Die Reduktion des aktivierten Sulfates - Ruhr

Dissertation

vorgelegt zur Erlangung eines Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr−Universität Bochum

Die Reduktion des aktivierten Sulfates

von

Christopher Horst Lillig aus Berlin

angefertigt am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen unter der Betreuung von Privat Dozent Dr. Jens−Dirk Schwenn

„ Zweifle an allem wenigstens Einmal, und wäre es auch der Satz: zweimal 2 ist 4.“ Georg Christoph Lichtenberg (Sudelbuch K, 303)

Referent: Priv. Doz. Dr. Jens−Dirk Schwenn Korreferent: Prof. Dr. Elmar Weiler Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2001

für Nicole

Danksagungen An dieser Stelle möchte ich mich sehr herzlich bei meinem Doktorvater und akademischen Lehrer Herrn Priv.−Doz. Dr. Jens−Dirk Schwenn bedanken. Seine Anregungen, die fruchtbaren Diskus− sionen, das gute Arbeitsklima und die hervorragende Ausstattung der Arbeit werde ich immer in bester Erinnerung behalten. Herrn Prof. Dr. Elmar Weiler danke ich herzlich für die Übernahme des Korreferates. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Graduiertenkollegs „Biogenese und Mechanismen komplexer Zellfunktionen“ erstellt. Bei den Dozenten und den Kollegiaten bedanke ich mich für ihr Interesse an meiner Arbeit und für die Öffnung meines wissenschaftlichen Horizontes für neue Themen und Methoden. Herrn Dr. Fredrik Åslund, Herrn Dr. Alexios Vlamis−Gardikas und Herrn Prof. Dr. Dr. Arne Holmgren vom Karolinska Institut in Stockholm, Schweden möchte ich danken für die Überlassung der Redoxproteine Glutaredoxin 1−C14→S, Glutaredoxin 4 und T4−Glutaredoxin sowie für die Plasmide die eine Klonierung des Glutaredoxin 1−Genes grxA ermöglichten. Bei Prof. Dr. Yves Meyer von der Universität Perpignan, Frankreich und bei Prof. Dr. Jean−Pierre Jacquot von der Universität Nancy, Frankreich möchte ich mich für die Überlassung der Thiore− doxine TrxH1, TrxH2, TrxH3 und TrxH4 aus Arabidopsis thaliana bedanken. Herrn Dr. Eckhard Bill vom Max−Planck Institut für Strahlenchemie in Mühlheim an der Ruhr danke ich für die Zusammenarbeit bei der Tiefsttemperatur−EPR−Spektroskopie und für die wertvollen Diskussionen. Herrn Dr. Jürgen Wittsiepe von der Abteilung für Hygiene, Sozial− und Umweltmedizin der Ruhr− Universität danke ich für die Zusammenarbeit bei der Atomabsorptions−Spektroskopie. Im weiteren bedanke ich mich bei den früheren und aktuellen Mitgliedern der „Arbeitsgruppe Schwenn“ für das gute Arbeitsklima und ihre wertvollen Ratschläge. Insbesondere gilt dieser Dank Herrn Dr. Thomas Haverkamp, Frau Dr. Antje Berken geb. Prior, Frau Annette Wiessmann, Herrn Matthias Staudinger, Frau Eva Zahradnik und Herrn Carsten Berndt.

Inhalt

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Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................................10 1.1 Die assimilatorische Sulfatreduktion....................................................................................10 1.1.1 Aktivierung des Sulfates...............................................................................................10 1.1.2 Reduktion des Sulfates zum Sulfit und Sulfid...............................................................12 1.1.3 Synthese des Cysteins...................................................................................................13 1.2 Die Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen........................................................................13 1.2.1 Mikrobielle PAPS−Reduktasen....................................................................................14 1.2.2 Pflanzliche APS−Reduktasen.......................................................................................16 1.2.3 Bakterielle APS−Reduktasen........................................................................................18 1.3 Zielsetzung...........................................................................................................................19 2 Material und Methoden................................................................................................................20 2.1 Geräte und Feinchemikalien.................................................................................................20 2.2 Bakterienstämme..................................................................................................................20 2.3 Plasmide..............................................................................................................................21 2.3.1 Expressions− und Klonierungsvektoren........................................................................21 2.3.2 Rekombinante Plasmide...............................................................................................21 2.4 Oligonukleotide...................................................................................................................23 2.5 Mikrobiologische Methoden.................................................................................................24 2.5.1 Kulturmedien................................................................................................................24 2.5.2 Anzucht von Bakterienkulturen....................................................................................25 2.5.3 Herstellung kompetenter Bakterienzellen.....................................................................25 2.5.4 Transformation kompetenter Bakterienzellen...............................................................26 2.5.5 Bakterienzellaufschluss.................................................................................................26 2.6 Molekularbiologische Methoden..........................................................................................26 2.6.1 Präparation von Plasmid−DNA....................................................................................26 2.6.2 Standardtechniken........................................................................................................26 2.6.3 Polymerase−Kettenreaktion (PCR)...............................................................................26 2.6.4 Ortsgerichtete Mutagenese............................................................................................27 2.6.5 DNA−Sequenzierung....................................................................................................27 2.7 Biochemische Methoden .....................................................................................................27 2.7.1 Proteinchemische Methoden.........................................................................................27 2.7.1.1 Proteinbestimmung...............................................................................................27 2.7.1.2 SDS−Polyacrylamid−Gelelektrophorese...............................................................27 2.7.1.3 Native Polyacrylamid−Gelelektrophorese.............................................................28 2.7.1.4 Native Reinigung von Histidin−Fusionsproteinen.................................................28 2.7.2 Enzymtests...................................................................................................................29 2.7.2.1 Synthese der radioaktiven Nukleotide [35S]PAPS und [35S]APS............................29 2.7.2.2 Bestimmung der Aktivität der APS− und PAPS−Reduktasen................................29 2.7.2.3 Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase..........................................................30 2.7.2.3.1 Photometrische Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase..........................30 2.7.2.3.2 Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase mittels HPLC............................30 2.7.2.3.3 Bestimmung des Produktes [35S]PAPS mit Hilfe der PAPS−Reduktase.........30 2.7.2.3.4 Phosphorylierung der APS−Kinase................................................................31 2.7.3 Nachweis von Adeninnukleotiden mittels reversed−phase−HPLC................................31 2.8 Immunologische Methoden..................................................................................................31 2.8.1 Elektrotransfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen (Western−Blot)...............31 2.8.2 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen....................32 2.9 Spektroskopie......................................................................................................................32 2.9.1 (Differenz−) Absorptions−Spektroskopie.....................................................................32 2.9.2 Fluoreszenz−Spektroskopie..........................................................................................33

Inhalt

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2.9.3 EPR−Spektroskopie......................................................................................................33 2.9.4 Atomabsorptions−Spektroskopie..................................................................................33 2.10 Computergestützte Arbeiten...............................................................................................33 2.10.1 Mathematische Berechnungen....................................................................................33 2.10.2 Auswertung von Nukleotid− und Aminosäuresequenzen............................................34 2.10.3 Homologiebasierte Modellierung von Proteinstrukturen.............................................34 2.10.4 Darstellungen und Analyse von Molekülstrukturen....................................................34 2.10.5 Abbildungen...............................................................................................................35 3 Ergebnisse...................................................................................................................................36 3.1 Aktiviertes Sulfat.................................................................................................................36 3.1.1 PAPS Bildung durch die APS−Kinase..........................................................................36 3.1.2 Optimierung der Reaktionsbedingungen und Aktivierung der APS−Kinase.................37 3.1.3 „Steady−state“ Analyse der PAPS−Bildung..................................................................38 3.2 Die PAPS−Reduktase aus Escherichia coli..........................................................................40 3.2.1 Interaktionen der PAPS−Reduktase mit ihren Substraten.............................................41 3.2.1.1 Inhibierung der PAPS−Reduktase durch Purinnukleotide.....................................41 3.2.1.2 Modell der PAPS−Bindung...................................................................................43 3.2.1.3 Funktionsanalyse des Arginin R164 durch ortsgerichtete Mutagenese.....................45 3.2.1.4 Wechselwirkungen der PAPS−Reduktase mit Redoxproteinen der Thioredoxin− Familie..............................................................................................................................46 3.2.1.4.1 Expression des Thioredoxin 1 und Glutaredoxin 1 aus E. coli ......................46 3.2.1.4.2 Untersuchung der Reduktion der PAPS−Reduktase mit der Glutaredoxin 1− Mutante C14→S.............................................................................................................47 3.2.1.4.3 Heterologe Thio− und Glutaredoxine als Elektronendonatoren der PAPS− Reduktase.....................................................................................................................48 3.2.2 Redoxeigenschaften der PAPS−Reduktase aus E. coli..................................................50 3.2.2.1 UV−Absorptions−Spektroskopie zur Charakterisierung von redoxinduzierten Konformationsänderungen................................................................................................50 3.2.2.2 Bestimmung des Standard−Redoxpotentials der PAPS−Reduktase.......................53 3.3 Das PAPS−Reduktase−homologe Protein CysH1 aus Bacillus subtilis.................................55 3.3.1 Expression und Reinigung des CysH1−Proteins aus Bacillus subtilis ..........................55 3.3.2 Eigenschaften des rekombinanten Proteins...................................................................56 3.3.3 Substratspezifität des CysH1−Proteins aus Bacillus subtilis .........................................56 3.4 Die APS−Reduktase aus Catharanthus roseus.....................................................................58 3.4.1 Anpassung der Expression der APS−Reduktase in E. coli............................................59 3.4.2 Eigenschaften der rekombinanten APS−Reduktase.......................................................59 3.4.3 Homologie−basierte Modellierung der Struktur der APS−Reduktase aus Catharanthus roseus....................................................................................................................................60 3.5 Enthalten die Sulfonukleotid−Reduktasen Metalle?.............................................................63 3.5.1 Elektronen−paramagnetische−Rosonanz−Spektroskopie..............................................63 3.5.2 Abhängigkeit der EPR−Signale vom Vorhandensein des Oligohistidin−Anteils...........67 3.5.3 Anpassung der Medien für die rekombinante Expression.............................................68 3.5.4 Atomabsorptions−Spektroskopie..................................................................................69 3.5.5 Untersuchung des ECGLH−Motivs mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese..............70 4 Diskussion...................................................................................................................................73 4.1 Die assimilatorische Sulfonukleotid−Reduktion...................................................................73 4.1.1 Thio− und Glutaredoxine als Elektronendonor.............................................................73 4.1.2 Das Standard−Redoxpotential der PAPS−Reduktase aus E. coli...................................77 4.1.3 Wechselwirkungen der PAPS−Reduktase mit ihrem Substrat PAPS.............................79 4.1.4 Sulfonukleotid−Spezifität der Sulfonukleotid−Reduktasen...........................................81 4.1.5 Folgen der Sulfonukleotid−Spezifität...........................................................................82 4.1.6 Reaktionszyklus der Sulfonukleotid−Reduktasen.........................................................83

Inhalt

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4.1.7 Chromophore Gruppen & Elektronen−Transfer............................................................86 4.1.7.1 Kupfer in den Sulfonukleotid−Reduktasen............................................................87 4.1.7.2 Eisen in den Sulfonukleotid−Reduktasen aus C. roseus und B. subtilis.................89 4.1.7.3 Relevanz der vorgestellten Ergebnisse vor dem Hintergrund einer möglichen Beteiligung von Metallen bei der Reaktion.......................................................................92 4.1.8 Phylogenie der Sulfonukleotid−Reduktasen..................................................................93 4.1.9 Ausblick.......................................................................................................................95 5 Zusammenfassung.......................................................................................................................97 6 Literatur.......................................................................................................................................99

Inhalt

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Abkürzungen AAS Abb. ADP AMP Amp APS AR A. thaliana ATP B. subtilis cAMP CoA C. roseus C−Terminus DEAE d.h. DNA dpm DTT E. coli E EDTA EPR Fd ggf. GMP Grx GSH GSSG GTP HPLC IPTG Kap. kDa mind. NAD(H) NADP(H) N−Terminus OD ox PAP PAPS PCR PDB PEP PPi red RNase rpm SDS−PAGE

Atomabsorptions−Spektroskopie Abbildung Adenosin−5´Diphosphat Adenosin−5´Monophosphat Ampicillin Adenylylsulfat APS−Reduktase Arabidopsis thaliana Adenosin−5´Triphosphat Bacillus subtilis zyklisches Adenosin−5´Monophosphat Coenzym A Catharanthus roseus Carboxy−Terminus eines Proteins Diethylaminoethyl das heißt Desoxyribonukleinsäure Zerfälle pro Minute Dithiotreitol Escherichia coli Extinktion Ethylendiamin−N,N,N´,N´−Tetraessigsäure Elektronen−paramagnetische−Resonanz Ferredoxin gegebenenfalls Guanosin−5´Monophosphat Glutaredoxin Glutathion, reduziert Glutathion, oxidiert Guanosin−5´Triphosphat Hochleistungs−Flüssigchromatografie (high performance liquid chromatography) Isopropyl−β−D−Thiogalaktosid Kapitel Kilodalton mindestens Nicotinamidadenindinukleotid oxidiert (reduziert) Nicotinamidadenindinukleotidphosphat oxidiert (reduziert) Amino−Terminus eines Proteins optische Dichte oxidiert 3´Phosphoadenosin−5´Phosphat Phosphoadenylylsulfat Polymerase Kettenreaktion Proteindatenbank Phosphoenolpyruvat anorganisches Pyrophosphat reduziert Ribonuklease Umdrehungen pro Minute Natriumdodecylsulfat−Polyacrylamid−Gelelektrophorese

Inhalt SN SNR s.o. s.u. Tab. TBAH TEMED Tet Trx Tris vgl. z.T.

IX Sulfonukleotid Sulfonukleotid−Reduktase siehe oben siehe unten Tabelle Tetrabutylammoniumhydroxid N,N,N´,N´−Tetramethyldiamin Tetrazyklin Thioredoxin Tris−[Hydroxymethyl]−Aminomethan vergleiche zum Teil

Die Abkürzungen der DNA−Bausteine im Einbuchstabencode und der Aminosäuren im Ein− oder Dreibuchstabencode erfolgte gemäß der IUPAC Nomenklatur. Die Position von Aminosäuren in− nerhalb einer Primärstruktur wurde ggf. durch tiefgestellte Indizes angegeben.

Abkürzungen kinetischer Konstanten Kcat Ki KI Km KS Vmax vopt Q10

[s−1] [mol l−1] [mol l−1] [mol l−1] [mol l−1] [µmol mg−1 min−1] [µmol mg−1 min−1]

Umsatzrate pro aktivem Zentrum Dissoziations−Konstante des Enzym−Inhibitor−Komplexes Inhibierungs−Konstante Michaelis−Menten−Konstante, Substratkonzentration bei ½ Vmax Dissoziations−Konstante des Enzym−Substrat−Komplexes maximale Reaktionsgeschwindigkeit optimale (d.h. maximal gemessene) Reaktionsgeschwindigkeit Relative Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit bei Zunahme der Tem− peratur um 10 K

Anmerkung zur Rechtschreibung Diese Arbeit wurde nach den Regeln der neuen Rechtschreibung gemäß der Wiener Absichtser− klärung vom 1.6.1996 mit Gültigkeit ab 1.8.1998 verfasst.

Einleitung

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1 Einleitung Schwefel ist wegen seiner Vielseitigkeit eines der wichtigsten Elemente in allen Lebewesen. Er findet in seiner hexavalenten Form (SO42−) Verwendung für Sulfatierungs− und Entgiftungsreak− tionen, in der tetravalenten Form (SO32−) ist er als Sulfonsäurerest in den Sulfolipiden der photo− synthetischen Membranen zu finden und in der divalenten Form (S2−) ist der Schwefel Bestandteil der Aminosäuren Cystein und Methionin und einer großen Gruppe von Kofaktoren. Während Tiere reduzierten Schwefel mit der Nahrung aufnehmen müssen, können höhere Pflanzen, Bakterien und Pilze Sulfat als Schwefelquelle für die Synthese nutzen. Das aufgenommene Sulfat wird dabei in der Reaktionsfolge der assimilatorischen Sulfatreduktion enzymatisch zum divalenten Sulfid re− duziert.

1.1 Die assimilatorische Sulfatreduktion Die Reduktion des Sulfates zum Sulfid in der assimilatorischen Sulfatreduktion ist ein endergoner Prozess. Mit einem Energiebedarf von ∆G0´ = 733 kJ mol−1 ist er deutlich energieintensiver als die Stickstoff− oder Kohlenstoffassimilation. Die Assimilation des Sulfates in allen Schwefel autotro− phen Organismen kann in 4 Phasen unterteilt werden (Übersichten in: Schwenn, 1994; Hell, 1997; Schwenn, 1997; Leustek und Saito, 1999). Nach Aufnahme des Sulfates und seinem Transport zum Reaktionsort wird der Schwefel durch Adenylierung und Phosphorylierung aktiviert. Das aktivierte Sulfat wird zum Sulfit und Sulfid reduziert. Die Fixierung des Sulfid−Schwefels mündet schließ− lich im Primärprodukt dieser Reaktionsfolge Cystein. 1.1.1 Aktivierung des Sulfates Sulfat ist chemisch relativ inert und unter physiologischen Bedingungen nicht auf di− rektem Weg zu Sulfit reduzierbar. Die Diffe− renz des Standard−Redoxpotentials des Paares Sulfat/Sulfit beträgt ∆E0´ = −517 mV (Thauer et al., 1977). Das Sulfat muss daher durch Adenylierung zum Adenylylsulfat (APS) und Phosphorylierung zum Phosphoadenylylsulfat (PAPS) aktiviert werden. Dies senkt die Po− tentialdifferenz der Redoxpaare APS/Sulfit bzw. PAPS/Sulfit auf −60 mV. Abbildung 1: Struktur des Adenylyl (APS)− und Phosphoadenylylsulfates (PAPS)

Einleitung

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Der erste Aktivierungsschritt erfolgt durch die Gruppe der ATP−Sulfurylasen (EC 2.7.7.4). Diese setzen das Sulfat mit ATP magnesiumabhängig zu APS und Pyrophosphat (PPi) um: (1)

SO42− + MgATP2− + H+

APS2− + MgPPi

Das Gleichgewicht der Sulfat−Adenylierung liegt mit einem ∆G0´ von 45 kJ mol−1 weit auf der Seite der Edukte, zudem wird das Enzym durch sein Produkt APS effektiv gehemmt (Seubert et al., 1985). Um einen Stofffluss in Richtung des APS zu ermöglichen müssen die Produkte der Reaktion aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Das Pyrophosphat kann durch Hydrolyse durch die anor− ganische Pyrophosphatase (EC 3.6.1.1) exergon gespalten werden (∆G0´ = −33.5 kJ mol−1), das APS wird durch die weitere Reaktion der APS−Kinase umgesetzt. Innerhalb der Familie der ATP−Sulfurylasen gibt es bezüglich ihrer Primärstrukturen zwei unabhängige Gruppen. Die erste Gruppe wird von Enzymen aus Pflanzen, Pilzen und einigen Eu− bakterien gebildet, die als Homooligomere mit Monomeren von 48 − 64 kDa vorliegen (Übersicht in: Schwenn, 1997). In Pilzen weisen die Monomere gegenüber den pflanzlichen eine APS−Kinase homologe C−terminale Extension mit rein regulatorischer Funktion auf (Renosto et al., 1990; Fos− ter et al., 1994; Borges−Walmsley et al., 1995; McRae et al., 2000a). Für das Enzym aus Saccha− romyces cerevisiae wurde aktuell die erste Kristallstruktur eines Proteins dieser Familie vorgestellt (Ullrich et al., 2001). Sie repräsentiert einen dreiteiligen Komplex aus dem Homohexamer und den Produkten APS und PPi. Die zweite Gruppe wird von bakteriellen Enzymen gebildet, die als He− terodimere vorliegen. In Escherichia coli ist die ATP−Sulfurylase ein Dimer aus einer kleineren Untereinheit (35 kDa, cysD) und einer großen (53 kDa, cysN). Während letztere GTPase−Aktivität aufweist, katalysiert die kleine Untereinheit die Adenylierung. Die APS−Bildung durch diese En− zyme ist obligat auf eine Aktivierung durch GTP angewiesen, dessen Hydrolyse die Reaktion vo− rantreibt und reguliert (Liu et al., 1994a; Liu et al., 1994b; Wang et al., 1995; Yang und Leyh, 1997; Liu et al., 1998; Wei und Leyh, 1999). Den zweiten Aktivierungsschritt, die Phosphorylierung des APS mit einem MgATP2− Komplex als Substrat, katalysieren die APS−Kinasen (EC 2.7.1.25): (2)

APS2− + MgATP2−

PAPS4− + MgADP− + H+

Diese Reaktion ist aus energetischer Sicht ein exergoner Prozess (∆G0´ = −25 kJ mol−1 ). Dies und die sehr hohe Affinität dieser Enzyme für das Substrat APS im Bereich von 10−6 mol l−1 (Jender und Schwenn, 1984; Renosto et al., 1984; Satishandran et al., 1992) bilden eine ideale Grundlage für die Überwindung der thermodynamischen Barriere der Sulfat−Adenylierung. Die Enzyme die−

Einleitung

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ser Familie bilden eine sehr homogene Gruppe mit einem Molekulargewicht von 22 − 30 kDa, die Identität der Primärstrukturen aus A. thaliana und E. coli beträgt beispielsweise ~ 48 %. Das an diesen Enzymen augenfälligste Merkmal ist eine sehr hohe Affinität für das Substrat APS, die mit einer starken Inhibierung der Reaktion durch das Substrat APS einhergeht (Robbins und Lipmann, 1958). Das Enzym aus Penicillium chrysogenum, dessen Kristallstruktur aufgeklärt wurde (McRae et al., 2000b), folgt einem „ordered−bi−bi“ Reaktionsmechanismus, bei dem die Substrate in der Reihenfolge MgATP und APS binden und die Produkte in der Reihenfolge PAPS und MgADP freigesetzt werden (Renosto et al., 1984). Die als unkompetitiv in Bezug auf MgATP beschriebene Inhibierung der Reaktion durch APS soll durch einen „dead−end“−Komplex zustande kommen, bei dem sich ein Enzym−MgADP−APS Komplex bildet, der nicht weiter reagieren kann (McRae und Segel, 1999). Demgegenüber wurde für das Enzym aus E. coli ein „Ping−Pong“ Re− aktionsmechanismus beschrieben, bei dem das Enzym stabil durch ATP phosphoryliert wird, bevor es selber das Substrat APS phosphoryliert (Satishchandran und Markham, 1989; Satishchandran et al., 1992). Die Substratinhibierung wird für das E. coli Enzym als kompetitiv in Bezug auf ATP beschrieben, was durch einen „dead−end“−Komplex durch Bindung des APS vor dem ATP bedingt wird (Satishchandran und Markham, 1990). Bisherige Untersuchungen von APS−Kinasen aus photoautotrophen Organismen betreffen das Enzym aus Chlamydomonas reinhardii (Schwenn und Jender, 1980; Jender und Schwenn, 1984). Dieses Enzym wird durch Thioredoxin (Schwenn und Schriek, 1984) aktiviert. Erste Untersuchungen eines Enzyms aus A. thaliana zeigten, dass auch pflanzliche APS−Kinasen durch APS inhibiert werden (Lee und Leustek, 1998; Schiffmann, 1998). 1.1.2 Reduktion des Sulfates zum Sulfit und Sulfid Der erste reduktive Schritt der Sulfatassimilation wird durch die Sulfonukleotid−Reduktasen kata− lysiert. Enzyme dieser Proteinfamilie (ausführlich besprochen in Kap. 1.2ff) reduzieren das akti− vierte Sulfat in Form des APS oder PAPS zum Sulfit. Hierbei dient ein Dithiol−Substrat als Elek− tronendonor, das selber zum Disulfid oxidiert wird: APS/PAPS + 2 R−SH

(3)

SO32− + AMP/PAP + R−S−S−R

Die darauf folgende Reduktion des Sulfit zum Sulfid katalysieren die Sulfit−Reduktasen. Bei den Enzymen aus heterotrophen Organismen (4a, EC 1.8.1.2) dient dabei NADPH, bei denen aus photoautotrophen (4b, EC 1.8.7.1) Ferredoxin (Fd) als Elektronendonor: (4a)

HSO3− + 3 [NADPH + H+]

(4b)

HSO3− + 6 Fdred

HS− + 3 NADP+ + 3 H2O HS− + 6 Fdox + 3 H2O

Einleitung

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Die NADPH−abhängigen Sulfit−Reduktasen aus Enterobakterien bilden Komplexe aus 8 α− Untereinheiten von 66 kDa, die von Flavoproteinen mit einem FMN und einem FAD pro Monomer gebildet werden und 4 β−Untereinheiten von 64 kDa, die ein Sirohäm und einen [4Fe−4S]−Cluster enthalten (Siegel und Davis, 1974; Siegel et al., 1974). Diese Proteinkomplexe übertragen die notwendigen 6 Elektronen vom NADPH, ohne dass detektierbare Zwischenprodukte auftreten (Siegel et al., 1974; Tan und Cowan, 1991). Die Kristall−Struktur des Hämoproteins (Crane et al., 1995) und eines großen Fragments des Flavoproteins aus E. coli (Gruez et al., 2000) konnten auf− geklärt werden. Das Enzym der Hefe besteht aus 2 Flavoproteinen mit je 116 und zwei Hämopro− teinen mit je 167 kDa (Kobayashi und Yoshimoto, 1982), entspricht in seinen kinetischen Eigen− schaften aber den bakteriellen Proteinen. Demgegenüber bestehen die Proteine aus photoautotro− phen Organismen nur aus einem [4Fe−4S]− und sirohämhaltigen Protein (64 − 70 kDa), welches die zu übertragenden Elektronen direkt vom Ferredoxin erhält. Die Proteine aus Synechococcus sp. und A. thaliana weisen eine Identität mit den Hämoproteinen der NADPH:Sulfit−Reduktasen von > 50 % auf (Gisselman et al., 1993; Brühl et al., 1996). 1.1.3 Synthese des Cysteins Die Insertion des divalenten Sulfids wird durch die O−Acetyl−L−Serin−(thiol)−Lyasen (EC 4.2.99.8) katalysiert: O−Acetyl−L−Serin + HS−

(5)

Cystein + Acetat

Dieses Enzym beinhaltet Pyridoxalphosphat als Kofaktor. Als Substrat für die Sulfidinsertion benutzt es O−Acetyl−L−Serin, welches von Serin−Acetyl−Transferasen synthetisiert wird. In Saccharomyces cerevisiae dient O−Acetyl−L−Homoserin als Substrat, so dass hier nicht Cystein, sondern Homocystein das Primärprodukt der Sulfatassimilation darstellt (Kerjan et al., 1986). Die Serin−Acetyl−Transferase und die O−Acetylserin−(thiol)−Lyasen können einen Enzymkomplex bilden, welcher die kinetischen Eigenschaften der Enzyme moduliert (Bogdanova und Hell, 1997; Droux et al., 1998). Dieser Komplex ist aber nicht essentiell für die Funktionalität der Enzyme (Droux et al., 1998).

1.2 Die Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen Die Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen katalysiert den ersten reduktiven Schritt der Sulfatas− similation, bei der das durch Adenylierung und ggf. Phosphorylierung aktivierte Sulfat zum Sulfit reduziert wird. Diese Familie kann in drei Gruppen eingeteilt werden, die im Folgenden vorgestellt werden.

Einleitung

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Abbildung 2: Reaktionsfolge der assimilatorischen Sulfatreduktion Links: Reaktionsfolge für Bakterien und Pilze. Rechts: Reaktionsfolge in höheren Pflanzen. (1) Sulfat−Permease, (2) ATP−Sulfurylase, (3) APS−Kinase, (4) Trx:PAPS−Reduktase, (5) Sulfit−Reduktase, (6) O−Acetyl−L−Serin−(thiol)− Lyase, (7) Trx:APS−Reduktase, (8) GSH:APS−Reduktase (Abkürzungen gemäß dem Abkürzungsverzeichnis).

1.2.1 Mikrobielle PAPS−Reduktasen In vielen prototrophen Bakterien und Pilzen erfolgt der erste reduktive Schritt der assimilatorischen Sulfatreduktion durch Reduktion des 3´5´Phosphoadenylylsulfates (PAPS) zum Sulfit und 3´Phosphoadenosin−5´Phosphat (PAP). Diese Reaktion wird mit Thioredoxin als Reduktionsmittel (Gonzales−Porque et al., 1970) von der Gruppe der Trx:PAPS−Reduktasen (EC 1.8.99.4) kataly− siert: (3a)

PAPS + Trxred

SO32− + PAP + Trxox

Einleitung

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In Escherichia coli kann das Thioredoxin in vivo durch Glutaredoxin (Grx1) ersetzt werden (Tsang, 1981). Das Enzym reduziert ausschließlich PAPS, APS kann nicht als Substrat dienen. Neuere Untersuchungen mit allen bis dahin in E. coli bekannten Redoxinen zeigten, dass in vitro das Thioredoxin 1 (Trx1) durch Thioredoxin 2 (Trx2) und Grx1, nicht aber durch Glutaredoxin 3 (Grx3) oder das ungewöhnlich große (23 kDa) Glutaredoxin 2 (Grx2) ersetzt werden kann (Lillig et al., 1999). Die in der Regel 9 − 14 kDa großen und nahezu ubiquitären Thioredoxine und Gluta− redoxine zeichnen sich durch ihr redoxaktives Zentrum CxxC aus, mit dem sie durch Dithiol−Dis− ulfid−Übergänge Redoxreaktionen katalysieren können. Sie besitzen zahlreiche Funktionen in einer Vielzahl von Organismen (Übersichten in: Holmgren, 1985; Jacquot et al., 1997), von denen be− sonders die Reduktion der Ribonukleotid−Reduktase hervorzuheben ist. Die Trx:PAPS−Reduktasen mit einem Molekulargewicht von ca. 28 − 30 kDa besitzen nach aktuellem Stand der Forschung keine chromophoren Gruppen. Als Reaktionszentrum wurde die Thiolgruppe eines Cysteins im Konsensus−Motiv ECGLH der Sulfonukleotid−Reduktasen identi− fiziert. Eine Behandlung der Proteine mit thiolspezifischen Inhibitoren führte ebenso wie die orts− gerichtete Mutagenese dieses Cysteins zu einem Verlust der Aktivität (Berendt et al., 1995). Das Protein ist als Homodimer aktiv und bildet in der oxidierten Form ein Disulfid zwischen diesen Cysteinen der beiden Monomere (Berendt et al., 1995). Die Reaktionen der PAPS−Reduktasen aus Saccharomyces cerevisiae und E. coli folgen einem Ping−Pong Mechanismus (Schwenn et al., 1988; Berendt et al., 1995). Zunächst wird das oxidierte Protein durch Thioredoxin (Trx) oder ggf. Glutaredoxin (Grx) reduziert: (3a.1)

PAPS−Reduktaseox + Trxred

PAPS−Reduktasered + Trxox

(3a.2)

PAPS−Reduktaseox + Grxred

PAPS−Reduktasered + Grxox

Im Anschluss reduziert die PAPS−Reduktase die Sulfatgruppe im PAPS: (3a.3)

PAPS−Reduktasered + PAPS

SO32− + PAP + PAPS−Reduktaseox

Sowohl die reduzierte als auch die oxidierte Form des Enzym−Dimers ließen sich stabil isolie− ren. Hierbei zeigten sich große Unterschiede im apparenten Molekulargewicht der beiden Redox− zustände, die auf Konformationsänderungen induziert durch Substratbindungen und die Redoxre− aktionen hinweisen (Berendt et al., 1995). Eine hochauflösende 3D−Struktur der reduzierten Form des E. coli−Proteins konnte nach Kristallisation (Montoya et al., 1998) in einer Auflösung von 2 Å gewonnen werden (Abb. 3, Sa− vage et al., 1997). Das Monomer des V−förmigen Proteins wird aus einem 6−strängigen β−Faltblatt

Einleitung

16

gebildet. Von den einzelnen Faltblättern steht eines (β5) antiparallel zu den anderen. Auf einer Seite wird diese Struktur von vier α− Helices, auf der anderen Seite von einer kur− zen und einer langen, geknickten Helix um− geben. Am N−Terminus wird die Protein− oberfläche von drei weiteren Helices gebildet. Bei der Aufklärung dieser Struktur konnten keine Daten für die 27 C−terminalen Amino− säurereste gewonnen werden, welche das re− doxaktive Zentrum ECGLH beinhalten. Die PAPS−Reduktase zeigt auffallende Ähnlich−

Abbildung 3: Struktur der PAPS−Reduktase aus E. coli gemäß Savage et al. (1997)

keiten mit Proteinen der ATP−Pyrophospha− tase−Familie, insbesondere mit der Struktur der ATP−Pyrophosphatase−Untereinheit der GMP− Synthetase aus Bacillus subtilis (Tesmer et al., 1996) und in geringerem Maße auch mit der NAD− Synthetase (Rizzi et al., 1996). Sie wird daher mit diesen in eine gemeinsame Struktur−Familie eingeordnet (Savage et al., 1997). Den Mitgliedern dieser Familie ist eine Adeninnukleotid−α− Hydrolase−Aktivität gemein. Die Konsensussequenz und −struktur dieses erstmals von Bork und Koonin (1994) auf Basis von Sequenzvergleichen beschriebenen Motivs lautet (β−Faltblatt)− SGGxDS−(α−Helix)−(β−Faltblatt)−DxG. In der PAPS−Reduktase liegt dieses Motiv stark modi− fiziert in Form der Aminosäuren S53FGIQ...D78TG vor (Abb. 3, 1 + 2), wobei die hier verwendete Nummerierung das prozessierte Met1 einschließt. Diese putative PAPS−Bindestelle bildet einen Reaktionsraum mit stark positiver Ladungsoberfläche aus, der von einem als „flexibler Loop“ be− zeichneten Bereich abgedeckt wird. Trotz der weitreichenden Untersuchungen der PAPS−Reduk− tasen fehlen bislang Informationen zum molekularen Mechanismus der Reaktion, zu den Wech− selwirkungen mit den Substraten, den Ursachen ihrer Substratspezifität und zum Fluss der Elek− tronen vom Thioredoxin zum Sulfat−Schwefel. 1.2.2 Pflanzliche APS−Reduktasen Die zweite Gruppe der assimilatorischen Sulfonukleotid−Reduktasen stellen die pflanzlichen APS− Reduktasen dar. Für Pflanzen wurde lange Zeit die Existenz einer APS−Sulfotransferase diskutiert, welche mit Reduktion des APS den Schwefel auf einen Carrier übertragen sollte (Übersicht in: Schmidt und Jäger, 1992). Zwar konnten homogene Proteine von ca. 43 kDa aus der marinen Ma− kroalge Porphyra yezoensis (Kanno et al., 1996) und aus Spinat−Blättern (Ara und Sokiya, 1996) isoliert werden, denen eine solche Aktivität zugeschrieben werden konnte, genetische Informatio−

