E. coli - Alfred-Nissle

M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller E. coli – Bedeutung in Forschung und Medizin

ISBN 3-9811198-4-3

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E. coli Bedeutung in Forschung und Medizin

3., überarbeitete Auflage

M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller

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M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller

E. coli Bedeutung in Forschung und Medizin

3., überarbeitete Auflage

Fotohinweis zum Titelblatt (von oben nach unten): Wachstum von E. coli auf McConkey-Agar (Aufnahme T. Grela, U. Sonnenborn, Herdecke) Adhäsion von E. coli Stamm Nissle 1917 an das Darmepithel (Aufnahme J. Schulze, A. Lorenz, Potsdam-Rehbrücke) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von E. coli Stamm Nissle 1917 (Aufnahme H. J. Jacob, Bochum)

Im Fokus dieser Broschüre steht der weltweit am besten untersuchte Autoren: Dipl.-Biol. Martina Schiemann Dr. rer. nat. Ulrich Sonnenborn Priv.-Doz. Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schulze Dr. med. Hilke Müller Herausgeber: Alfred-Nissle-Gesellschaft Internationale Vereinigung zur Förderung der mikroökologischen Forschung und mikrobiologischen Therapie e. V.

­Mikroorganismus, das Bakterium Escherichia coli (E. coli), mit seiner Bedeutung für Gesundheit und Krankheit sowie für die medizinische, mikrobiologische, biochemische und molekularbiologische Forschung des 20sten und 21sten Jahrhunderts.

Vorsitzender: Prof. Dr. med. dent. Dr. med. Dieter Loew An der Residenz 5 55270 Sörgenloch [email protected] www.a-nissle-ges.de 3., überarbeitete Auflage Alle Rechte, insbesondere das Recht der Vervielfältigung und Verbreitung sowie der Übersetzung in fremde Sprachen vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf in irgendeiner Form (Fotokopie, Mikrofilm oder ein anderes Verfahren) ohne schriftliche Genehmigung reproduziert werden. © 2015 Alfred-Nissle-Gesellschaft e. V. · Deutschland

ISBN 3-9811198-4-3 2

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Inhaltsverzeichnis Seite Theodor Escherich – Erstbeschreiber des „Bacterium coli commune“ 7 Mikrobiologische Kurzcharakteristik von E. coli 11 E. coli K-12: Das beliebteste „Versuchstier“ der Molekulargenetiker

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E. coli in der Biotechnologie

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„E. coli is the first to come, and the last to go“

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Intra- und extraintestinal pathogene E. coli -Varianten 19 Alfred Nissles Entdeckung des Coli-Antagonismus und sein „neues Heilprinzip“

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Das „Auf und Ab“ der Therapie mit lebenden Mikroorganismen

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E. coli Stamm Nissle 1917: der weltweit am besten untersuchte probiotische E. coli -Stamm 32 Wirkungen und Wirkmechanismen von E. coli Stamm Nissle 1917

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– Mikrobielle Kommunikation und Interaktionen („Cross Talk“) im Gastrointestinaltrakt

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–  Bildung von Biofilmen und Mikrokolonien im Darm

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–  Die Stärkung der intestinalen Barrierefunktion

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   1. Der Anti-Invasionseffekt am Darmepithel

38

   2. Der Induktionseffekt auf die Synthese antimikrobieller Peptide des Darmepithels

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   3. Die Stärkung des Zusammenhalts des epithelialen Zellverbands

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–  Immunmodulierende Wirkungen

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– Antimutagenität

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Indikationsspektrum für E. coli Stamm Nissle 1917 (Mutaflor®) und konfirmatorische klinische Studien

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Ausblick 78 Literatur 81 Sachverzeichnis 95 4

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Theodor Escherich – Erstbeschreiber des „Bacterium coli commune“ Am 14. Juli des Jahres 1885 hielt der damals 27-jährige Theodor ­Escherich* vor der Gesellschaft für Morphologie und Physiologie in München einen ­Vortrag mit dem Titel „Die Darmbacterien des Neugeborenen und Säug­ lings“ ­ (Escherich, 1885) [Abb. 1]. Escherich, zu der Zeit Assistent am Dr. von Hauner­schen ­Kinderspital, berichtete über seine Forschungs­ergebnisse und trug dem Auditorium vor, dass das Mekonium des Neugeborenen steril sei, aber innerhalb der ersten ­Lebensstunden von Mikroorganismen besiedelt werde. Weil er fest davon überzeugt war, dass es „für die Pathologie und Therapie der myco­tischen Darmerkrankungen unentbehrlich sei“, versuchte er, „die scheinbar ganz regellose und von tausend Zufällig­keiten abhängige Menge der im ­normalen Stuhl- und Darmkanal vorkommenden Bacterien zu e ­ ntwirren.“ Dazu entwickelte er s­ pezielle ­Kultivierungsmethoden mit flüssigen und festen Nährmedien, die im Prinzip noch heute zum klassischen Handwerkszeug eines Prof. Dr. med. Theodor Escherich (1857 – 1911) mikrobio­­logi­schen Labors gehören. Nach eineinhalbjähriger intensiver Forschung präsentierte er diese und weitere Ergebnisse in seiner umfangreichen Habilitationsschrift „Die Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung“, die 1886 im Verlag von Ferdinand Enke, Stuttgart, abgedruckt wurde (Escherich, 1886). Hier teilte er u. a. minutiös seine ­Erkenntnisse zum ­ Vorkommen, zur Gestalt und zu den Eigenschaften der von ihm ­beobachteten Bakterien mit, die er – je nach ­Häufigkeit und Menge – in obligate und fakultative D ­ armbakterien einteilte. Im Säuglingsstuhl fielen ihm hauptsächlich zwei B ­ akterientypen auf, die er als „obligate ­Milchkotharten“ bezeichnete. Eine davon war – wie bereits in ­seinem 1885 publizierten ­Vortrag dargestellt – besonders häufig in den unteren Darmabschnitten ­anzutreffen, weshalb Theodor Escherich sie als typische „­ Colonbacterien“ bezeichnete und ihnen den Artnamen „Bacterium coli commune“, das ­allgemeine Dickdarmbakte­rium, gab [Abb. 2]. „Dasselbe findet sich so* Weiteres über Leben und Arbeit von Theodor Escherich kann der Monographie von B.A. Oberbauer „Theodor Escherich – Leben und Werk“, Paul-Ehrlich-Gesellschaft für Chemotherapie (Hrsg.), Futuramed Verlag München, 1992, entnommen werden.

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wohl im Mekoniumkothe als bei Milch-, Fleischdiät und gemischter Kost und kann insofern als ein diesen verschiedenen Kotharten „gemeinsamer“ Spalt­pilz bezeichnet werden, während die Bakterienvegetation der­ selben im ­ Übrigen große Verschiedenheiten darbietet...“. Später fand er das B ­acterium coli commune auch als obligates Darmbakterium in den Fäzes ­Erwachsener. Neben der Erstbeschreibung w ­ eiterer Darmbakterien (z. B. Klebsiella, Cam­ Abb. 2 b acter) ist es ein weiteres großes pylo­ Die erste Abbildung vom Verdienst Escherichs, auch auf mikro­ Bacterium coli commune. Dauerpräparat von Th. Escherich, 1886: angefärbt mit ökologische Zusammenhänge im Darm Gentiana­violett in wässrigem Anilin. hingewiesen zu haben (der Begriff In: Die Darmbakterien des Säuglings und ihre „Mikroökologie“ wurde allerdings erst Beziehungen zur Physiologie der Verdauung. 1960 von Helmut Haenel eingeführt). Verlag von Ferdinand Enke, Stuttgart. Im Stuhl von gestillten Kindern stellte er eine auf­fällige Verminderung oder sogar das Fehlen von gelatineverflüssigenden ­Keimen, von Eiweißspalt­produkten und von fäkalem Geruch

1885 Erstbeschreibung (Th. Escherich):

Bacterium coli commune (später: Bacterium coli)

1919 Systematisierung (A. Castellani, A.  J. Chalmers): Vorschlag zur Umbenennung in

Escherichia coli

1930 Internationaler Mikrobiologenkongress, Paris: offizielle Umbenennung in

Escherichia coli

1953 Internationaler Mikrobiologenkongress, Rom: Streichung der Bezeichnung zugunsten von

Bacterium coli Escherichia coli

1958 Judicial Commission: „Conservation of the Enterobacteriacea, ...“ verbindliche Veröffentlichung zur Bezeichnung

Abb. 1  Titelseite der Arbeit, in der Escherich erstmals das Bacterium coli commune beschrieb. 8

Escherichia coli

Abb. 3 Von der Erstbeschreibung als Bacterium coli commune zur heute gültigen Bezeichnung Escherichia coli. 9

fest, was später als antiputrider Effekt der Muttermilch beschrieben wurde. Nach seinen Befunden bezeichnete Escherich die B ­ esiedlung der oberen Darmabschnitte als monoton und ­spärlich, und stellte fest, dass die Zahl der Bakterien jenseits der Ileozäkalklappe im Dickdarm sprunghaft ansteigt. Er vermutete, dass die Vermehrung der Bakterien unabhängig von der Nahrungs­zufuhr sei und dass die Bakterien ihren Nah­rungs­­bedarf aus der Verstoffwechselung von Darmsekreten decken würden.

Mikrobiologische Kurzcharakteristik von E. coli Die Art Escherichia coli (E. coli) gehört zur Familie der ­Enterobacteriaceae und steht in enger verwandt­schaftlicher Nachbarschaft zur Gattung ­Shigella und in naher Verwandtschaft zu den Gattungen Citrobacter und ­Salmonella. Ent­ferntere Verwandte sind die Gattungen Enterobacter und Klebsiella [Abb. 4].

Trotz aller Weitsicht konnte Theodor Escherich nicht ahnen, dass das von ihm entdeckte Bacterium coli und die später nach ihm benannte S ­ pezies Escherichia coli [Abb. 3] zum weltberühmten Modellobjekt der natur­ wissenschaftlichen und medizinischen Mikrobiologen, Mikroökologen s­ owie der Biochemiker und Molekulargenetiker aufsteigen sollte.

Abb. 4 Stammbaum und Verwandtschaftsbeziehungen der Familie Enterobacteriaceae (nach Brenner, 1984).

Das E. coli-Bakterium ist ein gramnegatives Stäbchen von etwa 1,1 – 1,5 µm x 2,0 – 6,0 µm Größe. Es wächst unter aeroben und anaeroben ­Bedingungen (fakultativ anaerob), weil es zwei verschiedene Redoxsysteme besitzt (Mena­chinon und Ubichinon), die eine Energiegewinnung aus dem katabolen Stoffwechsel sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen ermöglichen. Unter optimalen Wachstumsbedingungen ist die Zellteilungsgeschwindigkeit der Coli-Bakterien rasant: Alle 20 Minuten ­ kann sich die Zahl der Bakterienzellen verdoppeln. Allerdings werden diese für die Populationsdynamik idealen Zustände nur unter Laborbedingungen, nicht aber im natürlichen Umfeld der Bakterien erreicht. Midtvedt (1998) berichtete von einer Verdoppelung der E. coli-Zellen im Zäkum der ­Ratte nach etwa 100 Minuten, im menschlichen Darm kann es 30 ­Stunden 10

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­ auern und in wässrigen Biotopen im Freien bis zu mehreren Tagen (­ Hecker, d 1998). ­ Bereits Escherich beobachtete die morphologische Vielfalt der Kolonie­ formen dieser Bakterien bei Wachs­ tum auf festen Nährböden. Noch zahlreicher sind die serologischen V ­ arianten. In der medizinischen ­Mikrobiologie dient die Serologie seit langem zur Keim­differen­zierung. Die serologische Einteilung der unterschied­lichen E. coli-Stämme wird durch die Sero­typisierung ihrer O-, K- und H-Antigene möglich. O-Antigene stellen dabei hitzestabile Bestandteile des Lipo­ poly­ saccha­ rid-­ Komplexes (LPS) der ­äußeren Zellmembran, K-Antigene Poly­saccha­ride der Kapsel und H-Antigene Geißel- oder Flagellenantigene dar [Abb. 5].

Abb. 5 Schematischer Längsschnitt und Zellwandaufbau einer gramnegativen E. coli-Zelle. Serologisch werden E. coli-Stämme anhand ihrer unterschiedlichen O-, K- und H-Antigene ­differenziert, z.  B. E. coli Nissle 1917 = Serotyp O6 : K5 : H1.

In der Natur können rund 50.000 unterschiedliche Serovare von E. coli ­vorkommen, die sich aus der Kombination verschiedener Antigenstruk­ turen ergeben (Hacker & Kruis, 1998). Bisher sind 200 Oberflächen-(O-), 80 Kapsel-(K-) und 60 Geißel-(H-)Antigene bei E. coli bekannt. Zudem gibt es noch mehr als 100 serologisch unterscheidbare Fimbrien-Varianten, die als Adhäsine verschiedene Rezeptoren erkennen. 12

E.  coli K-12: Das beliebteste „Versuchstier“ der Molekulargenetiker (Arber, 1982) Es war reiner Zufall, dass 1922 aus dem Stuhl eines an Diphtherie erkrankten Patienten eine E. coli-Variante isoliert wurde, die wegen ihrer völligen Harmlosigkeit auffiel und mit der Laborbezeichnung „K-12“ e ­ inen Platz in der bakteriologischen Stammsammlung der Medical School der Stanford-­ University in Kalifornien fand. Bereits im zweiten Drittel des vergangenen Jahr­hunderts suchten Genforscher nach geeigneten Studien­objekten, um die Frage zu beantworten: „Wie funktionieren Gene und wie kontrollieren sie spezifische Merkmale?“. Diese Versuchsobjekte sollten leicht, schnell und in unbegrenzter Menge zu züchten, und zudem in der Lage sein, ­genetische Veränderungen anhand phäno­typischer ­Ausprägungen offenFlagellen Fimbrien (H-Serotyp) zulegen. So fand die K-12-­Variante von E. coli das besondere ­Interesse eines amerikanischen Forscherteams um J. Lederberg und E.L. Tatum Kapsel (K-Serotyp) (1946). Als dann bei diesem ­E. coli K-12 para­sexuelle Vorgänge – d. h. die Fähigkeit des Austauschs genetischen Materials zwischen zwei Bakterienzellen – entdeckt wurden, war die Basis für die Durchführbarkeit der gezielten Übertragung von Genen gegeben, und E. coli K-12 avancierte zum Ribosomen Standardobjekt der Genetiker und Moleku­lar­biologen. Ähnlich wie die klassischen Tier- und Pflanzenzüchter suchten auch die Chromosom Mikrobiologen bei ihrem „Haustier“ E. coli nach neuen Stämmen. Mit ­Hilfe von Röntgen- und UV-Strahlen führten sie verschiedene Mutationen in den K-12-„Wildstamm“ ein. Sehr bald wurde mit dem Ausgangsstamm Plasmid und den daraus hergestellten Varianten in vielen Laboratorien weltweit gearbeitet. Die ­Varianten von E. coli Cytoplasma K-12 weisen Veränderungen in den ­verschiedensten Genen auf, sie tragen z. B. Merkmale für Auxotrophien (Stämme mit zusätzlichen Nährstoffbedürfnissen), Resistenzen und andere Mutationen. Als Sicherheitsmaßnahme wurden diese Mutantenstämme so verändert, dass sie –  keine Adhäsionsorganellen (Fimbrien) haben, um den Darm zu besiedeln, – fremde Plasmide ohne die Möglichkeit der Weitergabe an artfremde ­Zellen zuverlässig aufnehmen können, –  in der freien Natur nicht überleben können, –  UV- und Chemikalien-empfindlich sind.

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Zellw

Periplasma innere

Membran

Unterdessen sind weit mehr als 3000 verschiedene Mutanten von E. coli K-12 bekannt, mit deren Hilfe grundlegende Erkenntnisse zur ­Biochemie und Zellphysiologie, zur Genregulation und zum Gentransfer gewonnen wurden. Einer der ersten Bakterienstämme, dessen Genom voll­ ständig sequenziert wurde, war folgerichtig ein E. coli K-12-Stamm (MG 1655) (Blattner et al., 1997). Die erste genetische Karte des E. coli K-12-Genoms wurde bereits im Jahr 1964 u. a. mit Hilfe von Restriktionsenzymen, die ­ Stränge der DNA an spezifischen Basensequen­ homann, 1964). Während auf ihr 99 zen schneiden, erstellt (­Taylor & T Gene vermerkt waren, wies die G ­ enkarte aus dem Jahr 1990 schon 1403 Gene auf (Bachmann, 1990). Die 1997 ver­öffentlichte v­ ollständige Genomsequenz des E. coli K-12-Stamms ergab etwa 4300 Gene (­Blattner et al., 1997) [Abb. 6]. Mit ­einer Größe von 4,7 x 106 ­Basenpaaren ist das Genom von E. coli K-12 um den Faktor 1000 kleiner als das mensch­liche Genom, das infolge des „­ Human Genome Projects“ ebenfalls voll­ ständig sequenziert ist. Ein Forschungsschwerpunkt der modernen Molekulargenetik ist die Analyse der Genome ganzer Mikrobengemeinschaften wie z.  B. der mensch­ lichen Darm­ mikrobiota. Seit einiger Zeit wird die Gesamtheit aller Mikroorganismen im Magen-Darm-Trakt als intestinale Mikrobiota bzw. Darmmikrobiota bezeichnet. Intestinale Mikrobiota oder Darmmikrobiota ersetzen in der heuti­ gen Fachliteratur den klassischen Begriff Darmflora. Die Gesamtheit ­ aller Abb. 6 Genom von E. coli K-12 (MG1655), Genome der Darmmikrobiota wird als Größe 4,7 x 106 Basenpaare (Blum-Oehler, 2001). „Mikro­biom“ bezeichnet. Die Bedeutung von Escherichia coli für den internationalen Wissenschaftsfortschritt wird auch dadurch unter­strichen, dass in den letzten Jahr­ zehnten eine Reihe von Nobelpreisen für Arbeiten an und mit E. coli ver­ geben wurden.

