Dystrophin - Ruhr-Universität Bochum

Erbliche Muskelerkrankungen - Morbus Duchenne / Becker - Gliedergürtel-Muskeldystrophien

- Maligne Hyperthermie

Dystrophinopathien

Muskeldystrophie Duchenne Muskeldystrophie Becker Einschlusskörpermyopathie 2 Einschlusskörpermyopathie 3 Einschlusskörpermyopathie IBMPFD1 Einschlusskörpermyopathie IBMPFD2 Einschlusskörpermyopathie IBMPFD3 Envelopathien/Emery-Dreyfuss-Muskeldystrophien Emerinopathie; Laminopathie Gliedergürteldystrophien Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1A Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1B Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1C Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1D Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1E Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1F Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1G Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1H Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2A Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2B Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2C Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2D Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2E Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2F Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2G Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2H Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2I Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2J Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2K Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2L Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2M Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2N Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2O Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2P Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2Q Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2R Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2S Kardiomyopathien (>50 Formen) Dilatative Kardiomyopathie (MYBPC3) Dilatative Kardiomyopathie (LMNA) Dilatative Kardiomyopathie (SGCD) Kongenitale Myasthenien Kongenitale Myasthenie (MUSK) Kongenitale Myasthenie (RAPSN) >6 weitere Formen Kongenitale Myopathien Bethlem-Myopathie Fukuyama-MDC Muscle-Eye-Brain disease Walker-Warburg Syndrom Walker-Walker Syndrom Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1B Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1C Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1D Myotubuläre Myopathie Nemaline Myopathie 1 Nemaline Myopathie 2 Nemaline Myopathie 3 Nemaline Myopathie 4 Nemaline Myopathie 5 Nemaline Myopathie 6 Nemaline Myopathie 7 Nemaline Myopathie 8 Ullrich-Myopathie Myofibrilläre Myopathien Myofibrilläre Myopathie 1 Myofibrilläre Myopathie 2 Myofibrilläre Myopathie 3 Myofibrilläre Myopathie 4 Myofibrilläre Myopathie 5 Myofibrilläre Myopathie 6 Myotonien/Myot. Dystrophien Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1A Hypokaliämische periodische Paralyse 1 Hypokaliämische periodische Paralyse 2 Myotone Dystrophie 1 Myotone Dystrophie 2 Myotonia congenita Thomsen Paramyotonia congenita Proximale myotone Myopathie DM2/PROMM Myotonia congenita Becker Struktur-Myopathien Central-Core-Myopathie Multiminicore-Myopathie Maligne Hyperthermie 1-6 Rigid-Spine-Syndrom Weitere Muskeldystrophien Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie 1 Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie 2 Okulopharyngeale Muskeldystrophie Einschlusskörper-Myopathien

ad erbliche Muskelleiden

Pseudohypertrophie

Lordosis, scapulae alatae

Gower Manöver

DMD / BMD: klinische Aspekte DMD

BMD

• 1:3500 neugeborene Jungen • spätes Laufen, im 3.-5. LJ Symptome • Lebenserwartung 20 Jahre • progressive Skelettmuskel-Dystrophie • pseudohypertr. Waden, „Engelsflügel“ •  Creatinkinase im Blut • Herzmuskel affiziert, EKG! • 1/3 mentale Retardierung • glatte Muskulatur, Retina betroffen

• 1:35000 neugeborene Jungen • mildere Symptome, bes. frühkindl. • selten spätes Gehen lernen • >20 J.  Rennen, Treppensteigen • im mittleren Lebensalter Gehen  •  Creatinkinase im Blut • oft Lernprobleme • fertil

Dystrophin-Protein

DMD / BMD: „Selbstheilung“ durch alternative mRNAs ? alternative Dystrophin mRNAs: 1. alternative Promotoren