Einleitung

17

nen zu dieser Aktivität blieben aber aus. Dieser gebundene vom APS ausgehende Weg stand lange Zeit in Kontrast zu dem vom PAPS ausgehenden Reaktionsweg über freie Intermediate, wie er für Bakterien und Pilze aufgezeigt wurde (Übersicht in: Schmidt und Jäger, 1992; Schwenn, 1994). Durch Komplementation prokaryotischer PAPS−Reduktase defizienter Stämme konnten dann aber cDNAs aus Arabidopsis thaliana (Guiterez−Marcos et al., 1996; Setya et al., 1996) und einer he− terotrophen Zellkultur von Catharanthus roseus (Prior et al., 1999) isoliert werden, die für PAPS− Reduktase homologe Proteine kodieren. Diese Proteine sind mit Molekulargewichten von ca. 43 − 48 kDa deutlich größer als die beschriebenen bakteriellen. Sie weisen neben einem putativen Transitpeptid für ihren Import in Plastiden einen den PAPS−Reduktasen homologen Core−Bereich und zusätzlich eine C−terminale Domäne mit Homologien zu Proteinen der Thioredoxin−Familie auf. Neben dem für diese Proteinfamilie charakteristischen CxxC−Motiv im C−Terminus weisen alle im PAPS−Reduktase homologen Bereich das Adeninnukleotid−α−Hydrolase−, das ECGLH− Motiv und zusätzlich streng konserviert ein weiteres CxxC− und ein CC−Motiv auf, deren Funk− tionen bisher nicht bekannt sind. Diese Proteine reduzieren nicht PAPS, sondern APS und setzen dabei Sulfit frei (Guiterez−Marcos et al., 1996; Setya et al., 1996; Prior et al., 1999). Dies äußert sich in ihrer Fähigkeit auch mikrobielle APS−Kinase defiziente Mutanten in Hinblick auf eine Schwefel−Autotrophie zu komplementieren, was anzeigt, dass sie diesen Aktivierungsschritt um− gehen und auch in vivo APS reduzieren können. Als Reduktionsmittel dieser Reaktion kann in vitro neben artifiziellen Reduktionsmitteln wie Dithiotreitol (DTT) reduziertes Glutathion (GSH) dienen: (3b)

APS + 2 GSH

SO32− + AMP + GSSG

Es wird angenommen, dass auch in vivo Glutathion das Reduktionsmittel dieser Proteine dar− stellt. Mittlerweile wird diesen Proteinen auch die lange Zeit beschriebene APS−Sulfotransferase− Aktivität zugeschrieben (Suter et al., 2000), da sich mit oxidiertem Glutathion (GSSG) im Reak− tionsgemisch Sulfoglutathion bilden kann. Neuere Untersuchungen zeigten, dass diese Enzyme neben der APS−Reduktase−Aktivität noch zahlreiche weitere Reaktionen katalysieren, wie sie für Proteine der Thioredoxin−Superfamilie charakteristisch sind. So reduzieren sie Insulin (Prior et al., 1999; Wray et al., 1998), Hydroxyetyldisulfid, Dehydroascorbat und die Ribonukleotid−Reduktase (Bick et al., 1998) und sie reaktivieren denaturierte und reduzierte RNase (Prior et al., 1999). Werden APS−Reduktasen ohne die C−terminale Domäne exprimiert, so sind sie inaktiv. Ihre Ak− tivität kann aber teilweise durch Hinzugabe der C−terminalen Domäne (Wray et al., 1998) oder durch Thioredoxin, nicht aber durch Glutaredoxin, aus E.coli (Prior et al., 1999) rekonstituiert werden. Während der Anfertigung dieser Arbeit wurde das homologe Enzym aus Lemna minor als gelb beschrieben. Es soll daher einen Kofaktor enthalten (Suter et al., 2000). Über die Natur und

Einleitung

18

Funktion dieses Kofaktors ist nichts bekannt. Genetische Informationen für diese Gruppe der as− similatorischen Sulfonukleotidreduktasen existieren heute neben Arabidopsis thaliana, Catharan− thus roseus und Lemna minor unter anderem in den Pflanzen Brassica juncea (Heiss et al., 1999), sowie in marinen Makroalgen, wie z.B. Enteromorpha intestinalis. Im Laufe der Arbeit wurden mit den rekombinanten Proteinen aus Lemna minor (Suter et al., 2000) und Enteromorpha intestinalis (Gao et al., 2000) zwei weitere Enzyme dieser Gruppe charakterisiert. Sie weisen gegenüber den Proteinen aus Arabidopsis thaliana (Bick et al., 1998) und Catharanthus roseus (Prior et al., 1999) eine deutlich höhere maximale Reaktionsgeschwindigkeit auf von Vmax = 40 µmol mg−1 min−1 ge− genüber 0.2 bis 2.6 µmol mg−1 min−1, was dem hohen Schwefelbedarf dieser Organismen zuge− sprochen wird (Gao et al., 2000). 1.2.3 Bakterielle APS−Reduktasen Die dritte Gruppe der assimilatorischen Sulfonukleotid−Reduktasen wurde zuerst in den Bakterien Bacillus subtilis (Mansilla und de Mendoza, 1997) und Rhizobium sp. entdeckt. Hierbei handelt es sich um ca. 27 − 30 kDa große Proteine, die das für PAPS− und APS−Reduktasen charakteristische ECGLH−Motiv aufweisen. Zusätzlich besitzen sie die für die pflanzliche Gruppe charakteristischen Cystein−Motive der zur PAPS−Reduktase homologen Domäne (CC und CxxC), nicht aber die zur Thioredoxin−Familie homologe C−terminale Domäne. Sie stehen somit zwischen den mikrobiellen PAPS−Reduktasen und den pflanzlichen APS−Reduktasen. Während dieser Arbeit wurden die ersten Untersuchungen zu Proteinen dieser Gruppe veröffentlicht. Sie wurden mit Proteinen aus der Familie der Rhizobiaceae (Rhizobium, Sinorhizobium und Agrobacterium) durchgeführt. Das re− kombinant synthetisierte Genprodukt aus Rhizobium meliloti reduziert mit dem heterologen Thio− redoxin aus E. coli APS mit sehr viel höherer Effizienz als PAPS (Abola et al., 1999). Das Protein aus Pseudomonas aeruginosa reduziert ausschließlich APS ebenfalls mit Thioredoxin als Elektro− nendonor (Bick et al., 2000). Die Reaktion dieser Gruppe der Sulfonukleotid−Reduktasen wird zur Zeit als Thioredoxin−abhängige APS−Reduktion angegeben: (3c)

APS + Trxred

SO32− + AMP + Trxox

Abb. 4 auf der folgenden Seite fasst die charakteristischen Primärstruktur−Merkmale der drei Gruppen der assimilatorischen Sulfonukleotid−Reduktasen noch einmal zusammen.

Einleitung

19

Abbildung 4: Übersicht über die Primärstruktur−Merkmale der Sulfonukleotid−Reduktasen A: Mikrobielle Thioredoxin:PAPS−Reduktasen. B: Pflanzliche GSH:APS−Reduktasen. C: Bakterielle Thioredoxin: APS−Reduktasen.

1.3 Zielsetzung In der vorliegenden Arbeit wurde die Reduktion des aktivierten Sulfates im Rahmen der assimila− torischen Sulfatreduktion untersucht. Der Schwerpunkt sollte dabei in einer weiterführenden Cha− rakterisierung der Enzyme liegen, die diese Reaktion katalysieren. Hierbei galt es die bislang un− geklärten Fragen zu diesen Enzymen zu beachten: Was bestimmt die Spezifität der Enzyme für ihre Substrate? Wo liegen Unterschiede, wo Gemeinsamkeiten in den Gruppen dieser Enzyme? Wie ist der molekulare Mechanismus der Reaktion? Wie werden die Elektronen vom Donor auf das Substrat übertragen? Gibt es weitere Faktoren, die an der Reaktion beteiligt sind? Als Untersuchungsobjekte sollten rekombinante Proteine aus allen drei Gruppen der homologen Enzyme dienen. Den Schwerpunkt bildeten hierbei Untersuchungen mit der PAPS−Reduktase CysH aus Escherichia coli, die eine Vertreterin der Thioredoxin−abhängigen PAPS−Reduktasen ist. Im Vergleich zu diesem Protein sollte zum einen das Bacillus subtilis−Protein CysH1 unter− sucht werden, das zu den Vertretern der bakteriellen Enzyme zählt, die wie die pflanzlichen Pro− teine 4 zusätzlichen Cysteinreste beinhalten. Zum anderen wurde die APS−Reduktase Par2 aus Catharanthus roseus als Vertreterin der pflanzlichen, Glutathion−abhängigen APS−Reduktasen in die Untersuchungen mit einbezogen. Das Ziel dieser Arbeit lag darin einen Beitrag zu leisten, die offenen Fragen zu den Enzymen, die das aktivierte Sulfat reduzieren, mit den Methoden der Enzymatik, mit Hilfe spektroskopischer Techniken und durch computergestützte Ansätze weiter aufzuklären.

Material und Methoden

20

2 Material und Methoden 2.1 Geräte und Feinchemikalien Fermenter (3 l) Flüssigkeits−Szintillationszähler LKB Wallac 1219 Rackbeta Gelelektrophoresezubehör Inkubationsschüttler G25 pH−Meter HPLC−System Spektroskopie Fluoreszenzphotometer Aminco Bowman Ser. 2 Spektrophotometer PMQ II Spektrophotometer DU 7400 Zweistrahlphotometer ZWS II Sterilbank Zentrifugen Tischzentrifuge Sorvall RC−5B Rotoren GS 3, SS 34

Meredos, Göttingen Pharmazia, Freiburg Universitätswerkstatt New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey, USA Radiometer, Kopenhagen, Dänemark Waters Assoc., Milford, USA Spectronic Instruments, Rochester, USA Carl Zeiss, Jena Beckmann, Fullerton, USA Sigma, Berlin Gelaire Flow Laboratories, Meckenheim Sigma, München Du Pont Instruments, Bad Homburg Kontron, Eiching

Alle weiteren Geräte entsprachen dem üblichen Laborstandard. Acrylamid/Bisacrylamid Nukleotide Agarose Antibiotika Bacto−Agar, Bacto−Pepton, Hefeextrakt Commassie Brillant Blue G 250 Dithiotreitol (DTT) DNA−Größenstandard (λ−DNA EcoRI/HindIII) Isopropyl−β−D−Thiogalaktosid (IPTG) Phosphoenolpyruvat (PEP) Proteingrößenstandards Szintillationslösung Quicksafe A

Biomol, Hamburg Roche, Mannheim; Sigma, München Biozym, Oldendorf Roche, Mannheim; Sigma, München Gibco BRL, Paisley, Schottland Serva, Heidelberg Fluka, Buchs, Schweiz MBI Fermentas, Vilnius, Litauen Biosolve, Valkensvaard, Niederlande BioTech, St. Leon−Rot MBI Fermentas, Vilnius, Litauen Zinsser Analytic, Frankfurt

Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden von verschiedenen Herstellern in Analysequalität bezogen oder sind an entsprechender Stelle gekennzeichnet.

2.2 Bakterienstämme E. coli BL21 (DE3)

hsdS gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5−T7 gene1) (Novagen, Ma− dison, USA)

E. coli JM96 FAK

F− thr−1 leuB6 trp−1 hisG1 cysH56 argH1 thi−1 ara−13 lacY gal−6 malA1 xyl−7 mtl−2 strA9 tonA2 λR λ− supE44 (Jones−Mortimer, 1968), hsdR2 durch P1−Transduktion von zjj−202::Tn10 (Krone et al., 1991)

Material und Methoden

21

E. coli RL22

Hfr ∆(gal−uvrAB)45 ∆(cysH−J)264 relA1 spoT1 thi−1 (Fimmel und Loughlin, 1977)

E. coli TG1

supE hsd∆5 thi ∆(lac−proAB) F´[traD36 proAB+ lacIq lacZ∆M15] (Gibson, 1984)

E. coli XL 1 Blue MRF´ ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB−hsdSMR−mrr)173 endA1 supE44 thi−1 recA1 gyrA96 relA1 lac F´[proAB lacIqZ∆M15 Tn10(Tetr)] (Stratagene, Hei− delberg) recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thr−1 ∆(lac−proAB) (Ya− nisch−Perron et al., 1985)

E. coli JM109

2.3 Plasmide 2.3.1 Expressions− und Klonierungsvektoren pBS−KS+:

Blueskript KS+, Klonierungsvektor (Stratagene, Heidelberg)

pBTac1

Expressionsvektor mit tac−Promotor (Boehringer, Mannheim)

pET16b

Expressionsvektor für eine N−terminale 10−His−Fusion mit T7−lac−Promotor (Novagen, Madison, USA)

pET24a

Expressionsvektor mit T7lac−Promotor, für eine Expression mit N−terminalem T7−Tag und/oder C−terminaler 6−His−Fusion (Novagen, Madison, USA)

pHTEV2

Expressionsvektor mit T7lac−Promotor, für eine Expression mit N−terminaler 6− His−Fusion und der Erkennungssequenz für die TEV−Protease (teKaat, EMBL− Heidelberg)

2.3.2 Rekombinante Plasmide pUB5

1183 Bp EcoRI/HindIII cysH−Fragment aus E. coli im Vektor pBTac1 (Berendt, 1995)

pUB12

trxA−Fragment aus E. coli im Vektor pBTac1 (Berendt, 1995)

pBAD18grxA

grxA−Fragment aus E. coli im Vektor pBAD18 (Bick et al., 1998)

pET16bapsk

711 NdeI/BglII Bp akn1−Fragment aus A. thaliana im Vektor pET16b (Schiff− mann, 1998)

pET16bapsk∆

622 NdeI/BglII Bp akn1−Fragment aus A. thaliana im Vektor pET16b (Schiff− mann, 1998)

pET16bpar∆1

1258 Bp BamHI/BglII PCR−Fragment von par2 aus C. roseus im Vektor pET16b (Prior et al., 1999)

Material und Methoden

22

pET16bparMut 1258 Bp BamHI/BglII PCR−Fragment von par2 aus C. roseus im Vektor pET16b mit einem Basenaustausch, der zur Mutation C317→G führte (Prior, 2000) E5 pETcysHBs

232 Bp BamHI/BamHI PCR−Fragment von cysH1 aus B. subtilis im Vektor pET16b (Prior, unveröffentlicht)

pET16bcysH

733 Bp NdeI/BglII PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET16b (Lillig et al., 1999)

pCHLp1

733 Bp BamHI/BglII PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET16b (diese Arbeit)

pCHLp2

733 Bp BamHI/BglII PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET16b mit einem Basenaustausch, der zur Mutation C239→G führte (vormals: pET16bcysHC239G; Lillig, 1998)

pCHLp3

733 Bp BamHI/BglII PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET16b mit Basenaustauschen, die zu den Mutationen C239→H und H242→C führte (vormals: pET16bcysHCvsH; Lillig, 1998)

pCHLp4

733 Bp BamHI/BglII PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET16b mit Basenaustauschen, die zu den Mutationen R164→G, Y209→V und D214→N führte (diese Arbeit)

pCHLp5

733 Bp NdeI/BglII PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET16b mit Basenaustauschen, die zu der Mutation R164→G führte (diese Arbeit)

pCHLp6

733 Bp NdeI/BglII PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET16b mit Basenaustauschen, die zu der Mutation T79→A führte (diese Arbeit)

pCHLp7

733 Bp NdeI/XhoI PCR−Fragment von cysH aus pUB5 im Vektor pET24a (diese Arbeit)

pCHLt1

330 Bp BamHI/BamHI PCR−Fragment von trxA aus pUB12 im Vektor pET16b (diese Arbeit)

pCHLt2

330 Bp NcoI/BamHI PCR−Fragment von trxA aus pUB12 im Vektor pHTEV2 (diese Arbeit)

pCHLt3

330 Bp NdeI/XhoI PCR−Fragment von trxA aus pUB12 im Vektor pET24a (diese Arbeit)

pCHLt4

330 Bp NdeI/XhoI PCR−Fragment von trxA aus pUB12 im Vektor pET24a mit Basenaustauschen, die zu der Mutation C35→S führte (diese Arbeit)

pCHLg1

260 Bp NcoI/BamHI PCR−Fragment von grxA aus pBAD18grxA im Vektor pHTEV2 (diese Arbeit)

pCHLg2

260 Bp BamHI/BamHI PCR−Fragment von grxA aus pBAD18grxA im Vektor pET24a (diese Arbeit)

Material und Methoden

23

2.4 Oligonukleotide Zur Herstellung der rekombinanten Plasmide, für die ortsgerichteten Mutagenesen und für Se− quenzierungsreaktionen wurden folgende Oligonukleotide bei den Firmen Eurogentec (Belgien) und MWG−Biotech (Ebersberg) synthetisiert. Unterstrichene Bereiche kennzeichnen Erkennungs− sequenzen für Restriktions−Endonukleasen, klein geschriebene Bereiche stehen für nicht homologe Basen. Plasmid−homologe Oligonukleotide: T3−Promotor

20−mer 5´−ATTAACCCTCACTAAAGGGA−3´

T7−Promotor

20−mer 5´−TAATACGACTCACTATAGGG−3´

T7−Terminator

19−mer 5´−GCTAGTTATTGCTCAGCGG−3´

B. sub. cysH1−homologe Oligonukleotide PRbsub5

38−mer 5´−cacacacatATGTTAACGTATGATAATTGGGAAGAA−3´

PRbsub3

40−mer 5´−cacacagagctcTTCATGCAGTCCGCATTCTGTTTTCGC−3´

E. coli cysH−homologe Oligonukleotide: PRNdeI

21−mer 5´−GTGAGGAACATATGTCCAAAC−3´

PRBglIIrev

20−mer 5´−CCGGCAAGATCTACCCTTCG−3´

PRcysHBamHI

36−mer 5´−cacacaggatccTATGTCCAAACTCGATCTAAACGC−3´

PRcysHXhoIrev

35−mer 5´−cacacactcgagCCCTTCGTGTAACCCACATTCCC−3´

PRcysHR164G

25−mer 5´−CAATCCGGCAGTgGTGCCAATTTAC−3´

PRcysHR164Grev

25−mer 5´−GTAAATTGGCACcACTGCCGGATTG−3´

PRcysHT79A

25−mer 5´−CAAGTAACCCGcATCGGTGAGGATC−3´

PRcysHT79Arev

25−mer 5´−GATCCTCACCGATgCGGGTTACTTG−3´

E. coli trxA−homologe Oligonukleotide: PRtrxABamHI

35−mer 5´−cacacaggatccTATGAGCGATAAAATTATTCACC−3´

PRtrxABamHIrev

31−mer 5´−gtgtgtggatccTTACGCCAGGTTAGCGTCG−3´

PRtrxANcoI

43−mer 5´−cacacaccatggGCAGAGATAAAATTATTCACCTGAACT− GACG−3´

Material und Methoden

24

PRtrxANdeI

33−mer 5´−cacacacatATGAGCGATAAAATTATTCACCTG−3´

PRtrxAXhoIrev

31−mer 5´−cacacactcgagCGCCAGGTTAGCGTCGAGG−3´

PRtrxAC35S

23−mer 5´−GCGGTCCGaGCAAAATGATCGCC−3´

PRtrxAC35Srev

23−mer 5´−GGCGATCATTTTGCtCGGACCGC−3´

E. coli grxA−homologe Oligonukleotide: PRgrxANcoI

40−mer 5´−cacacaccatggGCCAAACCGTTATTTTTGGTCGTTCGGG−3´

PRgrxABamHIrev

38−mer 5´−cacacaggatccTCAGGCGTCCAGATTTTCTTTCACCC−3´

PRgrxANdeI

32−mer 5´−cacacacacATGCAAACCGTTATTTTTGGTCG−3´

PRgrxAXhoIrev

35−mer 5´−cacacactcgagGGCGTCCAGATTTTCTTTCACCC−3´

2.5 Mikrobiologische Methoden 2.5.1 Kulturmedien Zur Anzucht von Bakterienkulturen wurden die folgenden Kulturmedien eingesetzt: Luria−Bertani Medium

10 g l−1 NaCl, 10 g l−1 Bactotrypton, 5 g l−1 Hefeextrakt, pH 7.6 mit 4 N NaOH (Sambrook et al., 1989)

Vogel−Bonner Medium

20 g l−1 Glukose, 20 mM Thiamin, 1 VBB−Salze, 1 % (v/v) SL4 5 % (v/v), ggf. essentielle Aminosäuren (5 mM) (Vogel und Bonner, 1956) VBB−Salze (50 x)

10 mg MgSO4, 100 g Citrat H2O, 500 g K2HPO4 wasserfrei, 175 g Na(NH4)HPO4 4 H2O, ad 1 l mit H2Odest

SL 4

500 mg EDTA, 200 mg FeSO4 7 H2O, 100 ml SL 6 (s.u.), ad 1 l mit H2Odest

SL 6

100 mg ZnSO4 7 H2O, 30 mg MnCl2, 300 mg H3BO3, 200 mg CoCl2 6 H2O, 10 mg CuCl2 2 H2O, 20 mg NiCl2 6 H2O, 30 mg Na2MoO4 2 H2O, ad 1 l mit H2Odest

Alle Medien und Zusätze wurden autoklaviert (121°C, 1 bar Überdruck) oder sterilfiltriert (Ein− malfilter, 45 µm Porenweite, Schleicher und Schuell). Für die Propagierung antibiotikaresistenter Stämme wurden den Medien nach Bedarf 100 mg l−1 Ampicillin, 25 mg l−1 Kanamycin oder 10 mg l−1 Tetrazyklin zugesetzt.

Material und Methoden

25

2.5.2 Anzucht von Bakterienkulturen Für kleine Volumina (2 − 3 ml) erfolgte die Anzucht in sterilen Greiner−Röhren. Hierzu wurde das Medium mit ca. 50 µl einer Stammkultur oder einer Einzelkolonie beimpft. Die Kulturen wurden bei 37°C für 16 − 18 h im Horizontal−Inkubationsschüttler bei 200 − 250 rpm inkubiert. Für Kul− turvolumina von 10 − 300 ml wurden zur Anzucht sterilisierte Schikanen−Erlenmeyer−Kolben verwendet. Die Nährmedien wurden 1 − 2%ig angeimpft. Zur Expression rekombinanter Proteine in großem Maßstab erfolgte die Anzucht im 3 l Fermenter (Meredos, Göttingen) bei Temperaturen von 28 − 37°C. Den Nährmedien wurde 1 − 2 % (v/v) Glycerol und 0.5 % Glucose zugesetzt. Zur Expression von rekombinanten Proteinen erfolgte ggf. eine Induktion mittels 0.5 mM IPTG. Nach der Expression wurden die Bakterien durch Zentrifugation (10000 g, 20 min) geerntet. Tabelle 2.1: Übersicht der Anzuchtbedingungen für die Proteinexpression in E. coli BL21(DE3) Expressionsplasmid

Medium

Temperatur Induktion Wachstumsdauer pH

Ausbeute

vgl. 2.5.1

°C

OD

h

LB

35

0.7

2¾

7.5

40

VBB

32

keine

16

7.5

7

LB

35

0.7

2¾

7.5

12

VBB

28

keine

16

7.5

8

LB

32

0.7

2¾

7.5

10

VBB

28

keine

16

7.5

4

pET16bapsk

LB

32

0.6

2¾

7.5

14

pCHLt3

LB

35

0.7

2¾

7.5

100

pCHLg2

LB

35

0.7

2¾

7.5

75

pET16bcysH pET16bcysHBs pET16bpar∆1

mg pro l Kultur

2.5.3 Herstellung kompetenter Bakterienzellen Die Herstellung kompetenter Bakterienzellen erfolgte nach der RbCl−Methode von Hanahan (Pro− tokoll 3, Hanahan, 1985). Die verwendeten Kulturen wurden in der logarithmischen Wachstums− phase (OD595 von 0.5 − 0.7) abzentrifugiert, 15 min auf Eis inkubiert und anschließend sedimentiert (1000 g, 15 min). Das Zellpellet wurde in 1/3 des Ausgangsvolumen RF 1−Lösung (100 mM RbCl, 50 mM MnCl2 4 H2O, 39 mM Na−Acetat, 10 mM CaCl2 2 H2O, 15 % (w/v) Glycerol, pH


5.8 mit 0.2 M Essigsäure) resuspendiert. Nach 15 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen nach Zentrifugation (1000 g, 15 min) in 1/12.5 des Ausgangsvolumens RF 2−Lösung (10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2 2 H2O, 15 % (w/v) Glycerol, pH 6.8 mit 1 N NaOH) resuspendiert. Nach 15 min auf Eis wurden die Bakterien aliquotiert und bei −80°C gelagert.

Material und Methoden

26

2.5.4 Transformation kompetenter Bakterienzellen Zur Transformation wurden 200 µl kompetenter Bakterien mit ca. 25 ng Plasmid−DNA vermischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem 90−sekündigen Hitzeschock bei 42°C und anschlie− ßender Abkühlung auf Eis wurden die Zellen zur phänischen Expression der genetischen Marke mit 800 µl LB−Medium für 1 h bei 37°C inkubiert. Im Anschluss konnten die sedimentierten Zellen (4 min, 2000 g) auf Selektivmedien ausplattiert werden. 2.5.5 Bakterienzellaufschluss Zur Gewinnung bakterieller Rohextrakte wurden 1 − 3 g der gewonnenen Bakterien (vgl. 2.7.1) mit 20 − 30 ml Aufschluss−Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8.0, 100 mM NaCl) gewaschen und anschlie− ßend in 35 ml Aufschluss−Puffer resuspendiert. Der Aufschluss erfolgte in zwei Durchgängen durch eine „French−press“ (Ribi Press, Sorvall) bei 20000 psi und 5 − 15 °C. Die löslichen Proteine wurden durch Zentrifugation (20 min, 28000 g) von unlöslichen Bestandteilen und Zelltrümmern getrennt.

2.6 Molekularbiologische Methoden 2.6.1 Präparation von Plasmid−DNA Die Präparation von Plasmid−DNA in kleinem Maßstab erfolgte mit dem Wizard−Miniprep− DNA−Purification−System (Promega, Heidelberg) ausgehend von 2 − 3 ml Übernachtkultur nach Angaben des Herstellers. Für die Präparation in mittlerem Maßstab wurde das Plasmid−Midi−Kit (Qiagen, Hilden) nach Protokoll des Herstellers verwendet. 2.6.2 Standardtechniken Standardtechniken wie die Fällung von DNA, die Restriktion mit Endonukleasen, Ligationen, Modifizierungen von DNA−Enden und die Agoresegelelektrophorese wurden gemäß Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Die Elution von DNA aus Agarosegelen erfolgte mit Hilfe des „Nucleo− Spin Extract“−Systems nach Angaben des Herstellers Macherey und Nagel (Düren). 2.6.3 Polymerase−Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase−Kettenreaktion (Mullis et al., 1986) wurde zur in vitro Amplifizierung und Mu− tagenisierung von Nukleinsäuren verwendet. Die Reaktionsansätze (100 µl) enthielten dabei: 2 − 20 ng DNA als Matrize, 0.2 mM dNTPs, 0.5 − 2.5 U Biotherm−DNA−Polymerase (Genecraft, Münster), Reaktionspuffer des Herstellers, und je 30 pmol der Oligonukleotide (vgl. 2.4). Die Re− aktion erfolgte im TRIO−Block der Firma Biometra (Göttingen). Nach einer 3 − 5−minütigen An−

Material und Methoden

27

fangsdenaturierung erfolgten je nach Beschaffenheit und Zusammensetzung der Oligonukleotide 30 Zyklen des folgenden Programms: 1 min (45 − 55 °C) Startermolekül−Hybridisierung, 30 − 90 s Strangsynthese bei 72°C und 1 min Denaturierung bei 92°C. Der letzte Elongationszyklus erfolgte 3 min. Die Reinigung der PCR−Produkte erfolgte durch Fällung der DNA nach Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Na−Acetat und 3 Volumen 100 % Ethanol oder durch Verwendung des „NucleoSpin Extract“−Kits der Firma Macherey und Nagel (Düren). 2.6.4 Ortsgerichtete Mutagenese Die ortsgerichtete Mutagenese erfolgte nach dem Verfahren der „overlap−extension−PCR“ (Ho et al., 1989; Horton und Pease, 1991) mit Hilfe von vier spezifischen Oligonukleotiden (vgl. 2.4). 2.6.5 DNA−Sequenzierung Die Sequenzierungen der rekombinanten Plasmide wurden bei den Firmen SEQLAB (Göttingen) und MWG−Biotech (Ebersberg) nach der Didesoxy−Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) durchgeführt .

2.7 Biochemische Methoden 2.7.1 Proteinchemische Methoden 2.7.1.1 Proteinbestimmung Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Methode von Bradford (1976) mit Coomassie Brillant Blue G 250 (Serva, Heidelberg) als Farbreagenz. Als Eichprotein diente Rinderserumalbumin. Al− ternativ wurde die Extinktion der Proteinlösung bei 260 und 280 nm bestimmt (Warburg und Christian, 1941). Die Konzentrationsbestimmungen für Thioredoxine und Glutaredoxin erfolgten durch Bestimmung der Extinktion bei 280 nm auf Grundlage ihrer molaren Extinktionskoeffizien− ten (Grx1: ε280 = 12500 M−1 cm−1; Trx1: ε280 = 13500 M−1 cm−1). 2.7.1.2 SDS−Polyacrylamid−Gelelektrophorese Die SDS−Polyacrylamid−Gelelektrophorese wurde wie bei Laemmli (1970) beschrieben durchge− führt, wobei aber β−Mercaptoethanol als Reduktionsmittel durch Dithiotreitol ersetzt wurde. 12.5%ige Minigele der Ausmaße 1.5 50 90 mm wurden bei 80 − 130 mV in einer vertikalen Ap− 



paratur für 1 − 2 h betrieben. Anschließend wurden die Protein entweder auf Nitrocellulose über− tragen, oder im Gel mit Coomassie Brillant Blue R 250 (Serva, Heidelberg) gefärbt. Als Größen− standards dienten Molekulargewichtsmarker (10 kD−Leiter, Gibco BRL, Paisley, GB; 7SDS MBI− Fermentas, St. Leon−Rot).

Material und Methoden

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2.7.1.3 Native Polyacrylamid−Gelelektrophorese Die native Polyacrylamid−Gelelektrophorese wurde wie bei Michov (1996, S. 141 − 148) be− schrieben durchgeführt. Hierbei handelt es sich um ein diskontinuierliches System unter Verwen− dung von TRIS/Glycin−Puffern, wobei das Sammelgel einen pH−Wert von 8.3 und das Trenngel einen pH−Wert von 9.3 aufwies. 2.7.1.4 Native Reinigung von Histidin−Fusionsproteinen Die Reinigung von 6− oder 10−Histidin−Fusionsproteinen aus dem Rohextrakt erfolgte durch Metallchelat−Affinitätschromatografie über eine Talon−Matrix (Clontech PT 1320−1) mit Säulenvolumen von 1 − 15 ml. Die gewonnenen Rohextrakte wurden auf die mit Aufschlusspuffer (vgl. 2.5.5) äquilibrierte Säule aufgetragen. Durch Waschen mit diesem Puffer konnten ungebundene Proteine von der Säule entfernt werden. Unspezifisch gebundene Proteine wurden durch einen Waschschritt mit 5 − 50 mM Imidazol (im Aufschluss−Puffer) von der Säule entfernt. Die Elution der gebundenen Fusionsproteine erfolgte mit 40 − 200 mM Imidazol (im Aufschluss− Puffer) in einem Volumen von ca. 10 ml. Die APS−Kinase− und PAPS−Reduktase−homologen Proteine wurden anschließend in 50 % (v/v) Glycerol in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei −25°C gelagert. Thioredoxine und Glutaredoxine wurden nach einer Hitzefällung (10 min 70°C, 15 min auf Eis, 10000 g für 10 min) des Eluates lyophilisiert und bei 4°C gelagert. Zur Konzentrierung wurden die Eluate ggf. mit Hilfe einer Ultrazentrifugationskammer (Centriprep 10, Amicon, Witten) gemäß der Anleitung des Herstellers eingeengt. Tabelle 2.2: Übersicht der verwendeten Imidazolkonzentrationen bei der Reinigung der untersuchten Proteine durch Metallchelat−Affinitätschromatografie an der Talon−Matrix Protein 10−His−PAPS−Reduktase

Herkunft E. coli

Expressionsplasmide pET16bcysH, pCHLp1 − p6

10−His−(P)APS−Reduktase B. subtilis pET16bcysHBsub pET16bpar∆1

Waschschritt

Elution

mM Imidazol

mM Imidazol

30

200

25

200

25

200

10−His−APS−Reduktase

C. roseus

10−His−APS−Kinase

A. thaliana pET16bapsk(∆)

50

200

Thioredoxin−6−His

E. coli

pCHLt3

15

50 − 200

Glutaredoxin−6−His

E. coli

pCHLg2 − g4

15

50 − 200

Material und Methoden

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2.7.2 Enzymtests 2.7.2.1 Synthese der radioaktiven Nukleotide [35S]PAPS und [35S]APS Die Synthese des [35S]PAPS erfolgte in Anlehnung an die Methode von Schriek und Schwenn (1986) unter Zuhilfenahme einer rekombinanten ATP−Sulfurylase aus Saccharomyces cerevisiae (Sigma, München) und der rekombinanten APS−Kinase aus Arabidopsis thaliana als 10−His−Fu− sionsprotein. Als Hilfsenzyme wurden die rekombinante Pyruvat−Kinase aus Oryctolagus cunicu− lus (Boehringer, Mannheim) und die Pyrophosphatase aus E. coli (Sigma, München) verwendet. Der Reaktionsmix enthielt: 50 mM Triethanolamin pH 8.0, 2 mM Na2SO4, 4 mM MgCl, 10 mM KCl, 5 mM Phosphoenolpyruvat pH 7.0, 2 − 6 mM MgATP pH 7.0, 1 mM DTT, 1 µM Thioredoxin, 40 U Pyrophosphatase, 40 U Pyruvat−Kinase, 10 U ATP−Sulfurylase, 1 − 10 U APS−Kinase (als 10−His−Fusionsprotein), 1 − 2 mCi trägerfreies [35S]SO42− (Amersham, Freiburg), ad 5 ml mit H2Odest. Nach einer fünfminütigen Aktivierung der APS−Kinase im Reaktionsmix wurde die Reaktion durch Zugabe der ATP−Sulfurylase gestartet. Die Synthese wurde durch Auf− tragen von Aliquots auf die „reversed−phase“−HPLC (vgl. 2.7.3) verfolgt. Nach ausreichendem Umsatz wurde die Reaktion durch Auftragen des Reaktionsgemisches auf eine DEAE 650S−Matrix (Merck, Darmstadt) mit einem Säulenvolumen von 40 ml beendet. Die Säule wurde zuvor mit 5 M NaCl und H2Odest gewaschen und anschließend mit 50 mM Tris/HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA äqui− libriert. Die Elution erfolgte durch einen NaCl−Gradienten von 0 − 375 mM in einem Volumen von 300 ml. Für die Enzymtests wurde das [35S]PAPS auf eine spezifische Aktivität von 30000 − 400000 dpm nmol−1 und eine Konzentration von 100 − 500 µmol l−1 eingestellt. Hierzu wurde das [35S]PAPS mit in analoger Weise hergestelltem nicht radioaktivem PAPS und H2O verdünnt. [35S]APS konnte durch Behandlung des [35S]PAPS mit der Nuklease P1 (3´−Nukleotidase−Aktivi− tät) aus Penicillium chrysogenum (Roche, Mannheim) gewonnen werden. Um nukleasefreies [35S]APS zu erhalten, wurde dieses wiederum über eine DEAE 650S−Säule gereinigt und im An− schluss entsprechend den Erfordernissen eingestellt. 2.7.2.2 Bestimmung der Aktivität der APS− und PAPS−Reduktasen Zur Messung der Aktivität der APS− und PAPS−Reduktasen wurde die bei Schwenn und Schriek (1987) beschriebene Methode benutzt. Hierbei wird in einer Endwertbestimmung der Umsatz von [35S](P)APS zu säurelabilem [35S]SO32− bestimmt. Der 100 µl Reaktionsansatz enthielt: 100 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3, 0.5 − 200 µM [35S](P)APS, 0.5 − 200 µM Thioredoxin + 10 mM DTT, oder 0.5 − 50 µM Glutaredoxin + 10 mM GSH, 1 − 10 µg Protein eines Rohextraktes oder 0.5 − 200 ng des gereinigten Enzyms. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet. Der Umsatz erfolgte bei 30°C (E. coli und B. subtilis SNR) oder 25°C (C. roseus AR) und wurde nach 2

Material und Methoden

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− 20 min durch Zugabe von 100 µl Aceton gestoppt. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße in Szintillationsgefäße mit 600 µl Trioctylamin überführt. Durch Zugabe von 300 µl 6 N H2SO4 in das Reaktionsgefäß erfolgte durch Ansäuerung die Freisetzung des gebildeten [35S]SO32− als gasförmi− ges [35S]SO2. Dieses wurde im geschlossenen Szintillationsgefäß bei 65°C für mindestens 45 min herausdestilliert und vom basischen Trioctylamin gebunden. Nach dem Abkühlen der Reaktions− gefäße konnten sie aus den Szintillationsgefäßen entfernt werden. Die gebundene Radioaktivität wurde durch Zugabe von 4 bis 8 ml Szintillationsflüssigkeit in einem Flüssigkeits−Szintillations− zähler (Liquid Szintillation Counter 12/9 Rackbeta, Pharmacia−LKB) bestimmt. 2.7.2.3 Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase 2.7.2.3.1 Photometrische Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase Die Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase erfolgte bei diesem Test nach Burnell und Whatley (1975) optisch gekoppelt. Als Hilfsenzyme wurden die Pyruvat−Kinase und die Lactat−Dehydro− genase aus Oryctolagus cuniculus in einer gebrauchsfertigen Suspension verwendet (Roche, Mannheim). Das in der Lactat−Dehydrogenase−Reaktion verbrauchte NADH konnte photometrisch bei 340 nm kontinuierlich verfolgt werden. Die Reaktion wurde nach einer 15−minütigen Aktivie− rung der APS−Kinase mit reduziertem Thioredoxin (Schiffmann, 1998) durch die Zugabe des Substrates APS gestartet. Ein 500 µl Reaktionsgemisch enthielt: 60 µM Tris/HCl pH 7.4, 6.25 mM MgCl2,, 5 mM Phosphoenolpyruvat pH 7.0, 0.625 mM ATP pH 7.0, 0.375 mM NADH, 0.5 µM Thioredoxin, 2 mM DTT, 80 µl Lactat−Dehydrogenase−Pyruvat−Kinase−Mix, 2 − 8 µg gereinigte APS−Kinase, 0.01 − 20 µM APS. Nachdem das verfügbare APS in PAPS umgesetzt war, konnte durch Zugabe von 20 Unit Nuklease P1 aus Penicillium chrysogenum (Boehringer, Mannheim) das entstandene PAPS wieder zu APS umgesetzt werden. Danach konnte bei konstanten Substratkon− zentrationen eine kontinuierliche Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt werden, die zur Bestimmung der spezifischen Aktivität herangezogen wurde. 2.7.2.3.2 Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase mittels HPLC Die Bestimmung der Aktivität der APS−Kinase erfolgte bei dieser Methode durch Auftrennung eines Aliquots (25 µl) der Reaktionsgemische wie unter 2.7.3 beschrieben mittels HPLC. Die Re− aktionsansätze (0.1 − 1 ml) enthielten 0.1 − 10 µg Protein, 50 mM Tris/HCl pH 8.0 und je nach Bedarf 5 mM DTT, 5 µM Thioredoxin und 1.5 mM MgATP. 2.7.2.3.3 Bestimmung des Produktes [35S]PAPS mit Hilfe der PAPS−Reduktase Vor der Reaktion wurde die APS−Kinase durch Inkubation in 400 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM DTT und 1 µM Thioredoxin in einem Volumen von 30 µl 3 − 5 min bei 25°C aktiviert. Der Start

Material und Methoden

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der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 70 µl eines Substratgemisches (400 mM Tris/HCl pH 7.5, 0.01 − 1.5 mM MgATP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 − 50 µM [35S]APS). Nach drei Minuten bei 25°C wurde die Reaktion der APS−Kinase durch Zugabe von 50 µl EDTA (200 mM) beendet. Das ge− bildete [35S]PAPS wurde durch Zugabe von 50 µl einer PAPS−Reduktase−Lösung (0.5 µg PAPS− Reduktase, 20 mM DTT, 20 µM Thioredoxin, 40 mM Na2SO3 in 100 mM Tris/HCl pH 8.0) in− nerhalb einer Stunde bei 25°C vollständig zu [35S]Sulfit umgesetzt. Dieses konnte dann gemäß 2.7.2.2 säureabhängig überdestilliert und durch Szintillationszählung quantifiziert werden. 2.7.2.3.4 Phosphorylierung der APS−Kinase Durch Inkubation der APS−Kinase (0.1 µg µl−1) in einem Aktivierungsmix gemäß 2.7.2.3.3 mit 100 µM [32P] ATP konnte eine mögliche Autophosphorylierung des Proteins untersucht werden. 