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E. coli in der Biotechnologie Im Laufe der immer genaueren Charakterisierung des Genoms von E. coli erschlossen sich mit gentechnisch veränderten E. coli-Bakterien ­vielfältige Anwendungsgebiete. Bereits 1973 wurde gezeigt, wie man menschliches Insulin mit Hilfe eines gentechnisch veränderten E. coli-Stammes ­herstellen kann (Cohen et al., 1973). Mit Hilfe der modernen Gen- und Biotechnologie gelang es nun, rekombinante Arzneimittel herzustellen. Dabei wird das Gen für ein menschliches Protein in das Erbgut der Bakterien eingeschleust, die anschließend dieses Eiweiß herstellen [Abb. 7].

Abb. 7 Aus einer menschlichen Zelle wird die DNA isoliert. Mit Restriktions­enzymen („molekulare ­Scheren“) wird ein DNA-Fragment mit dem gesuchten Gen ausgeschnitten und mit Hilfe von ­Ligasen in einen ebenfalls aufgeschnittenen DNA-Plasmidring von E. coli eingeführt. Nach Einschleusung dieses ­Konstrukts in die E. coli-Zelle enthält das Bakteriengenom nun z. B. die genetische Information für das m ­ enschliche Hormon Insulin. Artfremde Proteine, die in ­Bakterien exprimiert werden, nennt man rekombinante Proteine.

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Als erstes rekombinantes Medikament wurde 1982 das Hormon Human­ insulin in den Markt eingeführt. Danach wurden Gene für weitere Proteine menschlicher, tierischer, pflanzlicher und bakterieller Herkunft erfolgreich in das E. coli-Genom integriert [Abb. 8]. Von E. coli exprimierte Pharmaproteine: • Humaninsulin •  Wachstumshormone (Somatostatin, Somatotropin) •  Immunmodulatoren (Interferone, Interleukine, TNFα) •  Wachstumsfaktoren (G-CSF, EGF) •  Blutfaktoren, Gerinnungshemmer (t-PA, Staphylokinase) • Enzyme

„E. coli is the first to come, and the last to go” (Midtvedt, 1998) Bis zur Geburt entwickelt sich der Fötus im Mutterleib unter keimfreien Bedingungen. Die Beobachtung Escherichs, dass sich bereits wenige ­ Stunden nach der Geburt „Colonbacterien“ im Mekonium nachweisen lassen, hat auch heute noch Bestand. Die sich ansiedelnden Keime ­ ­stammen aus der Mikrobiota der Mutter oder aus der Umgebung und ­werden während der Geburt bzw. der ersten Lebensstunden erworben (Sonnenborn et al., 1990). Fakultativ anaerobe Keime, allen voran E. coli, sind die ­klassischen Erstbesiedler des menschlichen Gastro­intestinaltrakts (Hoogkamp-Korstanje et al., 1979) [Abb. 9].

Abb. 8 Beispiele für von gentechnisch veränderten E. coli produzierte, pharmazeutisch verwendete Proteine und Peptide. Keimzahl (log/g Fäzes)

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8

6

4 14 15 17 20 1 8 11 14 16 3 8 16 6 1 12 6 8 21 8 12 14 3 12 24 6 10 18 Stunden 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tage Aerobier:

E. coli

Lactobacillus

Anaerobier:

Bacteroides

Bifidobacterium

Enterococcus

Abb. 9 Sequenzielle mikrobielle Besiedlung des Neugeborenendarms durch aerobe und anaerobe Bakterien (nach Hoogkamp-Korstanje et al., 1979).

Sie betreiben im zunächst noch sauerstoffhaltigen Dickdarm einen regen Stoffwechsel und senken dadurch den O2-Gehalt und das Redox­potential im Darmlumen so weit herab, dass sich nachfolgend anaerobe Darmbakterien – wie Bacteroides-Keime, Bifidobakterien u. a. – ansiedeln können (Schulze et al., 2008). Den Verbrauch von Sauerstoff durch die Colonbakterien hatte bereits Escherich beobachtet. Da über die Nahrung durch Abschlucken, aber auch über die Darmwand ständig neuer Sauerstoff in das Darmlumen eingebracht wird, bleibt diese Aufgabe der „Milieubereitung“ für E. coli während des gesamten Lebens des Wirtsorganismus erhalten. 16

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Die mikrobielle Besiedlungsdichte des Magen-Darmtrakts nimmt von proximal nach distal zu [Abb. 10]. Die durch­schnitt­liche Keimkonzentration von E. coli im Dickdarm unterliegt interindi­viduell aber auch intraindividuell großen Schwankungen und beträgt beim gesunden Erwachsenen z­ wischen 105 und 109 Kolonie-bildende Einheiten pro Gramm Fäzes (KBE/g). Da der über die Dickdarmwand ins Darmlumen ­diffundierende Sauerstoff für die Coli-­ Bakterien als chemotaktischer Reiz wirkt, sind diese auch an der M ­ ucosa, genauer gesagt an der aufliegenden Schleimschicht in großer Zahl zu finden. Durch diese „Anreicherung“ von E. coli an der Darmschleimhaut erhöht sich der Gehalt der sog. wandständigen Mikrobiota an aeroben Keimen.

Magen und Duodenum (101 - 103 KBE*/ml)

Laktobazillen Streptokokken Hefen (Candida albicans) Helicobacter pylori

Jejunum und Ileum (104 - 108 KBE*/ml)

Laktobazillen E. coli u.a. Enterobakterien Strepto- und Enterokokken Bacteroides-Arten Bifidobakterien Fusobakterien

Colon (1010 - 1012 KBE*/g)

*KBE = Kolonie-bildende Einheiten (syn. für Lebendkeime)

Bacteroides-Arten Bifidobakterien Peptostreptokokken Eubakterien Fusobakterien Clostridien Veillonellen

E. coli u.a. Enterobakterien (Enterobacter, Proteus, etc.) Enterokokken Laktobazillen Staphylokokken Pseudomonaden Hefen (Candida albicans) Protozoen (z.B. Entamoeba)

Intra- und extraintestinal pathogene E. coli-Varianten Escherich war anfangs überzeugt, dass es sich bei dem Bacterium coli commune um einen „harmlosen Schmarotzer“ handelt. Sicher hatte er damit recht, weil die meisten der oben erwähnten rund 50.000 Serovare zu den kommensalen Darmkeimen zu zählen sind. Allerdings berichtete ­Escherich bereits 1894 in einem publizierten Vortrag „über Cystitis bei Kindern hervorgerufen durch das Bacterium coli commune“ (Escherich, 1894). Er vermutete, dass die Darmbakterien als Quelle für Harnwegsinfektionen (Blasen- und Niereninfektionen) in Frage kämen. Diese frühe Hypothese, dass u. U. harnwegspathogene E. coli im Darm symptomlos persistieren und aus verschiedenen Gründen in die harnableitenden Organe gelangen und dort Ent­zündungen verursachen könnten, ist unterdessen mit modernen bio­­­ ­ chemischen und molekularbiologischen Methoden bestätigt worden (Blum et al., 1995; Hacker et al., 1983; Plos et al., 1995). Über die wirtsspezifische pathogene Potenz verschiedener E ­ . coli-­Varianten [Abb. 11] gibt es mittlerweile eine enorm umfangreiche Sammlung von ­Publikationen.

Darminfektionen Harnwegsinfektionen Sepsis Meningitis

Diarrhö Sepsis Mastitis

Abb. 10 Unterschiede in Keimgehalt und Keimspektrum in verschiedenen Abschnitten des Gastro­ intestinaltrakts (nach Sonnenborn & Greinwald, 1991).

Obwohl sich in den letzten Jahren Laborbefunde mehren, dass Neugeborene in den hoch­industrialisierten Ländern immer später mit E. coli besiedelt werden, und dass die Keimzahlen von E. coli in Stuhlproben von Patienten (vornehmlich von Allergikern) reduziert sind, bzw. sich manchmal sogar keine Coli-Bakterien nachweisen lassen (Adlerberth et al., 2006; ­Nowrouzian et al., 2003; Sepp et al., 2000), gilt auch heute noch die Aussage von Escherich: „Die Keime der Colonbacterien, die eine sehr große Verbreitung zu besitzen scheinen, … finden sich regelmäßig schon im Mekonium und bleiben von da bis zum Tode des Wirthes und darüber hinaus ständige Bewohner des Darmkanals.“ 18

Diarrhö Ödemkrankheiten

Harnwegsinfektionen

Diarrhö Sepsis

Sepsis

Abb. 11  Wirtsspektrum und Krankheitsbilder intestinaler und extraintestinaler pathogener E. coli. 19

In Abhängigkeit von der Schädigungsstrategie werden pathogene E. coli in sog. „Pathotypen“ eingeteilt (Hacker & Heesemann, 2000) [Abb. 12]. Pathogene E. coli-Varianten sind durch das Vorkommen von diversen ­Virulenzfaktoren, wie z. B. verschiedenen Toxinen, besonderen Fimbrien-­ Adhäsinen, Invasinen oder Sekretionssystemen, gekennzeichnet [Abb. 13]. Sie können sowohl plasmid- oder phagen- als auch chromosomal ­codiert im Bakteriengenom vorliegen. Darmpathogene E. coli werden aufgrund ihrer in den letzten Jahren aufgedeckten Virulenzfaktoren in derzeit 6 Klassen unterteilt, die Durchfall­ erkrankungen mit unterschiedlichen klinischen Erscheinungsformen verursachen (Kaper et al., 2004). Dabei werden die klinische Symptomatik sowie die von den Stämmen gebildeten Virulenzmerkmale, die Adhäsionsfaktoren und T ­ oxine, als Einteilungskriterien verwendet. Die in früheren Jahren vor allem angewandte Serotypisierung zur Identifizierung und Klassifizierung klinischer Isolate wird heute immer mehr durch den molekulargenetischen Nachweis der jetzt bekannten bakteriellen Virulenz- und Pathogenitätsgene ersetzt, unterstützt durch den Nachweis spezifischer pathogener Merkmale.

Virulenzmerkmale •  Adhäsine (CFA I/II-, P-, M-, S-Fimbrien) • Toxine (CNF, Hämolysin, hitzestabile und hitzelabile Toxine, Shiga-Toxine) • Invasine •  Typ-III-Sekretionsapparat (biologische „Injektionsspritze“) Abb. 13  Beispiele für Virulenzfaktoren pathogener E. coli-Stämme.

­ imbrien-Adhäsine ­ F (bundle-forming pili) und injizieren über ein Typ-III-­ Sekretionssystem bakterielle Signalproteine in die Epithelzelle, was zu Veränderungen des Aktingerüsts führt und letztlich zu einer Destruktion der Mikrovilli. Sie gelten heute vor allem in Entwicklungsländern als Verursacher von wässrigen Durchfall­erkrankungen mit Fieber und Erbrechen bei Säuglingen und Kleinkindern unter 2 Jahren (Cravioto et al., 1991; Levine & Edelmann, 1984). EPEC sind auch für Tiere pathogen und verursachen z. B. beim Kaninchen große Verluste in der Jungtieraufzucht.

Abb. 12 Pathotypen und Pathogenitätsmechanismen humanpathogener E. coli (nach Hacker & Heesemann, 2000).

Infektionen durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC) traten erstmals 1982 in den USA auf. Sie sind im Gegensatz zu anderen darmpathogenen E. coli-Stämmen, die sich nur beim Menschen finden und deren Übertragung durch fäkal kontaminiertes Gemüse oder durch Schmierinfektionen erfolgt, eher als Zoonoseerreger einzustufen (Baljer & Wieler, 1999; Karch 2011). Sie repräsentieren eine Untergruppe der auch als Shiga-Toxin-produzierende (STEC) bzw. Vero-Toxin-produzierende (VTEC) bezeichneten E. coli und kommen in der Natur relativ häufig vor. E. coli dieses Typs sind Auslöser meist blutiger Diarrhöen (MacDonald et al., 1988). Bei 10 – 20  % der Erkrankten entwickelt sich als schwere Verlaufsform eine hämorrhagische Colitis. Enterohämorrhagische E. coli schleusen nach der Anheftung Enterohämolysin und weitere Toxine in die Mucosazelle ein, was zu blutigen Läsionen im Darm führen kann. Da die Toxine auch in andere Organe gelangen können, kommt es u.U. zu irrever­siblen Schäden im Nierengewebe (Hämolytisch-urämisches Syndrom, HUS) sowie zur Thrombotisch-Thrombozytopenischen ­Purpura (TTP) (Karch 2011; Karmali, 1989; ­MacDonald et al., 1988). Nach heutiger Kenntnis sind landwirtschaft­liche Nutztiere in Massentierhaltung, vor allem Rinder, die wichtigsten Erreger­reservoire für Infektionen des Menschen (Beutin et al., 1995).

Enteropathogene E. coli (EPEC) wurden erstmals in den 40er Jahren des vergangenen Jahrhunderts als Erreger der Säuglingsenteritis während ­eines massiven Ausbruchs in Großbritannien isoliert. Enteropathogene E. coli nutzen zum Andocken an die Darmschleimhaut spezifische

Durch enterotoxische E. coli (ETEC) bedingte Infektionen sind eine weit verbreitete Ursache von Darmerkrankungen bei Kleinkindern sowie bei Reisen­den in tropischen und subtropischen Ländern (Reisediarrhö). ETEC besitzen typische Adhäsine und schädigen die Enterozyten über zwei ­Toxine

EPEC

EHEC

Toxinbildung

Toxinbildung

Toxinbildung

ETEC

EAggEC

SEPEC

MENEC

Toxinbildung EIEC

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UPEC

21

(hitzelabiles und/oder hitzestabiles Enterotoxin). ETEC-­Infektionen äußern sich in einem Cholera-ähnlichen Krankheitsbild. Es kommt zu ­wässrigen Durchfällen, abdominalen Krämpfen, Fieber und Erbrechen (Levine, 1987). Beim Tier sind vor allem neugeborene Lämmer, Kälber und Ferkel betroffen (Kennan & Monckton, 1990; Tzipori et al., 1981). Enteroaggregative E. coli (EAggEC) wurden bisher vor allem bei Kindern als Infektionserreger nachgewiesen und verursachen wässrige, oft persistierende Durchfälle. EAggEC haften an den Enterozyten des Dünndarms und lagern sich in typischer Weise zu Aggregaten zusammen, die an gestapelte Ziegelsteine erinnern (Nataro & Kaper, 1998). Sie schädigen die Epithelzellen durch Bildung eines besonderen Toxins (EAST I), das dem ­hitzestabilen Enterotoxin der ETEC ähnelt. Enteroinvasive E. coli (EIEC) besitzen die Fähigkeit, in die Darmwand einzudringen. Sie sind bezüglich ihrer pathogenen Eigenschaften den Ruhr­bakterien (Shigellen) vergleichbar und verursachen beim Menschen Ruhr­-ähnliche S ­ ymptome, wie anhaltende Bauchkrämpfe (Tenesmen) und breiige, blutige und blutig-schleimige Diarrhöen (Formal, 1983). Es kommt zu lokalen E ­ ntzündungen mit Bildung von Geschwüren durch Einwandern der Erreger in die Dickdarmwand. Eine Tierpathogenität ist nicht bekannt. Diffus adhärente E. coli (DAEC) wurden als Infektionsauslöser vor allem bei Kindern mit wässrigen Durchfällen nachgewiesen (Nataro & Kaper, 1998). Über ihre Pathogenitätsmechanismen ist noch wenig bekannt. Nekrotoxische E. coli (NTEC) zeichnen sich durch die Bildung spezieller ­Toxine, die sog. „Cytonekrose-Faktoren (CNF)“ aus (De Rycke et al., 1990). CNF1-­bildende NTEC sind vor allem beim Menschen mit extra­intestinalen Coli-Infektionen nachgewiesen worden, während CNF2-bildende NTEC bei Kälbern sowohl mit Durchfall als auch mit Septikämien in Verbindung gebracht werden (Caprioli et al., 1987). Extraintestinale Infektionen entstehen durch das Vordringen von Coli-Bakterien, die sich z. T. aus der eigenen Darmmikrobiota rekrutieren, in ansonsten sterile oder spärlich besiedelte Bereiche des Organismus, in denen eine Vermehrung begünstigt wird. Bei extraintestinalen Infektionen spielt E. coli vor allem als Erreger von Harnwegsinfekten (UPEC = uropathogene E. coli) eine wich­tige Rolle (Johnson & Stamm, 1989). Uropathogene E. coli heften sich mit ­spezifischen Adhäsinen (z. B. P-Fimbrien, S-Fimbrien) an uroepi­theliale Zellen und setzen zur Schädigung des Epithels ein zytolytisch wirkendes Toxin (α-Hämolysin) ein. Gleichzeitig entziehen sie sich den Attacken der Immunabwehr durch Kapselbildung. UPEC können die Harnwege von Menschen, Affen und Hunden infizieren. 22

