 1990. Editorial Reverté. 3.- Bioquímica. Horton; Moran; Ochs; Rawn; Scrimgeour. Primera Edición. 1995. Editorial Prentice-Hall Hispanoamericana. 4.- Bioquímica Dinámica. Borel; Randoux; Maquart; Le Peuch; Valiere. Editorial Médica Panamericana. 5.- Bioquímica Analítica. D.J. Holme; H. Peck. Primera Edición. 1987. Editorial Longman Group Limited. 6.- Principles of Biochemistry. Lehninger, A. L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. 2nd ed., Worth Publishers., 1993.

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