Dieses Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 25°C inkubiert und ggf. weitere 30 Minuten nach Zugabe von 50 µM APS inkubiert. Danach konnte das Gemisch durch SDS−PAGE (vgl 2.7.1.2) aufgetrennt werden. Die getrockneten Gele wurden auf Röntgenfilm (Amersham, HyperfilmTM MP) exponiert oder unter Verwendung eines Phospho−Imagers (Fujifilm BAS−1500) ausgewertet. Eine Phosphorylierung der APS−Kinase könnte so durch Analyse der Bandenmuster dargestellt werden. 2.7.3 Nachweis von Adeninnukleotiden mittels „reversed−phase“−HPLC Zur Trennung von Adeninnukleotiden wurde das Verfahren von Schwenn und Jender (1980) ein− gesetzt. Bei dieser Methode paaren die Nukleotid−Ionen mit Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) gemäß ihrer Ladung, so dass sie mit der hydrophoben Matrix (Spherisorb ODSII 5 µm Partikelgröße, Besta, Wilhelmsfeld) interagieren können. Als Laufmittel wurde 6 − 10 % (w/v) Isopropanol mit 6 mM TBAH verwendet, das mit 10 % (v/v) Phosphorsäure auf einen pH−Wert von 9.6 eingestellt wurde. Als HPLC−Pumpe diente das Modell 6000A (Waters Assoc., Milford, USA), zum Auftragen der Probe das Injektionssystem U6K der selben Firma. Die Detektion der Nukleotide erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm (Modell 440, Waters Assoc., Milford, USA). Radioaktive Ionen konnten in einem mit Anthrazeen befüllten Durchfluss−Radio− aktiv−Monitor (IM2000, IsoMess, Straubenhardt) nachgewiesen werden. Durch Integration der Elutions−Peaks konnten quantitative Analysen erstellt werden.

2.8 Immunologische Methoden 2.8.1 Elektrotransfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen (Western−Blot) Der Elektrotransfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen erfolgte gemäß Towbin et al. (1979). Nach Auftrennung eines Proteingemisches durch SDS−PAGE (2.7.1.2) wurden die Proteine mit Hilfe einer „Semi−dry−Elektrotransferkammer“ auf eine BA−S 85 Nitrocellulosemembran

Material und Methoden

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(beides Schleicher & Scheull, Dassel) übertragen. Das SDS−Gel wurde zuvor für 5 − 10 min in 20 mmol l−1 Tris/HCl pH 8.3, 150 mmol l−1 Glycin, 20 % (v/v) Methanol, 0.01 % (v/v) SDS bei Raumtemperatur äquilibriert. Der Transfer erfolgte bei einer Spannung von 10 V mit 100 mA für 45 − 60 min. 2.8.2 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen Auf Nitrocellulosemembranen immobilisierte Proteine wurden mittels polyklonaler Antikörper nachgewiesen. Nach Absättigung der freien Bindungsstellen der Membran durch mind. 1−stündige Inkubation in 2 % (v/v) Tween 80, 2 % (w/v) Milchprotein in PBS−Puffer (6.5 mmol l−1 Na2HPO4, 1.5 mmol l−1 KH2PO4, pH 7.4, 137 mmol l−1 NaCl, 3 mmol l−1 KCl). Nach Inkubation mit dem primären Antikörper (4 h, vgl. Tab. 2.3) wurde die Membran 4 mal 5 min in PBS gewaschen und anschließend mit dem zweiten Antikörper (Peroxidase gekoppelte Ziege anti−Kaninchen− oder Phosphatase Ziege anti−Kaninchen (ggf. −Maus)−Immunglobuline, Sigma, München, Verdünnung 1:5000 − 1:20000) in 2 % (w/v) PEG 6000, 0.05 % (v/v) Nonidet P40 in PBS−Puffer für 2 h in− kubiert. Der Nachweis der sekundären Antikörper erfolgte bei Peroxidasekopplung durch Färbung in 0.03 % (w/v) 4−Chlor−1−Naphtol, 10 % (v/v) Methanol, 100 mmol l−1 Tris/HCl pH 7.4, 0.0023 % (v/v) H2O2. Bei Verwendung von Phosphatase gekoppelten Antikörpern erfolgt die Fär− bung nach Angaben des „Dig Systems User Guide for Filter Hybridisation“ (Roche, Mannheim) mit NBT (4−Nitroblautetrazoliumchlorid) und BCIP (5−Bromo−4−chloro−3−indolylphosphat) als Farbsubstraten. Tabelle 2.3: Übersicht der verwendeten primären Antikörper Antigen

Antikörper

Organismus

Verdünnung

Quelle

PAPS−Reduktase E. coli

α:PR−Serum

Kaninchen

1:2000

Krone et al., 1991

α:AR−Serum

Kaninchen

1:3000

Prior, 2000

α:AR−IgG

Kaninchen

1:500

Staudinger, 2000

Kaninchen

1:10000

Schiffmann, 1998

APS−Reduktase C. roseus

APS−Kinase A. thaliana α:AKN−Serum Penta−His

monoklonale

Maus

gemäß dem Hersteller Qiagen, Hilden

2.9 Spektroskopie 2.9.1 (Differenz−) Absorptions−Spektroskopie Für die Aufnahme von Absorptionsspektren wurde das Spektral−Photometer DU7400 (Beckmann, Fullerton, USA) verwendet. Zur Beobachtung von Konformationsänderungen wurden gemäß Schmidt (1990) Differenzspektren aufgezeichnet. Die Aufnahme dieser Spektren erfolgte im

Material und Methoden

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Zweistrahlphotometer ZWSII (Sigma, Berlin) in vier Küvetten in einer Tandem−Konfiguration. Diese Anordnung erlaubte es den Einfluss bestimmter Reagenzien auf das Absorptionsverhalten der untersuchten Proteine unter Subtraktion der Absorptionseigenschaften dieser Reagenzien zu erfas− sen. Die Parameter der spektralen Analysen (Konzentrationen, spektrale Bandbreite, Aufnahmege− schwindigkeit, etc.) wurden den Anforderung angepasst und sind, wenn dies notwendig war, an entsprechender Stelle aufgeführt. 2.9.2 Fluoreszenz−Spektroskopie Fluoreszenz−Anregungs− und Fluoreszenz−Emissionsspektren wurden mit dem Gerät Aminco Bowman Ser. 2 (Spectronic Instruments, Rochester, USA) gemäß den jeweiligen Erfordernissen aufgenommen. 2.9.3 EPR−Spektroskopie Zur Analyse von metallischen Kofaktoren und für die Darstellung von Radikalen innerhalb von Proteinen wurde die Elektronen−paramagnetische−Resonanz−Spektroskopie (EPR) benutzt. EPR− Messungen bei 3 − 60 K wurden am Max Planck−Institut für Strahlenchemie (Mühlheim an der Ruhr) in Zusammenarbeit mit Dr. Eckhard Bill durchgeführt. Dort standen verschiedene Geräte der Firma Bruker (Rheinstetten) zur Verfügung. Die Versuchsbedingungen (Proteinkonzentration und Redoxzustand, Mikrowellenfrequenz und −energie, Modulationen, Feldstärke, Temperatur, Ver− stärkung) wurden an die Gegebenheiten angepasst und sind an entsprechender Stelle aufgeführt. 2.9.4 Atomabsorptions−Spektroskopie Die Atomabsorptions−Spektroskopie wurde in der Abteilung für Hygiene, Sozial− und Umwelt− medizin der Medizinischen Fakultät der Ruhr−Universität mit der Unterstützung von Dr. Jürgen Wittsiepe durchgeführt. Für die Quantifizierung von Eisen und Kupfer in den Proben standen dort 2 entsprechend ausgestattete und kalibrierte Geräte der Firma Perkin Elmer (SIMAA 6000 und Zeeman 5100 PC) zur Verfügung. Die Nachweisgrenze für Eisen betrug 20 nmol l−1, die für Kupfer 175 nmol l−1.

2.10 Computergestützte Arbeiten 2.10.1 Mathematische Berechnungen Die statistischen Auswertungen der kinetischen Untersuchungen und die linearen, so wie die nicht− linearen Regressionen der Ergebnisse an die ihnen zu Grunde liegenden Funktionen wurden mit den Programmen TechPlot (Software für Forschung und Technik Dr. Ralf Dittrich, Braunschweig) und Grace (http://plasma−gate.weizmann.ac.il/Grace/) durchgeführt.

Material und Methoden

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2.10.2 Auswertung von Nukleotid− und Aminosäuresequenzen Primärstrukturvergleiche wurden mit dem Programm CLUSTAL (Version W und X, Higgins und Sharp, 1988) durchgeführt. Das Auffinden homologer Protein− und DNA−Sequenzen in den ent− sprechenden Datenbanken ermöglichten die BLAST−Algorithmen (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997). Die Berechnung der Molekülmasse von Proteinen gemäß ihrer Primärstruktur wurde mit den Programmen PEPTIDEMASS (Wilkins et al., 1997) und ProtParam (http://www.expasy. ch/tools/protparam.html) durchgeführt. Sekundärstruktur−Vorhersagen wurden mit dem PHDsec− Programm (Rost und Sander, 1993; Rost et al., 1994; Rost und Sander, 1994) berechnet. 2.10.3 Homologiebasierte Modellierung von Proteinstrukturen Die Modellierung von Proteinstrukturen wurde in komparativen, auf Homologien zu bekannten Proteinstrukturen basierenden, Ansätzen durchgeführt (Übersicht in: Sprinivasan et al., 1996). Hierzu fand das Programm WHATIF (Vriend, 1990) und der Swiss−Model−Service (Guex und Peitsch, 1997) Verwendung. Die als Vorlagen dienenden Proteine wurden auf Grund ihrer Homo− logie mit den Zielproteinen und ihrer Qualität gemäß Hooft et al. (1996) ausgewählt. Strukturdaten wurden aus der Proteindatenbank (PDB) bezogen (Bernstein et al., 1977). Für Berechnungen der molekularen Dynamik und für die Energieminimierung von berechneten 3D−Strukturen wurde GROMOS96 (van Gunsteren et al., 1995) eingesetzt. Zur Beurteilung der Qualität von modellierten Strukturen und Vorlagen aus der Proteindatenbank wurde neben den in WHATIF enthaltenen Routinen (WHATCHECK) die Biotech−Validation−Suite (http://biotech.embl−heidelberg.de:8400) verwendet. Für die Modellierung der Substrate APS und PAPS wurde B (http://www.scripps.edu/ ~nwhite/B) wie aufgeführt benutzt. 2.10.4 Darstellungen und Analyse von Molekülstrukturen Für die Darstellung, Analyse und Manipulation von 3D−Strukturen wurden RASMOL (Sayle und Milner−White, 1995) der Swiss−PDB−Viewer (SPDBV), MOLMOL (Koradi et al., 1996), und WHATIF (Vriend, 1990) verwendet. Bilder von 3D−Strukturen wurden aus Vorlagen der Pro− gramme SPDBV und MOLMOL mit dem Raytracing−Programm „Persistence of Vision“ (POV− RAY, http://www.povray.org/) berechnet. Zur Analyse und Darstellung von Protein−Substrat− Wechselwirkungen wurde LIGPLOT (Wallace et al., 1995) verwendet. Die Sekundärstrukturen von Proteinen mit bekannter Tertiärstruktur wurden mit DSSP (Kabsch und Sander, 1983) aus den PDB−Dateien abgeleitet.

Material und Methoden

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2.10.5 Abbildungen Alle in dieser Arbeit dargestellten Abbildungen wurden elektronisch erfasst und bearbeitet. Sie stimmen inhaltlich vollständig mit den Originaldaten oder Ergebnissen überein.

Ergebnisse

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3 Ergebnisse Alle Lebewesen benötigen Schwefel in der divalenten Form für die Synthese der Aminosäure Cy− stein. Bakterien, Pilze und Pflanzen können ihn durch Reduktion aus hexavalentem Sulfat bereit− stellen. Vor Reduktion und Insertion in organische Moleküle wird das Sulfat durch Adenylierung und Phosphorylierung aktiviert. Im ersten Reduktionsschritt der Sulfatassimilation wird das akti− vierte Sulfat zum tetravalenten Sulfit reduziert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Untersu− chung von drei exemplarischen Vertretern der Enzyme, die diese Reaktion katalysieren, den Sul− fonukleotid−Reduktasen.

3.1 Aktiviertes Sulfat Für die Messungen der Enzymaktivität der Sulfonukleotid−Reduktasen wurden die Sulfonukleotide APS und PAPS benötigt. Diese wurden selbstständig enzymatisch synthetisiert. Hierbei mussten die gleichen thermodynamischen Beschränkungen überwunden werden, wie sie auch in vivo gelten (vgl. 1.1.1). Um das Produkt APS der ATP−Sulfurylase aus dem Reaktionsgleichgewicht im Syn− theseansatz (vgl. 2.7.2.1) zu entfernen, wurde die APS−Kinase Akn1 aus Arabidopsis thaliana verwendet. Zum besseren Verständnis dieser Reaktion wurde die verwendete APS−Kinase (Akn1 aus Arabidopsis thaliana, Arz et al., 1994, Genbank: CAA53426) einer kinetischen Analyse un− terzogen. 3.1.1 PAPS Bildung durch die APS−Kinase Die APS−Kinasen katalysieren die Phosphorylierung des APS an der 3´−Position der Ribose mit einem MgATP−Komplex als Substrat: APS2− + MgATP2−

PAPS4− + MgADP− + H+

Die Expression des rekombinanten Proteins und seine Reinigung erfolgten in Anlehnung an Schiffmann (1998) mit Hilfe des Plasmids pETapsk in E. coli BL21(DE3). Die Ausbeute betrug nach Reinigung 14 mg APS−Kinase pro l Kulturvolumen. Für die Aktivitätsbestimmungen der APS−Kinase wurde ein neuer Test entwickelt, der es bei einer sehr hohen Sensitivität erlaubte viele Messungen in kurzer Zeit durchzuführen. Hierzu diente ein System, bei dem das aus [35S]APS gebildete PAPS durch eine Endwertbestimmung in einer zweiten Reaktion durch die PAPS−Reduktase aus E. coli vollständig zu [35S]SO32− und PAP um− gesetzt wird. Ersteres konnte dann, wie von Schwenn und Schriek (1987) beschrieben, säureab− hängig aus der Reaktionslösung herausdestilliert und durch Szintillationszählung quantifiziert werden (vgl. 2.7.2.2). Die APS−Kinase benötigt als Substrat für die Phosphorylierung des APS

Ergebnisse

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einen [MgATP]2−−Komplex. ATP in der vollständig ionisierten Form oder als Hydrogenkomplex kann nicht als Substrat des Proteins dienen (ohne Abb.). Diese Eigenschaft wurde ausgenutzt um die primäre Reaktion vor dem Umsatz des gebildeten PAPS vollständig abzustoppen. Eine Zugabe von EDTA in einer Konzentration > 50 mM führte durch Komplexierung des gesamten Mg2+ zu einem sehr schnellen Ende der Reaktion der APS−Kinase, ohne dass die PAPS−Reduktase nen− nenswert beeinflusst wurde (Lillig, 1998). Dies wurde mit Hilfe eines optisch gekoppelten APS− Kinase−Tests nach Burnell und Whatley (1975) nachgewiesen (ohne Abb.). Durch Überprüfung mittels HPLC gemäß Schwenn und Jender (1980) wurde sichergestellt, dass der MgEDTA−Kom− plex für mindestens 2 Stunden so stabil war, dass kein signifikanter Umsatz von APS nach PAPS mehr stattfand (ohne Abb.). Die Nachweisgrenze dieses Testsystems von ca. 5 pmol [35S]PAPS (Übersicht unter 2.7.2.3.3) ermöglichte es bereits sehr geringe Umsätze, wie sie bei Einhaltung der Anfangsbedingung („initial conditions“) in der Durchführung einer Endwertbestimmung des Pro− duktes anfallen, sicher zu quantifizieren. 3.1.2 Optimierung der Reaktionsbedingungen und Aktivierung der APS−Kinase Die Reaktionsbedingungen für die Phosphorylierung des APS durch die APS−Kinase Akn1 aus Arabidopsis thaliana wurden hinsichtlich Temperatur, Enzymkonzentration, pH−Wert und Puf− ferzusammensetzung optimiert. Ein pH−Wert von 7.5 − 7.6 in einem Tris/HCl Puffer, eine Reaktionstemperatur von 25 °C und eine Pro− teinmenge von 0.1 − 5 ng in einem 100 µl Reaktionsansatz wurden als optimale Reakti− onsbedingungen ermittelt. Die Abhängigkeit der PAPS−Bildung von chaotropen Salzen wurde durch Bestimmung der Enzymaktivität in Puffern mit verschie− denen Salzen in Abhängigkeit von der Kon− zentration untersucht. Wie Abb. 5 illustriert sind die Umsätze der untersuchten APS−Ki− nase Akn1 nach Vorinkubation und bei Reak− tion in 400 mmol l−1 Tris/HCl, in 400 mmol l−1 Triethanolamin/HCl oder bei Anwesenheit von 400 mmol l−1 NaCl maximal. Na2SO4 und (NH4)2SO4 führen zu einem Verlust an Akti− vität.

Abbildung 5: Aktivität der APS−Kinase in Ab− hängigkeit von Salzen im Reaktionspuffer Die Messungen wurden mit Hilfe des PAPS−Reduktase− gekoppelten Testsystems (vgl. 2.7.2.3.3) durchgeführt, der Reaktionsmix enthielt 25 ng ml−1 Enzym, 1 mmol l−1 MgATP und 10 µmol l−1 APS.

Ergebnisse

38

Die mögliche Aktivierbarkeit des Enzyms durch Reduktion, insbesondere durch Thio− redoxin, wurde als nächstes untersucht (Abb. 6). Das Protein wurde hierzu zum Zeitpunkt 0 mit dem chemischen Reduktionsmittel Dit− hiotreitol (DTT) und in einem weiteren Ver− such zusätzlich mit Thioredoxin (Trx1) aus E. coli versetzt. Darauf folgend wurde die Akti− vität des Enzyms in Abhängigkeit von der Inkubationszeit mit den Reduktionsmitteln bestimmt. Bereits eine fünfminütige Inkuba− tion mit DTT (10 mmol l−1) steigerte die Ak− tivität des Proteins um das 6fache. Thioredo− xin (1 µmol l−1) im Aktivierungsmix erhöhte die Aktivität auf das 10fache des Ausgangs− wertes. Nach einer Zugabe eines Überschusses an oxidiertem Glutathion (GSSG, 20 mmol l−1) zum aktivierten Enzym sank die Aktivität wieder auf das Ausgangsniveau.

Abbildung 6: Zeitabhängigkeit der reversiblen Aktivierung der APS−Kinase durch Reduktion Die Aktivierung wurde zum Zeitpunkt (0) durch Zugabe der Reduktionsmittel gestartet. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt der Zugabe eines Überschusses an GSSG. Die Messungen wurden mit Hilfe des PAPS−Reduktase− gekoppelten Testsystems (vgl. 2.7.2.3.3) in 50 mmol l−1 Tris/ HCl pH 8.0 ohne zusätzliche Salze durchgeführt, der Reaktionsmix enthielt 25 ng ml−1 Enzym, 1 mmol l−1 MgATP und 10 µmol l−1 APS. 100 % entsprechen einer Aktivität von 2.7 µmol mg−1 min−1.

Für alle weiteren Messungen wurde diesen Ergebnissen folgend ein 4 min durch 10 mmol l−1 DTT und 1 µmol l−1 Trx in 400 mmol l−1 Tris/HCl pH 7.5 aktiviertes Enzym verwendet. 3.1.3 „Steady−state“ Analyse der PAPS−Bildung Das neu etablierte Testsystem mit dem aktivierten Enzym diente als Grundlage für die im Folgen− den aufgeführte „steady−state“ Untersuchung der PAPS−Bildung. Hierzu wurde die Reaktionsge− schwindigkeit des Enzyms in Abhängigkeit von der Konzentration der beiden Substrate APS und MgATP bestimmt. Hierbei ergab sich für APS nicht das typische Bild einer Substratsättigung (Abb. 7). Die Aktivität des Enzyms stieg bis zur Konzentration von ~ 1 µmol l−1 APS an und fiel dann mit zunehmender APS−Konzentration wieder ab. Die APS−Kinase wurde durch ihr Substrat APS (> 1 µmol l−1) gehemmt. Nach Auftragung der APS−Konzentrationen, bei denen die höchsten Umsatz− raten erzielt wurden ([APS]opt), gegen die zugehörigen MgATP Konzentration ergab sich eine hy− perbolisch abfallende Kurve. Dies charakterisiert die APS−Hemmung gemäß McRae und Segel (1999) als unkompetitiv in Bezug auf MgATP.

Ergebnisse

39

Abbildung 7: Aktivität der APS−Kinase Akn1 aus Arabidopsis thaliana in Abhängigkeit von der APS Konzentration bei 0.04, 0.22, 0.4 und 2.5 mmol l−1 MgATP A: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der APS−Konzentration. B: Abhängigkeit der APS−Konzen− tration, bei der die gemessene Reaktionsgeschwindigkeit maximal wird ([APS]opt), von der MgATP−Konzentration zur Identifikation des APS−Inhibierungstyps. Die Messungen wurden mit Hilfe des PAPS−Reduktase−gekoppelten Testsystems (vgl. 2.7.2.3.3) mit einem wie unter 3.1.2 beschrieben aktivierten Enzym durchgeführt.

Tabelle 3.1: Kinetische Konstanten der APS−Kinase aus Arabidopsis thaliana (Akn1) Die Messungen erfolgten mit Hilfe des PAPS−Nachweises durch die PAPS−Reduktase (2.7.2.3.3).

Konstante

Wert

Bedeutung

Km APS

0.14 µmol l−1

[APS] bei ½ vmax

KI APS

4.54 µmol l−1

Inhibierungskonstante für APS

Km MgATP

147 µmol l−1

[MgATP] bei ½ vmax

Ki MgATP

199 µmol l

−1

Dissoziationskonstante des Enzym−MgATP−Komplexes −1

−1

Vmax

7.35 µmol mg min

Maximale Reaktionsgeschwindigkeit

Kcat

3.43 s−1

Umsatzrate pro aktivem Zentrum

[APS]opt

1 µmol l−1

[APS] bei optimaler Reaktionsgeschwindigkeit −1

−1

vopt

5.28 µmol mg min

Maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei [APS]opt

Q10

1.94

Relative Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit bei Erhöhung der Temperatur um 10 K ([15,35]°C)

Die Messpunkte aus Abb. 7 wurden einer nicht linearen Regressionsanalyse nach McRae und Segel (1999) unterworfen. Aus diesen Daten und den hier nicht dargestellten doppelt reziproken und sekundären Auftragungen der Ergebnisse wurden die in Tab. 3.1 zusammengefassten Ergeb− nisse errechnet. Besonders die hohe Affinität der APS−Kinase zu ihrem Substrat APS, die sich in

Ergebnisse

40

einer Michaelis−Konstante von Km = 140 nmol l−1 niederschlug, fiel auf. Dagegen lag die Michae− lis−Konstante für MgATP um den Faktor 103 höher (Km = 147 µmol l−1). Bereits bei einer APS Konzentration von 1 µmol l−1 wurde die optimale Reaktionsgeschwindigkeit von vopt = 5.28 µmol mg−1 min−1 erreicht. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit betrug 7.35 µmol mg−1 min−1. Die hohe Effizienz des Enzyms in Bezug auf sein Substrat APS mit 2.45 107 l mol−1 s−1 sollte es ihm 

ermöglichen, auch bei sehr geringen APS−Konzentrationen PAPS zu bilden. Die ermittelten Er− gebnisse werden in Zukunft helfen, die Synthese der Sulfonukleotide APS und PAPS auf enzyma− tischem Weg besser steuern zu können.

3.2 Die PAPS−Reduktase aus Escherichia coli Die PAPS−Reduktase aus E. coli bildete den Einstiegspunkt in die Untersuchung der Sulfonukleo− tid−Reduktion. Ihre Funktion bei der Reduktion des aktivierten Sulfates innerhalb der Sulfatassi− milation ist gut untersucht und allgemein akzeptiert. Das Enzym katalysiert die PAPS−Reduktion mit Thioredoxin oder Glutaredoxin als Elektronendonor: PAPS + Trxred/Grxred

SO32− + PAP + Trxox/Grxox

Bezüglich einiger zentraler Punkte ihrer molekularen Eigenschaften bestehen noch große Lücken im Wissensstand. Diese betref− fen die Interaktionen des Proteins mit seinen Substraten PAPS und Thio− oder Glutaredo− xin, die Redoxeigenschaften des Enzyms, den Elektronentransfer innerhalb des Proteins und die Dynamik des Proteins. Die im Folgenden beschriebenen biochemischen Untersuchungen der PAPS−Reduktase erfolgten mit, wie bei Lillig et al. (1999) aufgeführt, rekombinant exprimierten und durch Metallchelat−Affini− tätschromatografie gereinigten Histidin−Fu− sionsproteinen. Im Laufe dieser Arbeit konnte durch Verbesserungen der Expression die

Abbildung 8: Reinigung der PAPS−Reduktase A: SDS−PAGE von Zellextrakten aus E. coli BL21(DE3), 12.5 %, Coomassie Brillant Blue gefärbt. B: Western−Blot des Gels aus (A) mit anti:PAPS−Reduktase−Antikörpern. M: Molekulargewichtsmarker; 1: Expressionwirt. 2: Wirt mit pET16b transformiert. 3: Induzierter Wirt mit Ex− pressionsplasmid pET16bc y sH. 4: Gereinigtes Protein nach Metallchelat−Affinitätschromatografie (2 µg).

Ausbeute auf bis zu 40 mg l−1 Kulturvolumen gesteigert werden (vgl. 2.7.1.4). Die Reinheit des Proteins betrug dabei mindestens 98 %, was durch SDS−PAGE und immunologisch nach Western−Blotting überprüft wurde (Abb. 8).

Ergebnisse

41

3.2.1 Interaktionen der PAPS−Reduktase mit ihren Substraten Die PAPS−Reduktase katalysiert als Homodimer in einem Ping−Pong Mechanismus die Reduktion des aktivierten Sulfates. Hierbei wird das Protein zunächst durch Thio− oder Glutaredoxin redu− ziert. Im Anschluss kann es die gespeicherten Elektronen verwenden PAPS zu PAP und Sulfit umzusetzen (Berendt et al., 1995). Untersuchungen zur Spezifität der PAPS−Reduktase für diese Substrate und die Interaktionen mit diesen Substraten sind das folgende Thema. 3.2.1.1 Inhibierung der PAPS−Reduktase durch Purinnukleotide Zuerst wurden Inhibierungsstudien durchgeführt, um die Spezifität der PAPS−Reduktase für das Purinnukleotid PAPS zu untersuchen. Den Reaktionsansätzen wurden Substanzen zugesetzt, die mit dem Substrat PAPS um die Bindung im Protein konkurrieren könnten. Interaktionen der einge− setzten Purinnukleotide mit dem Enzym am Ort der PAPS−Bindung hätten sich so in einer ver− minderten Aktivität des Proteins niedergeschlagen. Folgende Substanzen wurden in dieser Weise in einem Konzentrationsbereich von 1 − 500 µmol l−1 untersucht: 2´AMP, 3´AMP, 5´AMP, 3´5´cAMP, 5´ADP, 5´ADPxMg, 5´APS, 2´5´PAP, 3´5´PAP, 5´ATP, 5´ATPxMg, 5´GTP, NAD+, NADH, NADP+, NADPH und Coenzym A (CoA). Von allen aufgeführten Substanzen führte nur 3´5´PAP zu einer verminderten PAPS−Reduktion. Um Aufschluss über die Natur der PAP Inhibierung zu erhalten, wurden detailiertere Untersu− chungen durchgeführt. Hierzu wurde die Abhängigkeit der PAPS−Reduktase−Aktivität von der [PAPS]−Konzentration (3.3 − 30 µmol l−1) bei in Vorversuchen festgelegten 3´5´PAP−Konzentra− tionen von 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10, 13.3, 16.7 und 20 µmol l−1 gemessen. Die Ergebnisse wurden in Abb. 9 doppelt reziprok aufgetragen (v−1 gegen [PAPS]−1). Der gemeinsame Schnittpunkt aller Geraden wurde mit (−0.0108±0.009/0.0631±0.028) als Mittel aus 28 Schnittpunkten bestimmt. Die sekundären Auftragungen der Ergebnisse mit [3´5´PAP] gegen die Steigungen der entsprechenden Geraden und [3´5´PAP] gegen die Schnittpunkte dieser Geraden mit der Y−Achse (v−1) ergaben lineare Funktionen (Abb. 9, B und C). Diese Befunde sind unter Vernachlässigung des zweiten Substrates Thioredoxin für eine „linear mixed−type“−Inhibierung charakteristisch (Segel, 1993, S. 170ff). Dieses System beinhaltet einen nicht produktiven Enzym−Inhibitor−Substrat−Komplex [EIS], in dem das Substrat (PAPS) [S] nicht umgesetzt werden kann:

Ergebnisse

42

Abbildung 9: Inhibierung der PAPS−Reduktase durch 3´5´PAP A: Doppelt reziproke Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der PAPS−Konzentration bei verschiedenen PAP−Konzentrationen. B: PAP−Konzentration gegen die Steigungen der Geraden aus (A). C: PAP− Konzentration gegen die Schnittpunkte der Geraden aus (A) mit der Y−Achse (v−1). Die Reaktionsansätze entsprechen 2.7.2.2 und enthielten als Reduktionsmittel 100 µmol l−1 Thioredoxin (sättigend), welches durch 10 mmol l−1 DTT im reduzierten Zustand gehalten wurde.

Aus den Sekundär−Plots konnten die kinetischen Parameter der Inhibierung wie folgt abgeleitet werden: Die Dissoziations−Konstante des Enzym−Inhibitor−Komplexes [EI] wurde aus dem X− Achsenabschnitt der Geraden [3´5´PAP] gegen die Steigung der Originaldaten als Ki = 3.7 µM be− stimmt. Die Dissoziations−Konstante αKi als X−Achsenabschnitt der [3´5´PAP] gegen die Y− Achsenabschnitte der Originaldaten konnte mit 29.5 µM ermittelt werden. Somit ergab sich für den Faktor α der Wert 8. Er gibt an, um wie viel sich die Gleichgewichts−Konstante ändert, wenn der Inhibitor (PAP) [I] im Enzym [E] bindet. Dieses Ergebnis legte den Schluss nahe, dass beide Mo− nomere des aktiven Dimers gleichzeitig in der Lage sind Substrat und Produkt [P] (Inhibitor) zu binden, ohne dann aber das Substrat umsetzen zu können. Die Spezifität der PAPS−Reduktase für PAP diente als Grundlage für eine Affinitätschroma− tografie des Proteins an einer 3´5´PAP−Agarose−Matrix (Sigma, Taufkirchen, A3640). Bei dieser Matrix ist das PAP am N6 des Purins über 8 Atome mit der Agarose verbunden. Die PAPS−Re− duktase zeigte in diesen Versuchen aber keine Affinität zu dieser Matrix (ohne Abb.). Als Ergebnis der Inhibierungsversuche wurde festgehalten, dass die PAPS−Reduktase aus− schließlich frei diffusibles Adenosin binden kann, das an 3´− und 5´−Position der Ribose phos− phoryliert ist.