Ein wesentlich selteneres Krankheitsbild ist die Sepsis oder Meningitis bei Neugeborenen, die durch Sepsis/Meningitis-assoziierte E. coli (SEPEC, MENEC) hervorgerufen werden kann (Dawson et al., 1999). Sepsisaus­ lösende E. coli nutzen ähnliche Pathogenitätsfaktoren wie die UPEC. Durch E. coli ausgelöste Sepsis kommt bei Mensch, Rind, Schaf, Schwein und Geflügel vor. SEPEC schützen sich vor der Attacke durch das Komplementsystem durch den Besitz bestimmter Kapseltypen und langkettiger Lipopolysaccharide. Dies ermöglicht ihnen, längerfristig im Blutserum zu überleben. SEPEC werden daher als „serumresistent“ bezeichnet. Meningitis-assoziierte E. coli (MENEC) sind ­E. coli-Varianten, die auch Harnwegs­ infektionen verursachen können. Sie werden beim Menschen während der Geburt von der Mutter auf das Neugeborene übertragen, bei dem sie eine Meningitis auslösen können. MENEC schützen sich ebenfalls durch Bildung einer Kapsel (oft vom K1-Serotyp). Sie docken mit patho­ genen S-Fimbrien-Adhäsinen an Epithel- und Endothelzellen an und können diese Gewebsbarrieren durchdringen. Nach der vollständigen Genom-Sequenzierung des E. coli K-12-Stammes MG 1655 (Blattner et al., 1997) folgte die Entschlüsselung weiterer Genome von ­apathogenen wie auch pathogenen Varianten der Spezies Escherichia coli. Durch Vergleiche der jeweiligen DNA-Sequenzen konnten Unterschiede in der genetischen Organisation aufgezeigt und Hinweise auf die phylogenetische Entwicklung von Bakterienstämmen gegeben werden (Dobrindt et al., 2010). Die Analyse der Sequenzdaten hat zu der Erkenntnis geführt, dass bakterielle Genome aus einem Kern­genom bestehen, aber daneben zusätzliche Gene vorhanden sind, die für stammtypische Eigenschaften codieren und ­möglicherweise über horizontalen Gentransfer in das Genom integriert w ­ urden [Abb. 14]. Kerngenom Phagen Plasmide Genom-Inseln

Pathogenität

Resistenz

Sekretion

Metabolismus

Degradation

Symbiose

Abb. 14  Genomstruktur von Bakterien (nach Hacker et al., 2001). 23

Hierbei trägt die Integration von Fremd-DNA über mobile genetische ­Elemente (z. B. Plasmide, Bakteriophagen, Transposons), Mutationen und intragenomische Umlagerungen wesentlich zur Ausbildung eines flexi­ blen ­Genpools bei (Dobrindt et al., 2004; Hacker & Kaper, 2000). Bei der Ent­ ­ stehung von pathogenen Varianten durch horizontalen Gentransfer [Abb. 15] spielen auch die sog. „Pathogenitätsinseln“ (große chromo­ somale DNA-Regionen mit DNA-Sequenzen, die sich in ihrer Zusammen­ setzung stark vom Kern-Genom unterscheiden), eine besondere Rolle (Hacker et al., 1997). Hier sind gehäuft Gene für die Expression von bestimmten ­Virulenz- bzw. Fitnessfaktoren lokalisiert. Patho­gene und apathogene E. coli-Stämme unterscheiden sich durch das Vorhandensein oder Fehlen solcher Virulenzgene (Dobrindt, 2005; Grozdanov et al., 2004).

Bakterien tauschen ihre DNA aus Die der Pathogenität zu Grunde liegenden Virulenzgene befinden sich häufig auf übertragbaren DNA-Elementen. Es wird vermutet, dass die Entstehung der EHEC-Stämme durch horizon­ talen Gentransfer via Plasmide und Bakteriophagen erfolgte. Während z.  B. die evolutionäre Trennung der Spezies E. coli und Salmonella ssp. auf die Zeit vor ca. 160 Millionen Jahren datiert wird, liegt die Entstehung von :  H7 nur wenige EHEC O157  Jahrzehnte zurück (Armstrong et al., 1996). Wahrscheinlich wurden u. a. durch Phagen die ­ Toxin-­Deter­minanten von ­Shigella dys­enteriae auf E. coli O55 übertragen, der dadurch zu einem neuen Stamm E. coli EHEC O157 : H7 mutierte, dem Auslöser der enterohämorrhagischen Colitis (Lathem et al., 2003).

24

Transposon Pathogenitätsinsel

Bakteriophage Plasmid

Kommensale E. coli

Bakterienruhr (EIEC)

Meningitis (MENEC)

Diarrhöen (EPEC, EHEC, ETEC, EAggEC, DAEC)

Harnwegsinfekte (UPEC)

Hämolytisch-Urämisches Syndrom (EHEC)

Abb. 15 M  obile genetische Elemente in der Evolution pathogener E. coli. Enteropathogene (EPEC), enterohämorrhagische (EHEC), enteroinvasive (EIEC), enteroaggregative (EAggEC), diffus adhärente (DAEC), uropathogene (UPEC), ­Meningitis-assoziierte (MENEC) E. coli (nach Kaper et al., 2004).

Alfred Nissles Entdeckung des Coli-Antagonismus und sein „neues Heilprinzip“ Gegen Ende des 19. Jahrhunderts erlebte die mikrobiologische Forschung, insbesondere die Medizinische Mikrobiologie, einen enormen Aufschwung, vor allem durch die bahnbrechenden Entdeckungen von Louis Pasteur, ­Robert Koch, Theodor Escherich, Paul Ehrlich, Ilja Metchnikoff u.v.a. ­Indes blieb die Frage, ob die Darmmikrobiota als Ganzes oder aber b ­ estimmte Darmkeime einen eher positiven oder mehr negativen Einfluss auf den Wirt haben, ebenso unbeantwortet wie die Frage nach den regulierenden Mechanismen im Zusammenleben der Bakterien im Gastrointestinaltrakt untereinander. Verschiedene Forschergruppen versuchten bereits damals, diesen Geheimnissen auf die Spur zu kommen. So war es nicht verwunderlich, dass sich der Freiburger Hygieniker und Bakteriologe Alfred Nissle auf Grund seiner Untersuchungen an Darmkeimen im „Routine-Labor“ weitere Fragen stellte, nämlich: „Warum und wie beeinflussen sich Bakterien in einer Mischkultur, wie im Darm vorhanden, gegenseitig in ihrem Wachstum?“ oder „Warum bleiben bei epidemie­ artigen Durchfallerkrankungen einige wenige Menschen darmgesund?“ Nachdem sich Nissle etwa 4 Jahre mit diesen Fragen experimentell auseinandergesetzt hatte, präsentierte er 1916 vor der Freiburger Medizinischen Gesellschaft seine Ergebnisse in einem Vortrag Prof. Dr. med. Alfred Nissle mit dem Titel „Über die Grundlagen einer neuen (1874 – 1965) ursächlichen Bekämpfung der pathologischen Darmflora“ (Nissle, 1916) [Abb. 16]. Die metho­dische Grundlage bildete ein von Nissle entwickelter und im Prinzip noch heute v­ erwendeter Testansatz zur In-vitro-Bestimmung bakterieller Interferenz („Antagonismus-Test“) ­ einkulturen eines Infektions­erregers mit Reinkultu[Abb. 17]. Dabei werden R ren eines Bakterienstamms aus der physiologischen Darmmikrobiota (poten­ zieller Antagonist) gemeinsam in ­Flüssigkultur gezüchtet. Nach bestimmter Zeit, meist nach Übernacht-Kultur, werden Proben entnom­men und auf geeigneten Festnährböden die Keimzahlen der co-kultivierten ­Bakterien bestimmt. Kann der physiologische Darmkeim das Hochwachsen des Infektionserregers behindern oder unterbinden, so gibt das Ausmaß der Wachstums­hemmung die Stärke der antagonistischen Aktivität wieder. 25

Nissle hatte für die Kennzeichnung solcher Darmkeime einen „Antagonis­ tischen Index“ e ­ ntwickelt und fand unter den von ihm isolierten Coli-Stämmen aus dem menschlichen Intestinaltrakt solche mit starker oder schwacher antagonistischer Wirkung. Er nutzte diese Methode auch für die Bestimmung der wechselseitigen antagonistischen Aktivität zwischen verschiedenen Coli-Stämmen. E. coli mit besonders starker Hemmwirkung fand er während des Ersten Weltkrieges bei zwei Patienten im Freiburger Verwundeten-Lazarett, die „niemals Neigung zu Darmerkrankungen gezeigt hatten und speziell auch dann nicht an infektiösen Darmprozessen erkrankt waren, als ein größerer Teil ihrer Umgebung daran erkrankte und sie infolge des engen Zusammen­lebens mit bereits Erkrankten der Gelegenheit zur Infektion in reichlichstem Maße ausgesetzt waren“ (Nissle, 1916). Diese Stämme, die auch unter Labor­bedingungen ihre antagonistische Wirksamkeit behielten, wurden von Nissle zuerst im Selbstversuch und an gesunden Personen getestet, um ihre Unschädlichkeit beim Menschen nach oraler Verabreichung festzustellen. Anschließend therapierte er versuchsweise Patienten, zuerst solche mit i­nfektiösen Diarrhöen, Paratyphus B, Shigellen-Ruhr und Salmonellen-Dauerausscheider und später Patienten mit post-dysenterischen Darmfunktionsstörungen („Colon irritabile“, heute „Reizdarm-Syndrom“) oder ­chronischer habitueller Obstipation (Nissle, 1916, 1918). Obwohl es sich ­hierbei um Einzel­­fall­beobachtungen handelte, war Nissle von der klinischen Wirksamkeit ­seiner Coli-Kulturen überzeugt und dehnte die Untersuchungen auch auf w ­ eitere Darmerkrankungen, wie z. B. Colitis ulcerosa und dyspep­tische Beschwerden, aus (Nissle, 1918, 1925).

Abb. 16  Titelseite der Arbeit, in der Nissle erstmals über den E. coli-Antagonismus berichtete. 26

Ein weiteres E. coli-Isolat von besonderer „antagonistischer Stärke“ gewann Nissle 1917 aus den Fäzes eines Soldaten, der während des Balkanfeldzugs im Ersten Weltkrieg in der Region Dobrudscha stationiert war und der „im Gegensatz zur großen Mehrzahl seiner Kameraden weder an Ruhr noch anderen Darmkrankheiten gelitten hat“ (Nissle, 1925). Nissle ­züchtete, von der asservierten Stammkultur ausgehend, die Keime auf Festagar­platten und füllte die frisch abgeernteten Bakterienkulturen in Hartgela­tinekapseln. Damit schuf er die Grundlage für ein Arzneimittel, das als Wirkstoff lebende Coli-Bakterien enthält. Nissle meldete für ­dieses Arzneimittel den Namen „MUTAFLOR“ beim Reichspatentamt an, der am 1. März 1917 als Waren­zeichen geschützt wurde. Später erhielt der im Mutaflor® enthaltene E. coli-Stamm, im Gedenken an Alfred Nissle, die Stammbezeichnung „E. coli Nissle 1917“, abgekürzt „EcN“. Der gegen verschiedene pathogene E. coli-Stämme sowie gegen Salmonellen, Shigellen, 27

Relative Keimzahl (%)

Cholera-Vibrionen, Proteus und Candida in vitro gefundene ­Antago­nismus von E. coli Nissle 1917 [Abb. 17] wurde später auch in vivo bei gnotobio­ tischen Ferkeln [Abb. 18] und Ratten nachgewiesen. Selbst bei Neu­gebore­ nen ist der antimikrobielle Effekt nachweisbar, worauf nachfolgend noch eingegangen wird.

Antagonismus von EcN, Co-Kultivierung mit:

100

50

0

1 2 3 4 5 6

EcN

Testorganismen

1  Salmonella enteritidis 2  Shigella dysenteriae 3  E. coli O112 ab (EPEC) 4  E. coli O6 : K15 : H31 (UPEC) 5  Proteus vulgaris 6  Candida albicans

Abb. 17 Antagonismus von E. coli Nissle 1917 (EcN) gegen verschiedene Mikro­organismen. EcN hemmt in vitro signifikant das Wachstum pathogener Bakterien und Pilze (nach Sonnenborn & Greinwald, 1991).

Abb. 18 Beispiel für die antagonistische Wirkung von E. coli Nissle 1917 (EcN) im gnotobiotischen Ferkel. Die orale Gabe von EcN bekämpft Infektionen mit enteropathogenen E. coli (nach Schulze et al., 1992).

Nissle selbst, aber auch andere Autoren, veröffentlichten in den Folgejahren zahlreiche Kasuistiken und Fallsammlungen, die wichtige Hinweise für die therapeutische Anwendbarkeit des antagonistisch aktiven E. ­coli-Stamms ­Nissle 1917 lieferten. 28

Das „Auf und Ab“ der Therapie mit lebenden Mikroorganismen Nissle war zu seiner Zeit nicht der alleinige Protagonist einer Therapie mit lebenden Mikroorganismen. Die zunehmende Kenntnis über Infektionen des Darms und die damit im Zusammenhang stehenden Erkrankungen sowie die Erfahrungen über die Möglichkeit, Immunitäten dagegen zu ent­ wickeln, ließen auch bei anderen Forschern die Idee reifen, zur Bekämpfung von Infektions­erregern „harmlose Bakterien“ aus der körpereigenen Mikrobiota zu ­nutzen. Bereits um das Jahr 1900 und später wurden vor allem Laktobazillen­ ­ kulturen gezielt zur Therapie eingesetzt (Brudzinski, 1900; ­Distaso & ­Schiller, 1914; Rettger & Cheplin, 1921; u. a.), nicht zuletzt auch ausgelöst durch ­ Metchnikoffs Bestseller „The prolongation of life“ (­Metchnikoff, 1907). ­Nissle war aber jahrzehntelang der Einzige, der durch den Einsatz des von ihm ­isolierten lebenden E. coli-Stamms in Form des Präparats Mutaflor® therapeu­tische Erfolge erzielte. Dennoch ebbte das allgemeine Interesse an dieser Therapiestrategie gegen Mitte des vergangenen Jahrhunderts ab. Hauptgrund war der Beginn des „Antibiotika-Zeitalters“. 1928 hatte Alexander Fleming aus dem Schimmelpilz Penicillium notatum eine antibakteriell wirkende Substanz isoliert, die KBE [log/g kam Kot] (Penicillin). In der Folge­ ab 1940 zur therapeutischen Anwendung zeit 12 ­wurde eine Fülle weiterer Antibiotika entwickelt, mit dem Ergebnis einer 10 Infektionskeimen aus Entzündungs­äußerst erfolgreichen Eliminierung von herden. Das Ziel, alle Infektionskrankheiten mit diesen antimikrobiellen Sub8 stanzen zu beherrschen, schien erreichbar zu sein (Muniesa et al., 2012). 6 Je näher man sich aber dem Ziel glaubte, umso häufiger wurden therapeutische Misserfolge dokumentiert und 4umso intensiver wurde entweder nach 2 neuen wirksamen Antibiotika oder nach solchen mit einem noch breiteren Wirkungs­spektrum gesucht. Schätzungsweise sind es heute 50.000 Tonnen 2 6 8 10 und 12 an Antibiotika, die weltweit jährlich von0Mensch und4 Tier aufgenommen z. T. unverändert in die Umwelt wieder ausgeschieden werden. Ohne diese Antibiotika wäre in den zivilisierten Ländern der heutige Gesundheits- und Lebensstandard nur schwer vorstellbar. Allerdings können Antibiotika auch krank machen: Übelkeit, Durchfälle, Erschöpfung, Psychosen, Leber- und Nieren­ ­ schä­ den, Allergien, anaphylak­ tischer Schock sind nur einige der vielfach dokumen­ tierten Nebenwir­ kungen. Hinzu kommt, dass Mikroorganismen in der Lage sind, sich schnell und ­effektiv an veränderte Umweltbedingungen anzupassen. So können sie auf verschiedenen Wegen Resistenzen ausbilden und sich so der ­Wirkung 29

der ­Anti­biotika entziehen. In Biotopen mit hoher Antibiotikakonzentration – z. B. ist der Gastrointestinaltrakt eines Patienten im Krankenhaus solch ein Biotop  – ist die residente Mikrobiota einem zunehmenden Selektionsdruck durch anti­mikrobiell wirkende Substanzen ausgesetzt. Das Ergebnis ist eine Häufung multiresistenter Keime im Hospitalmilieu und ein Anstieg von noso­ komialen I­nfektionen mit multiresistenten Erregern weltweit. Diese Entwicklung und das langsam zunehmende Bewusstsein bei Therapeuten und P ­ atienten, mit der Anwendung von Antibiotika kritischer umzugehen sowie zusätzlich oder alternativ bewährte und positiv evaluierte Methoden einzusetzen, ­haben in den letzten Jahren zu einer Renaissance der Therapie mit lebenden Mikro­organismen geführt. Übereinstimmend mit der internationalen Literatur bezeichnet man diese Therapie heute auch als „probiotische Therapie“ und die dabei eingesetzten Mikroorganismen als „Probiotika“. Probiotika sind ­definitionsgemäß apatho­gene lebende Mikroorganismen, die, wenn sie in genügend hoher Zahl lebensfähig in den Gastrointestinaltrakt gelangen, ­einen positiven Effekt auf die Gesundheit des Wirtsorganismus ausüben (FAO/ WHO, 2001). Ein Probiotikum, das als Arzneimittel zugelassen werden soll, muss hohe Anforderungen erfüllen [Abb. 19]. Im Gegensatz zu Nahrungs­ ergänzungsmitteln ­müssen hier der Nachweis der ­klinischen Wirksamkeit bei ­ edizinischen Indikationen und Belege zu Wirkungen und Wirk­ ­definierten m mechanismen erbracht ­werden. Außerdem muss die Einhaltung spezieller Kriterien zur P ­ roduktqualität und Unbedenklichkeit (u. a. mikrobiologische Reinheit und ­definierter Lebendkeimgehalt sowie Apathogenität und genetische Stabilität des ­therapeutisch eingesetzten Mikroorganismus) garantiert sein [Abb. 19]. Der Nachweis der Apathogenität oder Avirulenz ist bei der Überprüfung von E. coli-Stämmen, die als Probiotika therapeutisch eingesetzt werden s­ ollen, von besonderer Bedeutung, da – wie bereits beschrieben – die Spezies Escherichia coli eine Reihe von pathogenen Varianten beinhaltet. Aus diesem Grunde wurde die Verwendung von Präparaten mit lebenden E. coli-Bakterien von einigen Autoren noch bis Mitte der 90er Jahre des letzten Jahrhunderts pauschal abgelehnt (Expert’s Opinion Poll – Marget et al., 1995). Diese pauschale Ablehnung ist mittlerweile einer differenzierteren Betrachtungs­weise gewichen, was nicht zuletzt der Weiterentwicklung molekular­­­ genetischer Differenzierungs- und Identifizierungsmethoden zu verdanken ist. Mit Hilfe dieser Techniken ist es möglich, pathogene E. coli-Varianten eindeutig von apathogenen Stämmen zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigen apatho­ gene Stämme, wie E. coli Nissle 1917, im Gegensatz zu virulenten E. coli-­ Varianten in toxikologischen Untersuchungen sowohl an konventionell als auch an keimfrei gehaltenen Tieren keinerlei schädliche Wirkungen. 30