2. alternatives Spleißen 3. alternative Polyadenylierung

Dystrophin-Promotoren + -Isoformen

gesamt

B, Gehirn M, Muskel P, Purkinje-Zelle R, Retina S, Schwann-Zelle G, allgemein

Dystrophin + interagierende Proteine

Dp260 Dp140 Exon

ProteinHomologie

Dystrophin 427 kD

ab1

Dp116

ab2 ActinBindung

rod Domänen

ß-Dystroglycan/SyntrophinDp71 Bindung ab3

ab2 ab1

Dystrophinopathie Protein (427kD): 0.002 % der Muskelmasse Therapie DMD: symptomatisch,  simple Genersatz-Therapie

modifier Gen-Effekt Golden Retriever Muskeldystrophie

dystrophischer Zebrafisch

escaper

betroffen

Jagged 1 Überexpression

gesunder Zebrafisch escaper affiziert Chromos. 24

Jagged 1 Kandidatenregion

Dystrophinopathie Stammzell-Therapie

Gentherapie-Strategien chromosomale DNA

Gen-Ausbesserung mit Insertions- oder episomalen Vectoren  cDNA-Expression (µdystrophin or µUTRN)  zufällige Integration, geringe Transduktions-Effizienz

genomische DNA

prä-mRNA

reife mRNA

Genom-Editieren mit programmierbaren Nukleasen  target-spezifische Modifikation  unerforschte Verabreichungsform, off-target Mutagenese

exon skipping mit antisense Oligonukleotiden  systemische Verabreichung  transiente und Nebeneffekte

„mis-“Translation von Stopcodons

Protein

PTC124  read-through  systemische Verabreichung

PTC124 (Ataluren) + AON nonsense Mutationen  Translationsstop - Therapie: PTC124  read-through  Stop-Codon wird „fehl“-translatiert -  Dystrophin-Produktion in Zellkultur - verbesserte Muskelfunktion im Mausmodell - klinische Phase II-Studien Exon-skipping mit AON (antisense-Oligonukleotid) - klinische Studien fortgeschritten

Vor- und Nachteile viraler Vektoren bei DMD-Gentherapie Vektor

VerpackInfektion nicht- Hauptrisiko bei genGenombarkeitsteilungsfähiger therapeutischer Integration stabile Expression Limit Zellen Anwendung

Retrovirus

∼8 kb

ja

nein

Lentivirus

∼8 kb

ja

ja

Leukämie, Rekombination mit HIV

Herpes simplex virus

∼150 kb

nein

ja

Zytotoxizität + Immunogenität

Adenovirus (Helfer Virusabhängig)

∼30 kb

nein

ja

immunoges virales Capsid

ja

inhibiert mit neutralisierendem Antikörper

Adeno-assoz. Virus (AAV)

∼4 kb

nein

Leukämie

targeting vectors classic targeting vector

BAC targeting vector

Helper-dependent adenovirus targeting vector

AAV targeting vector

DSB-mediated targeting vector

piggyBac targeting vector

single-strand oligonucleotide (ssODN)

DSB: double strand break BAC: bacterial artificial chromosome AAV: adeno-associated virus TR: terminal repeat ITR: inverted terminal repeat

Vor-/Nachteile verschiedener Genommanipulations-Techniken programmierbare DNANuklease Erkennungsmotiv

Konstruktherstellung

Sequenztargetability

meganuclease

homing endonuclease LAGLIDADG motifs

sehr kompliziert

↓↓

ZFNs

Zinkfinger-Domänen

kompliziert

↓

TALENs

TAL effector RVD domain

relativ kompliziert ↑↑

CRISPR-Cas9

crRNA (DNA-RNA heteroduplex)

„einfach“

↑

ZFNs: Zinkfinger Nukleasen TALENs: Transcription activator-like effector nucleases TAL effector RVD: transcription activator–like effector repeat-variable diresidues CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat Cas9: CRISPR-associated 9 crRNA: CRISPR RNA

CRISPR-Cas9

CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat Cas9: CRISPR-associated 9 crRNA: CRISPR RNA tracrRNA: trans crRNA sgRNA: single guide RNA