Ergebnisse

43

3.2.1.2 Modell der PAPS−Bindung Die Ergebnisse der Inhibierungsversuche warfen die Frage auf, worin die Spezifität des Enzyms für freies PAP und PAPS begründet liegt. Um einen Enzym−Substrat−Komplex zu modellieren wurde daher auf Basis der Strukturen des PAP in der Östrogen−Sulfotransferase (Kakuta et al., 1997, PDB: 1aqy) und der Heparansulfat N−Deacetylase/N−Sulfotransferase (Kakuta et al., 1999, 1nst) ein 5´Phosphosulfat modelliert und durch Energieminimierung geometrisch korrigiert (Programm B, 100 Schritte, „AMBER force field“). Abb. 10 enthält eine Darstellung des Strukturmodells. Das PAPS und das zugrundeliegende PAP weisen für Adeninnukleotide eine ungewöhnliche Struktur im Bereich der Ribose auf. In der Halbses− selkonformation der Pentose sind wie in der Mehrzahl aller untersuchten Nukleotide 4 Atome koplanar. Das fünfte Atom steht in der Regel in Richtung des 5´Kohlenstoffs aus dieser Ebene heraus. Im Falle des C2 wird diese Konformation C(2´)−endo genannt, im Falle des C3 C(3´)−endo. Beim PAPS sind das O, das C1, das C2 und das C4 in einer Ebene. Das C3 mit der 3´Phosphatgruppe steht aber

Abbildung 10: Strukturmodell des PAPS

aus dieser Ebene nicht in Richtung des C5 heraus, sondern weist in die gegenüberlie− gende Richtung. Der Zucker befindet sich in C(3´)−exo−Konformation. Diese Konforma− tion weist nur geringe Ähnlichkeit mit anderen Purinnukleotiden auf, was als erstes Indiz für die hohe Spezifität der PAPS−Reduktase für dieses Substrat gewertet wurde. Das PAPS−Strukturmodell wurde in die Struktur der reduzierten PAPS−Reduktase (Savage et al., 1997, 1sur) modelliert (Abb. 11). Ausgang war die Position des Purinring− systems des AMP in der strukturell homologen Pyrophosphatase−Domäne der GMP−Synthe−

Abbildung 11: Übersicht des modellierten PAPS/ Protein−Komplexes

tase (Tesmer et al., 1996, 1gpm). Dieses An−

Die Ladungsverteilung auf der Oberfläche des Protein− Monomers wurden mit dem Swiss−PDB−Viewer berech− net (GROMOS 43A1 force field), rote Bereiche kenn− zeichenen negative Ladungen, blaue positive.

fangsmodell wurde im Anschluss 100 Schrit− ten einer Energieminimierung (Gromos 96)

Ergebnisse

44

Abbildung 12: Modell der PAPS Bindung in der PAPS−Reduktase Das Modell wurde nach Berechnung eines PAPS−Moleküls mit Hilfe von „B“ auf Basis der Position des AMP in der zur PAPS−Reduktase strukturell homologen Pyrophosphatase−Domäne der GMP−Synthetase (Tesmer et al., 1996, PDB: 1gpm) erstellt.

unterzogen. Das Substrat nimmt im Modell eine Lage in der positiven Bindenische des Proteins ein, bei der das N6 des Purinrings in der Bindenische verborgen ist (Abb. 11). Dies könnte die fehlen− den Wechselwirkungen des Proteins mit der PAP−Agarose−Matrix erklären, bei der das PAP über das N6 an die Matrix gekoppelt ist. Die möglichen Interaktionen zwischen Protein und Substrat in diesem Modell wurden mit Hilfe von Ligplot (Wallace et al., 1995) visualisiert (Abb. 12). Das Modell postuliert zahlreiche Wechselwirkungen des Proteins mit seinem Substrat. Für alle mögli− chen Donatoren und Akzeptoren am Purinring und am Phosphat der 3´−Position werden Wasser− stoffbrücken vorhergesagt. Das Purinringsystem und die Ribose sind darüber hinaus an hydropho− ben Wechselwirkungen mit dem Protein beteiligt. Erwartungsgemäß sind auch Aminosäurereste des Adeninnukleotid−α−Hydrolase−Motivs (Bork und Koonin, 1994; Savage et al., 1997) S51SSFG und

Ergebnisse

45

T77DTG in diese Wechselwirkungen involviert. Während S52 und S53 mit dem 3´Phosphat, dem Ribose−O2 und den N1 und N3 Atomen des Purins über die Sauerstoffe ihrer Peptidbindungen wechselwirken, werden für das T77 Wasserstoffbrücken zum N1 und N6 des Purins vorhergesagt. Die Aminosäuren G155 und L156 des sogenannten flexiblen Loops (Savage et al., 1997) interagieren mit dem 3´Phosphat über die Stickstoffatome ihrer Peptidbindungen. Für das Lysin K136 wurde schon eine Rolle bei der Bindung und Orientierung des Purinringsystemes von Savage et al. (1997) vorhergesagt. Diese in allen Sulfonukleotid−Reduktasen konservierte Aminosäure koordiniert hier das N7 des Purins. In Hinblick auf die PAPS−Reduktion muss im vorliegenden Modell besonders das Arginin R164 hervorgehoben werden. Dieses befindet sich mit seiner Guanidinogruppe in un− mittelbarer Nähe zum Phosphosulfat und damit am Ort der Reaktion. In dem hier vorgestellten Modell wurde das redoxaktive Zentrum der PAPS−Reduktase EC239GLH nicht berücksichtigt, da es für diesen Bereich noch keine experimentell ermittelten Strukturdaten für das Protein gab. Bis diese und Kokristallisationen des Enzyms mit seinem Sub− strat oder einem Analogon vorliegen, kann das erstellte Modell als Basis für biochemische Unter− suchungen der Substratbindung dienen. 3.2.1.3 Funktionsanalyse des Arginin R164 durch ortsgerichtete Mutagenese Im vorgestellten Modell der Protein−Substrat− Interaktionen befindet sich die Aminosäure Arginin R164 aus dem sogenannten flexiblen Loop in unmittelbarer Nähe zur Phosphosulfat Gruppe des Substrates. Zur Untersuchung der Funktion dieser Seitenkette wurde durch ortsgerichtete Mutagenese mit Hilfe der Po− lymerasekettenreaktion

(vgl.

2.6.4)

diese

Aminosäure durch Glycin ersetzt. Nach Veri− fizierung der Mutation durch Sequenzierungen erfolgte die Expression und Reinigung des mutagenisierten Proteins, wie für das Wild− typprotein beschrieben (vgl. 2.5.2, 2.7.1.4). Eine theoretische Überprüfung der Mutation mit Hilfe von Whatif (Vriend, 1990) lieferte ebenso wie das gereinigte Protein keine Hinweise

auf

nennenswerte

strukturelle

Auswirkung dieser Mutagenese. Die Nähe

Abbildung 13: Kinetische Analyse der PAPS− Reduktase mit dem Austausch R164→G Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der PAPS−Konzentration. Einschub: Doppelt reziproke Dar− stellung der Ergebnisse. Die Messpunkte entsprechen 3 unabhängigen Versuchen gemäß 2.7.2.2, sie erfolgten mit 20 µg ml−1 des gereinigten Proteins.

Ergebnisse

46

zum Phosphosulfat implizierte eine Beteiligung des Arginins am Reaktionsmechanismus. Nach Austausch durch Glycin sank die apparente maximale Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms auf Vmax = 21.4 nmol mg−1 min−1, Kcat = 1.14 10−2 s−1 (Abb. 13). Dies entsprach ca. 0.3 % der Aktivität 

des Wildtypproteins. Die Michaelis−Konstante für das Substrat PAPS lag mit einem Wert von Km = 8.7 µmol l−1 um den Faktor 2.6 niedriger als für das Wildtypprotein beschrieben (22.5 µmol l−1, Lillig et al., 1999). Der Austausch des in allen Sulfonukleotid−Reduktasen streng konservierten Arginin R164 durch Glycin führte zu einer Abnahme der Aktivität der PAPS−Reduktase um den Faktor 340. Die Effi− zienz in Bezug auf das Substrat PAPS sinkt hierbei um das 130fache von 1.76 105 l mol−1 s−1 auf 

1.31 103 l mol−1 s−1 . Dieser signifikante Aktivitätsverlust spricht für eine wichtige Funktion der 

Guanidinogruppe des R164 bei der Katalyse. 3.2.1.4 Wechselwirkungen der PAPS−Reduktase mit Redoxproteinen der Thioredoxin−Familie Die PAPS−Reduktase aus E. coli muss spezifisch durch Thioredoxin 1 (Trx1), Thioredoxin 2 (Trx2) oder Glutaredoxin 1 (Grx1) reduziert werden, bevor sie selbst das aktivierte Sulfat reduzie− ren kann, Glutaredoxin 2 (Grx2) oder Glutaredoxin 3 (Grx3) sind dazu nicht in der Lage (Lillig et al., 1999). Die im Folgenden aufgeführten Versuche sollten einen Betrag leisten, die Wechselwir− kungen der PAPS−Reduktase mit diesen Substraten und den Mechanismus der Reduktion des En− zyms durch die Redoxine besser zu verstehen. 3.2.1.4.1 Expression des Thioredoxin 1 und Glutaredoxin 1 aus E. coli Für die geplanten Experimente wurden die Redoxine Trx1 und Grx1 aus E. coli in Substrat− Mengen benötigt. Durch Expression rekombinanter Proteine und Reinigung durch Metallchelat− Affinitätschromatografie konnten diese bereitgestellt werden. Unter den hierfür hergestellten Plasmiden erwiesen sich die pET24a (Novagen, Madison USA) Derivate pCHLt3 und pCHLg2 (vgl. 2.3.2) in Kombination mit dem Expressionsstamm E. coli BL21(DE3) als effektivste Kom− bination. Die zur Reinigung benötigten His−6−Oligopeptide sind hier C−terminal anfusioniert, da so die redoxaktive CxxC−Gruppe nicht beeinflusst wird. Nach Anzucht der Bakterien gemäß 2.5.2 und Reinigung der Proteine gemäß 2.7.1.4 standen diese in ausreichenden Mengen zur Verfügung. Die Ausbeute betrug für das Trx1−6His ca. 100 mg und für das Grx1−6His ca. 75 mg pro l Kul− turvolumen. Die Reinheit der Proteine (> 99 %) wurde durch SDS−PAGE überprüft (ohne Abb.). Ihre Funktionalität wurde durch die Aktivität der PAPS−Reduktase und im Falle des Trx1 zusätz− lich durch seine Fähigkeit die Reduktion des Insulins zu katalysieren (Holmgren, 1979) nachge−

Ergebnisse

47

wiesen (nicht dargestellt). Die so synthetisierten Proteine mit C−terminal angefügten 6 Histidinen entsprachen in ihrer Aktivität vollständig den nicht modifizierten Proteinen. 3.2.1.4.2 Untersuchung der Reduktion der PAPS−Reduktase mit der Glutaredoxin 1− Mutante C14→S Thio− und Glutaredoxine reagieren im allgemeinen mit einem Pro− teindisulfid, in dem dieses durch nukleophilen Angriff des ersten Cysteins des CxxC−Motivs reduziert wird, wonach das gemischte Disulfid durch das zweite Cystein reduziert wird (Abb. 14, Holm− gren, 1995). Die Monothiol−Mutante C14→S des Glutaredoxin 1 aus E. coli1, bei der das zweite Cystein des reaktiven CxxC−Motivs ausgetauscht ist, konnte bereits erfolgreich benutzt werden, die In− teraktionen des Redoxins mit Glutathion (Bushweller et al., 1992; Bushweller et al., 1994) und den Mechanismus der Reduktion der Ribonukleotid−Reduktase zu untersuchen (Beradi et al., 1998). In der SDS−PAGE konnte hier erstmals nachgewiesen werden, dass auch die PAPS−Reduktase einen stabilen Komplex mit der Monothiol−Glutaredoxin−Mutante C14→S in Form eines gemischten Disulfids bilden kann (Abb. 15). Unter denaturierenden Bedingungen

Abbildung 14: Mechanis− mus der Disulfid−Reduk− tion durch Trx oder Grx (nach Holmgren, 1995)

ohne zusätzliche Reduktionsmittel ließen sich die reduzierte und oxidierte Form der PAPS− Reduktase gut unterscheiden. Die reduzierte Form lief auf einer Höhe von 30 kDa, ent− sprechend dem Monomer, während die oxi− dierte Form als Disulfid−Dimer im Gel ent− sprechend einer Größe von 60 kDa wanderte. Wurde die oxidierte Form der PAPS−Reduk− tase vor der Denaturierung mit Grx1C14→S inkubiert, so bildete sich ein Proteingemisch aus reduziertem PAPS−Reduktase− Monomer, dem Glutaredoxin und einem gemischten Disulfid aus der PAPS−Reduktase und dem Redoxin, erkennbar an der Proteinbande ent− sprechend ca. 40 kDa, was der Summe aus

Abbildung 15: Die PAPS−Reduktase vor und nach Behandlung mit DTT und der Grx1− Mutante C14→S SDS PAGE, 17.5 %, Coomassie Brillant Blue gefärbt. M: Molekulargewichtsmarker; 1: 3 µg PAPS−Reduktase mit 5 mmol l−1 DTT; 2: 3 µg PAPS−Reduktase wie gereinigt; 3: 3 µg PAPS−Reduktase mit 1 µg Grx1C14→S (äquimo− lar); 4: wie (3), aber zusätzlich mit 5 mmol l−1 DTT.

1 Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Dr. Arne Holmgren, Karolinska Institut Stockholm, Schweden.

Ergebnisse

48

PAPS−Reduktase−Monomer (30.4 kDa) und Glutaredoxin (9.6 kDa) entsprach (Abb. 15, 3). Das Verhältnis zwischen dem gemischten Disulfid und dem PAPS−Reduktase−Monomer war nach Abschätzung aus dem Gel etwa 1:1. Dies ließ darauf schließen, dass das Glutaredoxin einen PAPS− Reduktase−Dimer so reduziert, dass nach Denaturierung ein Monomer−Glutaredoxin−Komplex und ein freies reduziertes Monomer entstand. Bei Einsatz eines Glutaredoxins mit vollständigem CxxC−Motiv entstand der Komplex nicht (ohne Abb.). Die Inkubation des gemischten Disulfids mit Reduktionsmitteln löste den Komplex wieder auf, wie aus der SDS−PAGE ersichtlich wurde (Abb. 15, 4). Das auch in der SDS−PAGE stabile Disulfid aus PAPS−Reduktase−Monomer und Glutaredoxin repräsentiert einen Übergangskomplex der Reduktion des Enzyms durch das Redoxin (vgl. Abb. 14, Mitte). In Lösung wird es höchstwahrscheinlich als Intermediat zwischen dem Dimer und dem Redoxin auftreten. Die Ergebnisse bestätigen, dass das PAPS−Reduktase−Dimer in seiner oxidierten Form ein Disulfid zwischen den beiden Cysteinen der Monomere im EC239GLH−Motiv ausbildet und dass dieses durch das Glutaredoxin in einer zweistufigen Reaktion reduziert wird, wobei sich interme− diär ein gemischtes Disulfid zwischen dem Cystein239 eines Monomers und dem N−terminalen CxxC Cystein11 des Glutaredoxins ausbildet. 3.2.1.4.3 Heterologe Thio− und Glutaredoxine als Elektronendonatoren der PAPS− Reduktase Die PAPS−Reduktase aus E. coli kann Thioredoxin 1, Thioredoxin 2 und Glutaredoxin 1, nicht aber Glutaredoxin 2 oder Glutaredoxin 3 aus E. coli als Reduktionsmittel verwenden (Lillig et al., 1999). Die Proteine der strukturell sehr ähnlichen Thioredoxinfamilie unterscheiden sich haupt− sächlich in ihrem Redoxpotential und ihren Oberflächeneigenschaften nahe dem redoxaktiven Zentrum CxxC. Um herauszufinden, ob und wie die PAPS−Reduktase zwischen verschiedenen Redoxinen unterscheidet, wurden 4 cytosolische Thioredoxine aus Arabidopsis thaliana2 (trxH1, Genbank: Z14084; trxH2, Z35475; trxH3, Z35474; trxH4, Z35473), das Glutaredoxin 43 aus E. coli, das Glutaredoxin aus dem Phagen T44 und der C−Terminus der APS−Reduktase aus Catha− ranthus roseus, der dort als Reduktand der N−terminalen PAPS−Reduktase−homologen Domäne dient und Eigenschaften von Thio− und Glutaredoxinen aufweist (Prior et al., 1999), untersucht. Während dieses Protein wie das Glutaredoxin 4 aus E. coli und das T4−Glutaredoxin keine Elektronen auf die PAPS−Reduktase übertragen konnten, waren alle getesteten pflanzlichen dazu in der Lage (Abb. 16). Als Kontrolle dienten die als C−terminale 6−Histidin−Fusion exprimierten und durch Metallchelat−Affinitätschromatografie gereinigten Redoxine Trx1 und Grx1 aus E. coli. Die 2 Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Yves Meyer, Universität Perpignan, Frankreich und Prof. Dr. Jean Pierre Jacquot, Universität Nancy, Frankreich. 3 Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Alexios Vlamis, Karolinska Institut Stockholm, Schweden. 4 Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Fredrik Åslund, Karolinska Institut Stockholm, Schweden.

Ergebnisse

49

Abbildung 16: Pflanzliche Thioredoxine als Elektronendonatoren der PAPS−Reduktase A: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der eingesetzten Thioredoxin−Konzentration. B: Doppelt reziproke Darstellung der Ergebnisse aus (A). Die Versuche wurden gemäß 2.7.2.2 mit 250 − 1000 ng ml−1 Enzym bei einer sättigenden PAPS−Konzentration von 100 µmol l−1 durchgeführt. Als Kontrolle wurde Thioredoxin 1 aus E. coli mit am C−Terminus angefügten 6 Histidinen eingesetzt (trx1−6H E.c.).

ermittelten kinetischen Parameter (Übersicht in Tab. 3.2) für das Trx1−6His mit Vmax = 7.4 µmol mg−1 min−1 und Km = 13.2 µmol l−1 und das Grx1−6His mit Vmax = 4.1 µmol mg−1 min−1 und Km = 12.7 µmol l−1 stimmen mit früheren Ergebnissen für die Proteine ohne Histidinfusion überein (VmaxTrx = 6.6 µmol mg−1 min−1 und KmTrx = 13.7 µmol l−1, VmaxGrx = 5.1 µmol mg−1 min−1 und KmGrx = 14.9 µmol l−1, Lillig et al., 1999). Von den untersuchten pflanzlichen Thioredoxinen ist das TrxH3 das effektivste Reduktionsmittel. Seine Michaelis−Konstante Km = 17.8 µmol l−1 und die maximalen Reaktionsgeschwindigkeit von Vmax = 13.2 µmol mg−1 min−1 entsprechen einer Effekti− vität (Kcat Km−1) von 154 % im Vergleich zum E. coli Trx1. Die übrigen ermöglichen die PAPS− Reduktion mit Effizienzen von: TrxH1 = 18 % (Vmax = 5.3 µmol mg−1 min−1, Km = 59 µmol l−1), TrxH2 = 23 % (Vmax = 4.7 µmol mg−1 min−1, Km = 43.1 µmol l−1) und TrxH4 = 45 % (Vmax = 5.7 µmol mg−1 min−1, Km = 26.1 µmol l−1). Die PAPS−Reduktase aus E.coli konnte mit bislang jedem getesteten Thioredoxin als Reduk− tionsmittel PAPS zu Sulfit und PAP umsetzen. Die unterschiedliche Effektivität der getesteten Redoxine und die Unfähigkeit des T4 Glutaredoxins, des C−Terminus der APS−Reduktase sowie der Glutaredoxine 2 und 3 (Lillig et al., 1999) konnte nicht durch offensichtliche Gemeinsamkeiten oder Unterschiede in der Primärstruktur dieser Redoxine erklärt werden. Als Erklärung hierfür könnten aber gestörte Protein−Protein−Wechselwirkungen auf Grund von inkompatiblen elektro− statischen Oberflächen ebenso in Frage kommen wie energetische Barrieren (vgl. Diskussion, 4.1.1).

Ergebnisse

50

Tabelle 3.2: Thio− und Glutaredoxine als Elektronendonatoren der PAPS−Reduktase Die Messungen erfolgten gemäß 2.7.2.2 mit 250 − 1000 ng ml−1 PAPS−Reduktase und [PAPS] = 100 µmol l−1. Die relative Effizienz bezieht sich auf das Wildtyp−Thioredoxin 1 aus E. coli (Lillig et al., 1999). Trx1−, Grx1−6His: Trx1 bzw. Grx1 mit am C−Terminus angefügten 6 Histidinen. Par2−CT: Die C−terminalen 142 Aminosäurereste der APS−Reduktase aus Catharanthus roseus.

Proteine

Genbank−ID

Organismus

Km

Vmax

Effizienz

µmol l−1

µmol mg−1 min−1

%

Trx1−6His

−

E. coli

13.2

7.4

116

Grx1−6His

−

E. coli

12.7

4.1

64

Grx4

−

E. coli

TrxH1

Z14084

Arabidopsis thaliana

59.0

5.3

19

TrxH2

Z35475

Arabidopsis thaliana

43.1

4.7

23

TrxH3

Z35474

Arabidopsis thaliana

17.8

13.2

154

TrxH4

Z35473

Arabidopsis thaliana

26.1

5.7

45

Par2−CT

−

Catharanthus roseus

keine Aktivität

Grx

TXBPT4

Bakteriophage T4

keine Aktivität

keine Aktivität

3.2.2 Redoxeigenschaften der PAPS−Reduktase aus E. coli Das PAPS−Reduktase−Dimer erfährt während seines Reaktionszyklus konformationelle Verände− rungen, die zu einer Abnahme des apparenten Molekulargewichtes von 52 kDa auf 46 kDa während der Reduktion des Substrates PAPS führen (Berendt et al., 1995). Die Autoren konnten die UV− Differenzabsorptions−Spektroskopie als praktikables Mittel zur Charakterisierung dieser redoxin− duzierten Konformationsänderungen einführen. Das dabei verwendete Verfahren mit Tandem− Küvetten ermöglichte es diese Änderungen durch redoxaktive Substanzen zu induzieren, ohne dass die Absorption dieser Stoffe selber berücksichtigt werden musste (Schmidt, 1990; vgl. 2.9.1). 3.2.2.1 UV−Absorptions−Spektroskopie zur Charakterisierung von redoxinduzierten Konformationsänderungen Dieses Verfahren wurde in dieser Arbeit benutzt, um den Mechanismus der Reduktion des Enzym− Dimers zu untersuchen und um eine Methode zu etablieren, die es möglich machte den Redoxzu− stand des Proteins in Lösung zu bestimmen. Zur Induktion der verschiedenen Redoxzustände wurden die Substrate des Enzyms PAPS und Grx1 eingesetzt, wobei letzteres als Grx1−6His durch Glutathion reduziert wurde. Das Photometer wurde mit der PAPS−Reduktase in Substratkonzen− tration (60 − 500 µmol l−1) im Referenz− und Messstrahl abgeglichen. Danach erfolgte die Be− handlung des Proteins im Messstrahl mit redoxaktiven Substanzen, während diese Substanzen im Referenzstrahl in die zweite Küvette ohne Protein gegeben wurden. Danach konnten die Verände−

Ergebnisse

51

rungen über das gesamte Spektrum oder die zeitabhängige

Absorptionsveränderung

bei

einer Wellenlänge verfolgt werden. Abb. 17 repräsentiert verschiedene Differenzspektren. (A) zeigt 2 unabhängig erstellte Spektren der Differenz aus zuvor oxidiertem minus voll− ständig durch GSH und Grx1 reduziertem Protein. Nach Reduktion traten 2 zusätzliche Absorptionsbanden auf. Die erste, recht breite Bande hatte ihr Maximum bei 253 nm. In diesem Bereich absorbieren Disulfide und Phenylalanin (Schmidt, 1990), zum Teil auch die dissoziierte Thiolgruppe (Jocelyn, 1972). Die stärkere Absorptionsänderung hatte ihr Maximum bei 294 nm. Dieser Spektralbereich ist charakteristisch für Tryptophane, die nach einer Konformationsänderung anders mit ihrer Umgebung interagieren. Neben diesen starken

Abbildung 17: UV−Absorptionsdifferenz−Spek− tren der PAPS−Reduktase Die Messungen wurden im Zweistrahl−Spektralphoto− meter SIGMA ZWSII mit 4 in Paaren angeordneten Küvetten nach Schmidt (1990) durchgeführt (vgl. 2.9.1). Die Referenzküvetten enthielten das vollständig oxidierte Protein und das Glutathion/Grx getrennt. (A) Veränderung des molaren Absorptionskoeffizienten bei vollständiger Reduktion des Proteins in den Messküvetten, (B) bei Einstellung eines Redoxpotentials von −100 mV.

Signalen konnte erstmals zusätzlich ein sehr kleines Signal bei 284 nm detektiert werden, wie es für verändert interagierende Tyrosine typisch ist. Die selben Ergebnisse konnten auch bei umgekehrter Vorgehensweise durch Behandlung eines reduzierten Proteins mit dem Substrat PAPS erzielt werden. Abb. 17 (B) zeigt ein Differenzspek− trum, bei dem sich in den Referenzküvetten vollständig oxidiertes Protein befand, während die Probenküvetten PAPS−Reduktase mit Grx1 bei einem durch das GSSG/GSH2 Verhältnis vorge− gebenen Redoxpotential von −100 mV enthielt. Unter diesen Bedingungen war das Enzym−Dimer fast vollständig oxidiert. Dies konnte parallel durch Inkubation eines so behandelten Proteins mit [35S]PAPS bestätigt werden. Das Protein konnte auch in Substrat−Konzentration kein [35S]Sulfit in einer Einzelumsatzreaktion freisetzen. In den Differenzspektren dieses Proteins war das 294 nm Signal fast vollständig verschwunden. Die Signalintensität bei 253 nm sank auf etwa 40 % gegen− über dem vollständig reduzierten Enzym. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Differenzsignal bei 294 nm proportional zur Proteinmenge und zum Anteil des reduzierten Proteins in der Lösung war, während das Signal bei 253 nm vermutlich wegen eines heterogenen Ursprungs diese Proportionalität nicht aufwies. Die PAPS−Reduktase bildet ein stabiles gemischtes Disulfid mit der Grx1−Mutante C14→S, welches einen Übergangskomplex der Reduktion des Enzyms durch das Redoxin repräsentiert (vgl.

Ergebnisse

52

3.2.1.4.2). Eine Untersuchung dieses Kom− plexes gegenüber der oxidierten PAPS−Re− duktase und dem freien Glutaredoxin in der Differenz−Spektroskopie (Abb. 18) zeigte Ähnlichkeiten mit den Absorptionsänderungen der PAPS−Reduktase nach Reduktion. Sowohl das Signal im Bereich von 253 nm als auch das Tryptophan Signal bei 294 nm waren vorhanden, wiesen aber in ihrer Qualität und Quantität Unterschiede auf. Das Maximum des 253 nm Signals lag weiter im UV−Bereich bei 250 nm und es enthielt zusätzlich eine kleine Schulter bei ~ 264 nm. Es schien, als fehlte dieser Probe eine absorbierende Teilkompo− nente, eventuell der Anteil eines Phenylala−

Abbildung 18: UV−Absorptionsdifferenz−Spek− trum des PAPS−Reduktase/Grx1C14→S−Kom− plexes Die Messungen wurden im Zweistrahl−Spektralphoto− meter SIGMA ZWSII mit 4 in Paaren angeordneten Küvetten nach Schmidt (1990) durchgeführt (vgl. 2.9.1). Die Referenzküvetten enthielten das vollständig oxidierte Protein und das Grx getrennt. In der Messküvette befand sich ein gemischtes Disulfid zwischen den beiden Proteinen.

nins. Der Hauptteil der Absorption in diesem Spektralbereich wurde vermutlich durch die gebildete Disulfidbrücke zwischen dem Enzym und dem Grx1 verursacht. Die 3.8fach geringere Intensität gegenüber der Veränderung des molaren Absorptionskoeffizienten der oxidierten minus reduzierten Proteine beruhte wahrscheinlich auf einer anderen Zugänglichkeit der gemischten Disulfidbindung gegenüber dem Disulfid des PAPS− Reduktase−Dimers. Das 294 nm Signal entsprach in seiner Ausprägung den Ergebnissen für das reduzierte Protein, seine Intensität war aber 5.2fach geringer. Da sich die Signalformen sehr ähnlich waren, lag der Schluss nahe, dass die Konformationsänderungen hin zu einem apparent größeren Molekulargewicht zum Teil schon durch die Ausbildung des gemischten Disulfids mit dem Redo− xin stattfanden. Die vollständigen Absorptionsänderungen durch die Konformationsänderungen hin zur „offenen“ oder reduzierten Konformation finden erst nach Reduktion des gemischten Disulfids durch das C−terminale Cystein des CxxC−Clusters des Redoxins statt. Die PAPS−Reduktase−Mutante C239→G (Lillig, 1998), die in ihrer Konformation dem redu− zierten Dimer entsprechen sollte (Berendt et al., 1995), aber inaktiv ist und nicht oxidiert werden kann, zeigte bei Inkubation des Proteins in der Messküvette mit PAPS oder PAP keine Verände− rungen der Absorptionseigenschaften zwischen 220 und 340 nm gegenüber dem unbehandelten Protein. Dieser Befund deutete darauf hin, dass das Protein seine apparent kleinere Konformation nicht durch Bindung des Substrates einnimmt, sondern erst nach der Katalyse. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Konformationsänderungen der PAPS−Reduk− tase mit Hilfe der Differenz−Spektroskopie sowohl bei Reduktion als auch bei Oxidation des Pro−

Ergebnisse

53

teins dargestellt werden können. Ein bei 294 nm auftretendes Differenzsignal eignet sich zur Be− stimmung des Redoxzustands des Enzym−Dimers. Während des ersten Reduktionsschrittes des Proteins durch Glutaredoxin 1, dem gemischten Disulfid, treten mit geringerer Intensität und leicht veränderter Qualität Absorptionsveränderungen auf, wie sie für den reduzierten Dimer im Ver− gleich zum oxidierten aufgezeigt wurden. Dagegen finden bei Verwendung einer inaktiven C239→G PAPS−Reduktase−Mutante, die ein apparentes Molekulargewicht entsprechend dem reduzierten Dimer besitzt, keine Veränderungen im Absorptionsverhalten bei Inkubation mit PAPS oder PAP statt. 3.2.2.2 Bestimmung des Standard−Redoxpotentials der PAPS−Reduktase Das gemessene redoxabhängige UV−Absorp− tionsdifferenz−Signal bei 294 nm war geeig− net, um den Anteil an oxidiertem bzw. redu− ziertem Protein in einer Lösung zu bestimmen. Damit war eine Möglichkeit gegeben das Standard−Redoxpotential des Enzyms zu be− stimmen. Zu diesem Zweck wurde das Protein in

glutathionhaltigen

Redoxpuffern

(Na−

triumphosphat, pH 7.0), die eine katalytische Menge an Grx1 enthielten (0.5 − 1 µmol l−1) inkubiert und die Veränderungen der Absorp− tion bei 294 nm mit der Zeit aufgezeichnet. Die PAPS−Reduktase wurde vor diesen Ver− suchen durch Inkubation mit PAPS für eine Stunde bei 25°C vollständig oxidiert. Über− schüssiges PAPS, PAP und Sulfit wurden durch Gelfiltrationschromatografie (Sephadex G25) entfernt. Das Redoxpotential des Puffers

Abbildung 19: Zeitabhängige Veränderung der Absorption der PAPS−Reduktase bei 294 nm durch Reduktion Die Gleichgewichtseinstellung wurde durch Absorptions− differenz−Spektroskopie bei 294 nm mit vollständig oxidiertem Enzym als Referenz nach Inkubation der Proben mit GSH/GSSG−Grx1−Redoxpuffern mit dem angegebenen Potential verfolgt.

wurde durch Variation des GSH/GSSG Ver− hältnisses vorgegeben. Daraufhin wurde die Veränderung der Absorption bis zur Einstellung eines Gleichgewichtes verfolgt (Abb. 19). Die im Gleichgewicht gemessene Veränderung des molaren Absorptionskoeffizienten wurde dann im Verhältnis zur Signalintensität des 

294

PRox − 

294

PRred

Signals ausgewertet. Bei den Berechnungen der Potentiale im Gleichgewicht konnte das eingesetzte Glutaredoxin vernachlässigt werden, da die Gleichgewichts−Konstante der Gesamtreaktion keq nur die oxidierten und reduzierten Formen der PAPS−Reduktase und des Glutathions enthält:

Ergebnisse

54

Auf Basis der Nernst Gleichung ergibt sich im Gleichgewicht:

Hierbei steht R für die allgemeine Gaskonstante (8.3145 J K−1 mol−1), T für die absolute Tem− peratur in Kelvin, n für die Mole übertragener Elektronen und F für die Faraday−Konstante (96494 J V−1 mol−1). Legt man das allgemein akzeptierte Redoxpotential für Glutathion mit E0´ = −240 mV (Rost und Rapoport, 1964) zu Grunde, so bleibt als einzige Unbekannte das Standard− Redoxpotential für die PAPS−Reduktase. Der reduzierte Anteil der PAPS−Reduk− tase in Abhängigkeit vom vorgegebenen Re− doxpotential

unter

Standardbedingungen

wurde auf dieser Basis spektroskopisch be− stimmt. Die Ergebnisse von 25 Bestimmungen im Gleichgewicht sind in Abbildung 20 dar− gestellt. Die Messwerte wurden gemäß der aufgeführten Gleichung einer nicht linearen Regressionsanalyse unterzogen. Hierbei wur− den das E0´ der PAPS−Reduktase und n als variable Parameter eingesetzt. Das Ergebnis ist als Kurve ebenfalls in Abb. 20 dargestellt. Die Auswertung dieser Ergebnisse lieferte ein Standard−Redoxpotential für die PAPS−Re− 0

duktase von E ´ = −162.2 mV. Der dabei für n berechnete Wert von 1.97 stimmt mit der Annahme

eines

2

Elektronen−Übergangs

Abbildung 20: Redoxtitration der PAPS−Reduk− tase aus Escherichia coli Die Kurve ist die Regression der Messwerte gemäß der Nernst−Gleichung. Der Anteil der reduzierten PAPS−Re− duktase wurde durch Absorptionsdifferenz−Spektroskopie bei 294 nm mit vollständig oxidertem Enzym als Referenz durch Inkubation der Proben in GSH/GSSG−Grx1− Redoxpuffern bei pH 7.0 und 25°C bestimmt.

überein. Das Redoxpotential von −162.2 mV kann keine thermodynamische Erklärung für das Versagen von Grx3 als Elektronendonor der PAPS−Reduktase liefern. Sein Redoxpotential von −198 mV (Åslund et al., 1997) sollte unter re− duzierenden Bedingungen die Reduktion aus energetischer Sicht ermöglichen.

Ergebnisse

55

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass mit Hilfe der UV−Differenz−Spektroskopie das Standard−Redoxpotential der ECGLH−Thiolgruppen der PAPS−Reduktase als E0´ = −162 mV bestimmt werden konnte. Bei den in E. coli vorherrschenden reduzierenden Bedingungen sollte die PAPS−Reduktase daher immer in der reduzierten und damit aktiven Form vorliegen.