Wirksamkeit ● Durch kontrollierte klinische Studien nachgewiesene Wirksamkeit bei definierten Indikationen

Produktqualität ● Mikrobiologische Reinheit ● Definierter Lebendkeimgehalt ● Exakte Identifizierung und Abgrenzung von nahe verwandten Mikroorganismen ● Lebensfähigkeit im GI-Trakt

Unbedenklichkeit ● Apathogenität ● Genetische Stabilität

Wirkmechanismen ● Unterdrückung von Wachstum und Kolonisation unerwünschter Mikroorganismen ● Beitrag zur Optimierung des intestinalen Milieus und zum luminalen Stoffwechsel ● Kommunikation mit Darmepithel und Immunsystem ● Kolonisationsfähigkeit

Abb. 19 Anforderungen an probiotische Arzneimittel: Nachweis der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit, Erkenntnisse zu den Wirkmecha­nismen, nachgewiesene und reproduzierbare Produktqualität.

Wirksamkeit ● Durch kontrollierte klinische Studien nachgewiesene Wirksamkeit bei definierten Indikationen

Produktqualität

● Mikrobiologische Reinheit ● Definierter Lebendkeimgehalt ● Exakte Identifizierung und Abgrenzung von nahe verwandten Mikroorganismen ● Lebensfähigkeit im GI-Trakt

Unbedenklichkeit ● Apathogenität ● Genetische Stabilität

Wirkmechanismen ● Unterdrückung von Wachstum und Kolonisation unerwünschter Mikroorganismen ● Beitrag zur Optimierung des intestinalen Milieus und zum luminalen Stoffwechsel ● Kommunikation mit Darmepithel und Immunsystem

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E. coli Stamm Nissle 1917: der weltweit am besten ­untersuchte probiotische E. coli-Stamm Alle in Abb. 19 aufgelisteten Anforderungen an ein probiotisches Arznei­mittel werden von E. coli Nissle 1917 (EcN), der „Wirksubstanz“ von Mutaflor®, vollständig erfüllt (Sonnenborn & Schulze, 2009). Die Aufklärung der Genomstruktur (Grozdanov et al., 2004; Hancock, Vejborg et al., 2010; Sun et al., 2005) wie auch die vollständige Genom-Sequenzierung (Cress et al., 2013; Reister et al., 2014) hat gezeigt, dass das Fehlen von Pathogenitätsfaktoren (z. B. von ­Enterotoxinen, Hämolysinen, Zytotoxinen, Invasinen, pathogenspezifischen F ­ imbrien) [Abb. 20], kombiniert mit dem Vorhandensein von sog. Fitness-­ Faktoren (z.  B. Mikrocinen, multiplen Eisenaufnahmesys­ temen, typischen Adhäsinen, Flagellen) [Abb. 21], die das Überleben und die ­ Kolonisierung im Darm ermöglichen, zu den probiotischen Eigen­ schaften von EcN beitragen (Blum-Oehler et al., 2001; Deriu et al., 2013; Dobrindt, 2005; Grosse et al., 2006; ­Jacobi & Malfertheiner, 2011; Lasaro et al., 2009; Patzer et al., 2003; Schlee et al., 2007; ­Valdebenito et al., 2006, ­Vassiliadis et al., 2010). • Apathogener E. coli-Stamm (Serotyp O6 : K5 : H1) •  Genetische Stabilität

Keine

 Enterotoxin-Produktion  Zytotoxin-Produktion  Hämolysin-Produktion   Pathogenen Adhäsionsfaktoren  Invasivität  Immuntoxizität   Serumresistenz (keine Sepsisgefahr)  Uropathogenität  Toxizität in keimfreien und konventionell gehaltenen Tieren

Stamm zwar immunmodulatorisch wirksam, zeigt aber keine immuntoxi­schen Wirkungen (Grozdanov et al., 2002). ­ ­ Serologisch-diagnostisch ist das EcN-Lipopolysaccharid als Oberflächenantigen (O-Antigen) vom Typ O6 anzusprechen. Ein zweites Set von Strukturelementen mit signalvermittelnder Wirkung sind die drei verschiedenen, in ihrer Kombination EcN-­typischen Fimbrien (F1A-, F1C- und „Curli“- Fimbrien). Diese sind zum einen wichtig für die Biofilmbildung, zu der EcN im Gegensatz zu anderen Coli-Bakterien auch bei der physiologischen Körpertemperatur von 37  °C in der Lage ist (Lasaro et al., 2009). Zum anderen können die ­ Fimbrien aufgrund ihrer Adhäsions­eigenschaften auch den Kontakt zur Epithelzelle bzw. zum Darmschleim vermitteln. Ein drittes Strukturelement mit signalvermittelnden ­Eigenschaften sind die Geißeln (Flagellen), die den EcN-Stamm primär in die Lage versetzen, sich im zähflüssigen Darmschleim aktiv f­ortzubewegen. Daneben sind die Flagellen von EcN verantwortlich für die Induktion der Synthese anti­mikrobieller Peptide (Defensine u. a.) im Darm­epithel, eine Fähig­ keit, die ­unter anderem für die therapeutische Effektivität des Keims bei Colitis ulcerosa von Bedeutung ist (Schlee et al., 2007). Auch die Kapsel vom Serotyp K5 ist wichtig bei der Interaktion zwischen EcN und den Darm­ epithelzellen (Hafez et al., 2009, 2010). Gencluster des Chromosoms, die für die phäno­typischen Merkmale von E. coli Nissle 1917 codieren 7 verschiedene Eisen­­­ auf­nahme-­Systeme als ­wichtige Fitness­faktoren

2 antagonistisch aktive Mikrocine

Chromosom

keine ­Pathogenitätsfaktoren Fimbrien 3 verschiedene Typen von Fimbrien ermöglichen Adhärenz und ­Biofilm­bildung

Flagellen (H1-Serotyp) sorgen für aktive Fortbewegung

Abb. 20  Sicherheitsaspekte von E. coli Nissle 1917.

Neben den Syntheseleistungen (Produktion von löslichen Signalstoffen), die das Vorhandensein der lebenden Bakterienzelle voraussetzen, sind auch ­bakterielle Strukturelemente, die für das Wirtsgewebe Signalfunktion haben, für die Interaktionen zwischen E. coli Nissle 1917 (EcN) und dem Darm­ epithel von Bedeutung (Behnsen et al., 2013). Zu diesen Struktur­elementen zählt das besondere stammtypische ­Lipopolysaccharid (LPS), das aufgrund der stark ver­kürzten Oligosaccharid-Seitenkette dafür verantwortlich ist, dass EcN nicht in der Lage ist, eine S ­ epsis zu verursachen. So ist der EcN32

2 stammtypische Plasmide ohne AntibiotikaResistenz-Gene, nicht übertragbar

Kapsel (K5)

Spezielle immunmodulatorische LPS-Variante vom Serotyp O6 , bisher bei keinem anderen Stamm nachgewiesen

Serotyp O6 : K5 : H1

Abb. 21 Phänotypische Charakteristika von E. coli Nissle 1917 (EcN) und ihre Genloci auf dem Bakterien­chromosom. Die wichtigsten Strukturkomponenten von E. coli Nissle 1917 mit signal­ vermittelnden Eigenschaften sind rot umkreist: O6-Antigen, adhäsive Fimbrien (F1A-, F1Cund „Curli“-Fimbrien), Kapsel-Komponenten und Flagellen (H1-Antigen). 33

Wirkungen und Wirkmechanismen von E. coli Stamm Nissle 1917 Mikrobielle Kommunikation und Interaktionen („Cross Talk“) im Gastrointestinaltrakt Mikroorganismen im Gastrointestinaltrakt kommunizieren über lösliche oder strukturgebundene Signalmoleküle mit der Darmschleimhaut des W ­ irtes. Diese Interaktion nennt man „Cross Talk“ [Abb. 22] (Köhler et al., 2003; ­Lebeer et al., 2010; Sekirov et al., 2010).

Darmkeime Pathogene

Kommensale

Probiotische Mikroorganismen Signalmoleküle Darmlumen Tight Junctions, Adherence Junctions und Desmosomen Mucinschicht Darmepithelzellen Basalmembran

Abb. 22 Mikrobielle Kommunikation und Interaktion im Gastrointestinaltrakt. Kommensale Darmkeime (blau) und probiotische Mikroorganismen (grün) ­produzieren ­verschiedene, sich gegenseitig beeinflussende und auch auf die Darmepithelzellen ­einwirkende Signalmoleküle (blaue und grüne Kügelchen). Durch die Produktion von Bakteriocinen (rote Blitze) hemmen bestimmte Darmbakterien, wie E. coli Nissle 1917, ­pathogene Mikroorganismen und hindern diese an der Kolonisierung des Intestinaltrakts.

Auch untereinander tauschen Darmbakterien Informationen aus, was zumeist durch lösliche Signalstoffe vermittelt wird. Zu diesen Signalstoffen gehören die N-Acylhomoserinlaktone (AHSL) gramnegativer Bakterien und die modi­fizier­ten Peptidmoleküle grampositiver Bakterien, die beim sog. „Quorum Sensing“ von Bedeutung sind (Kaper & Sperandio, 2005; S ­ hiner et al., 2005). Darunter versteht man die Fähigkeit der Darmbakterien, die Zelldichte ihrer Populationen zu messen und entsprechend zu agieren. Mit anderen löslichen Faktoren, den chemisch heterogenen Bakteriocinen, 34

die vielfältige anti­mikrobielle Wirkungen haben, halten bestimmte Darmbakterien Infektionskeime fern – eine Eigenschaft, die auch für uns als Wirtsorganismen von N ­ utzen ist (Gillor et al., 2008; K ­ irkup, 2006) [Abb. 22]. So produziert z. B. E. coli ­Nissle 1917 (EcN) zwei verschiedene antibakteriell ­wirkende Substanzen, Mikrocin M (M von Mutaflor®) und Mikrocin H47 ­(Patzer et al., 2003). Die Mikrocine bilden eine Untergruppe der Bakteriocine und wirken hauptsächlich auf nahe verwandte Keime des Produ­ zentenstamms, bei EcN vor allem auf andere gramnegative Entero­bakterien.

Bildung von Biofilmen und Mikrokolonien im Darm Als strukturgebundene Signalmoleküle sind insbesondere die von E. coli ­Nissle 1917 (EcN) gebildeten Fimbrien und Geißeln (Flagellen) von Bedeutung, die die interbakterielle Vernetzung und die Biofilmbildung des Keims an der Darmschleimhaut, genauer gesagt an der dem Darmepithel lumenseitig aufliegenden Mucinschicht, vermitteln (Troge et al., 2012). Die schematische Darstellung der ­Entste­hung eines Biofilms ist in Abb. 23 gezeigt ­(Jenkinson & ­Lappin-Scott, 2001). Wie Untersuchungen mit keimfreien Ratten gezeigt haben, deren Intestinaltrakt nach oraler Verabreichung (Mono­ assoziation) mit EcN besiedelt wurde, haben die probiotischen Coli-Bakterien eine ­starke Affinität zum Darmschleim, wo sie Mikrokolonien oder ➤O  berflächenenergie des Substrats  äumliche Nähe ➤ R „propinquity“

➤ Physiko-chemische Faktoren ➤ Nährstoffangebot ➤ K  ommemsalismus ➤ M  utualismus

➤ H  ydrodynamische Scherkräfte

➤ P  hänotypische Veränderungen

Strömungsrichtung

Adhäsion ➜

Kolonisation ➜

Akkumulation ➜

Verbandsbildung ➜

Ablösung

„climax community“

Abb. 23 Schematische Darstellung der Ausbildung eines Biofilms an der Darmschleimhaut (nach Jenkinson & Lappin-Scott, 2001). 35

Bio­filme a ­ usbilden [Abb. 24]. Für den Menschen als Patient bedeutet die Fähigkeit von EcN zur Biofilmbildung, dass eine im Verhältnis zur gesamten Darm­mikrobiota (ca. 1014 Keime) relativ geringe Menge an probiotischen Bakterien (ca. 1010 lebende Zellen/Einzeldosis) sich nach der Freisetzung aus der magensaftresistenten Mutaflor®-Kapsel nicht nur im Dickdarm lokal verteilt, sondern auch nach Assoziation an den Darmschleim ­dreidimensional vernetzen kann. Dies hat zur Folge, dass die Verweilzeit der verabreichten Keime am Ziel­ort, dem Colon, verlängert wird.

(­Joeres-Nguyen-Xuan et al., 2010). Die Fähigkeit von EcN zur Biofilmbildung zeigte sich in dieser Studie dadurch, dass eine Elimination des Keims aus dem Darm nach Absetzen der Medikation stark verzögert verlief. So war EcN nach 2 Wochen noch bei knapp 50 % der Probanden nachweisbar, nach 12 Wochen noch bei ca. 25 %. [Abb. 25]. Die Lebens­fähigkeit der EcN-­Bakterien im Darm wurde durch die antibakterielle Wirkung von Mesa­ lazin nicht signifikant beeinflusst. Die Feststellung, dass Mesalazin keine negativen Auswirkungen auf die Vitalität von EcN hat, eröffnet die Möglichkeit einer Co-Medikation bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Die bei E. coli Nissle 1917 (EcN) besonders stark ausgeprägte Fähigkeit zur ­Adhäsion verhindert, dass die oral verabfolgten EcN-Bakterien nach der Magen-Darm-­Passage schnell wieder ausgeschieden werden und verlängert ihre Persistenz im Intestinaltrakt.

Probanden [%] mit positivem Nachweis von E. coli Nissle 1917 im Stuhl 100

E. coli Nissle 1917 + Mesalazin E. coli Nissle 1917 + Placebo

80 60

Abb. 24 Besiedlung des Darmschleims durch E. coli Nissle 1917 nach oraler Verabreichung an keimfreie Ratten. Die Pfeile zeigen auf schleimumhüllte Bakterienzellen (rasterelektronenmikroskopische Aufnahme: A. Lorenz, J. Schulze, Potsdam-Rehbrücke).

Eine experimentelle Untersuchung zur Entstehung von Biofilmen zeigte für pathogenen (EPEC), E. coli Nissle 1917 (EcN) eine im Vergleich zu entero­ entero­toxischen (ETEC) und entero­hämorrhagischen E. coli-­Stämmen (EHEC) deutlich bessere Fähigkeit zur Biofilmbildung. Auch scheint EcN in der Lage zu sein, die pathogenen E. coli-Stämme während der Biofilmbildung zu ver­ drängen ­(Hancock, Dahl et al., 2010). Die Biofilmbildung beruht u. a. darauf, dass EcN C ­ ellulose produzieren kann, die in Biofilmen als extrazelluläre Matrix dient (Monteiro et al., 2009). Für die Ausbildung von Biofilmen sind die F1C-­ Fimbrien von EcN von besonderer Bedeutung (Lasaro et al., 2009). In einer placebokontrollierten, randomisierten doppelblinden Studie ­erhielten 48 gesunde Probanden 2 x täglich 2,5 – 25 x  109 E. coli Nissle 1917 (EcN)/Kapsel + 1500  mg Mesalazin oder 2,5 – 25 x 109 EcN-Bakterien/Kapsel + ­Placebo 36

40 20

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

12

16

24

32

40

48

Wochen

Abb. 25 Nach oraler Verabreichung an Probanden persistiert E. coli Nissle 1917 noch über Wochen im Darm einiger Testpersonen. Die Überlebensfähigkeit von E. coli Nissle 1917 im Darm wird durch Mesalazin nicht signifikant beeinflusst (nach Joeres-Nguyen-Xuan et al., 2010).