Gentherapie + induz. pluripot. Stammzellen

Gen knockout

Gen repariert

reprogrammieren

somatische Zellen

Reporter-Zellen

differenzieren

iPS-Zellen

Zellmarkierung

Tiermodell

differenzierte Zellen

iPS: induzierte pluripotente StammGFP: grünes Fluoreszenz-Protein Luc: Luciferase

Medikamententests

ex vivo: induzierte pluripotente Stammzellen

DMD- / BMD-Diagnose DNA-Sequenzanalyse + MLPA, in situ Hybridisierung  Deletionen Proteinanalyse • Western blot

• Immunohistochemie RNA-Analyse • RT-PCR /arrays • Protein Truncation Test (PTT)  nonsense Mutationen

DMD / BMD: Genetik • X chromosomal rezessiv • Xp21; 2.3 Mb; 79 Exons

• 14 kb Transcripte; gewebsspezifische Isoformen • 1/3 Punktmutationen • 2/3 Deletionen/ Rearrangements/ Insertionen • 1/3 Neumutationen

DMD / BMD: Deletionen hotspot für Deletionen Intron 44 Exon 44

• Deletionen sehr variabel • DMD: meist Leserahmen • BMD: meist Leserahmen +

Dystrophin-Mutationen

Dystrophin-Genvariationen Variation

n=

Position 5‘ UTR

Substitution

http://www.dmd.nl/DMD_deldup.html; aktual. 11.4.2017

kodierend intron.

3‘UTR

20248

120

4000

15926

202

Deletion

2521

3

635

1668

215

Duplikation

2119

6

213

1541

359

Insertion

465

2

25

434

4

Insertion + Deletion

100

59

41

2 Variationen in 1 Allel

200

komplex + unbekannt

175



25828

2 131

4932

19612

780

DMD / BMD: Punktmutationen • BMD: meist missense Mutationen im N-/C-Terminus oder Punktmutationen in Spleissstellen ohne Leserahmenstörung • DMD: meist nonsense Mutationen (überall

im Gen verteilt) oder LeserahmenStörung durch Indel etc.

kompensatorische Proteine 

kompensator. Mechanismen + therapeut. Strategien

MembranStabilisatoren

DystroglycanGlykosylierung 

kompensator. Proteine 

Suppression des vorzeitigen Stopcodons (PTC 124)

AS-Ersatz

normal Stopkodon

ErsatzProtein

Spleißosom normales Protein

DMD-Deletion, trunkiert

Exon übersprungen

Spleißen Exon A

U 1

U 2

Intron 1

Exon A

sf

sf

U 1

Exon B

Exon B

Intron 2

U 2

Exon C

+

Exon C

Intron 1

Intron 2

Sso – mediated splice switching Exon A

U 1

Exon A

sf

Exon B

Intron 1

sso

Exon C

Mutation

+

Intron 2

Intron 1 sf

Exon B

U 2

sf

Exon C

M. Duchenne/Becker ♀♀    

1 : 50 000 000 unsymmetrische X-Inaktivierung 45X 2 Mutationen

 Konduktorin: Cardiomyopathie?

X-Chromosomen Inaktivierung Zygote

XpXm

XpXm

Xp

Xp

XpXm

Xm

Xm

Xm

Xm

frühe Teilungen

Xp

Xp

zufällige XInaktivierung Inaktivierungsmuster wird vererbt an alle Tochterzellen

Mosaik

t(X;4)(p21;q31)

Chr. 4

der(4)

X-Chr.

der(X)

Deletion / Duplikation + 1. MLPA

Deletion / Duplikation -

DMD StufenDiagnostik

DMD bestätigt, dann - ist Mutter Konduktorin? - multidisziplinäre Versorgung - DMD-Register