3.3 Das PAPS−Reduktase−homologe Protein CysH1 aus Bacillus subtilis Das PAPS−Reduktase−homologe Protein CysH1 (Mansilla und de Mendoza, 1997, Genbank: CAA04409) aus Bacillus subtilis wurde als Vertreter der Gruppe der Sulfonukleotid−Reduktasen untersucht, die in ihrer Primärstruktur die pflanzentypischen CC...CxxC Cysteine aufweisen (vgl. 1.2.3). Im Vordergrund stand hierbei der Vergleich zur PAPS−Reduktase und dabei die Fragen nach der Sulfonukleotid−Spezifität und dem Elektronendonor dieses Proteins. 3.3.1 Expression und Reinigung des CysH1−Proteins aus Bacillus subtilis Ausgehend vom Plasmid pET16bcysHBs5, welches das Bacillus subtilis−Gen cysH1 (Mansilla und de Mendoza, 1997) enthält, erfolgte die Expression und Reinigung in Anlehnung an das für das homologe E. coli−Protein beschriebene Verfahren. Die Reinigung gemäß 2.7.1.4 erbrachte Protein mit mehr als 95 % Reinheit bei einer Ausbeute von 8 mg pro l Kulturvolumen (Abb. 21). Erstaunlicherweise erwies sich dieses Protein nicht wie das Homolog aus E. coli als farblos, es war gelb. Dieser Chromophor konnte weder durch Gelfiltration (Sephadex G25) noch durch Ul− trafiltration entfernt werden und musste daher stabil im Protein gebunden vorliegen. Eine Behand− lung des Proteins mit Reduktionsmitteln führte zu einer Verstärkung der gelben Farbe. Die Lagerung des Proteins über Nacht im Eis (0.5°C) führte dagegen zu fast vollständigem Ausbleichen des Proteins. Dieses Ausbleichen ging einher mit dem vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität. Daher wurde das Protein entweder direkt nach der Elution von der Chromatografiesäule oder nach Konzen− tration in flüssigem Stickstoff mit 10 % Gly− cerol eingefroren und

bei −80°C gelagert.

Hierdurch konnten die enzymatischen Eigen− schaften des „frischen“ Proteins erhalten werden.

Abbildung 21: Reinigung des CysH1−Proteins SDS−PAGE, 12.5 %, Coomassie Brillant Blue gefärbt. M: Molekulargewichtsmarker; 1: 12 µg Zellextrakt des Ex− pressionsstammes E. coli BL21(DE3) pET16b. 2: 12 µg Zellextrakt E . c ol i BL21(DE3) pET16bc ysHB s. 3: Durchlauf der Metallchelat−Affinitätschromatografie (12 µg). 4: 3 µg gereinigtes 10−His−Protein.

5 Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Antje Berken geb. Prior

Ergebnisse

56

3.3.2 Eigenschaften des rekombinanten Proteins Das rekombinant hergestellte CysH1−Protein enthielt eine chromophore Gruppe. Zur Cha− rakterisierung dieser Gruppe wurden zuerst spektroskopische Untersuchungen der nativen und reduzierten Proteine vorgenommen (Abb. 22). Die Absorptioneigenschaften der Proteine wurden durch Differenz− und Derivativ− Spektroskopie ausgewertet. Durch Bildung der vierten Ableitung der Spektren konnten so auch überlagerte Spektralbanden identifiziert werden (Schmidt, 1994). Sowohl das frisch gereinigte als auch das durch DTT reduzierte Protein wiesen neben den proteintypischen Absorptionsbanden eine zusätzliche bei 330 nm von geringer Intensität auf. Die reduzierte Form enthielt darüber hinaus eine schwache Absorptionsbande bei 414 nm. In der Diffe−

Abbildung 22: Absorptionsspektren der Sulfonu− kleotid−Reduktase CysH1 aus Bacillus subtilis A: Absorptionsspektren des Proteins (1.8 mg ml−1) nach der Reinigung und nach Behandlung mit dem Reduktions− mittel DTT. B: Differenz der Spektren und ein Teil der 4. Ableitung.

renz der Absorptionsspektren der reduzierten und der oxidierten Spezies des Proteins konnten zu− sätzliche Maxima bei 320, 424 und 514 nm detektiert werden. Der Chromophor des Proteins zeigte keine Fluoreszenz bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 300 − 600 nm. Die Sulfonukleotid−Reduktase CysH1 aus Bacillus subtilis enthielt eine chromophore Gruppe. Bislang galten aber die Sulfonukleotid−Reduktasen als farblos und frei von Kofaktoren. Die spek− troskopischen Eigenschaften dieses Chromophors sprachen gegen Hämgruppen, Flavinnukleotide, Chinone oder ähnliche Faktoren. Das Absorptionsspektrum zeigte aber gewisse Ähnlichkeiten mit Proteinen, die nicht hämgebundenes Eisen enthalten (Holm et al., 1996), ohne dass sie aber einem in der Literatur veröffentlichten Typ direkt zugeordnet werden konnten. 3.3.3 Substratspezifität des CysH1−Proteins aus Bacillus subtilis Für das Protein CysH1 aus B. subtilis lagen noch keine enzymatischen Untersuchungen vor, wes− halb im Rahmen dieser Arbeit die Spezifität des Proteins für die Sulfonukleotide APS und PAPS und mögliche Reduktionsmittel untersucht wurde. Nach einer Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde die Aktivität des Enzyms unter fol− genden Bedingungen gemessen: 100 mmol l−1 Tris/HCl pH 8.0, 30°C, 10 mmol l−1 Na2SO32−, 0.5 −

Ergebnisse

57

200 µmol l−1 APS oder PAPS, 1 − 100 µmol l−1 Trx und 10 mmol l−1 DTT bei einer Protein− menge von 3 − 8 µg ml−1. Das in dieser Arbeit untersuchte Protein CysH1 aus B. subtilis ist das erste Enzym der Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen, das APS− und PAPS reduzieren kann. Als Re− duktionsmittel des Enzyms konnte weder das artifizielle Dithiotreitol (DTT) noch das als Reduktionsmittel der pflanzlichen APS−Re− duktasen identifizierte Glutathion dienen. Wie das Protein aus E. coli , ist die von dem Pro− tein aus B. subtilis katalysierte Reaktion ob− ligat auf Thioredoxin als Elektronendonor angewiesen. Die Abhängigkeit der Enzymge− schwindigkeit von der Trx−Konzentration wurde mit dem Modell−Thioredoxin Trx1 aus

Abbildung 23: Aktivität des CysH1−Proteins aus Bacillus subtilis in Abhängigkeit von der Thio− redoxin−Konzentration A: Auftragung der Ergebnisse nach Michaelis und Menten. B: Doppelt reziproke Darstellung der Ergebnisse aus (A). Die Messungen erfolgten gemäß 2.7.2.2. mit 6 − 7.5 µg ml−1 Protein mit sättigenden APS− und PAPS−Konzen− trationen von mind. 100 µmol l−1.

E. coli untersucht (Abb. 23). Nach Auswer− tung von zwei unabhängigen Messreihen wurde bei Verwendung von APS als Substrat eine Michaelis−Konstante von Km

(Trx mit APS)

=

54.3 µmol l−1 bei einer apparenten maximalen Reaktionsgeschwindigkeit von Vmax = 327 nmol mg−1 min−1 bestimmt. Mit PAPS als Substrat ergaben sich mit Km (Trx mit PAPS) = 67.5 µmol l−1 und Vmax = 411 nmol mg−1 min−1 sehr ähnliche Werte. Die Michaelis−Konstanten für die Sulfo− nukleotide APS und PAPS wurden durch Messungen der Enzymgeschwindigkeit in Abhängigkeit von den Konzentrationen der Sulfonukleotide bestimmt (Abb. 24). Bei die− sen Messungen wurde das Trx1 in der sätti− genden Konzentration von 200 µmol l

−1

ver−

wendet. Die mathematische Auswertung der

Abbildung 24: Aktivität des CysH1−Proteins aus Bacillus subtilis in Abhängigkeit von der Sulfo− nukleotid−Konzentration A: Auftragung der Ergebnisse nach Michaelis und Menten. B: Doppelt reziproke Darstellung der Ergebnisse aus (A). Die Messungen erfolgten gemäß 2.7.2.2. mit 6 − 7.5 µg ml−1 Protein und der sättigenden Trx−Konzentration von 200 µmol l−1.

Ergebnisse

58

Ergebnisse durch lineare und nicht lineare Regression brachte eine leichte Präferenz des Enzyms für PAPS als Substrat zu Tage. Die Michaelis−Konstante für dieses Substrat liegt mit Km (PAPS) = 6.4 µmol l−1 ungefähr 4.5mal niedriger, als die für das Substrat APS (28.7 µmol l−1). Die hierbei er− rechneten Größen für die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (280 µmol mg−1 min−1 mit APS und 322 µmol mg−1 min−1 mit PAPS als Substrat) entsprechen sich im Rahmen der Messgenauigkeit. Innerhalb der Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen ist das Protein CysH1 aus B. subtilis das erste untersuchte, welches APS und PAPS für die Reduktion des aktivierten Sulfates verwenden kann. Es besitzt eine leichte Präferenz für PAPS als Substrat, was sich in der 5fach größeren Effi− zienz von 2.69 104 gegenüber 0.52 104 l mol−1 s−1 niederschlägt. Mit diesen Eigenschaften nimmt 



dieses Protein eine Zwischenstellung zwischen den pflanzlichen APS− und bakteriellen PAPS− Reduktasen ein. Im Verlauf dieser Arbeit wurden Ergebnisse über Untersuchungen weitere Mit− glieder der bakteriellen Sulfonukleotid−Reduktasen mit den zusätzlichen Cysteinen veröffentlicht. Die Enzyme aus der Familie der Rhizobiaceae und aus Pseudomonas aeruginosa reduzierten spe− zifisch APS, benötigten dafür aber auch Thioredoxin als Reduktionsmittel (Abola et al., 1999; Bick et al., 2000). Tabelle 3.3: Übersicht über die ermittelten kinetischen Konstanten der Sulfonukleotid−Reduktase CysH1 aus Bacillus subtilis Die Messungen erfolgten wie unter (2.7.2.2) beschrieben.

Substrat

Km

Vmax

Kcat

Effizienz

µmol l−1

nmol mg−1 min−1

s−1

l mol−1 s−1

APS

28.7

280

0.149

0.52 104

PAPS

6.4

322

0.172

2.69 104





Trx

(mit APS)

54.3

327

0.174

0.32 104

Trx

(mit PAPS)

67.5

411

0.219

0.32 104





3.4 Die APS−Reduktase aus Catharanthus roseus Nach den Sulfonukleotid−Reduktasen aus E. coli und B. subtilis wurde die APS−Reduktase aus Catharanthus roseus als Vertreterin der Gruppe der pflanzlichen APS−Reduktasen untersucht. Bislang wurden für diese Enzyme Untersuchungen zur Kinetik, zur Funktion der einzelnen Do− mänen, zur subzellulären Lokalisation und zur Expression ihrer Gene in Pflanzen durchgeführt. Sie katalysieren die APS−Reduktion mit Glutathion als Reduktionsmittel: APS + 2 GSH

SO32− + AMP + GSSG

Ergebnisse

59

Geringe Bedeutung in bisherigen Untersuchungen fand die strukturelle Verwandschaft dieser Enzyme mit den übrigen Sulfonukleotid−Reduktasen. Daher bildete der Vergleich der biochemi− schen und strukturellen Eigenschaften dieses Enzyms mit den beschriebenen Charakteristika der bakteriellen Enzyme den Ausgangspunkt der hier durchgeführten Untersuchungen. 3.4.1 Anpassung der Expression der APS−Reduktase in E. coli Zur Steigerung der Ausbeute der Expression und Reinigung wurde das veröffentlichte Verfahren (Prior et al., 1999) modifiziert. Die Anzucht der E. coli Wirtszellen im 3 l Fermenter (vgl. 2.5.2) sollte so verlaufen, dass das Protein wesentlich langsamer exprimiert wird, ohne dass dabei die Gefahr bestand, dass in einzelnen Zellen zu viel Protein akkumulierte. Diese geforderten Bedin− gungen ließen sich unter Beibehaltung des etablierten Expressionssystems aus dem E. coli Stamm BL21(DE3) und dem pET16b Derivat pET16bpar∆1 (Prior et al., 1999) als Expressionsplasmid verwirklichen. Die Repression des chromosomalen T7 RNA−Polymerase−Gens, die für die Tran− skription des Zielgenes in diesem System verantwortlich ist, ist nicht vollständig. Es verbleibt eine sehr geringe Hintergrundexpression6. Diese stellte sich als ausreichend heraus, die geforderte langsame Expression des Proteins zu ermöglichen. Die Anzucht der Zellen erfolgte bei 28°C unter aeroben Bedingungen nach 2%iger Inokulation für 16 h. Als Medium erwies sich das Vollmedium LB (vgl. 2.5.1), welches mit 0.67 % Glucose, 2 % Glycerol und 1 % SL4−Minerallösung (vgl. 2.5.1) supplementiert wurde, als optimal. Das mineralische VBB Medium (vgl. 2.5.1) mit Glucose als einziger Energiequelle war ebenfalls geeignet die Expression zu ermöglichen. Die Ausbeute nach Expression und nicht denaturierender Reinigung betrug bei Verwendung von supplementier− tem LB−Medium 10 mg und bei Verwendung von VBB−Medium 4 mg pro l Kulturvolumen. 3.4.2 Eigenschaften der rekombinanten APS−Reduktase Das im Rahmen dieser Arbeit gereinigte Protein war nicht wie zuvor beschrieben farblos (Prior et al., 1999; Prior, 2000), sondern genau wie die Sulfonukleotid−Reduktase aus B. subtilis gelb. Diese Farbe beruhte auch bei diesem Protein nicht auf einer Kontamination des Eluates mit anderen Pro− teinen oder niedermolekularen Substanzen, wie durch SDS−PAGE, Gelfiltrationschromatografie und Ultrafiltration nachgewiesen wurde. Genau wie das zuvor beschriebene bakterielle Protein enthielt es also einen stabil im Protein gebundenen Chromophor. Daher wurden auch hier zuerst Absorptionsspektren des neu synthetisierten Proteins aufgenommen (Abb. 25). Die Absorption des Chromophors im Bereich des sichtbaren Lichtes nahm auch bei diesem Protein nach Behandlung mit Reduktionsmitteln zu. Das oxidierte Protein besaß neben der für Proteine typischen Absorption der aromatischen Aminosäuren um 280 nm eine zusätzliche Absorptionsbande bei 344 nm. Diese 6 Laut Auskunft des Vertreibers Novagen, Madison, USA

Ergebnisse

60

Abbildung 25: Absorptionsspektren der rekombinanten APS−Reduktase Links: Absorptionsspektren des Proteins (0.75 mg ml−1) nach Reinigung und nach Behandlung mit dem Reduktions− mittel DTT. Rechts: Differenz der Spektren (reduziertes Protein minus Protein wie gereinigt). Zusätzlich ist ein Teil der vierten Ableitung dargestellt, mit deren Hilfe die Maxima der überlagerten Absorptionsbanden bestimmt wurden.

Bande wurde intensiver nach Reduktion des Proteins, wobei sich das Maximum in Richtung klei− nerer Wellenlängen auf 341.5 nm verschob. Die reduzierte Form und in geringerem Maße auch die unbehandelte Probe zeigten zudem vom UV−Bereich bis hin zu ca. 800 nm eine schwache Ab− sorption des Lichtes. Die Differenz der beiden Spektren (Abb. 25, rechts) offenbarte zusätzliche Eigenschaften der reduzierten Spezies des Proteins. Unter Verwendung der Derivativ−Spektro− skopie (s.o.) konnten in der Differenz zusätzlich Maxima bei 320 und 425 nm, sowie ein schwaches Maximum bei 505 nm detektiert werden. Auch diese Spektren zeigten, wie die des Proteins aus B. subtilis, Ähnlichkeiten mit den Absorptionsspektren von Proteinen, die nicht hämgebundene Me− talle enthalten. Die Aktivität des neu synthetisierten Proteins lag etwas höher als die des von Prior (2000) beschriebenen. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit des Proteins bei Verwendung von DTT als Reduktionsmittel wurde mit Vmax = 5.1 µmol mg−1 min−1 (Kcat pro aktivem Zentrum = 4.08 s−1) bestimmt gegenüber vormals 3.8 µmol mg−1 min−1 (Kcat = 3.04 s−1, Prior et al., 1999). Der hierbei ermittelte Km−Wert für APS liegt mit 2.1 µmol l−1 nur geringfügig unter dem zuvor be− stimmten von 2.5 µmol l−1. Dies entsprach einer Zunahme der Effizienz in Bezug auf APS von 1.22 106 auf 1.94 106 l mol−1 s−1. 



3.4.3 Homologie−basierte Modellierung der Struktur der APS−Reduktase aus Catharanthus roseus Die pflanzlichen APS−Reduktasen weisen in ihrer Primärstruktur eine Dreiteilung auf. Nach einer Importsequenz für Plastiden enthalten sie einen PAPS−Reduktase−homologen Bereich, dem eine

Ergebnisse

61

Domäne folgt, die Homologien zu Proteinen der Thioredoxinfamilie aufweist und die als Elektro− nendonor der Reduktase−Domäne dient (Bick et al., 1998; Wray et al., 1998; Prior et al., 1999). Um die strukturellen Ähnlichkeiten und mögliche Differenzen der Reduktase−Domäne mit der Struktur der PAPS−Reduktase zu untersuchen, wurde eine Struktur der Core−Domäne der APS− Reduktase aus Catharanthus roseus auf Basis ihrer Ähnlichkeit zur PAPS−Reduktase aus E. coli modelliert, deren Struktur durch Kristallisation und Röntgenbeugungsexperimente aufgeklärt wurde (Savage et al., 1997). Zur Modellierung wurde ein Verfahren verwendet, welches bei Beachtung der Beschränkungen durch geometrische und energetische Gegebenheiten auch den Einsatz einer Fragment−Datenbank einschloss. Die PAPS−Reduktase gehört zu einer Strukturfamilie, deren Mitgliedern eine Adeninnukleotid− α−Hydrolase−Aktivität gemein ist (Savage et al., 1997). Die Proteine dieser Familie beinhalten in

ihrer Primärsequenz das sogenannte Pyrophosphatase−Motiv (Bork und Koonin, 1994). Dieses wird aus einer Abfolge β−Faltblatt, α−Helix, β−Faltblatt und α−Helix (α−β−α−β) gebildet. Die an der Nukleotidbindung beteiligten Aminosäuren befinden sich an den Übergängen der Faltblätter zu den Helizes. Anhang 1 zeigt einen Primärstrukturvergleich von identifizierten und möglichen Mitgliedern dieser Proteinfamilie im Bereich des Pyrophosphatase−Motivs sowie einige strukturelle Eigenschaften der Mitglieder, deren Struktur aufgeklärt wurde. Das Pyrophosphatase−Motiv zeichnet sich durch große Variabilität in den Primärstrukturen bei einem hohen Konservierungsgrad in der Tertiärstruktur aus. Die Konsensussequenz des Motivs lautet SGGxDS(x)18−31DxG. Von diesen Aminosäuren sind nur das erste Serin und das letzte Glycin durchgehend konserviert. Die Tertiärstruktur des Motivs in den bekannten Strukturen der PAPS−Reduktase (Savage et al., 1997, PDB: 1sur), der Pyrophosphatase−Domäne der GMP−Synthetase (Tesmer et al., 1996, 1gpm) und der NAD−Synthetase (Rizzi et al., 1996, 1nsy) wird durch charakteristische Wasserstoffbrücken zwischen Faltblatt 2 und Faltblatt 1 bzw. Loop 1 bestimmt. Die Bindung des Produktes AMP in der GMP−Synthetase und der NAD−Synthetase ist sehr ähnlich (vgl. Anhang 1). Die PAPS−Reduktase nimmt im ersten Bereich dieses Motivs eine Sonderstellung ein. Das hier vorhandene S53FGIQA weicht sehr stark von der Konsensussequenz (SGGxDS) ab. Dies dürfte durch die ungewöhnliche Struktur des PAPS (vgl. 3.2.1.2) und die Tatsache bedingt sein, dass dieses Enzym keine Hydrolase sondern eine Reduktase ist. Demgegenüber ist die Primärstruktur der APS−Reduktase aus Catha− ranthus roseus dem Konsensus−Motiv näher (S120GAEDV). Dies ist verständlich, da das APS mutmaßlich eine dem ATP/AMP vergleichbare Struktur besitzt. Dementsprechend fand die größere Nähe der APS−Reduktase zu den ATP/AMP−bindenden Proteinen in der Modellierung der Struktur Bedeutung. Neben dem für die Substratbindung verantwortlichen Bereich sind bei geringer Se− quenzidentität (24 % Identität und 44 % Ähnlichkeit im modellierten Bereich) alle Struktur be− stimmenden Aminosäuren und Motive der PAPS−Reduktase bei der APS−Reduktase konserviert

Ergebnisse

62

(Details in: Prior et al., 1999). Auch die durchgeführten Sekundärstrukturvorhersagen stimmten zu 79.2 % mit der abgeleiteten Sekundärstruktur der PAPS−Reduktase überein (vgl. Anhang 2). Diese Tatsachen, gerade auch vor dem Hintergrund der geringen Identität zwischen den übrigen Mit− gliedern der Strukturfamilie der Adeninnukleotid−α−Hydrolasen, machte eine große strukturelle Übereinstimmung der PAPS−Reduktase mit dem homologen Bereich der pflanzlichen APS−Re− duktase sehr wahrscheinlich. Dies wurde durch die Modellierung bestätigt. Auf Basis des in An− hang 2 dargestellten Primärstrukturvergleichs wurde die Struktur mit dem Programm WhatIf mo− delliert (vgl. 2.10.3). Lücken und offensichtliche Fehler in Loop−Regionen wurden mit Hilfe der Fragmentdatenbank (dgloop) des Programms korrigiert. Der Bereich des Pyrophosphatase−Motivs wurde auf Basis der Struktur der GMP−Synthetase überprüft und korrigiert. Abschließend wurde das Modell 50 Schritten einer Energieminimierung mit der Gromos96−Schnittstelle von WhatIf unterzogen. Eine Bewertung des finalen Modells mit Hilfe der „Newqua“ Funktion von WhatCheck (Hooft et al., 1996) ergab einen Gesamt−„Z−Wert“ von −1.62. Dieser Wert steht für ein „gutes Modell“ (Vriend, 1990; Hooft et al., 1996). Im Ramachandran−Diagramm (Ramachandran et al., 1963) lagen 84.4 % der Aminosäurereste in den am meisten bevorzugten Bereichen, 14.3 % lagen in den zusätzlich erlaubten, 1.3 % in den generös erlaubten Regionen und keine in den verbotenen Regionen (ohne Abb.). Diese Werte lagen in einem für korrekte Proteinstrukturen typischen Be− reich. Zusammenfassend kann das erstellte Modell als gut im Sinne von benutzbar zur Untersu− chung der Funktion einzelner Aminosäurereste bezeichnet werden. Zusätzlich kann die Qualität des Modells als Indiz für die Richtigkeit der Ausgangsannahme, dass die Strukturen der Proteine ähn− lich sind, gewertet werden. Das Strukturmodell (Abb. 26) weist eine mittlere Abweichung (root mean square de− viation, rmsd) der Rückgrat Atome gegenüber der PAPS−Reduktase von 0.51 Å auf. Im Be− reich des Pyrophosphatase−Motivs sind dies 0.54 Å. Alle als funktionell oder strukturell bedeutend identifizierten oder postulierten Aminosäuren wie z.B. das bei der E. coli PAPS−Reduktase bedeutende Arginin R164 (hier: R214) befinden sich an äquivalenten Stellen in den Strukturen. Die APS−Redukta− sen aus Pflanzen und Bakterien zeichnen sich in ihren PAPS−Reduktase homologen Berei− chen durch 4 zusätzliche Cysteine aus. Bei der

Abbildung 26: Strukturmodell der APS−Reduk− tase von S99 − C292 Einzelheiten zur Erstellung befinden sich im Text. (1) und (2) markieren das Pyrophosphatase−Motiv. (3) Lysin K202 entsprechend dem K136 der PAPS−Reduktase. (4) Der „flexible Loop“. Zusätzlich sind die 4 Cysteine des CC− und CxxC−Clusters dargestellt.

Ergebnisse

63

APS−Reduktase aus Catharanthus roseus sind dies die Seitenketten C197C und C289EPC. Diese lie− gen im Modell auffällig nahe beieinander (Abb. 26). Ihre Orientierung zueinander, ihre Abstände und die Berücksichtigung des Modellcharakters der Struktur lassen sowohl verschiedene Disulfid− brücken mit regulatorischer oder struktureller Bedeutung als auch die Komplexierung eines kleinen Kofaktors, zum Beispiel eines Metalls, zu.

3.5 Enthalten die Sulfonukleotid−Reduktasen Metalle? Die Absorptions−Spektroskopie belegte das Vorkommen einer chromophoren Gruppe in den Pro− teinen aus C. roseus und B. subtilis. Die gemessenen Intensitäten und Lagen der Absorptionsbanden sprachen für das Vorkommen von Übergangsmetallen, konnten aber keinem in der Literatur ver− öffentlichten Typ direkt zugeordnet werden. Eine Säure−Fällung des gelben C. roseus Par2−Pro− teins mit anschließender kolorimetrischer Bestimmung nach Fish (1988) ergab die ersten Hinweise auf das Vorkommen von Eisen in einem molaren Verhältnis von 0.82 pro aktivem Zentrum. Der letzte Teil dieser Arbeit behandelt die Detektion, eine erste Charakterisierung und die Quantifizie− rung von Übergangsmetallen in den Sulfonukleotid−Reduktasen aus C. roseus, B. subtilis und E. coli. 3.5.1 Elektronen−paramagnetische−Resonanz−Spektroskopie Die EPR−Spektroskopie ermöglicht den Nachweis von freien bzw. ungepaarten Elektronen. Eisen, das in den gelben Sulfonukleotid−Reduktasen vermutet wurde, ist in der Oxidationsstufe +III pa− ramagnetisch. Es kann also durch diese Methode nachgewiesen werden. Zuerst wurden 77 K EPR− Spektren des gelben Proteins aus C. roseus (250 µmol l−1 Protein, X−Band, 0 − 400 mT) aufge− nommen7. Diese Messungen ergaben keine Hinweise auf paramagnetische Zentren in dem Protein. Signale eines paramagnetischen metallischen Zentrums können auf Grund ihrer kurzen Relaxati− onszeiten bei der relativ hohen Temperatur des flüssigen Stickstoffs leicht übersättigen und damit übersehen werden. Aus diesem Grund wurden weitere Messungen bei Kühlung der Probe mit flüssigem Helium, welches ein Absenken der Temperatur bis ca. 3 K möglich macht, durchgeführt8. Die Analyse des C. roseus−Proteins von 40 − 440 mT mit einer Anregungsfrequenz von 9.46 GHz und einer Anregungsenergie von 0.1 − 2 mW bei 10 K lieferte die ersten Belege überhaupt für pa− ramagnetische metallische Zentren in einer Sulfonukleotid−Reduktase. Die aufgezeichneten Spek− tren belegten nicht nur das Vorhandensein von Fe+III im Protein, sondern lieferten auch Resonanz− signale, die für Cu+II charakteristisch sind. Dieses Ergebnis lieferte den Anlass auch die anderen

7 Diese Messungen wurden freundlicherweise mit der Unterstützung von PD Dr. Heinz−Jürgen Feldhoff am Lehrstuhl für Biophysik der Ruhr−Universität durchgeführt. 8 Diese Messungen wurden in Kooperation mit Dr. Eckhard Bill am Max−Planck Institut für Strahlenchemie in Mühlheim an der Ruhr durchgeführt.

Ergebnisse

64

beiden in dieser Arbeit untersuchten Sulfonukleotid−Reduktasen mit Hilfe der EPR−Spektroskopie auf das Vorhandensein von Metallen zu untersuchen. Dabei ergab sich das folgende Bild (vgl. Abb. 27): Das Protein aus C. roseus enthält neben den erwähnten paramagnetischen metallischen Zentren ein freies Radikal organischen Ursprungs. Dies ist in Abb. 27 innerhalb der Kupferresonanzen (~ 340 mT) aufgelöst. Wie die APS−Reduktase enthielt auch die Sulfonukleotid−Reduktase aus B. subtilis EPR−Signale die Fe+III und Cu+II cha− rakterisieren. Für beide Proteine konnte dies mit verschiedenen Präparationen reproduziert werden. Die farblose PAPS−Reduktase aus E. coli enthielt ebenfalls ein spezifisches Cu+II−Signal, allerdings von deutlich geringerer Intensität. Die in diesem Protein zunächst gemessenen Eisen−Signale ließen sich mit weiteren Proben im Gegensatz zu denen des Kupfers nicht reproduzieren. Sie stellten sich im Nachhinein als Kontamination des zur Pufferherstellung verwendeten destillierten Wassers he− raus. Die für das Kupfersignal im Bereich von 260 − 350 mT bestimmten Parameter der EPR− Spektren der APS−Reduktase Par2 aus C. roseus (vgl. Tab. 3.4) sind mit g = 2.053 und g = 2.26 





bei einer relativ großen Kopplungskonstante von A = 17.1 mT charakteristisch für ein Kupfer− 



zentrum, in dem das Metall quadratisch planar oder tetragonal komplexiert wird (Cowan, 1993). Dies gilt auch für die Kupfersignale der E. coli PAPS−Reduktase (g = 2.061, g = 2.276 und A = 









16.3 mT) und des B. subtilis−CysH1−Proteins (g = 2.055, g = 2.247 und A = 17.1 mT). Das 









Kupfersignal in letzterem war von allen gemessenen das mit der höchsten Intensität. Während alle anderen Signale bezogen auf einen ebenfalls gemessenen Cu+II−Standard (ohne Abb.) substöchio− metrisch vorlagen, so entsprach dieses Signal einer Spinkonzentration von ~ 160 µmol l−1. Bei einer Proteinmonomer−Konzentration von ~ 350 µmol l−1 betrug das Verhältnis 0.46 zu 1. In den gelben Sulfonukleotid−Reduktasen wurden im Bereich von 50 − 200 mT Signale nachgewiesen, die cha− rakteristisch Fe+III zugeordnet werden konnten. Für die APS−Reduktase aus C. roseus konnten mit g = 4.282 und g = 8.89 sowie einer kleinen Schulter bei g = 6.459 Resonanzen aufgelöst werden, die ein High−Spin−Fe+III mit einem definierten Bindungsplatz im Protein anzeigen. Für das Protein aus B. subtilis wurde eine Resonanz bei g = 4.267 aufgelöst. High−Spin−Fe+III−Signale mit ver− gleichbaren g−Werten wurden z.B. für die mononuklearen Schwefel−Eisen−Zentren [Fe(Cys)4] der Rubredoxine veröffentlicht. In keiner der Messungen konnten Hinweise auf eine Kopplung oder ein Zusammenwirken des Eisen− und Kupferions in den gelben Sulfonukleotid−Reduktasen gefunden werden. Während die den hier vorgestellten Messungen zugrundeliegenden E. coli und C. roseus Pro− teine in ihrer enzymatischen Aktivität nicht eingeschränkt waren, konnte auf Grund der langwieri− gen Präparation zur Konzentration der Enzyme und der geringen Stabilität des B. subtilis−Proteins

Ergebnisse

65

Abbildung 27: EPR−X−Band−Spektren (1. Ableitung) der Sulfonukleotid−Reduktasen aus C. roseus, E. coli und B. subtilis in verschiedenen Zustandsformen A: APS−Reduktase Par2 aus C. roseus (250 µmol Monomer l−1). Der Einschub zeigt einen Ausschnitt des Spektrums bei 3 K, bei dem das Resonanz−Signal besser aufgelöst wird. B: PAPS−Reduktase CysH aus E. coli (600 µmol Monomer l−1). C: Sulfonukleotid−Reduktase CysH1 aus B. subtilis (350 µmol Monomer l−1). Mikrowellenfrequenz: 9.46 GHz, Energie: 0.1 mW, T = 10 K, Modulation: 3.13 mT, die Verstärkung wurde den jeweiligen Bedingungen angepasst. Die Pfeile markieren die im Text erwähnten g−Werte.

dies nur als enzymatisch inaktives Protein untersucht werden. Die für die Eisen− und Kupfersignale ermittelten Parameter der EPR−Spektren sind in Tab. 3.4 zusammengefasst. Zur Untersuchung der Spezifität der Signale wurde überprüft, ob und wie sie sich nach Inku− bation der Enzyme mit ihren Substraten verändern. Die Reduktion der Proteine durch DTT bzw. DTT und Trx führte in allen Sulfonukleotid−Reduktasen zu einer Löschung des Kupfer−EPR−

Ergebnisse

66

Tabelle 3.4: Übersicht der bestimmten Parameter der EPR−Spektren aus Abb. 27 (n.d.: nicht detektierbar)

Protein

Cu g 

g 



A 



Fe

Weitere Signale

g −Werte

g

mT

C. roseus Par2

2.0526

2.2597

17.1

4.2820 (6.4594) 8.8901

2.0048

E.coli CysH

2.0611

2.2763

16.3

n.d.

n.d.

B. subtilis CysH1

2.0549

2.2467

18.5

4.2669

n.d.

Signals. Dies dürfte durch Reduktion des Cu+II zum Cu+I ausgelöst werden. Auch das EPR−Signal des organischen Radikals in der C. roseus APS−Reduktase verschwand zum größten Teil bei dieser Reduktion (Abb. 27, A). Nach Inkubation der Enzyme aus C. roseus und E. coli mit ihren Substra− ten APS und PAPS wurden die Signale des Cu+II und im Falle der pflanzlichen Reduktase z.T. auch das des organischen Radikals regeneriert (Abb. 27, A und B). Im Gegensatz zu dem Eisensignal des inaktiven B. subtilis Enzyms traf diese Beobachtung auch für das High−Spin−Fe+III−Signal des C. roseus−Proteins zu. Das in der APS−Reduktase aus C. roseus gemessene Radikal nicht metallischen Ur− sprungs (g = 2.005) wurde zur weiteren Cha− rakterisierung bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Die Signale freier Radikale sind für gewöhnlich bei niedrigen Temperaturen nur wenig ausgeprägt und werden mit höherer Temperatur immer deutlicher. Das hier ge− messene Signal wies deutlich andere Eigen− schaften auf (Abb. 28). Seine deutlichste Ausprägung hatte es bei 10 K. Mit anstei− gender Temperatur wurde das Signal immer kleiner und bereits bei einer Temperatur von 40 K war es fast vollständig verschwunden. Dies ist ein deutliches Zeichen dafür, dass dieses Radikal nicht „frei“ ist, sondern seine ungewöhnlich kurze Relaxationszeit von ei−

Abbildung 28: Temperaturabhängigkeit des nicht metallischen Radikal−Signals EPR−Spektren (1. Ableitung) des Par2−Proteins aus C. roseus (230 µmol l−1) (Mikrowellenfrequenz: 9.46 GHz, Energie: 0.1 mW, Temperatur wie angegeben, Modu− lation: 3.13 mT).

nem der Metallionen vorgegeben bekommt, welches mit diesem eine schwache Spinkopplung ein− geht.