Als Konsequenz für die klinische Praxis kann festgestellt werden, dass die Biofilmbildung von E. coli Nissle 1917 die Kolonisationsfähigkeit des Probio­ tikums verbessert und die Persistenz der Keime im Intestinaltrakt verlängert.

37

Die Stärkung der intestinalen Barrierefunktion Präklinische In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen haben zu der Erkenntnis geführt, dass die klinische Wirksamkeit von bestimmten Probiotika, darunter auch von E. coli Nissle 1917 (EcN), zumindest teilweise, wenn nicht sogar über­wiegend, auf eine intensive Kommunikation („Cross Talk“) der verabreichten nützlichen Mikroorganismen mit dem Darmepithel zurückzuführen ist. Dabei resultiert diese Kommunikation zwischen Probiotikum und Wirtsorganismus in einer generellen Stärkung der Barrierefunktion der Darmschleimhaut. Für EcN ­wurden bisher drei grundlegende Wirkmechanismen entdeckt, die in ihrer Gesamtheit eine Verbesserung der intestinalen Barrierefunktion zur Folge haben: 1. ein Anti-Invasionseffekt (Hemmung der Invasion von pathogenen entero­invasiven Mikroorganismen in die Darmepithelzellen), 2. ein Induktionseffekt auf die Synthese von antimikrobiell wirkenden ­körpereigenen Peptiden (Defensinen u. a. Wirkstoffen) durch die Darm­ epithelzellen, 3. eine Stärkung des Zusammenhalts des epithelialen Zellverbands durch die Beeinflussung bestimmter Zell-Kitt-Proteine (Zonula-occludens-Proteine) der sog. „Tight Junctions“. 1. Der Anti-Invasionseffekt am Darmepithel: Bestimmte pathogene Durchfall­ erreger sind in der Lage, in die Epithelzellen der Darmschleimhaut ­einzudringen. Man spricht hier von sog. enteroinvasiven Mikroorganismen. Zu diesen gehören beispielsweise die Ruhr-Bazillen (Shigellen), Salmonellen, Yersinien u. a. Die invasive Aktivität dieser Mikroorganismen kann man im mikrobio­logischen Labor durch spezielle Invasionstests mit menschlichen epithelialen Zellkulturen nachweisen [Abb. 26]. Die Infektion des Darmepithels mit entero­invasiven pathogenen Keimen initiiert profuse Diarrhöen, die bei stärkerem Befall der Schleimhaut auch zum Absetzen blutiger oder blutig-schleimiger Stühle führen können. Dies beruht darauf, dass die enteroinvasiven Keime letztendlich die Darmepithelzellen zerstören und z. T. großflächige Ulzerationen bewirken können. Die gegen solche Infektionserreger gerichtete Aktivität von Probio­ tika kann prinzipiell durch drei Wirkmechanismen zustande kommen: a)  ein direkter antagonistischer Effekt gegen die patho­­­ genen Erreger (Hemmung der Zellvermehrung bzw. Abtötung der Durchfallkeime), b) eine Besetzung von Rezeptoren an der Zellmembran der Darmepithelzelle oder in der aufliegenden Mucinschicht, so dass die pathogenen Keime k ­ eine „Andock­stellen“ finden, und/oder c) eine stabilisierende Wirkung auf die Darmepithelzelle, so dass diese dem Angriff der invasiven Erreger besser standhalten kann. 38

A

B

HeLa-Kontrolle

C

HeLa- + EIEC

HeLa + S. typhimurium

(ohne Mikroorganismen)

D

HeLa + S. typhimurium

E

HeLa + E. coli Nissle 1917

Abb. 26 In-vitro-Invasionstests von enteroinvasiven und apathogenen Enterobakterien mit HeLa-Zellen in der Zellkultur. EIEC: Enteroinvasive Escherichia coli-Bakterien, S. typhimurium: Salmonella typhimurium. Nach gemeinsamer Inkubation von enteroinva­siven Keimen und Epithelzellen sind Erstere bald im Inneren der Epithelzelle zu finden, wo sie sich rasch v­ ermehren können (B, C, D). Demgegenüber ist der nicht-invasive E. coli Stamm Nissle 1917 nach Co-Inkubation mit den Epithelzellen nicht im Inneren der Epithelzelle zu ­finden, sondern adhäriert außen an der Zellmembran (E). (Fluoreszenz­ mikroskopische Darstellung; Aufnahmen: A. Fahsbender, U. Sonnenborn, Herdecke).

Ein direkter antagonistischer Effekt von E. coli Nissle 1917 (EcN) gegen patho­ gene Erreger ist seit langem bekannt und wurde durch aktuelle Untersuchungen bestätigt [Abb. 27] (Kandasamy et al., 2014; Kleta et al., 2014; L ­ eatham et al., 2009; Schinner et al., 2015; Schroeder et al., 2006; ­Sonnenborn & ­Schulze, 2009; Storm et al., 2011). Es hat sich herausgestellt, dass EcN auch in der Lage ist, die Toxinproduktion pathogener Keime zu unterbinden. So reduziert EcN in Co-Kultivierung mit Shiga-Toxin produzierenden E. coliStämmen (EHEC) signifikant deren Wachstum, die stx-Genexpression und die Shiga-Toxin-Produktion (Mohsin et al., 2015; Reissbrodt et al., 2009; Rund et al., 2013). Während ein kürzlich von einer Forschergruppe E. coli-Stamm ähnliche des Robert-Koch-Instituts isolierter kommensaler ­ ­Wirkun­gen auf EHEC-Stämme wie EcN aufweist, z­eigen andere kommen­ sale ­ E. ­coli-Stämme und probiotische Bakterienstämme keine oder nur ­ eimen ­geringe Hemmwirkung [Abb. 28]. Eine Verdrängung von pathogenen K am Darm­epithel beruht u. a. auf der Fähigkeit von EcN, Biofilme zu bilden ­(Hancock, Dahl et al., 2010, s. oben „Bildung von Biofilmen“). Die Biofilmbildung geht einher mit einer Stimulierung der intestinalen Mucinsynthese (Hafez et al., 2012). EcN reduziert auch die Salmonellenadhäsion an Darm­ epithelzellen bei Schweinen (Schierack et al., 2011). 39

log KBE/g Fäzes 10 9

9

8

8

7

7

6

6

5

5

4

4

3

3 EHEC (E. coli EDL933) E. coli MG1655

2 1

Untersuchungen am Institut für Mikrobiologie der Tschechischen A ­ kademie der Wissenschaften in Novy Hradek haben darüber hinaus gezeigt, dass eine Besiedlung keimfreier Schweinchen mit E. coli Nissle 1917 die Translokation nachfolgend verabreichter Salmonella Thyphimurium-­Bakterien über die Darmschleimhaut in die mesenterialen Lymphknoten und die w ­ eitere Streuung über den Blutkreislauf verhinderte (Splichalova et al., 2011). Demgegenüber konnte für Bifidobacterium choerinum, einen schweine­ spezifischen Darmkeim, kein prophylaktischer Effekt gezeigt werden.

log KBE/g Fäzes 10

0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 Zeit (d)

EHEC (E. coli EDL933) E. coli Nissle 1917

2 1

0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 Zeit (d)

Abb. 27 Mit Streptomycin behandelte CD-1 Mäuse wurden prophylaktisch mit kommensalen E. coliStämmen (E. coli MG1655, E. coli Nissle 1917) besiedelt. Nur E. coli Nissle 1917 hemmt die An­siedlung des nach 10 Tagen verabreichten enterohämorrhagischen E. coli (EHEC EDL933) im ­Mäusedarm. KBE = Kolonie-bildende Einheiten (nach Leatham et al., 2009).

Abb. 28 Stamm-spezifische Wirkung von probiotischen Bakterien auf die Konzentration von ShigaToxinen nach Co-Kultivierung mit Shiga-Toxin produzierenden E. coli (EHEC-Stämme). E. coli N ­ issle 1917 reduziert signifikant die Shiga-Toxin-Konzentration (nach Reissbrodt et al., 2009). 40

Untersuchungen am Institut für Molekulare Infektionsbiologie der Universität Würzburg mit der intestinalen Zelllinie INT407 haben ergeben, dass der anti-invasive Wirkmechanismus von E. coli Nissle 1917 (EcN) durch eine d ­ irekte Einwirkung des ­pro­biotischen Coli-Bakteriums auf die Darmepithelzelle zustande kommt (Altenhoefer et al., 2004; Oelschlaeger et al., 2001). Bei CoKulti­vierungen von INT407-Zellen mit EcN oder dem apathogenen Kontrollstamm E. coli K-12 wurden keine Bakterien in den Epithelzellen gefunden, d. h. beide Escherichia coli-Stämme haben keine invasiven Fähigkeiten. Im Gegensatz dazu kommt es bei Co-Kultivierung der Epithelzellen mit den Salmonella typhimurium-Stämmen C17 bzw. LT2 zum Eindringen der invasiven Bakterien in die Darmzellen. Nach Co-Inkubation kann man mehr als 40 % des verabreichten Inokulums des virulenteren Salmonellenstamms (C17) in den Epithelzellen wiederfinden. Bei dem schwächer viru­ ­ almonellenstamm (LT2) beträgt die Invasionsrate gut 10 %. Führt lenten S man nun eine dreifache Co-Kultivierung mit Epithelzellen, Salmonellen und ­E. ­coli-Bakterien durch, so wird die Invasivität der Salmonellen nur im Falle der Co-Kultivierung mit E. coli Nissle 1917 deutlich reduziert. Im Vergleich dazu zeigt der Kontrollstamm E. coli K-12 keinen anti-invasiven Effekt. Zur Klärung der Frage, wie der anti-invasive Effekt von E. coli Nissle 1917 (EcN) zustande kommt, wurden verschiedene Versuchsansätze in der Zellkultur durchgeführt. Bei Inkubationen der Epithelzellen mit S. typhimurium C17 und EcN ließ sich der Anti-Invasionseffekt von EcN gegenüber S. typhimurium C17 gut reproduzieren. Dabei kam es zu keiner Abnahme der Salmonellen-Zellzahlen in den Versuchs­ansätzen, was vermuten lässt, dass der durch EcN bewirkte Anti-Invasions­effekt nicht durch die Ausschüttung der antimikrobiell wirkenden Mikrocine zustande kommt. Auch mit einer Mikrocin-negativen Mutante von EcN (Stamm H5445) war der anti-invasive Effekt noch in vollem Umfang vorhanden. Das beweist, dass dieser Wirkmechanismus des EcN-Stamms nicht mit seiner Fähigkeit verknüpft ist, antimikrobielle Substanzen zu produzieren. Ebenso kommt eine Besetzung von Haftstellen für die invasiven Salmonellen an der Zellmembran der Epithelzellen durch EcN nicht als Wirkmechanismus 41

in Frage. Diese Möglichkeit konnte man ausschließen durch eine Versuchs­ anordnung, bei der die probiotischen EcN-Bakterien durch Einbringen in ­einen Filtereinsatz von den pathogenen Salmonellen wie auch von den E ­ pithelzellen getrennt wurden. Bei diesem sog. „Transwell-System“ handelt es sich um einen Filtereinsatz, dessen Bodenfläche mit einer semipermeablen Membran bestückt ist, die zwar durchlässig ist für Moleküle, nicht aber für ganze ­Bakterienzellen. Trotz der räumlichen Trennung von EcN und den anderen Testkomponenten blieb der Anti-Invasionseffekt von EcN erhalten. Dieser Befund spricht – in Zusammenhang mit den anderen Ergebnissen  – ­dafür, dass der anti-invasive Effekt von EcN auf der Synthese d ­ iffusibler Signal­moleküle beruht, die auf die Epithelzellen in einer Art und Weise einwirken, dass diese unempfindlicher werden gegenüber den Invasions­mechanismen des virulenten Salmonellenstamms. Welche Signalsubstanzen von EcN diesen Effekt bewirken und welche Gene dafür verantwortlich sind, ist zur Zeit Gegenstand intensiver Forschung. Neuere Untersuchungen auf zellbiologischer Ebene haben ergeben, dass E. coli Nissle 1917 die Aktivität des Invasionsapparats von Salmonellen r­eduziert (Schierack et al., 2011). Dies führt dazu, dass die ersten Invasions­schritte ­ rreger, wie die Epithelzelladhäsion, unterdrückt werden. der pathogenen E

50

Monoinkubation Co-Inkubation mit E. coli K-12 DH5α Co-Inkubation mit E. coli Nissle 1917

Invasionseffizienz [%]

40 30 20 10 0

Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stamm C17

Stamm SL 1344

Yersinia enterocolitica Stamm WA-C

Stamm WA314

Shigella flexneri Stamm M90T

Abb. 29 Nachweis der Anti-Invasionswirkung von E. coli Nissle 1917 gegen die Salmonella Typhimurium-­ Stämme C17 und SL1344, die Yersinia enterocolitica-Stämme WA-C und WA314 und den ­Shigella flexneri-Stamm M90T in vitro. Für den Nachweis wurden Co-Inkubationen von E. coli Nissle 1917 mit den o. g. pathogenen Bakterienstämmen in Zellkulturversuchen mit INT407-­ Zellen durchgeführt (nach Altenhoefer et al., 2004). 42

Erfreulicherweise funktioniert die Anti-Invasionswirkung von E. coli Nissle 1917 (EcN) nicht nur mit Salmonellen, sondern auch mit verschiedenen ­anderen invasiven Infek­tions­erregern (Altenhoefer et al., 2004; Huebner et al., 2011). So konnten Altenhoefer et al. (2004) in Zellkulturver­suchen mit der INT407-Zelllinie auch die Hemm­wirkung von EcN auf das Invasionsver­ mögen von Yersinia enterocolitica und Shigella flexneri [Abb. 29] sowie von Listeria monocytogenes und Legionella pneumophila nachweisen. Dies ist um so interessanter, da die verschiedenen invasiven Keime über völlig unterschied­liche Invasionsmechanismen verfügen, ein weiterer Hinweis ­darauf, dass die Anti-Invasionswirkung von EcN auf einer direkten Beeinflussung grundlegender Signalvorgänge in der Epithelzelle selbst beruht. Desweiteren konnten die Infektionsbiologen bestätigen, dass die beobachtete Hemmung der Z ­ ellinvasion der darmpathogenen Erreger durch EcN nicht auf der M ­ ikrocin-Produktion beruht, keines direkten Kontakts zwischen EcN und den invasiven Bakterien bzw. z­ wischen EcN und den Epithelzellen bedarf und auch nicht vom ­Vorhandensein der F1A- bzw. F1C-Fimbrien abhängig ist. Eine mögliche Bedeutung von ­plasmidcodierten Genprodukten für den Anti-Invasionseffekt konnte ebenfalls nicht gefunden werden, da ein plasmidfreies EcN-Derivat dieselbe Anti-­In­vasionswirkung zeigte wie der Originalstamm. Dies bedeutet, dass auch die EcN-typischen kleinen Plasmide pMUT1 und pMUT2 [s. Abb. 21] für den invasions­­hemmenden Effekt von EcN nicht erforderlich sind, die Erb­information für die Anti-In­ vasionswirkung also chromosomal codiert sein muss. Welche Gene auf dem EcN-Chromosom den anti-invasiven ­Effekt bewirken, ist Thema aktueller molekulargenetischer Untersuchungen. Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass E. coli Nissle 1917 (EcN) bisher noch unbekannte Signalmoleküle sezerniert, die direkt auf die Darm­ epithelzellen einwirken, wodurch deren Funktion als Infektionsbarriere gegen entero­invasive Keime deutlich verbessert wird. Diese anti-invasive Aktivität r­ epräsentiert einen Aspekt des Cross Talk von EcN mit dem Darm­ epithel, der für die klinische Wirksamkeit bei bestimmten gastroenterologischen Indikationen von Bedeutung sein dürfte. Als Konsequenz für die klinische Praxis kann festgehalten werden, dass der anti-invasive Effekt von E. coli Nissle 1917 nicht nur wichtig ist bei Durchfallerkrankungen als Folge einer Infektion mit enteroin­vasiven Er­ regern, sondern auch bei der Behandlung von Patienten mit C ­ olitis ulcerosa, bei denen bekanntlich eine Infektion mit enteropathogenen ­ ­Keimen einen akuten Entzündungsschub auslösen kann.