Mutation + 2. Sequenzieren best. Exons Mutation φ Dystrophinopathie

3. Dystrophin-Protein, Muskelbiopsie

normales Dystrophin-Protein

φ (normales) Dystrophin-Protein

DMD bestätigt, dann - multidisziplinäre Versorgung - optionale RNA-Analyse ? - DMD-Register

versch. Dystrophin-Mutationen verursachen… normal Start Translation

Translationsstop

Dystrophin mRNA wird in Dystrophin protein translatiert DMD Leserahmen-Mutation

prämature Translationsstops

Einbau falscher Aminosäuren nach Deletion und prämature Translations-Trunkation Nonsense-Mutation prämature Trunkation der Protein-Translation; Leserahmen ok M. Becker in frame-Mutation Translation bis zum natürlichen Stopcodon; intern verkürztes, teil-funktionelles Protein

versch. Dystrophin-Mutationen verursachen… Deletion eines oder mehrerer Exons (68%)

Duplikation eines oder mehrerer Exons (11%)

Punktmutationen (20%) Nonsense-Mutationen (10%)

kl. Insertions-/Deletions-Mutationen (10%)

Spleißstellen-Mutationen (3%)

Exon fehlt in mRNA

Conclusiones DMD / BMD Gendiagnostik komplex - meist definitive Ergebnisse Genanalysen  kausale Pathogenese besser verstanden + neue therapeutische Optionen ?

Gliedergürtelmuskel-Dystrophien

Gliedergürtelmuskel-Dystrophien (LGMD) • progressive Leiden der Skelettmuskeln • initiale Symptome bei Kind / Erwachsenen

• initiale Pathologie im Schultergürtel • meist Creatinkinase im Blut

• Histologie: Dystrophie der Muskelfasern

LGMD - Differentialdiagnose • alle Muskelleiden mit proximaler Komponente – – – – – –

neurogene Muskelatrophie metabolische + mitochondriale Myopathien inflammatorische Myopathien myasthenische Syndrome congenitale Strukturmyopathien andere

LGMD - Differentialdiagnose

-Sarkoglykanopathie

Autosomal dominante LGMD Form

Chromos.

Protein

LGMD1A

5q31

Myotilin

LGMD1B, ADEDMD...

1q21

Lamin A/C

LGMD1C

3p25

Caveolin 3

LGMD1E

7q

DNAJB6

LGMD1F

7q32

Transportin 3

LGMD1G

4q21

HNRNPDL

LGMD1H

3p23

?

heterogenous nuclear ribonucleoprotein D-like protein

{aktualisiert 12.4.2017}

Form

Chromosom

Protein

LGMD2A LGMD2B LGMD2C-2F LGMD2G LGMD2H LGMD2I LGMD2J LGMD2K LGMD2L LGMD2M LGMD2N LGMD2O LGMD2P LGMD2Q LGMD2R LGMD2S LGMD2T LGMD2U LGMD2W LGMD2X LGMD2Y LGMD2Z

15q 2p 13q, 17q, 4q, 5q 17q 9q 19q 2q 9q 11p 9q 14q 1p 3p 8q 2q 4q 3p 7p21 2q14 6q21 1q25 3q13

Calpain 3 Dysferlin Sarkoglykans TCAP TRIM32 Fukutin-rel. protein Titin POMT-1 ANO5 FKTN POMT2 POMGNT1 DAG1 Plectin DES TRAPPC11 GMPPB ISPD LIMS2 BVES TOR1AIP1 POGLUT1

{aktualisiert 12.4.2017}

6 J.:

9 J.:

• auffälliges Gangbild • Zehengang • Stolpern & Fallneigung •  Muskelschwäche Schulter- + Beckengürtel • Kniebeugen unmöglich, Treppensteigen 

A.D.

Labor:

Creatinkinase GOT GPT LDH

6360 U/l 138 U/l 156 U/l 1070 U/l

Myosonographie & Elektromyogramm: Myopathie

Biopsie m. vastus lateralis: HE Immunohistologie Western blot  Diagnose:

dystrophischer Muskel Muskelfaser schwach pos. für Dys-1, negativ für Dys-2 Dystrophin