Ergebnisse

67

Die gemessenen Signale belegen erstmals das Vorhandensein von Eisen− und Kupferionen und in einem Fall eines Radikals organischen Ursprungs in Sulfonukleotid−Reduktasen. Durch die In− duzierbarkeit der Signale in den Proteinen aus E. coli und C. roseus durch ihre Substrate wurden darüber hinaus erste Indizien für eine Funktion dieser Metalle in den Proteinen gewonnen. Die Funktion der Sulfonukleotid−Reduktasen galt bis zu diesen Messungen als unabhängig von Ko− faktoren. Im Folgenden sollte daher zur Kontrolle untersucht werden, ob die EPR−Signale nicht durch Kontaminationen, durch unspezifisch gebundene Metalle oder die Präparation der Proteine mittels Metallchelat−Affinitätschromatografie entstanden sind. 3.5.2 Abhängigkeit der EPR−Signale vom Vorhandensein des Oligohistidin−Anteils Die untersuchten Proteine enthielten alle ein N−terminales Fusionspeptid mit 10 Histidinresten, welches die Reinigung der Proteine mittels Metallchelat−Affinitätschromatografie an einer co− balthaltigen Talon−Matrix (Clontech) ermöglichte. Solche Oligohistidine können selbstverständlich nicht nur immobilisierte, sondern auch freie Metalle komplexieren. Am Beispiel der APS−Reduktase aus C. roseus wurde überprüft, ob die gemessenen EPR− Signale durch Abspaltung des 10−Histidin−Anteils verändert werden. Zwischen den Proteinen und dem Histidin−Peptid existiert eine Erkennungssequenz für die Faktor Xa−Protease. Für die Pro− teolyse wurde das Xa−Spaltungs−Kit der Firma Roche verwendet, bei dem der zugesetzte Biotin markierte Faktor Xa leicht wieder durch immobilisiertes Streptavidin entfernt werden kann. Bei der Inkubation der APS−Reduktase mit der Protease über Nacht bei 4 °C fiel ein großer Teil des ein− gesetzten Proteins aus. Nach Entfernung der Protease und des ausgefallenen Proteins durch Zen− trifugation wurde das verbliebene Protein erneut auf die Metallchelat−Affinitätsmatrix aufgetragen. Der Durchlauf wurde nach Konzentration als Protein−Fraktion ohne His−Tag untersucht. Von der Affinitätsmatrix konnte nach Elution mit 200 mM Imidazol auch Protein aufgefangen werden, bei dem das Histidinpeptid nicht abgespalten worden war. Dies wurde ebenfalls konzentriert und als Kontrolle in der SDS−PAGE, die den Erfolg der proteolytischen Entfernung des Histidin−Oligo− peptids dokumentiert (Abb. 29 B), und in der EPR−Spektroskopie verwendet. Trotz der nur ge− ringen zur Verfügung stehenden Proteinmengen konnten, wie in Abb. 29 dargestellt, in beiden Fraktionen Signale gemessen werden, die dem nicht behandelten Protein entsprachen. Das High− Spin−Fe+III−Signal, das einem Cu+II zugeordnete Signal und das nicht metallische Radikal bei g = 2.005 waren eindeutig vorhanden. Die Fraktionen unterschieden sich nur geringfügig voneinander. Der größte Unterschied war im Eisen−Signal vorhanden, welches in der Fraktion ohne His−Tag besser aufgelöst wurde (Abb. 29 A). Alle hier überprüften Puffer und Lösungen enthielten keine signifikanten Kontaminationen mit metallischen oder organischen Radikalen.

Ergebnisse

68

Abbildung 29: Eigenschaften der APS−Reduktase mit und ohne N−terminalem 10−His−Tag A: EPR−Spektren der Proteine (~ 80 µmol l −1, Mikrowellenfrequenz: 9.46 GHz, Energie: 0.1 mW, T = 10 K, Modulation: 3.13 mT). Das Signal bei ~ 270 mT wurde durch eine Verunreinigung der Hohlkammer verursacht. B: SDS−PAGE, 12.5 %, Coomassie Brillant Blue gefärbt. 1: Durchlauf der Metallchelat−Affinitätschromatografie nach proteolytischer Abspaltung der Histidin−Fusion (5µg). 2: 200 mM Imidazol Eluat dieser Chromatografie (5µg).

Diese Ergebnisse zeigen, dass die gemessenen EPR−Signale nicht von den zur Affinitätsreini− gung eingebrachten Oligohistidinfusionen ausgehen. Sie sind spezifisch mit den Sulfonukleotid− Reduktasen verbunden. 3.5.3 Anpassung der Medien für die rekombinante Expression In allen Sulfonukleotid−Reduktasen wurden charakteristische EPR−Signale für Übergangsmetalle detektiert. Die Expression der Proteine aus C. roseus und B. subtilis in E. coli erfolgte in minerali− schen oder supplementierten Voll−Medien, die Eisen in ausreichender Menge, Kupfer aber limi− tierend enthielten. Die Expression der E. coli PAPS−Reduktase erfolgte ausschließlich in Vollme− dien, deren Mineralgehalt unbekannt war. Die Sulfonukleotid−Reduktasen aus C. roseus und E. coli wurden daher in dem mineralischen VBB−Medium (vgl. 2.5.1), dem 6 µmol l−1 CuCl2 zuge− setzt wurde, im Fermenter für 16 h ohne Induktion in E. coli BL21(DE3) exprimiert (vgl. 3.4.1) und durch Metallchelat−Affinitätschromatografie gemäß 2.7.1.4 gereinigt. Das so hergestellte Par2−Protein aus C. roseus wies keine signifikanten Unterschiede bezüglich seiner spektroskopischen oder enzymatischen Eigenschaften gegenüber dem bisher untersuchten auf (Übersicht in Tab. 3.5). Die Aktivität der PAPS−Reduktase aus E. coli hingegen stieg deutlich an. Die maximale apparente Reaktionsgeschwindigkeit stieg von Vmaxapp = 7.4 µmol mg−1 min−1 (Kcat = 3.8 s−1) auf Vmaxapp = 25.9 µmol mg−1 min−1 (Kcat = 13.3 s−1). Das EPR−Spektrum dieses Proteins wies im Bereich der Kupfer−Signale keine großen Veränderungen gegenüber dem in Kap. 3.5.1

Ergebnisse

69

vorgestellten auf, ein spezifisches Eisen−

Tabelle 3.5: Aktivität der Enzyme nach Expression der Wirtszellen in supplementierten Medien

Signal war in diesen Proben nicht vorhan− den (ohne Abb.).

Protein

Die langsame Expression (16 h ohne In− duktion, hohe Zelldichte) der PAPS−Reduk−

Medium

Vmax

Kcat§

vgl. 2.5.1

µmol mg−1 min−1

s−1

tase in E. coli BL21(DE3) in einem Mine−

C. roseus Par2

VBB

5.1

4.1

ralmedium, welches mit 6 µmol l−1 CuCl2

C. roseus Par2

VBB¶

5.3

4.2

E. coli CysH

LB

7.4

3.8

25.9

13.3

supplementiert war, erbrachte nach Reinigung ein Protein mit 3.5fach höherer Aktivität als bei schneller Expression (2.5 h mit Induktion,

E. coli CysH § ¶

¶

VBB

bezogen auf den Protein−Monomer supplementiert mit 6 µmol l−1 CuCl2

niedrige Zelldichte) in einem Vollmedium. Um festzustellen, ob dies durch einen unterschiedlichen Metallgehalt der Proteine bedingt wird oder z.B. durch einen höheren Anteil an „korrekt“ gefaltetem Protein, musste der Metallgehalt in den Proteinen bestimmt werden. 3.5.4 Atomabsorptions−Spektroskopie Zur Bestimmung der Menge der Metalle in den Sulfonukleotid−Reduktasen aus E. coli, C. roseus und B. subtilis unterschiedlicher Anzuchtbedingungen wurden diese mit Hilfe der Atomabsorpti− ons−Spektroskopie9 untersucht. Die gemessenen Anteile sind in Tabelle 3.6 zusammengefasst. Während die PAPS−Reduktase aus E. coli kein Eisen enthielt, befanden sich in der APS−Reduktase aus C. roseus 0.8 − 1 Mol und in dem Enzym aus B. subtilis 0.23 Mol Eisen pro Mol aktiven Zentrums. Alle untersuchten Proteine enthielten zudem signifikant Kupfer. Die PAPS−Reduktase, deren Aktivität nach Expression des Proteins im Wirtsstamm in VBB−Medien mit 6 µmol l−1 CuCl2 um das 3.5fache anstieg, enthielt mit 0.058 Molen Kupfer pro Mol Proteinmonomer ~ 4.8mal mehr Kupfer als das mit Hilfe eines Vollmediums hergestellte. Dieser Anteil ließ sich bei Verwendung von Mineralmedium mit 5 mmol l−1 CuCl2 auf 0.38:1 steigern. Ein Mol APS−Reduktase aus C. roseus enthielt ~ 0.1 (0.08 − 0.11) Mol Kupfer. Den höchsten Kupfer−Anteil besaß die Sulfonukleotid−Reduktase aus B. sub− tilis. Diese enthielt 0.47 Mol Kupfer pro Mol Proteinmonomer. Dieser Wert war fast identisch mit dem Anteil von 0.46:1 (vgl. 3.5.1), der aus der Spin−Konzentration des Kupfer EPR−Signals be− rechnet wurde. Die Ergebnisse bestätigen, dass alle Sulfonukleotid−Reduktasen Kupferionen im Protein kom− plexieren. Die gemessene Aktivitätssteigerung des Proteins aus E. coli geht einher mit einer Zu− nahme des Kupferanteils. Die gegenüber dem farblosen E. coli Protein gelben Proteine aus B. 9 Diese Messungen wurden freundlicherweise mit der Unterstützung von Dr. Jürgen Wittsiepe in der Abteilung für Hygiene, Sozial− und Umweltmedizin der Ruhr−Universität durchgeführt.

Ergebnisse

70

Tabelle 3.6: Übersicht über die mit Hilfe der Atomabsorptions−Spektroskopie gemessenen Anteile an Eisen und Kupfer in den Sulfonukleotid−Reduktasen Protein

Medium

Anteil Fe pro Monomer Anteil Cu pro Monomer

(vgl. 2.5.1)

%

%

E. coli CysH

LB

0

1.2

E. coli CysH

VBB + 6 µM CuII

0

5.8

E. coli CysH

VBB + 5 mM CuII

0

37.9

C. roseus Par2

VBB

80

10.9

II

C. roseus Par2

VBB + 6 µM Cu

105.3

8.2

B. subtilis CysH1

VBB

23.4

46.9

subtilis und C. roseus enthalten darüber hinaus ionisches Eisen, im Falle des Proteins pflanzlichen Ursprungs in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1, was die oben geäußerte Vermutung eines mononuklearen Eisenzentrums bestätigt. 3.5.5 Untersuchung des ECGLH−Motivs mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese Um Aussagen über die Funktion des Konsensus−Motivs ECGLH der Sulfonukleotid−Reduktasen vor dem Hintergrund der gemessenen EPR−Signale machen zu können, wurden ortsgerichtete Mutanten der Proteine aus E. coli und C. roseus untersucht. Zu diesem Zweck wurden die PAPS− Reduktase−Mutanten C239→G (EGGLH) und C239→H + H242→C (EHGLC) (Lillig, 1998) sowie die APS−Reduktase−Mutante C317→G (EGGLH) (Prior, 2000) in E. coli in mit Kupfer supplementier− tem Mineralmedium (vgl. 3.5.3, VBB + 6 µM CuCl2) exprimiert und durch Metallchelat−Affini− tätschromatografie gereinigt. Das mutagenisierte C317→G−Par2−Protein aus C. roseus erschien nach Konzentrierung im Vergleich zum Wildtypprotein nur schwach gelb. Das Absorptionsspektrum dieses Proteins zeigte auch keine deutlich Absorptionsbande bei 344 nm mehr, sondern nur noch eine diffuse Absorption von 300 − 800 nm (ohne Abb.). Wie bereits früher beschrieben, sind die nach Mutagenese herge− stellten Proteine, die alleine das Cystein betreffen, inaktiv (Berendt et al., 1995; Prior, 2000). Eine hier in einer von drei unabhängigen Präparationen gemessene geringe Aktivität der PAPS−Reduk− tase C239→G Mutante konnte mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf eine Kontamination mit Wild− typprotein zurückgeführt werden. Erstaunlicherweise erwies sich die PAPS−Reduktase−Mutante C239→H + H242→C, bei der das Cystein und Histidin des ECGLH−Clusters vertauscht wurden, re− produzierbar als aktiv (Abb. 30). Da das Protein aus E. coli mit dem C239 direkt mit Glutaredoxin interagieren kann (vgl. 3.2.1.4.2), wurde die Aktivität dieses Enzyms in Abhängigkeit von den Redoxin−Konzentrationen gemessen. Hierbei wurden für Trx1 mit Km = 15.3 µmol l−1 bei Vmax =

Ergebnisse

71

19.67 µmol mg−1 min−1 und für Grx1 mit Km = 18.9 µmol l−1 bei Vmax = 10.44 µmol mg−1 min−1 Konstanten ermittelt, die mit denen des unter identischen Bedingungen hergestellten Wild− typproteins vergleichbar sind (KmTrx = 13.2 µmol l−1, VmaxTrx = 25.9 µmol mg−1 min−1, KmGrx = 12.7 µmol l−1). Die mutagenisierten Proteine wurden mit Hilfe der EPR−Spektroskopie, wie in Abb. 31 dargestellt, auf mögliche Unterschiede zu den Wildtypproteinen

untersucht.

Die

aktive

PAPS−Reduktase Doppelmutante C239→H + H242→C offenbarte ein Spektrum, welches dem Wildtypprotein

entspricht.

Das

inaktive

C239→G PAPS−Reduktase Protein zeigte zwei zusätzliche Signale bei g = 1.78 und g = 1.68.

Abbildung 30: Abhängigkeit der Aktivität der PAPS−Reduktase−Doppelmutante C239→H und H242→C von der Redoxin−Konzentration Die Messungen erfolgten gemäß 2.7.2.2. mit 25 ng ml−1 Protein bei der sättigenden PAPS−Konzentration von 100 µmol l−1.

Diese Muster mussten auf Grund einer Spin− kopplung zustande gekommen sein. Welcher Spin hier mit dem Spin des Cu+II interagierte, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Spinkopplungsmuster sind aber im− mer auf spezifische Wechselwirkungen zweier Spins zurückzuführen. Möglicherweise exis− tiert in diesem Protein ein weiteres unter den gewählten Bedingungen nicht sichtbares Ra− dikal. Die APS−Reduktase−Mutante C317→G entspricht in ihren Cu+II−Signalen dem Wild− typprotein, das Signal des Radikals nicht me− tallischen Ursprungs besitzt aber eine deutlich geringere Intensität. Auch für die mutagenisierten Proteine wurden unter Verwendung der Atomabsorp− tions−Spektroskopie die Anteile an Eisen und Kupfer bestimmt (Tab. 3.7). Alle drei Proteine enthielten ungefähr 0.04 Mol Kupfer pro Mol

Abbildung 31: EPR−Spektren (1. Ableitung) der nach Mutagenese hergestellten Proteine A: E. coli PAPS−Reduktasen (160 µmol l−1), B: C. roseus APS−Reduktasen (230 µmol l−1). Mikrowellenfrequenz: 9.46 GHz, Energie: 0.1 mW, Temperatur 10 K, Modulation: 3.13 mT). Die Pfeile markieren die zusätzlichen Signale einer Spinkopplung.

Ergebnisse

72

Proteinmonomer. Wie das Wildtypprotein enthielten auch die durch ortsgerichtete Mutagenese veränderten E. coli−PAPS−Reduktasen kein Eisen. Für das C. roseus−Protein bestätigen sich die optischen Eindrücke und die Ergebnisse der Absorptions−Spektroskopie. Der vermutlich für die chromophoren Eigenschaften verantwortliche Eisenanteil lag mit 0.14:1 deutlich niedriger als im Wildtypprotein (~ 1:1). Tabelle 3.7: Übersicht über die Aktivität und die mit Hilfe der Atomabsorptions−Spektroskopie gemessenen Anteile an Eisen und Kupfer in den mutagenisierten Sulfonukleotid−Reduktasen Protein (Herkunft und Typ)

Anteil Fe pro Anteil Cu pro Monomer Monomer

Vmaxapp

(vgl. 2.5.1)

%

%

µmol mg−1 min−1

E. coli

C239→G

VBB + 6 µM CuII

0

4.1

0 / 0.6¶

E. coli

C239→H + H242→C

VBB + 6 µM CuII

0

3.6

19.7

13.7

3.4

0

C. roseus C317→G ¶

Medium

VBB + 6 µM Cu

II

Eine Kontamination mit Wildtypprotein kann bei dieser Präparation nicht ausgeschlossen werden.

Diese Ergebnisse sprechen gegen eine direkte Beteiligung des Cysteins im ECGLH−Cluster an der Bindung der Metalle, da auch die Proteine ohne diese Thiolgruppe, wenn z.T. auch in geringe− rem Anteil, paramagnetische Metalle enthalten. Möglicherweise ist der Rückgang des Eisenanteils im C. roseus−Protein auf die strukturellen Auswirkungen der Mutation zurückzuführen. Die in der E. coli PAPS−Reduktase gemessenen Spinkopplungsmuster in der C239→G Mutante lieferten ein weiteres Indiz für eine spezifische Funktion des Kupfers im Enzym. Die demgegenüber hohe Ak− tivität der C239→H + H242→C Doppelmutante kann ein erster Hinweis sein, dass auch das Histidin im ECG(L/I)H−Cluster der Sulfonukleotid−Reduktasen eine mit dem Imidazolrest verbundene spezi− fische Funktion inne haben könnte.

Diskussion

73

4 Diskussion Die Reduktion eines aktivierten Sulfates ist ein Prozess, der sich schon sehr früh in der Evolution entwickelt hat. Unter anaeroben Bedingungen in sulfidogenen Bakterien dient das Sulfat als ter− minaler Elektronenakzeptor, auf den Substratwasserstoff übertragen wird. Dieser der Energiege− winnung dienende Prozess der dissimilatorischen Sulfatreduktion liefert als Hauptprodukt Schwe− felwasserstoff. Der größte Teil der abbauwürdigen Schwefelvorkommen der Erde stammen aus dieser Reaktion. Bei dieser Reaktion dient im ersten Schritt ein durch Adenylierung zum APS ak− tiviertes Sulfat als Substrat. Dieses wird von der heterodimeren dissimilatorischen APS−Reduktase reduziert. Dieses Enzym ist eine Schwefel−Eisen−Flavo−Protein, das an anaerobe Bedingungen gebunden ist. Mit der Entwicklung von Sauerstoff durch den Prozess der Photosynthese entwickelte sich ein System, bei dem der im Stoffwechsel notwendige Sulfidschwefel im Rahmen der assimi− latorischen Sulfatreduktion aus Sulfat gebildet werden musste. Auch hier dient als Substrat akti− viertes Sulfat, das zum APS adenyliert und ggf. weiter zum PAPS phosphoryliert wurde. Diese unter aeroben Bedingungen ablaufende Reaktion ist ein energetisch sehr kostspieliger Vorgang, der etwa doppelt so viel Energie erfordert wie die Kohlenstoff− oder Stickstoffassimilation.

4.1 Die assimilatorische Sulfonukleotid−Reduktion Die in dieser Arbeit untersuchten Sulfonukleotid−Reduktasen katalysieren die Reduktion des akti− vierten Sulfates im Rahmen der assimilatorischen Sulfatreduktion. Bei dieser Reaktion werden 2 Elektronen von 2 Thiolgruppen auf den hexavalenten Sulfatschwefel übertragen. Hierdurch wird der Schwefel zum Sulfit reduziert und der Elektronendonor zum Disulfid oxidiert: APS/PAPS + 2 R−SH

SO32− + AMP/PAP + R−S−S−R

Die Untersuchung der PAPS−Reduktase aus dem Eubakterium Escherichia coli bildete den Schwerpunkt dieser Arbeit, vergleichend wurden die Sulfonukleotid−Reduktasen aus Bacillus subtilis und Catharanthus roseus untersucht. Für die im Folgenden diskutierten Untersuchungen wurden mit Hilfe rekombinanter Techniken hergestellte Proteine verwendet. Eine so synthetisierte PAPS−Reduktase hatte sich bereits bei der Untersuchung von homologen Redoxinen als Elektro− nendonor bewährt (Lillig, 1998; Lillig et al., 1999). 4.1.1 Thio− und Glutaredoxine als Elektronendonor Die Sulfonukleotid−Reduktasen aus B. subtilis und E. coli sind zur Reduktion des aktivierten Sul− fates auf Thioredoxin als Elektronendonor angewiesen. Mit chemischen Reduktionsmitteln können diese Enzyme kein Sulfit freisetzen. Demgegenüber können die pflanzlichen APS−Reduktasen

Diskussion

74

Glutathion verwenden. Der dieser Gruppe eigene C−Terminus wird als intermolekulares Redoxin angesehen (Bick et al., 1998; Wray et al., 1998; Prior et al., 1999) Die Notwendigkeit für Thioredoxin als Reduktionsmittel für die Reduktion des aktivierten Sulfates wurde schon früh erkannt (Wilson et al., 1961; Gonzales−Porque et al., 1970). Tsang (1981) konnte durch einen E. coli trx−−Stamm Glutaredoxin als alternativen Elektronendonor des E. coli−Enzyms identifizieren. In vitro Messungen mit allen bis dahin in E. coli bekannten Thio− und Glutaredoxinen zeigten, dass Trx1, Trx2 und Grx3 nicht aber Grx2 oder Grx3 Elektronen auf die PAPS−Reduktase übertragen können (Lillig et al., 1999). Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum besseren Verständnis der Spezifität für die Redoxine un− tersucht, inwieweit alternative Thio− und Glutaredoxin−homologe Proteine als Elektronendonor der PAPS−Reduktase aus E. coli dienen können. Untersuchungsobjekte waren die cytosolischen Thioredoxine H1, H2, H3 und H4 aus Arabidopsis thaliana, das Glutaredoxin aus dem Bakterio− phagen T4, der C−Terminus (N323 − R464) der APS−Reduktase Par2 aus C. roseus (C−Term Par2) und das erst kürzlich als solches identifizierte Glutaredoxin 4 aus E. coli. Das Grx4 aus E. coli, das T4−Grx und der C−Terminus der APS−Reduktase konnten keine Elektronen auf das Enzym übertragen. Das Versagen des Glutaredoxins 4 aus E. coli, dem vermut− lich eine Funktion bei der Regulation des Redoxzustands in der Zelle zukommt und das nur ein Cystein statt des üblichen CxxC−Clusters besitzt10, war ebenso wie das Versagen des T4−Glutare− doxins, das eine gegenüber den anderen Mitgliedern der Thioredoxin−Familie unterschiedliche Struktur im Bereich des CxxC−Clusters besitzt (Soderberg et al., 1978; Eklund et al., 1992), er− wartet worden. Auch der separat von der Sulfonukleotid−Reduktase−Domäne synthetisierte C− Terminus der APS−Reduktase aus C. roseus, der einen CxxC−Cluster enthält, die N−terminale Domäne reduzieren kann und Eigenschaften von Thioredoxinen aufweist (Prior et al., 1999), war nicht in der Lage die PAPS−Reduktase zu reduzieren. Demgegenüber konnten alle getesteten pflanzlichen Thioredoxine Elektronen auf die PAPS−Reduktase übertragen. Tabelle 4.1 gibt einen Überblick über die bis heute in vitro als Reduktionsmittel der E. coli PAPS−Reduktase getesteten Proteine. Von allen überprüften Glutaredoxinen konnte nur das Grx1 aus E. coli als Elektronendonor dienen. Während die Glutaredoxine 2 und 4, sowie das Redoxin des Phagen T4 in ihrer Primär− oder Tertiärstruktur von den Thioredoxinen und dem Grx1 abweichen (Vlamis−Gardikas et al., 1997; Soderberg et al., 1978; Eklund et al., 1992), nimmt das Grx3 eine dem Grx1 sehr ähnliche Struktur ein (Nordstrand et al., 1999 und 2000). Alle bis heute untersuch− ten Thioredoxine konnten Elektronen zur Reduktion des aktivierten Sulfates durch die E. coli PAPS−Reduktase bereitstellen. Eines der hier getesteten cytosolischen pflanzlichen Thioredo− xine (TrxH3, vgl. 3.2.1.4.3) erwies sich mit 154 % der Effizienz des E. coli Trx1 als das effek− 10 Persönliche Mitteilung Vlamis−Gardikas, A.

Diskussion

75

tivste. Dieses Thioredoxin weicht vom Konsensus−Motiv

der

Tabelle 4.1: Übersicht aller in vitro als Elektronendonor der PAPS−Reduktase aus E. coli getesteten Thio− und Glutaredoxine

Thioredoxine

(WCGPC) ebenso wie das TrxH4 (45 %

Protein

Effizienz) durch den Ersatz des Glycins

Km

Vmax

µmol l−1 µmol mg−1 min−1

durch ein Prolin ab (WCPPC). Die üb− rigen Redoxine pflanzlichen Ursprungs reduzierten das Enzym mit einer relati− ven Effizienz von 19 und 23 %. Diese coli (38 %), das in seiner Primärstruktur

%

Trx1 E. coli ¶

13.7

6.6

100

Trx2 E. coli ¶

34.2

6.3

38

Grx1 E. coli ¶

14.9

5.1

71

¶

keine Aktivität

Grx3 E. coli ¶

keine Aktivität

Grx2 E. coli

Effizienzen sind mit der des Trx2 aus E.

Effizienz

diese Arbeit:

eher dem eukaryotischen Typ entspricht

Grx4 E. coli

(Miranda−Vizuete et al., 1997), ver−

TrxH1 A. thaliana

59.0

5.3

19

gleichbar. Auch in früheren Untersu−

TrxH2 A. thaliana

43.1

4.7

23

chungen konnte die E. coli PAPS−Re−

TrxH3 A. thaliana

17.8

13.2

154

duktase mit allen getesteten Thioredo−

TrxH4 A. thaliana

26.1

5.7

45

xinen PAPS reduzieren. Dies betraf auch

Grx T4

keine Aktivität

C−Term Par2

keine Aktivität

heterologe Thioredoxine (I und II) aus ¶

der Hefe und eine M−Typ−Thioredoxin−

keine Aktivität

Lillig et al. (1999)

Fraktion aus Spinat (Schriek, 1984). Die PAPS−Reduktase konnte darüber hinaus benutzt werden, heterologe Thioredoxine in Chromato− grafie Fraktionen verschiedener Organismen zu detektieren (Schwenn und Schriek, 1987). Auch vor dem Hintergrund der hier vorgestellten Ergebnisse kann die E. coli PAPS−Reduktase, wie von den Autoren vorgeschlagen, zur Identifikation von Thioredoxinen unterschiedlichster Herkunft verwendet werden. Gegenüber der Unspezifität der bakteriellen PAPS−Reduktase, konnte die Sulfatautotrophie eines S. cerevisiae trx−−Stammes bei der Überprüfung der A. thaliana Thioredoxine H1, H2, H3, H4 und H5 nur durch TrxH2 komplementiert werden (Mouaheb et al., 1998). In weiteren Versu− chen mit Hybrid−Proteinen wurde gezeigt, dass die Spezifität dieser Komplementation vom C− terminal des CxxC−Cluster liegenden Bereichs des TrxH2 ausgeht (Brehelin et al., 2000). Das Enzym aus der Hefe kann also im Gegensatz zu dem aus E. coli nicht von allen Thioredoxinen re− duziert werden, wenn die Ergebnisse der Komplementationen nicht neben der Spezifität der Pro− tein−Protein Wechselwirkungen durch weitere Faktoren bestimmt wurden. Innerhalb der Primärstrukturen der getesteten Redoxine gibt es keine direkten Hinweise auf die Ursache der unterschiedlichen Effizienz oder die Diskriminierung des Grx3. Vermutlich spiegeln Unterschiede im Redoxpotential der Thiolgruppen des CxxC−Clusters der Redoxine auch nur einen

Diskussion

76

Teil der möglichen Effizienz−Unterschiede wider (s.u.). Sie können das Versagen von Grx3 als Elektronendonor nicht erklären. Allgemein bedürfen Protein−Protein−Wechselwirkungen in Lö− sung nicht nur einer geometrischen, sondern auch einer elektrostatischen Komplementarität der In− teraktionspartner. Entgegengesetzte elektrostatische Oberflächen erhöhen die Kollisionswahr− scheinlichkeit zweier Proteine und sorgen durch eine Ausrichtung der Proteine vor der Kollision dafür, dass die Kollisionspartner mit deutlich höherer Wahrscheinlichkeit an der „richtigen“ Stelle interagieren. (Janin, 1997). Die Spezifität einer Protein−Protein−Interaktion wird in erster Linie von dieser elektrostatischen Ladungskomplementarität ausgemacht (u.a. Roberts et al., 1991; Karshikov et al., 1992; Novotny und Sharp, 1992; Braden und Poljak, 1995; McCoy et al., 1997). Gegenüber dem Grx1 gibt es beim Grx3 deutliche Differenzen in der Ladungsverteilung in Nähe des aktiven CxxC−Clusters (Åslund et al., 1996). Dass dies auch die Ursache für sein Versagen bei der Reduktion der PAPS−Reduktase sein kann, verdeutlicht die Verteilung der Ladung auf der Oberfläche der experimentell ermittelten Strukturen der Redoxine Trx1, Grx1 und Grx3 aus E. coli, sowie der für diesen Zweck modellierten Strukturen der A. thaliana Thioredoxine H1, H2, H3 und H4 (Abb. 32). Die Interaktionsfläche der Thio− und Glutaredoxine mit anderen Proteinen liegt in der Nähe ihres CxxC−Clusters. Sie wird z.B. in dem Komplex aus Thioredoxin und der Thioredo− xin−Reduktase (Lennon et al., 2000) aus dem Loop zwischen Faltblatt 2 und Helix 2 (in dem das

Abbildung 32: Elektrostatisches Oberflächenpotential untersuchter Redoxine Oben links: Darstellung der durch die Interaktionen des E. coli Thioredoxins mit der Thioredoxin−Reduktase (TR) verborgenen Oberfläche (60 % Transparenz). Der gelbe Bereich ist der Anteil des gemischten Disulfids zwischen den Proteinen. Die Strukturen des Trx1−TR−Komplexes (1f6m), des E. coli Trx1 (1xob), des E. coli Grx1 (1grx) und des E. coli Grx3 (3grx) wurden aus der Proteindatenbank bezogen. Die Strukturen der pflanzlichen Thioredoxine wurden für diesen Zweck gemäß 2.10.3 modelliert. Die Darstellung der Interaktionsfläche erfolgte mit Hilfe des Swiss−PDB−Viewers, die Berechnung und Darstellung der Potentiale erfolgten mit Hilfe von MOLMOL. Blaue Bereiche kennzeichnen positive Ladungen, rote negative.

Diskussion

77

N−terminale CxxC−Cystein liegt), dem Bereich zwischen Faltblatt 3 und 4 einschließlich Helix 3, dem Loop zwischen Faltblatt 5 und Helix 4 und aus Teilen der Oberflächen von Helix 3 und 4 ge− bildet. Abb. 32 zeigt auch diese durch die Protein−Protein−Wechselwirkungen nicht mehr zugäng− liche Oberfläche des Redoxins. In die genannten Bereiche fallen auch die strukturell ermittelten Interaktionsflächen zwischen dem Human−Thioredoxin und Peptiden der Proteine NfκB und Ref−1 (Qin et al., 1995; Qin et al., 1996), die Interaktionsfläche des Human−Glutaredoxins mit Glutat− hion (Yang et al., 1998), die Interaktionsfläche der E. coli Glutaredoxine 1 und 3 mit Glutathion (Bushweller et al., 1992; Nordstrand et al., 1999) und die Interaktionsfläche des Grx1 mit einem Fragment der Ribonukleotid−Reduktase (Berardi und Bushweller, 1999). Bei Analyse der Oberflächen fällt sofort das deutlich positivere Potential des Grx3 in dem Be− reich der beschriebenen Interaktionsfläche auf. Die pflanzlichen Thioredoxine besitzen demge− genüber ein überwiegend negatives Potential, das dem des E. coli−Thioredoxins ähnelt. Mögli− cherweise ist eine negative Ladungsverteilung in diesem Bereich notwendig für eine Interaktion der Redoxine mit der PAPS−Reduktase. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Bunik et al. (1999) bei ihrer Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Thioredoxinen und dem 2−Oxosäure−Dehydroge− nase−Komplex. Die Autoren konnten durch theoretische und experimentelle Ansätze die La− dungsverteilung am aktiven Zentrum neben der Polarität der Proteine als Ursache für die Effizienz der Redoxine ermitteln. Mora−Garcia et al. (1998) konnten durch Mutagenese des E. coli Thiore− doxins hin zu einer positiveren Oberfläche im Bereich des aktiven Zentrums Proteine herstellen, die dem Thioredoxin F ähnlicher sind. Die Aktivität dieser mutierten Proteine bei der Aktivierung der Fructose−1,6−Bisphosphatase stieg deutlich an. Die Autoren folgerten, dass die elektrostatischen Interaktionen die Bildung des nicht kovalenten Komplexes vor dem Dtihiol−Disulfid−Austausch kontrollieren. Die weitreichenden elektrostatischen Interaktionen bestimmen nach bisherigen Erkenntnissen das Zustandekommen von Komplexen aus Thioredoxinen und Zielproteinen. Dies trifft wahr− scheinlich auch für die Wechselwirkungen von Thio− und Glutaredoxinen mit der PAPS−Reduk− tase zu. Nicht kompatible Oberflächen sind hiernach auch für das Versagen von Grx3 als Elektro− nendonor des Enzyms verantwortlich. 4.1.2 Das Standard−Redoxpotential der PAPS−Reduktase aus E. coli Die PAPS−Reduktase aus E. coli durchläuft als Homodimer redoxabhängig Konformationsände− rungen in ihrem Reaktionszyklus (Berendt et al., 1995). Diese sind verbunden mit der Ausbildung eines Disulfids zwischen den Thiolgruppen der Cysteine des ECGLH−Clusters nach der Reduktion des Substrates PAPS. Wie hier aufgezeigt, wird das Disulfid direkt von einem Redoxin unter Ausbildung eines intermediären gemischten Disulfids zum Dithiol reduziert (vgl. 3.2.1.4.2). Die

Diskussion

78

Konformationsänderungen des Enzym−Dimers können durch Absorptionsdifferenz−Spektroskopie verfolgt werden (Berendt et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass ein Differenzsignal bei 294 nm, welches höchstwahrscheinlich durch veränderte In− teraktionen eines oder mehrerer Tryptophane mit dem Lösungsmittel entsteht, proportional zum Redoxzustand des Proteins ist. Unter Verwendung von Glutathion−Redoxpuffern, die in katalyti− scher Konzentration Grx1 enthielten, konnte das Standard−Redoxpotential des Dithiol/Disulfid− Paares der C239−Thiole des Dimers als E0´ = −162 mV bestimmt werden (vgl. 3.2.2.2). Das Poten− tial der PAPS−Reduktase Thiolgruppen liegt damit erwartungsgemäß zwischen dem seiner Elek− tronendonatoren Trx1 (−270 mV, Krause et al., 1991) bzw. Grx1 (−233 mV, Åslund et al., 1997) und dem des Substrat/Produkt−Paares PAPS/SO32− (−60 mV). Bei bekannter Potentialdifferenz kann die freie Standard−Energie (∆G0´) einer Redoxreaktion unter reversiblen Bedingungen angegeben werden als:

Hierbei steht n für die Zahl übertragener Elektronen, und F für die Faraday−Konstante (96494 J V−1 mol−1). Das ∆G0´ der Reduktion der PAPS−Reduktase durch Thioredoxin beträgt demnach −20.8 kJ mol−1, das der Reduktion durch Glutaredo− xin −13.7 kJ mol−1. Das ∆G0´ der PAPS−Reduktase katalysierten PAPS−Reduktion zum Sulfit beträgt −19.7 kJ mol−1. Bei all die− sen Werten liegen die Gleichgewichte der Teilreaktionen weit auf Seite der Produkte, womit die PAPS−Reduktase bei den in E. coli vorherrschenden reduzierenden Bedingungen immer den größten Teil des vorhandenen PAPS zu PAP und SO32− umsetzen sollte. Das Standard−Redoxpotential des Grx3, das keine Elektronen auf die PAPS−Reduktase übertragen kann (Lillig et al., 1999),

Abbildung 33: Elektronen− fluss vom NADPH zum Sulfit

beträgt −198 mV (Åslund et al., 1997). Damit beruht die Unfä− higkeit der Elektronenübertragung nicht auf thermodynamischen Beschränkungen, denn ein hypo− thetisches ∆G0´ von −6.9 kJ mol−1 stünde einer Reaktion nicht entgegen. Hier spielen, wie bereits diskutiert, andere Ursachen eine Rolle. Die Reduktion von Protein−Disulfiden durch die Gruppe der Thio− und Glutaredoxine folgt auch in anderen Fällen nicht allein den thermodynamischen Eigenschaften ihrer Thiolgruppen. So ist zum Beispiel Grx1 als Reduktionsmittel der Ribonukleo− tid−Reduktase 10fach aktiver als Trx1 (Holmgren, 1979), obwohl das Thioredoxin energetisch (auf Basis des ∆E zum Grx1) einen fast 18fach besseren Disulfid−Reduktanden darstellt.