43

2. Der Induktionseffekt auf die Synthese antimikrobieller Peptide des Darmepithels: Die Barrierefunktion der Darmschleimhaut gegenüber den im Darmlumen vorhandenen kommensalen Mikroorganismen wie auch gegenüber Infektionskeimen ist gekennzeichnet durch die Fähigkeit der ­Enterozyten, auf einen mikrobiellen Reiz hin besondere Peptidmoleküle und Proteine zu s­ ynthetisieren und auszuschütten, die sich durch breite anti­mikro­bielle Wirkungen auszeichnen. Zu den in den letzten Jahren intensiv untersuchten körper­eigenen Schutzsubstanzen gehören die humanen α- und β-Defensine und die Cathelicidine als niedermolekulare antimikrobielle Peptide, wie auch das vergleichsweise höhermolekulare Calprotectin und funktionell verwandte ­Proteine. Diese evolutionsbiologisch sehr alten Schutzsubstanzen der Epithelien sind Komponenten der sog. natürlichen oder angeborenen Immunität und werden nicht durch das spezifische ­adaptive Immunsystem reguliert. Bei bestimmten Darmerkrankungen, z. B. Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, ist die Synthese dieser Schutzstoffe vermindert (Wehkamp et al., 2005). Als Folge findet man bei den betroffenen Patienten im Gegensatz zu gesunden Personen eine dichte Besiedlung der Mucinschicht und der Darmepithelzellschicht mit kommensalen, z. T. auch mit pathogenen Darmkeimen (Swidsinski et al., 2002). Eine mögliche Stimulierung der krankheitsbedingt brach liegen­den Produktion dieser körpereigenen antimikrobiellen

Schutzstoffe durch P ­ robiotika wäre daher eine neue Wirkqualität dieser Lebendkeimpräparate. Die ersten experi­ mentellen Untersuchungen zur Wirkung verschiedener physio­logischer wie auch pathogener Darmkeime, darunter auch E. coli Nissle 1917 (EcN), auf die intestinale Defensin-Produktion wurden von Jan Wehkamp und K ­ ollegen am Robert-Bosch-Krankenhaus in Stuttgart vorgenommen (Wehkamp et al., 2002, 2004). Hierbei zeigte sich in In-vitro-Untersuchungen mit Zell­kulturen von Dickdarmepithelzellen (Caco-2-Zellen), dass der EcN-Stamm im Vergleich zu mehr als 40 anderen getesteten E. coli-Stämmen eine außer­gewöhnlich starke Stimulierung der Genexpression des induzierbaren Schutzfaktors humanes β-Defensin-2 (HBD-2) bewirkte [Abb. 30]. Weiterfüh­rende Untersuchungen zeigten, dass nicht nur die Genexpression von HBD-2 durch EcN dosis- und zeitabhängig stimuliert wurde, sondern dass die erhöhte ­Genexpression auch mit ­einer vermehrten Synthese des HBD-2-Peptids einherging (Wehkamp et al., 2004). Damit war ein neues Wirkprinzip von EcN entdeckt, das vermutlich für die klinische Wirksamkeit bei Patienten mit C ­ olitis ulcerosa von ­großer Bedeutung ist. Weitere Unter­suchungen zur Aufklärung des molekularen Wirkprinzips führten zu der Erkenntnis, dass die HBD-2-stimulierende Aktivität auf dem ­Vorhandensein von zwei Komponenten des EcN-Stamms beruht, und zwar dem EcN-eigenen Flagellenapparat (Schlee et al., 2007) sowie dem Modulatorprotein tcpC (Menz et al., 2011). Experimente mit

Relative Genexpression / mg RNA

20

44

HD-5

HBD-2

HD-6

15

10

5

0

Abb. 30 Wirkung veschiedener pathogener und apathogener E. coli-Stämme auf die Induktion der antimikrobiellen Peptide HBD-1, HBD-2, HD-5 und HD-6 : E. coli Nissle 1917 (EcN) zeigt die stärkste Induktion von HBD-2 in humanen CaCo-2 Epithelzellen (Wehkamp et al., 2002, 2004).

HBD-1

Kontrolle

EcN

EPEC

E. coli K-12

UPEC

E. coli PZ915

Abb. 31 Aufbau des Geißel(Flagellen)apparates von E. coli. Als ein Induktor der HBD-2-Synthese in Colonepithelzellen durch E. coli Nissle 1917 wurde das Strukturprotein Flagellin identifiziert, aus dem sich das Geißelfilament zusammensetzt. 45

verschiedenen Defektmutanten von EcN ergaben, dass nur E ­ cN-Keime, die ein intaktes Flagellum synthetisieren konnten, in der Lage waren, die HBD-2-Produktion in den Colonepithelzellen zu stimulieren. Als wirk­ same Komponente wurde das Geißel-Strukturprotein Flagellin iden­tifiziert, aus dem die eigentliche Geißel, das sog. Flagellenfilament, aufgebaut ist [Abb. 31]. Weitere Untersuchungen auf molekularer Ebene sollen zeigen, ­welches die Besonderheiten des EcN-Flagellins sind, die den ungewöhnlich starken HBD-2-induzierenden Effekt bewirken. EcN induziert nicht nur die Expression von humanem β-Defensin-2 (HBD-2) und von Cathelicidin LL37 in humanen Colonepithelzellen in vitro [Abb. 30] (Wehkamp et al., 2004), sondern auch die Synthese von Calprotectin im Darm gnotobio­ tischer Ferkel in vivo (Splichal et al., 2005). Als Konsequenz für die klinische Praxis bedeutet die Induktion von körpereigenen Abwehrstoffen der angeborenen Immunität durch E. coli ­ Nissle 1917 eine generelle Stärkung der antimikrobiellen Abwehrkraft der Darmschleimhaut. Dies ist von besonderer Bedeutung für bestimmte gastro­ enterologische Erkrankungen, wie die chronisch entzündlichen Darm­ erkrankungen, bei denen die Synthese antimikrobieller Peptide durch die Mucosa krankheitsbedingt darniederliegt.

3. Die Stärkung des Zusammenhalts des epithelialen Zellverbands: Im gesunden Zustand ist die Translokationsrate (Übertrittfrequenz) von großmolekularen antigenen Nahrungsbestandteilen oder korpuskulären Teilchen, wie Bakterien, Viren und Pilzen, vom Darm ins Körperinnere sehr niedrig und strikt reguliert (Arrieta et al., 2006; Turner, 2009). Dabei wird nur soviel an Translokation erlaubt, wie benötigt wird, um eine gewisse Basisaktivierung („Hab-acht-Stellung“) des Immunsystems zu gewährleisten. Beim gesunden Menschen gibt es kein überschießendes Wachstum der luminalen Darm­ mikrobiota, die Permeabilität des Darmepithels für größere Partikel ist stark reduziert und das darmassoziierte Immunsystem verfügt über genügend Makrophagen, regulatorische T-Zellen, IgA-produzierende Plasmazellen und andere Lymphozyten, um einzelne, über das Darmepithel t­ranslozierte Mikro­ organismen abzufangen. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen erfolgt jedoch ein erhöhter Transfer luminaler Antigene ins Körper­innere. Dies kann verschiedene Ursachen haben [Abb. 32]: – ­eine überschießende Vermehrung von Darmkeimen oder von pathogenen Erregern im Darm bzw. eine reduzierte intraluminale Abtötung/Verdauung von Mikroorganismen und Nahrungsbestandteilen, – eine beschädigte Darmschleimhaut mit erhöhter Permeabilität für groß­ molekulare Antigene und ganze Mikrobenzellen („Leaky Gut“), – eine reduzierte Abwehrleistung des darmassoziierten Immunsystems, z. B. durch einen Mangel an Antikörper-produzierenden Plasmazellen (IgA, IgM) in der Lamina propria. In der Praxis ist das Vorkommen eines „Leaky Gut“ mit erhöhter Permea­ bilität der Darmschleimhaut wesentlich häufiger anzutreffen als etwa eine überschießende Vermehrung von Darmmikrobiota-Komponenten oder eine drastische Reduzierung der Aktivität des darmassoziierten Immunsystems. Der „Leaky Gut“ ist durch eine pathologisch veränderte epitheliale Barriere mit erhöhter Durchlässigkeit für antigenes Material aus dem Gastrointestinal­ trakt gekennzeichnet. Dieser Zustand beruht in vielen Fällen auf einer Reduzierung der Zahl der Zell-Kitt-Proteine in den sog. „Tight Junctions“ (auf deutsch „feste Verbindungen“), und damit einer Lockerung des intestinalen Zellverbands. Der „Leaky Gut“ kann nach Schädigung des Darmepithels durch pathogene Erreger und deren Toxine, durch bestimmte Arzneimittel und andere das Epithel schädigende Substanzen sowie durch Bestrahlungen entstehen. Eine erhöhte Permeabilität des Darmepithels kann aber auch Begleiterscheinung bestimmter intestinaler Erkrankungen sein und lässt ­ achweisen. sich beispielsweise bei Colitis ulcerosa und Morbus Crohn n

46

47

➋

Lymphsystem

IgA

IgM

IgA

IgM

➌

IgM IgA

Lumen Mucosa

Lymphsystem

Submucosa

➊ Lumen Mucosa

Submucosa

➊  reduzierte intraluminale Verdauung / überschießende mikrobielle Vermehrung ➋  beschädigte Schleimhaut-Barriere, erhöhte Permeabilität („Leaky Gut“) ➌  Abnahme der IgA- und IgM-produzierenden Plasmazellen in der Lamina propria Abb. 32 Regulierte und restriktive Aufnahme von großmolekularen Antigenen und Mikroorganismen aus dem Darmlumen ins Körperinnere (Translokation) unter physiologischen Bedingungen (linkes Bild) und erhöhter Transfer unter pathologischen Bedingungen verschiedener Ursache (rechtes Bild).

Die erhöhte Durchlässigkeit der Darmschleimhaut („Leaky Gut“), die Zunahme der bakte­riellen Trans­lokation und in der Folge erhöhte Endotoxinspiegel im Blut werden auch für die progrediente Leberschädigung bei der Alkohol-induzierten Leberzirrhose verantwortlich gemacht. E. coli Nissle 1917 (EcN) kann durch Modulation der gestörten Darmmikrobiota, durch Stärkung der Darmbarriere und Senkung der Infektanfälligkeit, die ­klinischen Symptome bei Zirrhose-Patienten („Child ­Pugh Score“) deutlich bessern. Die dafür ursächlichen molekularen Wirkmechanismen sind noch zu entschlüsseln, um das Infektions­risiko bei Zirrhose-Patienten gezielt zu senken und die protektive Wirkung von EcN optimal zu nutzen (Lata et al., 2007). Die zuvor angesprochenen Tight Junctions, die auf der apikalen Seite der Darmepithelzelle die sog. Zonula occludens des Interzellularraums bilden, repräsentieren einen Typ von speziellen Verbindungen zwischen den Epithelzellen. Zu den Interzellularverbindungen gehören verschiedene membran­stän­dige Multiprotein-Komplexe, die eine Bindung zwischen den Zellmembranen benachbarter Epithelzellen der Darmschleimhaut vermitteln. Die interzellu­lären Verbindungen sorgen dafür, dass die Epithelzellen 48

dicht aneinander liegen und dass das Darmgewebe zusammengehalten wird. ­ Weitere Verbindungen mit Haltefunktion sind die Desmosomen, ­wobei man zyto­logisch zwischen Belt-Desmosomen (Zonula adhaerens) und Spot-Desmosomen (Macula adhaerens) unterscheidet. Sogenannte „Adherence Junctions“ folgen auf die apikal ­lokalisierten Tight Junctions und stellen einen besonderen Typ an Desmosomen dar, der die Epithelzellen bandartig umgibt. Funktionell dienen alle Arten von Desmosomen in erster Linie der mechanischen Festigkeit des epithelialen Zellverbands. Besondere Interzellularverbindungen sind die Gap Junctions (Nexus), die ­direkte plasmatische Verbindungen ­zwischen den Epithelzellen darstellen und ­daher vor allem kommunikative Aufgaben haben. Der kompliziert aufgebaute Tight Junctional Complex (TJC) gehört zu den Interzellularverbindungen, die räumlich gesehen dem Darmlumen am nächsten sind, da sie sich auf der apikalen Seite der Epithelzellschicht befinden. Der TJC enthält mehrere „Klammer“- oder „Kitt“-Proteine, die als Zonula occludens-Proteine bezeichnet werden (abgekürzt ZO-1, ZO-2 und ZO-3) [Abb. 33]. Diese „Kitt“-Proteine sorgen für den festen Zusammenhalt des Zellverbands und die Dichtigkeit der Interzellularspalten zwischen den Epithelzellen, daher die lateinische Bezeichnung „Zonula occludens“. Die Zahl der „Kitt“-Proteine vor Ort bestimmt die Dichtigkeit des Interzellular­ spalts und damit die Un­ durch­ lässigkeit des epithelialen Zellverbands. Apikale Membran

Tight Junction Adherence Junction

F- Aktin

Desmosom

Occludin

ZO-1

Claudin

ZO-2

JAM

ZO-3 Nectin

Protein X Afadin

Adherence Junction Matrix

E-Cadherin

Protein Y

α-Catenin

IgA

– pathologisch –

β-Catenin

– normal –

Basalmembran

Abb. 33 Bild links: Schematische Darstellung der Interzellularverbindungen von Darmepithelzellen (Tight Junctions, Adherence Junctions, Desmosomen). Bild rechts: Aufbau des Tight Junctional Complex (TJC) auf der apikalen Seite der Darmepithel­ zellen. Die wichtigsten „Kitt“-Proteine, die den Interzellularspalt aktiv öffnen oder schließen können, sind dargestellt (nach Miyoshi & Takai, 2005). 49

Ihre Verteilung innerhalb der Epithelzelle (zytoplasmatische oder mem­­bran­ ständige Lokalisierung wird durch ein Netzwerk komplexer Signalkaskaden reguliert, wobei Sub­ typen der Proteinkinase C (PKC) von besonderer Be­deutung sind (Hering et al., 2014; Zyrek et al., 2007). Im Gegensatz zu den ­Ad­h erence Junctions bzw. mosomen haben die Tight Junction Zonula adhaerens Macula adhaerens Des­ Tight ­ Junctions dynamiAbb. 34 Elektronenmikroskopische Aufnahme: sche Funktionen zu erfüllen Benachbarte Darmepithelzellen mit Interzellular­spalt, [Abb. 34]. Ihre „Tightness“ Tight Junction und Desmosomen. reguliert den Einstrom von Elektrolyten und korpuskulären P ­ artikeln, wie Bakte­rien, Viren oder ­Pilze, ins Körperinnere. Im g ­ esunden Zustand sind die Tight Junctions völlig dicht und es findet so gut wie kein Austausch von Substanzen oder Organismen über den Interzellularspalt statt. Bestimmte Durchfallerreger, wie entero­ pathogene E. coli-Stämme (EPEC), sind in der Lage, durch die Ausschüttung von Toxinen oder Signalstoffen die Festigkeit der Tight Junctions zu lockern und sich so eine Zugangspforte in den menschlichen Körper zu öffnen. Interessanterweise ist E. coli Nissle 1917 (EcN) in der Lage, die durch den Angriff enteropathogener Erreger gelockerten Tight Junction-Verbindun­ ieder zu festigen und damit die Integrität des Darmepithels wieder gen w ­herzustellen (Trebichavsky et al., 2010). Wie M. Alexander Schmidt und Mitarbeiter am Institut für Infektiologie des Universitätsklinikums Münster unter Verwendung der sog. DNA-Microarray-Technik zeigen konnten (Cichon et al., 2004; Zyrek et al., 2007), bewirkt eine Co-Inkubation von Darmepithel­ ­ enexpression zellen (T84-Zellen) mit EcN eine zeitabhängige Induktion der G für Proteine, die an Aufbau und Zusammenhalt von Tight ­Junctions bzw. ­Desmosomen beteiligt sind. Insgesamt führt der Kontakt der ­Epithelzellen mit EcN zu einer Veränderung der Expression von über 300 ­Genen, wobei sowohl Herauf- als auch Herunter­regu­lierungen der Gen­aktivität verschiedener epithelialer Erbfaktoren fest­ gestellt wurden. In den verwendeten T84-Zellen wurde eine erhöhte ­Genexpression für die Tight Junction- bzw. Desmosomen-Proteine ZO-2 und Pinin nach­gewiesen, die nach 120 Minuten 50

Inkubationszeit ein Maximum erreichte (Cichon et al., 2004). Weiterführende Untersuchungen derselben Arbeitsgruppe (Zyrek et al., 2007), die sich mit der molekularen Regulation der ZO-2-Expression in den Epithelzellen befassten, konnten mit hochauf­lösenden mikroskopischen Techniken unter Verwendung von spezifischen F ­ luoreszenz-markierten Antikörpern [Abb. 35] und proteinchemischen Analysen nachweisen, dass EcN eine durch die Infektion mit enteropathogenen E. coli (EPEC) geschädigte epitheliale B ­ arriere wieder restaurieren kann. Dabei kommt es zu einer Umverteilung des ZO2-Proteins vom Zytoplasma an die Zellmembran der Epithelzelle. Dieser stabilisierende Effekt von EcN konnte in verschiedenen Zellkulturversuchen sowohl für eine prophylaktische als auch für eine therapeutische Gabe gezeigt werden. In T84 Epithelzellen kann die durch E. coli Nissle 1917 bewirkte Ver­besserung einer gestörten Barrierefunktion auch durch die Transfektion der ­Zellen mit bestimmten regulatorischen microRNAs (miRNAs) induziert werden (Veltman et al., 2012).