Diskussion

79

4.1.3 Wechselwirkungen der PAPS−Reduktase mit ihrem Substrat PAPS Die Interaktionen der PAPS−Reduktase aus E. coli mit ihrem Substrat PAPS wurden in dieser Ar− beit mit den Methoden der Enzymatik und durch in silico Modellierung eines Enzym−Substrat− Komplexes untersucht. Die PAPS−Reduktase zählt zu der Gruppe der Adeninnukleotid−α−Hydro− lasen (Bork und Koonin, 1994; Savage et al., 1997). Die überwiegenden Mitglieder dieser En− zymfamilie hydrolysieren das ATP zwischen dem α− und dem β−Phosphat. Die der PAPS−Re− duktase ähnlichsten Vertreter dieser Gruppe mit bekannter Tertiärstruktur sind die ATP−Pyro− phosphatase Untereinheit der GMP−Synthetase aus E. coli (Tesmer et al., 1996) und die NH4−ab− hängige NAD−Synthetase aus Bacillus subtilis (Rizzi et al., 1996). Ein 3−D−Vergleich ihrer Strukturen mit der der PAPS−Reduktase ergab eine mittlere Abweichung (root mean square de− viation, rmsd) der Cα−Atome von 1.9 Å bzw. 2.1 Å (Savage et al., 1997). Die Position des AMP und PPi und die Struktur des Adeninnukleotid−α−Hydrolase−Motivs in diesen beiden Enzymen ist fast identisch, obwohl sie auf Ebene der Primärstruktur nur eine Identität von 20.4 % über die strukturell homologen 234 bzw. 217 Aminosäurereste aufweisen. Zwischen der ATP−Pyrophos− phatase Untereinheit der GMP−Synthetase und der PAPS−Reduktase sind über 213 bzw. 228 Aminosäurereste 18.1 % identisch. Gerade vor dem Hintergrund der Ähnlichkeit der Position des AMP in den ATP−Pyrophosphatasen schien das Vorgehen, die möglichen Wechselwirkungen des PAPS mit der PAPS−Reduktase auf Basis dieser Position im Protein zu beginnen, gerechtfertigt. Die PAPS−Reduktase zeigte in Inhibierungsversuchen mit verschiedenen Purinnukleotiden eine ausschließliche Spezifität für frei diffusibles 3´5´PAP oder 3´5´PAPS (vgl. 3.2.1.1). Die auf Basis enzymgebundener PAP−Strukturen (Kakuta et al., 1997; Kakuta et al., 1999) gewonnene PAPS− Struktur mit der Ribose in der C(3´)−exo Konformation (vgl. 3.2.1.2) wurde in die Struktur des Enzyms modelliert. Dieses Modell (vgl. Abb. 12) zeigt mit Ausnahme des Phosphosulfatanteils alle möglichen Wasserstoffbrücken−Akzeptoren und −Donatoren gesättigt. Sowohl der Riboseanteil als auch das Purinringsystem sind darüber hinaus stark an hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt. Die Konsensussequenz der Adeninnukleotid−α−Hydrolasen lautet Sggxds...()...xdxG. In den an− gesprochenen ATP−Pyrophosphatasen bildet das β−Phosphat des abgespaltenen PPi Wasserstoff− brücken mit den Serinen im vorderen Teil der Konsensussequenz [Sggxds]. In diesen Strukturen wird das Purinringsystem neben hydrophoben Wechselwirkungen nur durch eine (NAD−Synthe− tase) bzw. zwei (GMP−Synthetase) Wasserstoffbrücken gebunden. In beiden Fällen geht eine Wasserstoffbrücke vom Sauerstoff der Peptidbindung des Aminosäurerestes vor dem dxG [xdxG] zum N1 des Purins (vgl. Anhang 1; Tesmer et al., 1996; Rizzi et al., 1996). Auch das N1 (zu− sammen mit dem N6) des PAPS bildet in dem Modell eine Wasserstoffbrücke mit dem Sauerstoff dieser Peptidbindung [T77DTG] (vgl. Abb. 12). In Einklang mit seiner Funktion und der gegenüber

Diskussion

80

AMP anderen Ribose−Konformation des PAPS ist das in der PAPS−Reduktase konservierte Serin [SFGIQA] nicht in unmittelbarer Nähe zum Sulfatanteil, der dem β−Phosphat im ATP entspricht. Die Funktion der Aminosäurereste im Konsensus−Motiv aller Adeninnukleotid−α−Hydrolasen ist nicht in spezifischen Interaktionen der Reste mit dem Substrat zu suchen, vielmehr sind sie not− wendig bei der Ausbildung einer Tertiärstruktur, die geeignet ist Adeninnukleotide zu binden (Sa− vage et al., 1997). Durch das Modell wurde das Arginin R164, dessen Guanidinogruppe in Nähe des Phosphosulfa− tes liegt, als potentiell bedeutend für die Reaktion identifiziert. Dies wurde durch enzymatische Untersuchungen einer durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellten R164→G−Mutante bestätigt (vgl. 3.2.1.3). Diese Mutante hat eine ~ 320fach niedrigere spezifische Aktivität und eine ~ 130fach niedrigere Effizienz in Bezug auf das Substrat PAPS gegenüber dem unter identischen Bedingun− gen hergestellten Wildtypprotein. In den strukturell nicht verwandten PAPS−Sulfotransferasen, die die Sulfatgruppe auf andere Substrate übertragen, wird von der Beteiligung eines Lysinrestes, der funktionell nur durch einen Argininrest ersetzt werden kann, an der Katalyse ausgegangen. Dies sind z.B. das Lysin K48 in der Östrogen−Sulfotransferase (Kakuta et al., 1998) oder das K59 in der Flavonol−3−Sulfotransferase (Marsolais und Varin, 1997). Aufgrund ihrer Nähe zum Brücken− sauerstoff des Phosphosulfates wird für diese Aminosäuren sowohl die Stabilisierung eines Über− gangskomplexes als auch durch Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zum Brückensauerstoff die Unterstützung der Dissoziation der Sulfatgruppe diskutiert (Kakuta et al., 1998). Auch in der PAPS−Reduktase könnte die Funktion des in allen Sulfonukleotid−Reduktasen strikt konservierten R164 in einer Rolle als Säure zur Protonierung des Brückensauerstoffs des Phosphosulfates zu su− chen sein. Eine Protonierung des Sauerstoffs einer S−O Bindung kann diese erheblich schwä− chen (Price und Oae, 1962). Hierdurch könnte die Spaltung des Phosphosulfates eingeleitet werden, welche durch die zusätzliche Übertragung von 2 Elektronen zur Freisetzung des zum Sulfit redu− zierten Schwefels führen würde. Die PAPS−abhängigen Sulfotransferasen können mit Hilfe einer Affinitätschromatografie an einer Säule mit einem über das N6 des Purins immobilisierten PAP gereinigt werden (u.a. Bouthil− lier et al., 1985; Marsolais und Varin, 1995). In der Struktur der Östrogen−Sulfotransferase (Ka− kuta et al., 1997) nimmt das PAP eine Struktur im Protein ein, in der dieses N6 in Nähe der Pro− teinoberfläche liegt und von außen zugänglich ist. Die PAPS−Reduktase bindet nicht an eine Ma− trix mit derart immobilisiertem PAP (vgl. 3.2.1.1). Dies wird durch das Modell erklärt. Das N6 liegt hier verborgen im Protein, so dass es nicht zugänglich ist, wenn das Nukleotid in der positiven Bindenische liegt (vgl. Abb. 11). Das vorgestellte Modell der Wechselwirkungen der PAPS−Reduktase mit ihrem Substrat PAPS wird durch seine Parallelen zur Bindung der Adeninnukleotide in anderen Adeninnukleotid−α−

Diskussion

81

Hydrolasen gestützt. Es kann die fehlenden Wechselwirkungen mit einer PAP−Affinitätsmatrix erklären. Zugleich konnte enzymatisch mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese die vorhergesagte Bedeutung des R164 bei der Katalyse bestätigt werden. Die Schwäche des Modells liegt im Fehlen von Informationen zur Lage des katalytischen Zentrums [ECGLH] und zur Funktion des Dimers, so dass auf dieser Basis keine weiteren Aussagen zum Mechanismus der Reduktion möglich sind. Hier werden erst weitere Experimente auf Basis vollständiger struktureller Informationen über diesen Bereich des Proteins Abhilfe schaffen. 4.1.4 Sulfonukleotid−Spezifität der Sulfonukleotid−Reduktasen In dieser Arbeit wurden drei Mitglieder der Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen vorgestellt, die alle eine unterschiedliche Spezifität für die Sulfonukleotide APS und PAPS aufweisen. Die erst− mals untersuchte Sulfonukleotid−Reduktase aus B. subtilis (CysH1) ist das erste charakterisierte Enzym das vergleichbare APS− und PAPS−Reduktase−Aktivität besitzt. Hierbei besitzt das Protein eine leichte Präferenz für PAPS (Km = 6.4 µmol l−1) gegenüber APS (Km = 28.7 µmol l−1) als Sub− strat. Die PAPS−Reduktase aus E. coli reduziert ausschließlich PAPS (Km = 22.5 µmol l−1, Lillig et al., 1999), während die APS−Reduktase aus C. roseus ausschließlich APS (Km = 2.5 µmol l−1, Prior et al., 1999) reduziert. Bei der Diskussion der Ursachen für die Sulfonukleotid−Spezifität müssen natürlich die Struk− turen der Substrate APS und PAPS mit in Betracht gezogen werden. Wie bereits aufgeführt (vgl. 3.2.1.2) besitzt die Ribose in PAP− und PAPS−Modellen C(3´)−exo Konformation. Demgegenüber liegen die Riboseanteile der beschriebenen AMP−Moleküle in den Strukturen der GMP− 5´APS

Synthetase und der NAD−Synthetase sowie in einer

zu

Vergleichszwecken

berechneten

3´5´PAPS

APS−Struktur in C(3´)−endo Konformation vor. Dies bedingt deutliche Unterschiede in der Lage des Sulfates in Bezug auf das Purin− ringsystem (Abb. 34). Diese Konformationen werden durch experimentell ermittelte, pro− teingebundene Strukturen des APS (Ullrich et al., 2001) und PAPS (Schneider et al., 1998) bestätigt. Die Bedeutung des Adeninnukleotid−α− Hydrolase−Motivs (Bork und Koonin, 1994; Savage et al., 1997) für die Substratbindung

Abstände 5´PO4 −5´PO4 = 4.4 Å 5´SO4 −5´SO4 = 5.2 Å Abbildung 34: Strukturmodelle des APS (orange) und PAPS (türkis)

Diskussion

82

wurde bereits im vorhergehenden Kapitel diskutiert. Bei Betrachtung der Aminosäure−Sequenzen der untersuchten Sulfonukleotid−Reduktasen fällt die größere Nähe der Primärstruktur der C. ro− seus−APS−Reduktase zu den ATP−umsetzenden Enzymen in diesem Bereich auf (vgl. Anhang 1). Die Notwendigkeit von komplementären elektrostatischen Eigenschaften bei den Wechselwirkun− gen zwischen Proteinen trifft natürlich auch auf die Interaktionen der Enzyme mit diesen Substraten zu. Dies deutet auf zwei Faktoren als Determinanten der Nukleotid−Spezifität der Sulfonukleotid− Reduktasen hin. Der erste ist die geometrische Ausformung, der zweite das elektrostatische Poten− tial der Bindenische. Dem folgend bietet das Reaktionszentrum des B. subtilis−Proteins sicher eine sehr große geometrische Freiheit bei der Bindung des Purinrings, damit die Phosphosulfate des APS und des PAPS trotz ihrer unterschiedlichen Lage in Bezug auf den Purinring an der gleichen Stelle des Proteins koordiniert werden können. Im Modell der APS−Reduktase aus C. roseus besitzt die Oberfläche der Substrat−Bindenische im Gegensatz zu der des E. coli−Proteins (Savage et al., 1997) ein negatives Potential. Wahrscheinlich kann dieses Protein wegen der geometrischen Aus− bildung seiner Bindenische und auf Grund einer elektrostatischen Abstoßung des 3´Phosphates nur APS umsetzen. Diese Überlegungen sprechen gegen die Vermutung von Bick et al. (2000), dass die Spezifität der Proteine von wenigen Aminosäuren bestimmt wird. Vielmehr scheint sie Folge sehr komplexer Faktoren bei der Ausbildung der Bindenische zu sein. Die Analyse der Struktur der PAPS−Reduktase zeigt, dass die Oberfläche des aktiven Zentrums von mindestens 30 Aminosäuren gebildet wird, von denen vermutlich mehr als 8 direkt an der Bindung des Substrates beteiligt sind. 4.1.5 Folgen der Sulfonukleotid−Spezifität Die Spezifität einzelner Sulfonukleotid−Reduktasen für APS oder PAPS als Substrat muss auch in Zusammenhang mit dem Schwefel−Stoffwechsel in diesen Organismen diskutiert werden. Hier gilt es in erster Linie die thermodynamischen (∆G0´ = 45 kJ mol−1) und enzymatischen (Inhibierung durch APS) Beschränkungen der Adenylierung des Sulfates durch die ATP−Sulfurylase zu beach− ten (Seubert et al., 1985). Ein substantieller Stofffluss erfordert die Entfernung der Produkte APS und PPi aus dem Reaktionsgleichgewicht. Die Entfernung des APS aus dem Gleichgewicht erfor− dert ein Enzym mit hoher Affinität und Effizienz in Bezug auf das APS. Dies kann durch die APS− Kinase gewährleistet werden. PAPS kann daher im Gegensatz zum APS auch akkumulieren. In einem Organismus der APS reduziert, sollte nur sehr wenig frei verfügbares PPi vorhanden sein, da sonst das wenige APS mit PPi zur Synthese von ATP in der Rückreaktion der ATP−Sulfurylase verwendet würde. In der aktuellen Literatur wird für Pflanzen die APS−Reduktion zur Assimilation des Schwefels beschrieben (Übersicht in: Bick und Leustek, 1998). Sowohl die APS−Kinase (Lee und Leustek, 1998; Schiffmann, 1998), als auch APS−Reduktase (Prior et al., 1999) werden in Plastiden impor−

Diskussion

83

tiert. Dort muss es zur Konkurrenz um das sehr wenige APS kommen. Plastiden enthalten darüber hinaus größere Mengen PPi (Weinert et al., 1987). Vergleicht man vor diesem Hintergrund die hier bestimmten Parameter der APS−Kinase mit denen einer pflanzlichen APS−Reduktase, so würde die hohe Effizienz der APS−Kinase in Bezug auf APS (Km = 0.14 µmol l−1, Effizienz: 2.45 107 l mol−1 

s−1) gegenüber der 30fach schlechteren der APS−Reduktase aus C. roseus (Km = 2.5 µmol l−1, Effi− zienz: 8.32 105 l mol−1 s−1, Prior et al., 1999) die Reduktion des aktivierten Sulfates zum Sulfit 

wenn nicht unterbinden, dann doch zumindest erheblich limitieren. Eine zeitliche oder räumliche Trennung der APS−Phosphorylierung und der APS−Reduktion könnte diese Beschränkung aufhe− ben. Alle Organismen, in denen bis heute eine assimilatorische APS−Reduktase identifiziert wurde, enthalten in ihrem Genom auch Sequenzen, die für eine APS−Kinase kodieren. Das von ihnen ge− bildete PAPS findet auch als Substrat für Sulfatierungs−Reaktionen Verwendung. Die Frage der Regulation des Schwefelstoffwechsels an diesem Verzweigungspunkt, an dem das APS reduziert für die Synthese von Cystein und Methionin, oder zum PAPS phosphoryliert als Substrat für Sul− fat−Konjugation dient, ist bis heute nicht beantwortet. 4.1.6 Reaktionszyklus der Sulfonukleotid−Reduktasen Im Rahmen dieser Arbeit wurden die im Folgenden detailiert beschriebenen Versuche durchge− führt, die zur Aufklärung des molekularen Reaktionsmechanismus der PAPS−Reduktase aus E. coli beitragen sollten. Mit Hilfe der Monothiol−Glutaredoxin 1−Mutante Grx1C14→S, bei der das C−terminale Cystein des redoxaktiven CxxC−Clusters gegen ein Serin ausgetauscht wurde, konnte mit Hilfe der SDS− PAGE erstmals ein gemischtes Disulfid aus PAPS−Reduktase und einem Redoxin dargestellt werden (vgl. 3.2.1.4.2). Da die PAPS−Reduktase nur einen einzigen Cysteinrest im Konsensus− Motiv der Sulfonukleotid−Reduktasen ECGLH aufweist, muss das Disulfid zwischen dieser Thiolgruppe und dem N−terminalen Cystein des CxxC−Clusters des Redoxins ausgebildet werden. Thio− und Glutaredoxine reduzieren ein Disulfid−Substrat durch nukleophilen Angriff des N− terminalen CxxC−Cysteins, über ein intermediäres gemischtes Disulfid, das durch das C−terminale CxxC−Cystein des Redoxins reduziert wird (Übersicht in: Holmgren, 1995, vgl. Abb. 14). Das Substrat wird zum Dithiol reduziert, das Redoxin zum Disulfid oxidiert. Vor diesem Hintergrund kann auch das gemischte Disulfid aus PAPS−Reduktase und Grx1 als Intermediat der Reduktion des Enzyms angesehen werden. Die Zunahme des apparenten Molekulargewichtes der PAPS−Re− duktase durch Reduktion wird als Konformationsänderung des Dimers von einer geschlossenen, oxidierten zu einer reduzierten, offenen Form angesehen. Diese Konformationsänderungen können durch UV−Absorptionsdifferenz−Spektroskopie verfolgt werden (vgl. 3.2.2.1, Berendt et al., 1995). Wie hier gezeigt wurde beinhaltet das gemischte Disulfid bereits einen Teil der Absorpti−

Diskussion

84

onsveränderungen, die das vollständig reduzierte Enzym auszeichnen. Somit stellt das gemischte Disulfid aus dem Redoxin und der PAPS−Reduktase nicht nur ein Intermediat auf dem Weg zur Dithiol−Form dar, sondern auch ein Intermediat von der apparent kleinen, geschlossenen Form hin zur großen, für das Substrat PAPS zugänglichen Form. Proteine der Thioredoxin−Familie sind in der Lage durch Dithiol−Disulfid−Übergänge Proteine zu falten (Holmgren, 1979; Pigiet und Schuster, 1986), was auch für das hier verwendete Glutaredoxin 1 C14→S zutrifft (Ruoppolo et al., 1997). Die „steady−state“ Untersuchung der Inhibierung der PAPS−Reduktase durch ihr Substrat PAP charakterisierte die Hemmung als „linear mixed−type“11. Bei diesem Typ der Hemmung kann sich ein nicht produktiver Enzym−Inhibitor−Substrat−Komplex bilden. Da die PAPS−Reduktase als Homodimer die Reduktion von PAPS katalysiert (Berendt et al., 1995), ist ein Komplex denkbar, bei dem ein Monomer das Produkt (= Inhibitor) und der andere das Substrat bindet. Diese Mög− lichkeit wird gestützt durch spektroskopische Untersuchungen (vgl. 3.2.2.1). Bei Inkubation der reduzierten PAPS−Reduktase mit PAPS kann ein Differenzsignal aufgenommen werden. Die PAPS−Reduktase geht durch die Reduktion in eine geschlossene, kompaktere Form über (Berendt et al., 1995). Weder die Inkubation mit PAP noch die Inkubation der katalytisch inaktiven C239→G Mutante der PAPS−Reduktase mit PAPS führte zu einem detektierbaren Differenzsignal. Die Pro− teine veränderten also nicht durch die Bindung des Substrates oder Produktes ihre Konformation, sondern erst nach Reduktion des Substrates. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das Enzym nach Bindung des PAP eine Konformation besitzt, die neben der Dissoziation des Komplexes auch die Bindung des Substrates in der Bindenische des zweiten Monomers ermöglichen würde. Die PAP− Inhibierung wurde auch von Schwenn und Schriek (1987) als „mixed−type“ beschrieben, während sie von Berendt et al. (1995) als kompetitiv in Bezug auf PAPS charakterisiert wurde. Die skizzierten Ergebnisse sind im folgenden Modell zusammengefasst:

11 Definition nach Segel (1993), S. 170ff

Diskussion

85

Die oxidierte geschlossene Form (A) des PAPS−Reduktase−Dimers [E−E] wird über ein in− termediäres gemischtes Disulfid (B) zwischen einem Redoxin [R] und einem Monomer zur offenen Form reduziert. Diese Form (C) ist in der Lage das Substrat PAPS (D) oder den Inhibitor bzw. das Produkt PAP (E) in der Nukleotid−Bindenische eines Monomers zu komplexieren. Aus beiden Formen kann sich der katalytisch inkompetente Enzym−PAPS−PAP−Komplex (F) bilden, bei dem die beiden Nukleotide in den Nukleotid−Bindenischen der Monomere gebunden sind. Nur der En− zym−PAPS−Komplex (D) kann zum Enzym−PAP−Sulfit−Komplex weiter reagieren (G), was nach Freisetzung der Produkte wieder zum oxidierten, geschlossenen Homodimer führt (A), womit ein Reaktionszyklus vollendet wird. Dieses Modell steht in Einklang mit dem seit langem auf Basis, enzymatischer Untersuchungen angenommenen Ping−Pong−Reaktionsmechanismus (Schwenn et al., 1988; Krone et al., 1991; Berendt et al., 1995), wie er für alle Thioredoxin−abhängigen Reak− tionen postuliert wurde (Holmgren, 1989). Einem wie von Berendt et al. (1995) vorgeschlagenem „Theorell−Chance“−Mechanismus (Segel, 1993) mit extrem kurzer Lebenszeit des Enzym−Redo− xin−Komplexes steht es entgegen. Gerade die Versuche mit verschiedenen Redoxinen (s.o.) lassen die Reduktion der PAPS−Reduktase durch die Redoxine als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Reaktion erscheinen. Für die Trx:APS−Reduktase aus Pseudomonas aeruginosa wurde auf Basis der Kinetik des Enzyms, die den Ergebnissen von Berendt et al. (1995) entsprechen, ebenfalls ein Ping−Pong− Mechanismus vorgeschlagen (Bick et al., 2000). Die pflanzlichen Sulfonukleotid−Reduktasen sind wegen ihrer C−terminalen Extension nicht auf Thioredoxin als Elektronendonor angewiesen (Bick et al., 1998; Wray et al., 1998; Prior et al., 1999). Für die GSH:APS−Reduktase aus Lemna minor wurde aktuell ein Reaktionsmechanismus vorgeschlagen (Weber et al., 2000), bei dem der Schwe− fel als Thiosulfit kovalent gebunden an das Cystein des ECGLH−Motivs vorliegen soll: a)

APS−Reduktasered + APS

b)

APS−Reduktase−SO3− + 2 GSH

APS−Reduktase−SO3− + AMP APS−Reduktasered + SO32− + GSSG

Als Beleg für diesen Mechanismus konnte eine radioaktive Markierung des Proteins nach In− kubation mit [35S]APS bei 4°C angeführt werden. Die gebundene Radioaktivität konnte durch In− kubation mit Thiolen freigesetzt werden. Bislang fehlen kinetische Untersuchungen, die einen sol− chen Mechanismus der GSH:APS−Reduktasen stützen würden. Wird die Sulfonukleotid−Reduk− tase−Domäne der pflanzlichen Enzyme als rekombinantes Protein ohne ihre als Redoxin funktio− nierende C−terminale Domäne exprimiert, so ist das gereinigte Protein inaktiv. Seine Aktivität kann aber durch Thioredoxin z.T. restauriert werden (Prior et al., 1999). Es katalysiert dann als

Diskussion

86

Trx:Sulfonukleotid−Reduktase die APS−Reduktion. Dies spricht für einen Mechanismus bei dem das Redoxin direkt ein Proteindisulfid reduziert. Die Reduktion eines Thiosulfits durch Thioredoxin ist sehr unwahrscheinlich, da dies in der Regel nur Proteindisulfide reduziert (Holmgren, 1985). Dies spricht für eine Übereinstimmung des Mechanismus der bakteriellen und pflanzlichen Enzyme mit dem Unterschied, dass die mikrobiellen Enzyme auf freies Thioredoxin angewiesen sind, wäh− rend diese Funktion bei den pflanzlichen Enzymen als C−terminale Extension fest mit dem Protein verbunden ist. Weitere Untersuchungen in der Zukunft sind notwendig, die Parallelen und Diffe− renzen in den Mechanismen dieser Proteine zu klären. 4.1.7 Chromophore Gruppen & Elektronen−Transfer Erstmals wurden im Rahmen dieser Arbeit Übergangsmetalle in Sulfonukleotid−Reduktasen iden− tifiziert. In den untersuchten Enzymen aus E. coli, B. subtilis und C. roseus konnten durch EPR− und Atomabsorptions−Spektroskopie Kupferionen nachgewiesen werden. In den gelben Sulfonu− kleotid−Reduktasen aus C. roseus und B. subtilis wurden darüber hinaus Eisenionen identifiziert. Die stöchiometrischen Anteile sind noch einmal in Tab. 4.2 zusammengefasst. Diese Metalle sind stabil mit den Proteinen verbunden, sie können nicht durch Gel− oder Ultrafiltration entfernt wer− den. Auch die N−terminal angefügten Oligopeptide mit 10 Histidinen (His−Tag), die für die Me− tallchelat−Affinitätsreinigung eingebracht wurden, tragen ebenso wie die Reinigung selber nicht zu Tabelle 4.2: Übergangsmetalle in Sulfonukleotid−Reduktasen Die Integralgröße der Signale diente als Maß zur Quantifizierung der Spin−Konzentrationen und damit des Fe+III− und Cu+II−Anteils aus den EPR−Spektren der oxidierten Proteine. Zusätzlich sind das zur Anzucht des E. coli Expressionsstamms verwendete Medium und die bestimmte maximale Reaktionsgeschwindigkeit angegeben. (n.b.:. nicht bestimmt.)

Protein

Medium

(Herkunft und Typ) (vgl. 2.5.1)

Wildtyp E. coli

LB

Fe pro Monomer

Cu pro Monomer

AAS EPR Fe+III

AAS EPR Cu+II

Mol pro Monomer

Mol pro Monomer

Vmaxapp

µmol mg−1 min−1

0

n.b.

0.012

0.016

7.4

Wildtyp

§

VBB

0

n.b.

0.058

0.047

25.9

Wildtyp

VBB£

0

n.b.

0.379

0.256

n.b.

C239→G

VBB§

0

n.b.

0.041

0.005

inaktiv

C239→H + H242→C

VBB§

0

n.b.

0.036

0.029

19.7

*

4.1

Wildtyp

VBB

0.800

0.861

0.109

0.140

C. roseus Wildtyp

VBB§

1.053

1.062

0.082

0.195*

4.2

C317→G

VBB§

0.137

0.159

0.034

0.066*

inaktiv

VBB

0.234

0.201

0.469

0.457

0.3

B. subtilis Wildtyp § *

−1

£

−1

supplementiert mit 6 µmol l CuCl2, supplementiert mit 5 mmol l CuCl2, enthält zusätzlich den Anteil des organischen Radikals

Diskussion

87

den spektroskopischen Eigenschaften der Enzyme bei, was für das C. roseus−Par2−Protein exem− plarisch gezeigt werden konnte (vgl. 3.5.2). 4.1.7.1 Kupfer in den Sulfonukleotid−Reduktasen Der Anteil des Kupfers in allen Sulfonukleotid−Reduktasen war substöchiometrisch. Den höchsten Anteil enthielt das Protein aus B. subtilis mit ~ 0.46 Mol pro Mol Proteinmonomer. Das Enzym aus C. roseus enthielt 0.08 − 0.11 Mol Cu+II, die PAPS−Reduktase aus E. coli in Abhängigkeit von den Bedingungen der Expression des Wirtsstammes 0.01 − 0.38 Mol pro Mol Monomer. Eine Erhö− hung des Kupferanteils in diesem Protein um den Faktor 4.8 (auf Basis der AAS) bzw. 2.9 (auf Basis der EPR−Spektroskopie) führte zu einer Steigerung der spezifischen Aktivität des Enzyms um das 3.5fache auf 25.9 µmol mg−1 min−1. Dies ist die höchste je gemessene spezifische Aktivität dieses Enzyms und ein Indiz für eine essentielle Funktion des Übergangsmetalls in diesem Protein. In der Literatur werden 3 Typen von Kupfer− Bindungsplätzen in Proteinen unterschieden (Ein− führung in: Cowan, 1993). Der Typ 1 beschreibt Bindungsplätze, in denen das Kupfer in verzerrt te− trahedraler Geometrie gebunden wird. Die für diese Proteine typische blaue Farbe beruht auf Wechsel− wirkungen des komplexierten Cu+II mit einem Cy− stein. Das Kupfer dient in den Proteinen dieses Typs als Elektronencarrier und ist nicht direkt am Reakti−

Abbildung 35: Typ 1− und Typ 2− Kupfer−Zentren in Metallproteinen R: Met, N− oder O−Liganden, L: N− oder O−, seltener S−Liganden. (Nach: Cowan, 1993)

onsmechanismus beteiligt. Ein typischer Vertreter dieser Gruppe ist das Plastocyanin. Im Typ 2 mit quadratisch planarer oder tetragonaler Geometrie wird das Metall von Stickstoff− und Sauerstoff−, seltener von Schwefel−Liganden koordiniert. In den Proteinen dieser Gruppe kann das Kupfer eine freie Koordinierungsstelle besitzen und so direkt an der Katalyse beteiligt sein. Ein Vertreter dieser Gruppe ist die Galaktose−Oxidase. Die Proteine des Typ 3 enthalten mehrere Kupfer−Moleküle. Die Metalle liegen hier stark antiferromagnetisch gekoppelt vor, so dass ein Typ 3−Zentrum in der Regel kein EPR−Signal aufweist. Diese Zentren können zwei Elektronen übertragen und stellen so in manchen Oxidasen die O2 reduzierende Funktion, bei der die Bildung von Superoxid umgangen wird. Die ermittelten Parameter der Kupfer−EPR−Signale (vgl. Tab. 3.4) in den Sulfonukleotid− Reduktasen, und hier vor allem die großen Kopplungskonstanten (A = 16.3, 17.1 und 18.5 mT, 



vgl. 3.5.1), klassifizieren eine Typ 2−Koordinierung wie sie z.B. auch in der Galaktose−Oxidase (A = 17.1 mT, Whittaker und Whittaker, 1988) und der Glyoxal−Oxidase (A = 17.2 mT, Whit− 



taker et al., 1996) vorliegen.





Diskussion

88

Von welchen Aminosäuren könnte ein Kupferion in den Sulfonukleotid−Reduktasen komple− xiert werden? Der bekannte Teil der Struktur der PAPS−Reduktase aus E. coli, in der die Amino− säuren bis zum Histidin216 sichtbar sind, lieferte keine Hinweise auf einen potentiellen Bindeplatz eines Metalls. Von den in der Struktur nicht sichtbaren 28 Aminosäuren waren 13 vorhanden, die restlichen fehlten dem kristallisierten Protein (Savage et al., 1997). Die Gewinnung von Schwer− metallderivaten zur Gewinnung von Strukturdaten nach der „multiple isomorphous replacement“− Methode war mit Schwierigkeiten verbunden (Montoya et al., 1998). Dies spricht gegen die spezi− fische Bindung eines Metalls durch Aminosäuren, die sich ausschließlich N−terminal vom Threo− nin230 in der Primärstruktur befinden. Der C−Terminus, der das Reaktionszentrum EC239GLH ent− hält, rückt so bei der Suche nach einem möglichen Bindungsplatz in den Vordergrund. In dieser Arbeit wurden 3 in diesem Bereich durch ortsgerichtete Mutagenese veränderte Proteine untersucht (vgl. 3.5.5). Die Proteine aus E. coli und C. roseus mit einem Austauch des Cysteins des ECGLH− Clusters durch Glycin waren enzymatisch inaktiv, enthielten aber Kupfer. Der Anteil im bakteriel− len Protein betrug ungefähr zwei Drittel des Wildtypproteins, im Protein pflanzlichen Ursprungs sank der Anteil auf etwa ein Drittel (vgl. Tab. 4.2). Die Thiolgruppe des Cysteins ist somit wohl kein dauerhafter Bestandteil der Koordination des Metalls. Dies steht in Einklang mit den in dieser Arbeit erstmals gezeigten direkten Interaktionen des Cysteins der PAPS−Reduktase mit einer Thiolgruppe des Glutaredoxins (vgl. 3.2.1.4.2). Im Gegensatz zu den Proteinen in denen nur das Cystein mutagenisiert wurde, behielt die PAPS−Reduktase, bei der das Cystein und das Histidin des ECGLH−Clusters vertauscht wurden (EHGLC), einen großen Teil (76 %) der Aktivität des Wild− typproteins. Möglicherweise bilden das Histidin und das Glutamat einen Teil der Koordination des Kupferions, während der Schwefel des Cysteins transient mit dem Metall interagiert, wobei ihm auch in dieser Position die Möglichkeit gegeben sein muss ein Disulfid mit dem Cystein des zwei− ten Monomers zu bilden, das dann durch ein Redoxin reduziert werden kann. Was kann die Funktion eines Kupferions in den Sulfonukleotid−Reduktasen sein? Gegen eine Rolle des Übergangsmetalls als Elektronendonor im Reaktionszyklus spricht das Redoxpotential des Cu+II von 153 mV in wässriger Lösung. Innerhalb von Proteinen ist dies in der Regel noch er− heblich positiver (~ 200 − 800 mV, Cowan, 1993). Demzufolge ist Kupfer in der Regel in Oxidasen vorzufinden. Mononukleare Typ 2−Kupferzentren, wie sie hier in den Sulfonukleotid−Reduktasen detektiert wurden, sind z.B. in Monooxygenasen wie den medizinisch relevanten Dopamin−β− Monooxygenasen enthalten, die mit Ascorbat als Elektronendonor und O2 als Substrat Sauerstoff in das organische Substrat integrieren (Übersicht in: Klinman, 1996). In der Galaktose−Oxidase, die die zwei Elektronen−Oxidation eines primären Alkohols zum Aldehyd gekoppelt an der Reduktion von O2 zu H2O2 katalysiert, ist die Funktion des Typ 2−Kupfers besonders gut untersucht (aktuelle Übersichten in: Whittaker, 1999; McGuirl und Dooley, 1999). Die aktive Form dieser Proteine

Diskussion

89

enthält, stark antiferromagnetisch gekoppelt, Cu+II und ein Radikal eines Tyrosinrestes, der über eine Thioether−Bindung mit einem Cysteinrest verbunden ist. In dieser Form, die keine EPR− Signale hervorbringt, wird der Hydroxy−Sauerstoff des Substrates vom Cu+II gebunden. Nach dem Transfer eines Wasserstoffs vom Substrat−Kohlenstoff zur Hydroxylgruppe des Thyrosins oxidiert das Cu+II das Substrat zum Aldehyd und wird selber zum Cu+I reduziert. Die Regeneration des Ausgangszustands erfolgt dann durch Reduktion von O2 zum H2O2. (Whittaker und Whittaker, 1993; Wang et al., 1998). Unter den bekannten Proteinen mit Typ 2−Kupferzentrum überträgt nur die Gruppe der kupferhaltigen dissimilatorischen Nitrit−Reduktasen Elektronen nicht auf Sauer− stoff, sondern auf Stickstoff (Übersicht in: Averill, 1996). Diese Enzyme katalysieren die Reduk− tion von NO2− zu NO und H2O. Das katalytische Zentrum dieser Proteine bildet ein Typ 2−Kupfer, das von 3 Histidinen koordiniert wird. Das Kupfer bindet als Cu+I den Stickstoff des NO2− und wird nach der Reduktion des Substrates zum Cu+II oxidiert. In der reduzierten Form der Sulfonukleotid−Reduktasen liegt das Kupfer reduziert als Cu+I vor. Nach Reduktion des Sulfonukleotides ist auch das Kupfer zum Cu+II oxidiert (vgl. 3.5.1). Es gibt aber bislang keine Hinweise auf eine Beteiligung beim Elektronentransfer. Möglicherweise ist die Funktion des Kupfers in der Stabilisierung von Übergangszuständen zu suchen. Eine solche Funk− tion besitzt häufig Zn+II in Hydrolasen, so z.B. in der Carboxypeptidase A, wo es negativ geladene Intermediate stabilisiert, oder in der alkalischen Phosphatase, wo 2 Zinkmoleküle intermediär das Phosphat binden (Übersicht in: Cowan, 1993). Auch Kupfer kann eine solche Funktion als Lewis− Säure einnehmen. Die 2 Elektronen der Sulfat−Reduktion stammen aus den 2 Thiolgruppen des ECGLH−Clusters. Da die Elektronen während der Sulfonukleotid−Reduktion einzeln auf das Sulfat übertragen werden, müssen radikalische Intermediate des Thiol− und des Substrat−Schwefels auf− treten. Möglicherweise dient das Kupfer als Hilfsligand zur Stabilisierung eben dieser Übergangs− zustände. Die beobachtete Oxidation des Kupfers während der Reduktion könnte mit dem in der C. roseus APS−Reduktase gemessenen organischen Radikal zusammenhängen, dessen Spin mit einem Metall gekoppelt ist (vgl. 3.5.1). Dieses Elektron könnte vom Kupfer selber stammen und nach Reduktion des Proteins wieder auf das Metall zurückübertragen werden. Zukünftige Untersuchun− gen werden die genaue Funktion des Kupfers klären müssen. 4.1.7.2 Eisen in den Sulfonukleotid−Reduktasen aus C. roseus und B. subtilis Die Sulfonukleotid−Reduktasen aus C. roseus und B. subtilis enthalten Eisen in einem stöchiome− trischen Verhältnis von 1:1 bzw. ¼:1 (vgl. Tab. 4.2), was die Existenz von mononuklearen Eisen− Zentren nahelegt. Das Eisen liegt in der oxidierten Form des Proteins fast vollständig als High− Spin−Fe+III vor. Während es in der durch DTT reduzierten, aktiven Form der APS−Reduktase aus C. roseus zum größten Teil als Fe+II vorliegt, bleibt es in der enzymatisch inaktiven Form der Sul−

Diskussion

90

fonukleotid−Reduktase aus B. subtilis auch nach Reduktion durch DTT und Thioredoxin in der Fe+III−Form. Für das bakterielle Enzym konnte nur eine Resonanz bei g = 4.27 in der EPR−Spek− troskopie aufgelöst werden. Das pflanzliche Protein beinhaltete Resonanzen bei g = 4.28 und 8.9 sowie eine sehr kleine Schulter bei g = 6.46. Die deutliche Resonanz bei g = 8.89 zeigt an, dass das Metall einen definierten Bindungsplatz im Protein einnimmt. Beide Enzyme sind gelb, wenn sie enzymatisch aktiv sind. Bei beiden nimmt die Intensität der gelben Farbe nach Reduktion der Pro− teine zu. Ein Verlust der chromophoren Eigenschaften geht bei beiden Proteinen mit dem Verlust der enzymatischen Aktivität einher. Die APS−Reduktase aus C. roseus enthält eine Absorptions− bande bei 344 nm, die nach Reduktion auf 341.5 nm verschoben wird. Das B. subtilis Protein hat in der oxidierten und der reduzierten Form eine Absorptionsbande bei 330 nm, in der reduzierten Form zusätzlich bei 414 nm. Die C. roseus−APS−Reduktase enthält in der Differenz der reduzier− ten gegenüber der unbehandelten Probe Absorptionsbanden bei 320, 425 und 505 nm, das B. sub− tilis−CysH1−Protein bei 320, 424 und 514 nm. Tabelle 4.3: Spektroskopische Eigenschaften des Eisen−Kofaktors der Sulfonukleotid−Reduktasen aus B. subtilis und C. roseus Protein

§

Absorptionsbanden

Absorptionsbanden der

EPR (Eisen)

Differenz red.−ox.

ox.

nm

nm

g−Werte

C. roseus−Par2

344 (red.→ 341.5)

320, 425, 505

8.89, (6.46), 4.28

B. subtilis−CysH1

330, (red. + 414)

320, 424, 514

4.27§

Dieser Wert stammt aus einer Messung mit enzymatisch inaktivem Protein.

EPR− und Absorptions−Spektren dieser Form sind bislang für kein Protein aus einem euka− ryotischen Organismus beschrieben worden. Die gemessenen Absorptionsbanden sind zumindest zum Teil typisch für Fe−S Ladungstransfers (Übersicht in: Holm et al., 1996). Die Absorptions− spektren zeigen demzufolge Ähnlichkeiten mit Proteinen, die [Fe2S2]− oder [Fe4S4]−Cluster ent− halten (Übersichten in: Beinert, 1990; Beinert et al., 1997). In diesen Proteinen liegt Eisen aber nicht in der High−Spin−Form vor. Die größten Übereinstimmungen in den EPR−Spektren zeigen die eisenhaltigen Sulfonukleotid−Reduktasen mit bakteriellen Rubredoxinen und Desulforedoxinen (vgl. Tab. 4.4). Diese bilden mit einem [Fe(Cys)4]−Cluster die einfachste Form der Schwefel−Ei− sen−Proteine (Beinert et al., 1997). Die Rubredoxine (~ 6 kDa) koordinieren das mononukleare Eisen mit den Thiolgruppen von 4 Cysteinen, die in der Regel in 2 CxxC−Clustern (CxxC...CxxC) vorliegen in einer tetrahedralen Geometrie (Sieker et al., 1994, vgl. Abb. 36, A). Die Desulforedoxine (~ 8 kDa) komplexieren das Metall in einer verzerrt tetrahedralen Geometrie mit 4 Cysteinresten, die in Form eines CxxC...CC−

Diskussion

91

Motivs vorliegen (Abb. 36, B, Archer et al., 1995). Durch

Mutagenese

kann

ein

Desulforedoxin−

[Fe(Cys)4]−Zentrum bezüglich seiner spektroskopi− schen Eigenschaften in ein Rubredoxin−[Fe(Cys)4]− Zentrum umgewandelt werden (Yu et al., 1997). So− wohl für Rubredoxine (u.a. Bau et al., 1998; Bertini et al., 1998) als auch für Desulforedoxine (Archer et al., 1995) liegen experimentell ermittelte Strukturen sehr hoher Qualität vor. Die Funktion dieser Proteine ist weitgehend unbekannt. Für das Rubredoxin aus Chlo− robium tepidum konnte gezeigt werden, dass es als

Abbildung 36: Koordination des Eisens in einem Rubredoxin (A, PDB: 1rb9, inkl. der H−Atome) und einem Desulfo− redoxin (B, 1dxg)

Elektronen−Akzeptor der Pyruvat−Ferredoxin−Oxi− doreduktase dient (Yoon et al., 1999). Es wird allgemein angenommen, dass diese Proteine als Elektronen−Carrier in Redox−Reaktionen dienen. Tabelle 4.4: Spektroskopische Eigenschaften einiger Rub− und Desulforedoxine Protein

Absorptionsbanden

EPR (Fe+III)

nm

g−Werte

1

Rubredoxin Butyribacterium methylotrophicum (ox.) 350, 378, 492, 570

9.1, 4.31

Rubredoxin Clostridium thermoaceticum2 (ox.)

375, 490, 585

9.34, 4.74, 4.32

Rubredoxin Desulfovibrio desulfuricans3 (nativ)

350, 380, 480, 575

9.94, 8.73, 5.3, 4.28

370, 492, 570, 774

9.68, 4.32

370, 506

8.9, 7.7, 5.7, 4.1, 1.8

4

Rubredoxin Chlorobium tepidum (ox.) Desulforedoxin Desulfovibrio gigas5,6 (ox.) 1

2

3

4

5

Saeki et al., 1989, Yang et al., 1980, LeGall et al., 1998, Yoon et al., 1999, Moura et al., 1980, 6 Czaja et al., 1995

In ihrer Primärstruktur zeichnen sich die gelben Sulfonukleotid−Reduktasen gegenüber dem Enzym ohne Eisen durch 4 zusätzliche Cysteine aus, die in Form eines CC...CxxC−Motivs vor− kommen (vgl. 4.1.8 und Anhang 2). Wie die Modellierung der Struktur der C. roseus Sulfonu− kleotid−Reduktasen ergab, stehen sich diese beiden Cystein−Cluster mit sehr hoher Wahrschein− lichkeit direkt gegenüber. Die bei der APS−Reduktase gemessenen EPR−Signale belegen eine te− trahedrale Geometrie der Eisen−Komplexierung. Die Lage der Thiolgruppen zueinander würde unter Beachtung des Modellcharakters der Strukturen die tetrahedrale Komplexierung eines Metalls durch die CC...CxxC−Thiole möglich machen, wie dies in den Rub− und Desulforedoxine ver− wirklicht ist (vgl. Abb. 26 und Abb. 36).

Diskussion

92

Die eisenhaltige Sulfonukleotid−Reduktase aus B. subtilis katalysiert die gleiche Reaktion wie das Enzym aus E. coli ohne Eisen mit dem gleichen Substrat und dem gleichen Elektronendonor, was eine Funktion des Eisens in der Redoxreaktion unwahrscheinlich erscheinen lässt. Die Funk− tion eines Eisen−Schwefel−Clusters muss aber nicht immer in der Beteiligung an Redoxreaktionen liegen (Übersicht in: Flint und Allen, 1996). Das Eisen scheint für diese Proteine trotzdem essen− tiell zu sein, da ein Ausbleichen der Proteine durch Verlust des Eisens mit dem Verlust der Aktivi− tät verbunden ist. Möglicherweise besitzt das Eisen strukturelle Bedeutung. Die putative Lage des Metalls am Anfang der langen geknickten Helix (bei E. coli: 7a) könnte die Ausformung des Teils der Struktur des aktiven Zentrums beeinflussen, der vermutlich bei E. coli an der Bindung des Pu− rinringsystemes beteiligt ist (vgl. 3.2.1.2). Vor diesem Hintergrund ist es interessant anzumerken, dass alle bislang untersuchten Enzyme mit dem Eisenbindungsmotiv APS reduzieren können und alle die dieses nicht beinhalten, nur PAPS als Substrat verwenden können. Das stöchiometrische Verhältnis des Eisens zur APS−Reduktase aus C. roseus beträgt ungefähr 1:1, die Absorptionspektren und die reproduzierbaren High−Spin−Fe+III−EPR−Signale sprechen für eine spezifische Komplexierung des Metalls durch Thiole in einem [Fe(Cys)4]−Cluster in den gel− ben Sulfonukleotid−Reduktasen. Es existieren eine Reihe von weiteren Sulfonukleotid−Reduktasen, die wie die hier untersuchten gelben Formen aus C. roseus und B. subtilis das putative Eisenbin− dungszentrum CC...CxxC in ihrer Primärstruktur enthalten (Übersicht in 4.1.8). Von diesen wurde auch die APS−Reduktase aus Lemna minor, leider ohne detailierte Angaben, als gelb beschrie− ben (Suter et al., 2000). Weitere Hinweise auf Eisen in Sulfonukleotid−Reduktasen in der Literatur gibt es bislang nicht. Die hier erzielten Ergebnisse, auch vor dem Hintergrund der erst in hohen Protein−Konzentrationen sichtbaren chromophoren Eigenschaften, lassen aber vermuten, dass es noch wesentlich mehr unentdeckte eisenhaltige Sulfonukleotid−Reduktasen gibt. 4.1.7.3 Relevanz der vorgestellten Ergebnisse vor dem Hintergrund einer möglichen Beteiligung von Metallen bei der Reaktion Im Rahmen dieser Arbeit wurden enzymatische und biophysikalische Untersuchungen der Sulfo− nukleotid−Reduktasen durchgeführt, die der Bestimmung von Substratspezifitäten und Enzym− Konstanten dienten, thermodynamische Eigenschaften sowie die Funktion einzelner Aminosäuren klären sollten. Müssen diese Ergebnisse vor dem Hintergrund einer möglichen Beteiligung von Metallen neu bewertet werden? Werden die Metalle als essentielle Bestandteile der Proteine angesehen, wofür es deutliche In− dizien gibt, so können die Proteine mit Metall−Kofaktor als Holo− und die ohne als Apo−Enzyme angesehen werden. Die Ergebnisse einer kinetischen Untersuchung sind nur teilweise von der ge− nauen Kenntnis der Holo−Enzym−Konzentration abhängig. Dies betrifft in erster Linie die ermit−

Diskussion

93

telten Reaktionsgeschwindigkeiten. Die hieraus abgeleiteten Enzym−Konstanten und Reaktions− mechanismen sind aus der Theorie der Enzymkinetik folgend unabhängig von der Enzymkonzen− tration, solange die Enzymmenge ein limitierender Faktor der Reaktion bleibt (Übersichten in: Segel, 1993; Bisswanger, 1994). Die gegenüber den Substraten erheblich niedrigere Konzentration der Enzyme schließt auch Verfälschungen der Ergebnisse durch die Erniedrigung der Substrat− Konzentration auf Grund transient oder stabil gebundener Substrate im Apo−Enzym aus. Somit behalten mit Ausnahme der maximalen Reaktionsgeschwindigkeiten alle ermittelten Parameter ihre Gültigkeit. Vergleichende Aussagen zur Effizienz oder Reaktionsgeschwindigkeit bleiben dann gültig, wenn sie mit Enzymen von vergleichbarer spezifischer Aktivität ermittelt wurden, was in jedem der hier beschriebenen Fälle zutraf. Die Bestimmung des Redoxpotentials der PAPS−Reduktase wurde mit einem Protein durchge− führt, das größtenteils als kupferfreies Apo−Enzym vorlag. Die Untersuchungen betrafen die thermodynamischen Eigenschaften der als Elektronendonatoren identifizierten Thiolgruppen des Proteins. Bislang gibt es keine Hinweise auf eine direkte Beteiligung der Metalle beim Elektro− nentransfer in den Proteinen (s.o.). Das hier vorgestellte Redoxpotential dieses Cystein−Paares be− stimmt dann auch die Redoxeigenschaften des Enzymdimers. Sofern sich die Metalle in Zukunft nicht als fakultative Kofaktoren mit modulierenden Eigen− schaften herausstellen, behalten die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse mit den genannten kleinen Einschränkungen ihre Gültigkeit. 4.1.8 Phylogenie der Sulfonukleotid−Reduktasen Die Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen teilt sich bezüglich ihrer Primärsequenzen in zwei große Gruppen auf (Abb. 37). Dies sind zum einen die „klassischen“ PAPS−Reduktasen mikro− biellen Ursprungs und zum anderen die Sulfonukleotid−Reduktasen, die N−terminal vom Konsen− sus−Motiv ECG(L/I)H 4 weitere Cysteine in den Clustern CC und CxxC besitzen. Die letztere Gruppe unterteilt sich weiter in bakterielle Proteine ohne und pflanzliche Proteine mit einer C− terminalen Extension, die homolog zu den Proteinen der Thioredoxin−Familie ist. Funktionell können die Proteine in drei Gruppen eingeteilt werden. Dies sind zum ersten Pro− teine die Thioredoxin−abhängig PAPS reduzieren, zum zweiten Proteine die Thioredoxin−abhängig APS reduzieren und zum dritten Proteine die Glutathion−abhängig APS reduzieren. Alle Proteine ohne die C−terminale Extension benötigen Trx als Elektronendonor, alle mit dieser Extension können GSH als Elektronenlieferanten nutzen. Die Primärstrukturgruppe der Proteine mit C−ter− minaler Trx−ähnlicher Extension und die funktionelle Gruppe der GSH:APS−Reduktasen fallen vollständig zusammen. Alle bislang enzymatisch untersuchten Vertreter der Sulfonukleotid−Re− duktasen ohne diese Extension und ohne die zusätzlichen Cystein−Cluster N−terminal vom

Diskussion

94

Abbildung 37: Radiales Dendrogramm der Proteine der Sulfonukleotid−Reduktase−Familie A: Mikrobielle PAPS−Reduktasen, B: Bakterielle Sulfonukleotid−Reduktasen mit 4 zusätzlichen Cysteinen, C: Pflanzliche APS−Reduktasen. Von den bekannten Isoformen der APS−Reduktasen aus A. thaliana wurden exemplarisch nur 2 aufgeführt (Prh19: Genbank AAC49561, Prh43: AAC49563), Allium cepa (AAF18999), Allochromatium vinosum (AAF27544), Aspergillus nidulellus (P56859), Aspergillus terreus (AAF28889), Bacillus halodurans (BAB05205), B. subtilis (CysH1: P94498, CysH2: O06737), Brassica juncea (CAA04611), Buchnera aphidicola (P57501), Burkholderia cepacia (AAD50979), C. roseus (T10065), Caulobacter crescentus (AAK23105), Deinococcus radiodurans (P56860), Enteromorpha intestinalis (AAC26855), E. coli (P17854), Lemna minor (CAB65911), Mesorhizobium loti (NP_104381), Mycobacterium tuberculosis (P71752), Neisseria meningitidis (AAF41541), Penicillium chrysogenum (AAG24520), Plectonema sp. (AAF23174, Teilsequenz), Pseudomonas aeruginosa (O05927), Rhizobium tropici (O33579), Saccharomyces cerevisiae (NP_015493), Salmonella typhimurium (P17853), Schizosaccharomyces pombe (Q10270), Sinorhizobium meliloti (P56891), Streptomyces coelicolor (CAC33945), Sulfolobus sulfataricus (CAC23977), Synechococcus PCC7942 (Q55309), Synechocystis PCC6803 (P72794), Thiocapsa roseopersicina (P52672), Vibrio cholerae (D82329), Xylella fastidiosa (AAF84306).

ECG(L/I)H aus E. coli (Krone et al., 1991), Saccharomyces cerevisiae (Schwenn et al., 1988) und Thiocapsa roseopersicina (Haverkamp und Schwenn, 1999) reduzieren Trx−abhängig PAPS und fallen damit in diese Funktionsgruppe. Die bisher untersuchten Vertreter der Gruppe mit den Cy− stein−Clustern aus der Familie der Rhizobiaceae (Abola et al., 1998) und aus Pseudomonas aeru− ginosa (Bick et al., 1999) reduzieren mit hoher Spezifität Trx−abhängig APS. Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Protein CysH1 aus B. subtilis ist das erste enzymatisch charakterisierte Enzym, welches mit vergleichbaren Umsatzraten APS und PAPS reduziert. Zugleich ist es das erste Enzym der Primärstrukturgruppe der Sulfonukleotid−Reduktasen mit den zusätzlichen Cystein−

Diskussion

95

Clustern, das PAPS reduzieren kann. Das Vorhandensein des putativen Eisen−Bindemotivs CC...CxxC ist somit nicht zwangsläufig an eine Funktion als APS−Reduktase gebunden. Diese Entdeckung macht es sehr zweifelhaft Proteine der Sulfonukleotid−Reduktase−Familie alleine durch Analyse ihrer Primärsequenz einem funktionellen Typ zuzuordnen, wie dies z.B. für das Protein aus Allochromatium vinosum getan wurde (Neumann et al., 2000). Die Einteilung der Sulfonukleotid−Reduktasen gemäß ihrer Primärstruktur−Ähnlichkeit oder ihrer Funktion steht größtenteils im Widerspruch zur systematischen Stellung der Organismen, aus denen ihre Gene isoliert wurden. So zählt das Protein aus dem Schwefelbakterium Thiocapsa ro− seopersicina (Haverkamp und Schwenn, 1999) zu den Proteinen ohne die Cystein−Cluster, wäh− rend das Protein aus Allochromatium vinosum (Neumann et al., 2000) diese Cysteine enthält. Beide gehören systematisch zur Familie der Chromatiaceae. Die bislang identifizierten Gene aus den Cyanobakterien Synechocystis PCC6803 (Kaneko et al., 1996) und Synechococcus PCC7942 (Niehaus et al., 1992) kodieren ebenfalls für Enzyme ohne die CC...CxxC−Cysteine und stehen somit nicht in der Nähe der pflanzlichen Enzyme. Mit denen weist außerhalb der Pflanzen das Protein aus dem Proteobakterium Pseudomonas aeruginosa die größte Identität auf. Mit einer Teilsequenz aus Plectonema sp. (unveröffentlicht) existieren aber auch erste Hinweise für cyano− bakterielle Sulfonukleotid−Reduktasen mit den 4 zusätzlichen Cysteinen. Die Primärstruktur−Ähnlichkeiten anderer Proteine der Sulfatassimilation entsprechen weitge− hend den phylogenetischen Stellungen der Organismen aus denen sie stammen. So wurde für die Fd:Sulfit−Reduktase aus A. thaliana eine eindeutige phylogenetische Verwandtschaft mit den En− zymen aus Cyanobakterien festgestellt, was eine Herkunft gemäß der Endosymbiontentheorie na− helegt (Gisselmann et al., 1993; Brühl et al., 1996). Ähnliches kann auch für die APS−Kinasen und ATP−Sulfurylasen gesagt werden. Der Ursprung und die phylogenetischen Zusammenhänge der Sulfonukleotid−Reduktasen geben demgegenüber Rätsel auf. Möglicherweise führten analoge Prozesse zu dem aktuellen Bild, aber auch der Prozess des horizontalen Gentransfers kann nicht ausgeschlossen werden. Viele der dem pflanzlichen Typ ähnliche Proteine stammen aus Organis− men, die in der Rhizosphäre beheimatet sind und zu deren näherer Verwandtschaft Vertreter zählen wie Agrobacterium aus der Familie der Rhizobiaceae, die Erbinformationen auf Pflanzen übertra− gen können. 4.1.9 Ausblick In dieser Arbeit wurden Ergebnisse vorgestellt und diskutiert, die zahlreiche Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen liefern. Die präsentierten Ergebnisse belegen erstmals die Existenz von Kofaktoren in den assimilatorischen Sulfonukleotid−Reduktasen. Sie enthalten wahrscheinlich alle ein Typ 2−Kupferzentrum und ein Teil von ihnen zusätzlich einen [Fe(Cys)4]−Cluster. Das Kup−

Diskussion

96

ferzentrum kann zur Zeit keinem bis heute publizierten Reaktionstyp für Typ 2−Kupferproteine zugeordnet werden. Möglicherweise liegt seine Funktion in der Stabilisierung von Übergangszu− ständen. Die Eisenzentren der gelben Sulfonukleotid−Reduktasen zeigen große Ähnlichkeiten mit denen der Desulforedoxine. Diese Proteine stammen aus Organismen wie Desulfovibrio, die zu den dissimilatorischen Sulfatreduzierern zählen und Sulfat anaerob mit einer Eisen−Schwefel−Flavo− APS−Reduktase zur Energiegewinnung reduzieren. Hier schließt sich in übertragenem Sinne ein Kreis zur assimilatorischen Reduktion des aktivierten Sulfates. Es wurden die Grundlagen ge− schaffen, auf deren Basis zukünftige Untersuchungen die Funktion der Metalle und Radikale in den Sulfonukleotid−Reduktasen klären können. Der Einsatz weiterer physikalischer Techniken wird hierbei hilfreich sein. Die Charakterisierung des Eisenzentrums in den vorgestellten gelben Enzy− men mit Hilfe der Mössbauer−Spektroskopie, an Proteinen in denen das Eisenisotop

57

Fe ang−

reichtert wird, ist bereits in Planung und wird in Kürze durchgeführt werden. Die weiterführenden Untersuchungen werden zeigen, ob hier das Tor zu einer neuen Klasse von radikalischen Metallo− enzymen aufgestoßen wurde. Strukturelle Informationen über weitere Mitglieder der Sulfonukleotid−Reduktasen könnten wichtige Beiträge zum Verständnis der Mechanismen dieser Enzyme leisten. Aber auch der hier begonnene biochemische Vergleich der thermodynamischen Eigenschaften, der Mechanismen und der Substratspezifitäten der drei Enzymgruppen kann in Zukunft helfen, die Gemeinsamkeiten und Differenzen dieser Enzyme noch besser verstehen zu lernen. Die Untersuchung von Proteinen, wie dem Bacillus subtilis−Protein CysH1 mit APS− und PAPS−Reduktase−Aktivität könnten dabei als Ausgangspunkt dienen. Auch außerhalb der Untersuchung der Sulfonukleotid−Reduktion wird das Forschungsgebiet rund um das aktivierte Sulfat sicher ein spannendes Feld bleiben. Bis heute ist unklar wie Orga− nismen die APS zur Assimilation des Schwefels reduzieren, bei den gegebenen thermodynamischen Beschränkungen, einen substantiellen Stofffluss zum Sulfit und weiter zum Sulfid gewährleisten können. Die Funktion einer APS−Kinase in diesen Organismen und damit die Rolle des PAPS wird geklärt werden müssen. Die PAPS−abhängige Sulfatierung als Signal zur Modulation und Steue− rung biologischer Prozesse rückt hierbei aktuell immer stärker in den Mittelpunkt des Interesses.

Zusammenfassung

97

5 Zusammenfassung Anorganisches Sulfat wird zur Assimilation in aktivierter Form als Adenylyl− (APS) und Phospho− adenylylsulfat (PAPS) von Enzymen zu Sulfit reduziert, die in der vorliegenden Arbeit als Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen definiert wurde. Diese Familie enthält drei Gruppen von Enzymen, die strukturell ähnlich sind, sich aber in ihrer Substratspezifität unterscheiden. Dabei erkennt man: Thioredoxin/Glutaredoxin:PAPS−Reduktasen 

Thioredoxin:PAPS/APS−Reduktasen und 



GSH:APS−Reduktasen

Als Grundlage für die Definitionen wurden im Einzelnen folgende katalytische, molekulare und strukturelle Eigenschaften zusammengestellt. Trx/Grx:PAPS−Reduktasen: Die PAPS−Reduktase aus E. coli reduziert ausschließlich 3´5´PAPS und wird spezifisch durch das Produkt 3´5´PAP gehemmt. Der Mechanismus der Produkthemmung wurde als „linear mixed−type“ identifiziert. Mit Hilfe rechnergestützter Vorhersagen der Struktur des Enzym−Substrat−Komplexes wurde gezeigt, dass die Konformation der Ribose im Substrat PAPS im Vergleich zum APS die Ursache der Substratspezifität sein kann. Die PAPS−Reduktase ist obligat auf Thio− oder Glutaredoxin als Elektronendonor angewiesen. Diese Gruppe der Sulfonukleotid−Reduktasen enthält keinen Chromophor. Das redoxaktive Zentrum wird durch zwei Cysteine des homodimeren Proteins im [ECGLH]−Motiv gebildet. Durch Verwendung eines mutagenisierten Glutaredoxins konnte gezeigt werden, dass das Disulfid des katalytischen Zentrums des oxidierten Enzym−Dimers direkt vom Redoxin reduziert wird. Die PAPS−Reduktase durchläuft redoxabhängige und durch Substratumsatz induzierte Konformationsänderungen. Mit Hilfe der Absorptionsdifferenz−Spektroskopie von reduzierten und oxidierten Formen konnte der Redoxzustand des Enzyms gemessen werden. Das Standard−Redoxpotential der redoxaktiven Cysteingruppe des Proteins wurde mit E0´ = −162 mV bestimmt. Das Potential des Enzyms reiht sich damit zwischen dem seiner Reduktanden und dem seines Substrates PAPS ein. Durch Atomabsorptions− und EPR−Spektroskopie konnte in der PAPS−Reduktase Kupfer nachgewiesen werden, das im Protein als Typ 2−Kupferzentrum vorliegt. Die Cu+II−EPR−Signale konnten durch Umsatz des Substrates PAPS induziert werden. Eine Erhöhung des Kupferanteils im Protein bewirkte eine Erhöhung der spezifischen Aktivität um das 3.5fache auf Kcat = 13.3 s−1 gegenüber vormals 3.8 s−1 (Lillig et al., 1999).

Typ 2−Kupferzentrum L = N−, O− oder S−Ligand

Zusammenfassung

98

Trx:PAPS/APS−Reduktasen: Das aus dieser Gruppe untersuchte Protein aus Bacillus subtilis ist das erste charakterisierte Enzym aus der Familie der Sulfonukleotid−Reduktasen, das APS und PAPS mit nahezu identischen Umsatzraten reduzieren konnte. Es war wie die Enzyme der ersten Gruppe auf Thioredoxin als Elektronendonor angewiesen. In der Primärstruktur unterscheiden sich diese Enzyme von der ersten Gruppe durch den Besitz von 4 zusätzlichen Cysteinen in einem CC− und einem CxxC−Cluster. Die Untersuchungen zeigten, dass dieses Enzym ein gelbes Chromophor enthält, das spektroskopisch als High−Spin−Eisen+III identifiziert wurde. In diesem Typ der Reduktase wird das Fe vermutlich von den CC...CxxC−Cysteinseitenketten in Form eines [Fe(Cys)4]−Komplexes gebunden. Auch das Bacillus subtilis−Protein enthielt Kupfer mit den Charakteristiken eines Kupfer−Typ 2−Zentrums. GSH:APS−Reduktasen: Diese Gruppe enthält die aus Pflanzen isolierten Sulfonukleotid− Reduktasen. Sie besitzen gegenüber den übrigen Sulfonukleotid−Reduktasen eine C−terminale Extension mit Homologien zu Thio− und Glutaredoxinen. Die Enzyme reduzieren ausschließlich APS und können die hierfür notwendigen Elektronen von Monothiolen wie Glutathion, aber nicht von Thioredoxinen erhalten. Proteine dieser Gruppe enthalten ebenfalls die CC...CxxC− Cysteinseitenketten, wie die PAPS/APS−Reduktasen des Bacillus−Typs. Entgegen früheren Messungen konnte gezeigt werden, dass auch das Enzym aus Catharanthus roseus eine gelbe prosthetische Gruppe enthält, die wie im Bacillus subtilis−Enzym vermutlich ein [Fe(Cys)4]− Cluster ist. Auch das Pflanzenprotein enthielt das putative Typ 2−Kupferzentrum und zusätzlich in der oxidierten Form ein stabiles organisches Radikal. In allen drei Enzymen sind das redoxaktive Zentrum [ECGLH], das Typ 2−Kupfer und ein Arginin konserviert, das vermutlich in unmittelbarer Nähe zum Phosphosulfat liegt. Als Mechanismus der Reduktion durch eine katalytische Triade aus dem Cystein, dem Arginin und dem Kupfer wird vorgeschlagen, dass die Guanidinogruppe des Arginins den Brückensauerstoff der Phosphosulfat− Bindung durch Protonierung destabilisiert. Durch transiente Komplexierung der Übergangszustände und Destabilisierung einer S::O−Bindung im Sulfat durch das Kupfer, könnte der zentrale Sulfatschwefel für den nukleophilien Angriff des Thiolats und die Übertragung der Elektronen vorbereitet werden. Die Funktion des Histidins und des Glutamats im [ECGLH]−Motiv könnten dabei in der Komplexierung des Kupfers liegen. Welche Rolle das Eisen in den gelben Sulfonukleotid−Reduktasen spielt, möglicherweise die Stabilisierung einer Struktur oder auch die eines Übergangszustands, muss sich in zukünftigen Untersuchungen zeigen.

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Anhang

Anhang 1

Anhang

Anhang 2 Primärstrukturvergleich der Sulfonukleotid−Reduktasen aus Catharanthus roseus (C.r. par4, Gen− bank: T10065), Arabidopsis thaliana (A.t. prH26, T49106), Bacillus subtilis (B.s. CysH1, P94488) und Escherichia coli (E.c. CysH., P17854). Die Sekundärstrukturen des C. roseus Proteins (PHDsec par4) wurde mit PHDsec (vgl. 2.10.2) vorhergesagt, die des E. coli Proteins (DSSP 1sur) wurden mit DSSP aus der Tertiärstruktur abgeleitet (vgl. 2.10.4). Der Pfeil markiert die putative Spaltstelle für das plastidäre Transitpeptid (nach Prior et al., 1999).

Anhang

Veröffentlichungen Lillig, C.H., Prior, A., Schwenn, J.D., Åslund, F., Ritz, D., Vlamis−Gardikas, A. und Holmgren, A. New thioredoxins and glutaredoxins as electron donors of 3´phosphoadenylylsulfate reductase. J. Biol. Chem. 274: 7695−7698 (1999) Prior, A., Uhrig, J.F., Heins, L., Wiesmann, A., Lillig, C.H., Stoltze, C., Soll, J. und Schwenn, J.D. Structural and kinetic properties of adenylyl sulfate reductase from Catharanthus roseus cell cultures. Biochim. Biophys. Acta 1430: 25−38 (1999) Lillig, C.H., Schiffmann, S., Berndt, C., Berken, A., Tischka, R. und Schwenn, J.D. Molecular and catalytic properties of Arabidopsis thaliana adenylylsulfate−(APS)−kinase. Arch. Biochem. Biophys. − zur Veröffentlichung angenommen Lillig, C.H., Jacquot, J.P., Meyer, Y. und Schwenn, J.D. Redox−properties and substrate specifity of thioredoxin/glutaredoxin:PAPS reductase from Escherichia coli. zur Veröffentlichung eingereicht Teile dieser Arbeit wurden auf dem Kongress „Thioredoxins and related proteins − 5th international conference“ vom 19. − 22. Spetember 2000 in Smolenice in der Slovakischen Republik unter dem Titel „Lillig, C.H., Jacquot, J.P., Meyer, Y., Schwenn, J.D. Redox−properties and substrate specifity of thioredoxin/glutaredoxin:PAPS reductase from Escherichia coli“ in Form eines Posters vorgestellt.

Anhang

Lebenslauf Persönliches

Name Christopher Horst Lillig Geburt 27.06.1972 in Berlin Hochzeit 21.03.1998, Ehefrau: Nicole Lillig geb. Petzinna

Schulbildung

1978 − 1982 Pestalozzi Grundschule in Marl 1982 − 1991 Gymnasium im Loekamp, Marl Abschluss: Abitur, Note „sehr gut“

Studium

1991 − 1998 Studium der Biologie an der Ruhr−Universität Bochum Abschluss: Diplom, Note „sehr gut“ Hauptfach: Biochemie und Biophysik Nebenfächer: Mikrobiologie, Pharmakologie Thema der Diplomarbeit „Thioredoxine und Glutaredoxine als Elektronendonor der PAPS−Reduktase aus Escherichia coli“. Angefertigt am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Betreuer: PD Dr. J.D. Schwenn

Promotion

seit 05/1998 Anfertigung der Dissertation mit dem Thema „Die Reduktion des aktivierten Sulfates“ am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen unter der Betreuung von PD Dr. J.D. Schwenn. 06/1998 Aufnahme in das Graduiertenkolleg „Biogenese und Mecha− nismen komplexer Zellfunktionen“. Mitglied bis zum Auslaufen des Kollegs am 1.10.1999.

Fortbildung

Berufliche Tätigkeiten

9. − 13.03.1998 Teilnahme am Kurs „WHATIF“, zur Anwendung der Soft− ware in der Analyse und Modellierung von Proteinstrukturen unter der Leitung von Dr. G. Vriend am European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Heidelberg. 05/1995 − 03/1999 Dozent für Pharmakologie der Ausbildungsstätte für Medizin und Therapie AMT GmbH, Recklinghausen 05/1997 − 12/1997 Studentische Hilfskraft am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen 05/1998 − 04/2001 Wissenschaftlicher Mitarbeiter von PD Dr. J.D. Schwenn im Rahmen des DFG−Projektes „Struktur, Funktion und mole− kulare Biologie der Enzyme des Stoffwechsels anorganischer Schwefelverbindungen“