Abb. 35 Darstellung der Induktion der ZO-2-Genexpression in T84-Epithelzellen und der Einlagerung des ZO-2-Proteins in die Tight Junctions. Die Anfärbung mit ZO-2-spezifischen fluoreszie­ren­­ den Antikörpern zeigt (Kontrolle ohne Bakterien), dass das ZO-2-Protein sich überwiegend in den Membranen der Epithelzellen befindet. Dies wird sichtbar durch die starke hellrote Färbung der Zellumrisse. Eine 120-minütige Inkubation mit EcN (E. coli Nissle 1917) führte zu keiner Veränderung der Distribution des ZO-2-Proteins. Eine 120-minütige Inkubation mit entero­ pathogenen E. coli (EPEC) führte demgegenüber zu einer Umverteilung von ZO-2 und einer Reduzierung der Dichtigkeit der Tight Junctions. Bei gleichzeitiger Inkubation von EPEC und EcN konnten die EPEC-Bakterien ihre schädliche Wirkung nicht entfalten (nach Zyrek et al., 2007). 51

In weiteren Zellkulturversuchen konnten Prisciandaro und Kollegen ­(Prisciandaro et al., 2012) sowie Howarth und Mitarbeiter (Wang et al., 2014) nachweisen, dass die durch den Antitumorwirkstoff 5 ­ -Fluorouracil (5-FU) beschädigte epitheliale Barriere von Faktoren, die E. coli Nissle 1917 (EcN) in den Kulturüberstand sezerniert, wieder restauriert werden kann. In Zellkulturversuchen mit Caco2-Zellen, bei denen der Zusammenhalt des Zellverbands durch die Verwendung calciumfreien Mediums gelockert war, konnte die Barrierefunktion des Epithelzell-Monolayers durch Kultur­überstände von EcN sowie durch gereinigtes EcN-Lipopoly­saccharid ­wieder hergestellt werden (Stetinova et al., 2010). Untersuchungen von Wissenschaftlern des Braunschweiger HelmholtzZentrums für Infektionsforschung (Ukena et al., 2007) konnten den die Tight Junctions stabilisierenden Effekt von E. coli Nissle 1917 (EcN) auch in Experimenten mit keimfrei gehaltenen Mäusen nachweisen. Mit Hilfe fluores­ zenzmikroskopischer und proteinchemischer Methoden konnten die Wissenschaftler zeigen, dass auch in vivo die Barrierefunktion des Darm­epithels durch eine gezielte Besiedlung des Gastrointestinaltrakts der keimfreien Tiere mit EcN verbessert wird. In den gnotobiotischen Mäusen hatte die EcN-Verabreichung unter anderem eine erhöhte Expression des Tight Junction-Proteins ZO-1 zur Folge.

spricht die durch die Entzündung verminderte Natrium-Transportaktivität nicht mehr auf Forskolin an. Die orale Verabreichung von E. coli Nissle 1917 (EcN) bewirkt eine deutliche Wieder­herstellung der Natrium-Absorptionskapazität über die Membran und stellt gleichzeitig die Ansprechbarkeit der Epithelzelle auf Forskolin wieder her. Diese Ergebnisse zeigen, dass die antiinflammato­rische Wirkung von EcN auch zu einer Restaurierung geschädigter funktioneller Aktivitäten der Darm­epithelzellen beiträgt. Ähnliche Mechanismen könnten auch die festgestellte Wirksamkeit von E. coli Nissle 1917 (EcN) bei akuten Stress-induzierten Schleimhautläsionen (Gastritis) des Magens erklären. Konturek und Kollegen konnten im Mausmodell eine ­anti-inflammatorische, durchblutungsfördernde Wirkung und vermehrte ­Bildung von Zellschutzproteinen wie Hsp70 (sog. „Hitzeschutzprotein“) unter EcN-Gabe nachweisen (Konturek et al., 2009). Gleichzeitig reduzierte ­EcN die unter Stressbedingungen erhöhte Gen­expression mucosaler Entzündungsmediatoren und die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor κB (NF-κB). Das Ausmaß der mucosalen Permeabilität für Nahrungsantigene oder Mikro­ organismen kann durch die Messung der Aufnahme des Farbstoffs „Evans Blue“ festgestellt werden (Bestimmung der Absorption bei 620 nm).

Bei Mäusen, bei denen durch Verabreichung von Dextransodiumsulfat (DSS) eine Dickdarmentzündung (Colitis) induziert wurde, war im Vergleich zu ge­sun­den Kontrollmäusen das Niveau der Expression des Tight ­Junction-Proteins ZO-1 drastisch reduziert. Dies bestätigt die bereits von ­anderen Arbeitsgruppen gewonnene Erkenntnis, dass Darmentzündungen mit einer Verschlechterung der Barrierefunktion der Darmschleimhaut einhergehen, wie hier an der DSS-induzierten Reduzierung des ZO-1-Gehalts der Zellmembranen der Enterozyten abgelesen werden kann. Interessanter­ weise erhöht die orale Verab­reichung von E. coli Nissle 1917 die Expression des Tight Junction-Proteins ZO-1 wieder, wenn auch das Niveau der gesunden Tiere nicht ganz erreicht wird. Außer der oben gezeigten Lockerung des Zellverbands der Darmschleimhaut, was den Übertritt von großmolekularen Antigenen wie auch ganzen Mikrobenzellen in den Körper begünstigt, hat die DSS-induzierte Colitis ­ auch Auswirkungen auf wichtige Transportfunktionen der Darmepithelzellen. So ist die Aktivität der membranständigen Natrium-Pumpe nach ­Etablierung der Colitis im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren drastisch abgesenkt. Bei gesunden Tieren kann die Aktivität dieses Transportproteins durch das Pharmakon ­Forskolin gehemmt werden. Bei Tieren mit DSS-induzierter C ­ olitis 52

0

0

0

0

0

0

Abb. 36 Eine durch Dextransodiumsulfat (DSS) provozierte Colitis erhöht die Durchlässigkeit der Darmschleimhaut für den Farbstoff „Evans Blue“ auf fast das Fünffache und zeigt eine geschädigte Darmbarriere an. Die Behandlung der DSS-Colitis-Mäuse mit E. coli Nissle 1917 führt die mucosale Permeabilität beinahe wieder auf den Normalwert zurück (nach Ukena et al., 2007). 53

Bei gesunden Mäusen ist die mucosale Durchlässigkeit für den Farbstoff „Evans Blue“ sehr gering. Wird bei den Versuchstieren eine Colitis ausgelöst, so erhöht sich die mucosale Permeabilität auf fast das Fünffache. Dies ist ein weiterer Hinweis für die entzündungsbedingte Abnahme der Barrierefunktion der Darmschleimhaut. Die orale Applikation von E. coli Nissle 1917 (EcN) bewirkt eine deutliche Verbesserung der Barrierefunktion, wie man an der Absenkung der mucosalen Permeabilität erkennen kann, die nach EcN-Behandlung von DSS-Colitis-Mäusen fast auf den Normalwert zurückgeführt wird [Abb. 36]. EcN verhindert somit die Entstehung eines „Leaky Gut“-­Phänomens bei den mit DSS behandelten Tieren (Ukena et al., 2007).

Als Konsequenz für die klinische Praxis ergibt sich aus diesen experimentellen Befunden, dass die Fähigkeit von E. coli Nissle 1917 zur Stärkung und Regeneration der Darmbarrierefunktion einen neuen Wirkmechanismus darstellt. Dies ist von zentraler Bedeutung für die Wirksamkeit von E. coli Nissle 1917 bei verschiedenen gastroenterologischen, hepatologischen, aber auch allergologisch-immunologischen Erkrankungen, die mit „Leaky Gut“-­Phänomenen einhergehen oder durch eine erhöhte Durchlässigkeit der Darmschleimhaut initiiert werden.

Immunmodulierende Wirkungen Nach der Geburt verläuft die Entwicklung des darmassoziierten Immunsystems parallel zur Entwicklung der Darmmikrobiota (Hooper & Gordon, 2001; Fink et al., 2012). Während der ersten Lebensmonate muss das lokale Immunsystem nicht nur lernen, Infektionserreger zu bekämpfen, sondern muss auch gegenüber der sich etablierenden Darmmikrobiota Toleranz entwickeln. Diese immunologische Toleranzentwicklung geht einher mit einer abgeschwächten Synthese proinflammatorischer Chemokine (Fink et al., 2012). Präklinische Untersuchungen verschiedener wissenschaftlicher Arbeits­ gruppen haben zu der Erkenntnis geführt, dass die biologischen Wirkungen von E. coli Nissle 1917 (EcN) auf Epithel- und Immunzellen auf der ­molekularen ­Ebene zumindest partiell durch das Ansprechen von sog. Toll-like-­Rezeptoren (TLR-2, TLR-4, TLR-5) vermittelt wird, die sich als Membran­komplexe auf der Außenhülle der Zielzellen befinden und als Musterer­kennungsrezeptoren dienen [Abb. 37]. Die Toll-like-Rezeptoren können Mikro­organismen-typische Strukturen und Bestandteile erkennen und diese Information ins Zellinnere weiter­leiten. Die Interaktion zwischen EcN und den verschiedenen Toll-­likeRezeptoren führt in der Zelle zum Anstoßen unterschiedlicher Signalkaskaden, die u. a. die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren im Zellkern nach sich ­ziehen (Grabig et al., 2006; Schlee et al., 2007; Sturm et al., 2005). Diese Transkriptions­faktoren aktivieren nun bestimmte Gene, deren Expression die spezifische Antwort der Zelle auf den Kontakt mit EcN darstellt (­Wehkamp et al., 2004). Die Epithelzellen, die nach neuesten ­Erkenntnissen als integraler Bestandteil des darmassoziierten Immunsystems anzusehen sind, da sie wichtige Sensorfunktionen beim Erkennen und U ­ nterscheiden von pathogenen und apathogenen Mikroorganismen ausüben, verfü­ gen über Toll-like-Rezeptoren: (TLRs) mit der Zytoplasmamembran der Epithelzelle assoziierte Rezeptoren (TLR 1 – 11) zur „Muster-Erkennung“ von verschiedenen für Mikroorganismen charakteristischen Stukturen und Molekülen (Lipopeptide, MDP, LPS, Flagellin, bakterielle und virale DNA und RNA, CpG-Motive) NOD-Rezeptoren: (Nucleotide Oligomerisation Domain) intrazelluläre Rezeptoren für die Erkennung von Zellwand­bestandteilen (Peptidoglycanen) gramnegativer (NOD1) und grampositiver (NOD2) Bakterien Abb. 37 Mustererkennungsrezeptoren (engl. Pattern Recognition Receptors) der Epithelzellen des Gastrointestinaltrakts erkennen hochspezifisch für Mikroorganismen typische Strukturen und Moleküle. Mustererkennungsrezeptoren sind als Toll-like-Rezeptoren in der Zellmembran der Epithelzelle lokalisiert. Als NOD-Rezeptoren befinden sie sich im Zytoplasma der Enterozyten.

54

55

eine ganze Reihe von Mustererkennungsrezeptoren. Neben den membran­ ständigen Toll-like-Rezeptoren haben die Epithelzellen auch ­­intrazellulär ­ rreger lokalisierte Erkennungsproteine, die in die Zelle eingedrungene E ­ detektieren können und die Epithelzelle ebenfalls zum Ausschütten ­ bestimmter Signalmoleküle (z.  ­ B. Interleukin-8, IL-8) veranlassen, die wieder­ um dem hinter der Darmschleimhaut befindlichen Immunsystem die Anwesen­ heit von Bakterien, Viren und Pilzen signalisieren. Diese ­intrazellulären Mustererkennungsrezeptoren werden als NOD-Rezeptoren bezeichnet [Abb. 37]. Bisher sind in der Fachliteratur für die Maus elf Toll-­like-Rezeptoren beschrieben worden, für den Menschen sind neun TLR bekannt. Dabei haben die e ­inzelnen TLR eine ausgeprägte Ligandenspezifität für die verschiedensten mikrobiellen Strukturen und Moleküle. So erkennt der ­ TLR-2, z. T. im Zusammen­ wirken mit TLR-1, Peptidoglycan-Strukturen ­grampositiver Bakterien wie auch Lipoproteine der äußeren Zellmembran gramnegativer Bakterien. TLR-4 ist spezialisiert auf das Erkennen des für gramnegative Mikro­organismen ­typischen Lipopolysaccharids (LPS), eine der stärksten in der Natur vorkommenden immunogenen Substanzen. TLR-5 erkennt das für bewegliche Bakte­rien typische Strukturprotein ­ihres Geißelapparats, das Flagellin. Alle hier genannten Toll-like-Rezeptoren sind an der Erkennung von E. coli Nissle 1917 durch die Darmepithel- und ­Immunzellen beteiligt. Durch die Kombination der angesprochenen Muster­ erkennungsrezeptoren sind die Zellen der Darmschleimhaut in der Lage, zwischen pathogenen und apathogenen Mikroorganismen zu differenzieren [Abb. 38]. Dabei werden verschiedene Signaltransduktionswege in der Epithelzelle genutzt. Die Mustererkennungsrezeptoren sind maßgeb­ lich daran beteiligt, dass das Darmimmunsystem eingedrungene pathogene Erreger effektiv bekämpfen kann und gleichzeitig Toleranz ausübt gegenüber der großen Zahl kommensaler Mikroorganismen im Intestinaltrakt. Der Darm und die bakterielle intestinale Besiedlung spielen eine Schlüssel­ rolle bei der Entwicklung des Immunsystems. Um die ­intestinale Homöo­ stase ­aufrecht zu erhalten, muss ein austariertes Gleichgewicht zwischen immunologischer Abwehr zum Schutz vor Infektionen und ­Immuntoleranz zur ­ Verhinderung von überschießenden oder ­ fehlregulierten Immun­ reaktionen (z.  B. Darmentzündungen oder Allergien) aufrecht erhalten werden (Artis, 2008). Ist der „Dialog“ zwischen Darmbakterien und ­ Darm­epithel gestört, kommt es zu überschießenden Reaktionen mit der Gefahr der chronischen Entzündung und der Entwicklung von Allergien (Clavel & ­Haller, 2007). Abhängig von dem Auslöser der Immunantwort wird eine s­ pezifische Immun­reaktion angestoßen, vermittelt über 56

Abb. 38 Registrierung und Unterscheidung kommensaler, intrazellulär pathogener und extrazellulär pathogener Bakterien und Mechanismen zur Erkennung von Mikroorganismen (nach De Gregorio & Rappuoli, 2004).

Boten­stoffe – die sog. Interleukine. Be­stimmte Interleukine, wie z. B. IL-8, werden auch von den Darmepithelzellen gebildet und dienen der Kommunikation mit dem dahinterliegenden d ­ armassoziierten Immunsystem. Der Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α) spielt eine zentrale Rolle im ­Entzündungsgeschehen an der Darmschleimhaut. Sein Kontakt mit Epi­ thelzellen bewirkt eine deutlich gesteigerte Sekretion von IL-8, wodurch das Immunsystem alarmiert wird. Interessanterweise kann ­E. coli ­Nissle 1917 (EcN) die TNF-induzierte IL-8-Sekretion dosis- und zeitabhängig hemmen [Abb. 39, links]. Für diese Wirkung sind lebende EcN-Zellen notwendig [Abb. 39, rechts]. Abgetötete Bakterien oder die bakterielle DNA zeigen k ­ einen Anti-TNF-Effekt (Kamada et al., 2008). Der antientzündliche Effekt von EcN beruht auf der Sekretion eines ­bisher noch unbekannten löslichen Faktors. Ein direkter Kontakt zwischen EcN und den Epithelzellen ist für den Anti-TNF-Effekt nicht notwendig. Für die Interaktion von E. coli Nissle 1917 mit den Darmepithelzellen scheint auch das Vorhandensein der Kapsel (K5-Antigen) von Bedeutung zu sein (Hafez et al., 2009; Nzakizwanayo et al., 2015). Dabei erfolgt die Informationsvermittlung über die Toll-like-Rezeptoren TLR-4 und TLR-5, wodurch bestimmte intrazelluläre Signal­kaskaden aktiviert werden (Hafez et al., 2010). 57

IL-8 Expression

IL-8 Expression ***

1400

2000

1200 1500

1000 800

400

0

N.S. **

1000

600

200

N.S.

500 1,0

1,08

Kontrolle

EcN

TNF-α

TNF-α +EcN

0

Kontrolle

EcN

durch Hitze abgetötete EcN-Zellen

EcNDNA

Signalmolekül, das für die Infektabwehr von Wichtig­ keit und mit der ­ ytokinproduktion gekoppelt ist. Für die iNOS-Aktivierung ist das Lipopoly­ Z saccharid (LPS) von EcN von entscheidender Bedeutung, da gereinigtes EcN-LPS dieselben aktivierenden Effekte zeigt. Die R ­ egulation der Zytokinsynthese wie auch der oben angesprochenen E ­ nzymaktivitäten durch EcN erfolgt bereits auf der genetischen Ebene, was durch die M ­ essung der Genexpression von für die Immunregulation wichtigen Boten­stoffen an präund postnatalen Darmzellen der Maus gezeigt werden konnte (Zeuthen et al., 2010). Desweiteren induzierte EcN ein rasches Abschalten der Gene für Toll-like-­Rezeptor-4 (TLR-4) und ein Anschalten der Gene für Toll-like-Rezeptor-2 (TLR-2). Die Einwirkung von EcN auf die Genaktivität intestinaler Epithelzellen (schnelle Aktivierung von Zytokin-Genen und Inaktivierung von TLR-4-Genen) kann als Induktion der immuno­logischen Toleranz gegenüber gramnegativen Bakterien gedeutet werden.

Abb. 39 E. coli Nissle 1917 (EcN) in lebender Form unterdrückt die TNF-α-induzierte Transkription von IL-8. Linkes Bild: HCT15-Zellen wurden mit EcN (1x 105 Bakterien/ml) für die Dauer von vier Stunden vorbehandelt und anschließend mit 20 ng/ml TNF-α stimuliert. Nach 30-minütiger Stimulation wurde die Expression von IL-8 mRNA mit real-time PCR bestimmt. Rechtes Bild: HCT15-Zellen wurden entweder mit lebenden EcN-Bakterien (1x 105 Bakterien/ml), mit durch Hitze abgetöteten EcN-Bakterien (1x 108 Bakterien/ml) oder mit der genomischen DNA des Stamms (10 μg/ml) für vier Stunden vorbehandelt und anschließend mit 20 ng/ml TNF-α für 30 Minuten stimuliert. Die Expression von IL-8 mRNA wurde mit real-time PCR bestimmt. Die angegebenen Werte sind dargestellt als relative Expression (gegen β-Aktin mRNA). Angegeben sind die Mittelwerte (± Standardabweichung) von fünf einzelnen Experimenten. Signifikante Unterschiede wurden bestimmt durch Vergleich mit den Werten der TNF-α-induzierten IL-8-Sekretion in den nicht mit E. coli behandelten Versuchsansätzen. N.S., nicht signifikant; **, p < 0,01; ***, p < 0,001 (nach Kamada et al., 2008).

Auf der anderen Seite werden Darmbakterien wie auch in den Gastroin­ testinaltrakt gelangende Probiotika durch das infolge einer Colitis veränderte Milieu beeinflusst. So konnten Forscher des Deutschen Instituts für Ernährung (DIfE) in Potsdam in einem gnotobiotischen Mausmodell ­zeigen, dass die Colitis-induzierende Substanz Dextransodiumsulfat (DSS) die Expression bestimmter Proteine verschiedener E. coli-Stämme in unterschiedlicher Weise modulierte (Schumann et al., 2012). In dieser ­Studie zeigte E. coli Nissle 1917 eine vier- bis achtfach höhere Konzentration bestimmter Antistressproteine als andere E. coli, außerdem eine vier- bis siebenfach höhere Produktion des antientzündlich wirkenden Stoff­wechselprodukts Indol.

Epithelzellen reagieren auf proinflammatorische Signale wie Gastrin, Interleukin-1b oder TNF-α, als Folge einer Aktivierung der induzierbaren ­Cyclooxygenase-2 (COX-2), mit vermehrter Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2). Diese entzündungsfördernde Enzymaktivität wird durch Kontakt der Epithelzellen mit E. coli Nissle 1917 (EcN) unterbunden, wobei sowohl die lebenden ­Bakterien als auch bakterienfreie Kulturüberstände wirksam sind (Otte et al., 2009). Auch Untersuchungen zur Aktivierung des sogenannten Inflammasoms in Darmepithelzellen ergaben, dass EcN im Vergleich zu anderen E. coli nur eine schwache Wirkung auf diesen Entzündungskomplex zeigte (Becker et al., 2014). Der Kontakt von EcN mit in Kultur gehaltenen Peritonealzellen führt gleichsinnig zu einer Aktivierung der induzierbaren Stickoxidsynthase (engl. inducible Nitric Oxide ­Synthase, iNOS) (Zidek et al., 2010). Stickoxid (NO) ist ein gasförmiges endo­genes

In einer Vergleichsstudie zur direkten Wirkung von E. coli Nissle 1917 schiedenen L (EcN), ver­ ­actobacillus- und Bifidobacterium-Stämmen auf ­mononukleäre Zellen aus menschlichem Blut zeigte sich, dass die Wirkung auf die Synthese der einzel­nen Zytokine stammspezifisch ist (Helwig et al., 2006). So wiesen v­ erschiedene Bifidobacterium-Stämme unterschiedlich große Aktivierungen des antientzündlichen Zytokins Interleukin-10 auf. Im Vergleich zu den getes­teten Lacto­bacillus-Stämmen wurde bei EcN eine sehr starke Aktivierung der Synthese von IL-10 beobachtet [Abb. 40]. Im Gegensatz dazu zeigten die v­erschiedenen BifidobacteriumStämme gleichzeitig eine starke Aktivierung der Produktion des pro­ inflammatorischen Zytokins TNF-α. EcN, wie auch die verschiedenen Lactobacillus-Stämme ­ stimulierten demgegenüber die TNF-α-Synthese nur sehr gering. ­Diese ­Effekte auf die Zytokinfreisetzung wurden durch die Verwendung von Z ­ elltrümmern ultra­schallbehandelter ­Bakterien erzielt.

58

59

Dies lässt darauf schließen, dass für die beschriebenen immunmodulierenden Aktivitäten der Bakterienstämme strukturgebundene Elemente von Wichtigkeit sind.

Zellfragmente

Zellfragmente

IL-10 Expression

TNF-α-Sekretion

[pg/ml] Fläche unter der Kurve

[pg/ml] Fläche unter der Kurve

1600

9000

1400

8000

1200

7000

1000

6000 5000

800

4000

600

3000

400

2000

200

1000

0 Bifidobacterium- LactobacillusStämme

Stämme

E. coli Nissle 1917

0 Bifidobacterium- LactobacillusStämme

Stämme

E. coli Nissle 1917

Abb. 40 Wirkung von probiotischen Bakterien auf die Synthese entzündungshemmender (IL-10) bzw. entzündungsfördernder (TNF-α) Zytokine in mononukleären Zellen des menschlichen Blutes. Zellfragmente von E. coli Nissle 1917 bewirken eine erhöhte Sekretion von IL-10 und eine verminderte Sekretion des Entzündungsverstärkers TNF-α (nach Helwig et al., 2006).

Neben mononukleären Blutzellen werden auch andere immunkompetente Lymphozyten wie dendritische Zellen, Makrophagen und regulatorische ­T-Zellen durch E. coli Nissle 1917 (EcN) beeinflusst (Gad et al., 2011). So induzierte EcN in einer V ­ergleichsstudie mit Bifidobacterium longum und ­Lactobacillus ­acidophilus ein stammspe­zi­fi­sches Reifungsmuster in primären dendri­tischen Zellen der Peyer’schen Plaques (Fink & Frokiaer, 2008). Ein weiteres wichtiges Ergebnis dieser Untersuchung ist die Erkenntnis, dass probio­ tische Bakterien bei der Entwicklung des Darm­immunsystems stammspezifische ­Wirkungen haben, die sich von denen unterscheiden, die die Keime bei direktem Kontakt mit dem systemischen Immunsystem haben würden. Untersuchungen von Hockertz (1991) an isolierten Makrophagen der Maus hatten bereits gezeigt, dass E. coli Nissle 1917 (EcN) über deutliche immunmodulie­ren­de Wirkungen verfügt. So konnte nachgewiesen werden, dass die Produk­tion von mikrobiziden Sauerstoffradikalen sowie die direkte Tumorzellabtötung durch EcN signifikant aktiviert wurden (Hockertz, 1991). 60

In-vitro-Versuche mit menschlichen T-Lymphozyten haben gezeigt, dass EcN in peripheren T-Zellen Zellzyklus und Zellvermehrung hemmt, nicht jedoch in mucosalen T-Zellen (Sturm et al., 2005). Dabei spricht EcN nur die γ/δ-T-Zellen, nicht jedoch die α/β-T-Zellen an. In den γ/δ-T-Zellen hemmt EcN die Sekretion von TNF-α und fördert die Synthese von IL-6 und CXCL8 (Guzy et al., 2008). Diese differenzielle Wirkung auf die verschiedenen T-Zell-Subtypen kann als anti-inflammatorischer Effekt inter­pretiert ­werden und könnte für die in T ­iermodellen für chronisch entzündliche Darm­ erkrankungen gezeigte Entzündungshemmung mit verantwortlich sein ­(Arribas et al., 2009; Garrido-Mesa et al., 2011; Grabig et al., 2006; Hudcovic et al., 2007; Kamada et al., 2005; Kokesova et al., 2006; Schultz et al., 2004; Sha et al., 2014). Die antientzündliche Wirkung von EcN konnte sowohl bei ­chemisch induzierten als auch bei immunologisch provozierten Colitiden (durch T-Zell-Transfer induzierte Colitis) bei immundefizienten Versuchs­ ­ erden. Dabei war die Wirkung bei chronischen tieren nachgewiesen w stärker als bei akuten Darm­entzündungen. Interessanterweise konnte die antientzündliche Wirkung von E. coli ­Nissle 1917 (EcN) nicht nur bei Darmentzündungen sondern auch bei systemischen Entzündungs­reaktionen, die durch die i.v.-Verabreichung von LPS provoziert wurden, ­nachgewiesen werden (Arribas et al., 2009). Hier wurde eine ­reduzierte Ausschüttung des proinflammatorischen Zytokins TNF-α sowohl im Darm von Ratten mit chemisch induzierter Colitis als auch in ­Plasma und Lunge von LPS-behandelten Mäusen festgestellt [Abb. 41]. Dieser systemische Effekt einer oralen Verabreichung von EcN ging desweiteren einher mit einer Hemmung der Produktion von T-Zell-Zytokinen und einer reduzierten Freisetzung von IgG durch B-Zellen aus der Milz. Eine veränderte Immunitätslage liegt auch bei Allergien vor, deren ­rasante Zunahme in den letzten Jahrzehnten in den hochindustrialisierten ­Ländern Anlass zur Besorgnis gibt. Allergien sind durch eine proinflamma­ torische T-Helfer-2-Zell(TH2)-dominierte Immunreaktion mit starker Interleukin(IL)-4-Expression gekennzeichnet. Da für E. coli Nissle 1917 (EcN) sowohl intestinale als auch systemische immunmodulierende Wirkungen nachgewiesen wurden, untersuchten Rasche und Kollegen (Rasche et al., 2007) in einer klinischen Vergleichsstudie, ob EcN bei Pollenallergikern eine Verschiebung der allergischen TH-2-dominierten Immunantwort hin zu einer protektiven TH-1-dominierten Immun­antwort induziert. Dabei w ­ urde an isolierten T-Lymphozyten festgestellt, dass EcN die anti-­inflammatorische IFN-γ-Bildung bei allergischen Patienten besonders deutlich erhöht und sich den zum Vergleich mitgeführten probiotischen Milchsäurebakterien überlegen zeigte [Abb. 42]. 61

In einem Mausmodell für Hausstaubmilbenallergie konnte gezeigt werden, dass E. coli Nissle 1917 (EcN) über antiallergisches Potential verfügt. Der anti­allergische Effekt wurde von einer Steigerung der allergenspezifischen IgG2a-Antwort begleitet (Adam et al, 2010). In einem weiteren Mausmodell verhinderte die orale Verabreichung von EcN dosisabhängig eine Allergen-induzierte Dermatitis (Weise et al., 2011). Weitere In-vitro- und In-vivo-Studien sollen nun den für EcN-spezifischen Wirkmechanismus klären. Eine klinische Pilotstudie mit Graspollenallergikern bestätigte die gute V ­ erträglichkeit von E. coli Nissle 1917 (Dölle et al., 2014). Eine s­ ignifikante Verbesserung der saisonbedingten Pollenallergien wurde allerdings nicht beobachtet.

% CD69+ T-Lymphozyten (TH1 Response) 40

Allergiker

Nicht-Allergiker

35 30 25 20 15 10

Allergiker

Nicht-Allergiker

5 0

TNF-α [pg/ml-1] 600

Plasma

Lunge

500 400 300 200 100

IL-2 [pg/ml-1] 4000 3000

150

2000

100

1000

50

0

0

IgG [pg/ml-1] 100

IL-10 [pg/ml-1] 2000

Plasma

80

Lunge

Milz

IL-5 [pg/ml-1] 200

Allergen = Graspollenextrakt Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus + Allergen

E. coli Nissle 1917 E. coli Nissle 1917 + Allergen

Abb. 42 E. coli Nissle 1917 und L. acidophilus induzieren eine erhöhte Expression des Oberflächen­ markers CD69 auf T-Lymphozyten. Eine erhöhte Expression von CD69 kennzeichnet eine TH1dominierte Immunantwort. Sowohl Allergiker als auch Nicht-Allergiker zeigen unter E. coli Nissle 1917, mit oder ohne Co-Inkubation des Allergens, eine signifikant stärkere TH-1-Zellproliferation als unter L. acidophilus [nach Rasche et al., 2007).

Milz

1500

60

1000

40 20

500

0

0 Gesunde Mäuse

LPS-induzierte Sepsis

LPS-induzierte Sepsis + E. coli Nissle 1917

Abb. 41 Wirkung von E. coli Nissle 1917 auf pro- und antientzündliche Immunreaktionen bei der LPS-induzierten Sepsis der Maus. Untersucht wurden die Sekretion von TNF-α, der T-Zell-Zytokine IL-2, IL-5 und IL-10 sowie die IgG-Sekretion der B-Zellen. Die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine in Plasma, Milz und Lunge wurde durch E. coli Nissle 1917 deutlich gehemmt (nach Arribas et al., 2009). 62

63

Antimutagenität

Comet Score

In randomisierten klinischen Studien hat sich E. coli Nissle 1917 (EcN, Mutaflor®) bei der Behandlung der Colitis ulcerosa in Remission als ebenso wirksam wie der Entzündungshemmer Mesalazin (5-Aminosalicylsäure) erwiesen (Schultz, 2008). Retrospektive Fall-Kohorten-Studien haben gezeigt, dass Mesalazin darüber hinaus antimutagene Wirkungen hat und das bei ­Colitis-ulcerosa-Patienten erhöhte Risiko, an Dickdarmkrebs zu erkranken, senkt. Es stellte sich daher die Frage, ob E. coli Nissle 1917 (EcN) ebenfalls anti­mutagene Eigenschaften besitzt. Mit Hilfe standardisierter Mutagenitätstests (Ames-Test, Comet-Assay) konnte der Nachweis erbracht werden, dass EcN, im Gegensatz zu den bekannten mutagenen Testsubstanzen 4-Nitroquinolin-1-oxid (NQO), Benz(a)pyren (BP) und H2O2, kein mutagenes Potential hat (Sonnenborn et al., 2009) [Abb. 43]. Die Co-Inkubation von EcN mit den ­mutagenen Stoffen führte zu einer dosisabhängigen Ab­nahme der mutagenen Wirkung der Testsubstanzen [Abb. 44]. Die Ergebnisse belegen, dass EcN anti­mutagene Wirkung gegenüber muta­ genen Substanzen wie NQO, BP und H2O2 aufweist.

Comet Score 300 250 200 150 100 50 0

CaCo-2-Zellen (Kontrolle)

CaCo-2-Zellen + NQO

CaCo-2-Zellen + E. coli Nissle 1917

Abb. 43 Vergleich der Mutagenität von E. coli Nissle 1917 gegenüber der mutagenen Substanz 4-Nitroquinolin-1-oxid (NQO) im Comet-Assay. E. coli Nissle 1917 zeigt keine mutagene Wirkung (nach Sonnenborn et al., 2009).

64

300 250 200 150 100 50 0 NQO Kontrolle

2x 1010

1010

4x 109

2x 109

109

[KBE/ml]

E. coli Nissle 1917 + 4-Nitroquinolin-1-Oxid (NQO)

Abb. 44 Dosisabhängigkeit der antimutagenen Wirkung von E. coli Nissle 1917 gegenüber 4-Nitroquinolin-1-oxid (NQO) im Comet-Assay. Für die antimutagene Wirkung sind lebende Bakterienzellen notwendig. KBE = Kolonie-bildende Einheiten (nach Sonnenborn et al., 2009).

Fazit: Bereits seit über 100 Jahren ist bekannt, dass nützliche Darmbakterien, die heute als Probiotika bezeichnet werden, in der Lage sind, pathogene Mikroorganismen an der Vermehrung zu hemmen und sie u. U. sogar abzutöten. Einer der ersten Forscher, der diese Hemmwirkung kommensaler Keime auf Infektionserreger näher untersuchte, war Alfred Nissle. Bereits 1916 ­publizierte er seine grundlegende Arbeit zur antagonistischen Wirkung physio­logischer E. coli-Bakterien gegen darmpathogene Salmonellen. Aus diesem Grunde gilt Nissle als „Urvater“ der antimikrobiell wirkenden Bakteriocine, eine Substanzklasse, die erst seit den 30er Jahren des vergangenen Jahr­hunderts chemisch näher untersucht wurde. Es ist das Verdienst von Alfred Nissle, die antagonistische Wirkung nützlicher son­ dere von kommensalen E. coli-Stämmen, erkannt Darmkeime, insbe­ und als Erster als ­Therapie­option in die Medizin eingeführt zu haben. Erst in den letzten Jahren hat man erkannt, dass gesundheitsfördernde bzw. auch therapeutische Wirkungen von Probiotika nicht nur auf den direkten Antagonismus gegen pathogene Keime zurückzuführen sind, sondern in noch viel größerem Ausmaß durch Kommunikation der probiotischen Mikroorganismen mit der Darmschleimhaut zustande kommen. Die Beeinflussung von Funktionen der Darmschleim­haut bzw. des darmassoziierten Immunsystems durch mikro­bielle (probiotische) Signalstoffe wird als „Host Cell Signaling“ oder auch als „Bacterial-Epithelial Cross Talk“ bezeichnet. 65

Die probiotische Signal­wirkung ist dabei stammspezifisch [Abb. 45] und kann nicht per Analogieschluss ungeprüft von einem Bakterienstamm (z. B. E. coli Nissle 1917) auf einen anderen Stamm übertragen werden. So, wie die therapeutischen Effekte eines jeden Arzneimittels an die Eigenschaften der wirksamen Substanz gebunden sind, bilden die hier keineswegs vollständig dargestellten Eigenschaften von E. coli Nissle 1917 die Basis für seine vielfältigen Wirkungen und liefern die Erklärung für seine Wirksamkeit bei verschiedenen Indikationen.

Indikationsspektrum für E. coli Stamm Nissle 1917 (Mutaflor®) und konfirmatorische klinische Studien Nissle und andere hatten bereits in diversen Erfahrungsberichten ein erstaunlich breites Indikationsspektrum für den Einsatz von E. coli Nissle 1917 (EcN) mitgeteilt. In einer prospektiven Anwendungsbeobachtung zum Einsatz von Mutaflor® bei 3.807 Patienten in 446 Prüfzentren (Krammer et al., 2006) konnten die verschiedenen Einsatzgebiete bestätigt werden [Abb. 46].

E. coli Nissle 1917

direkte antagonistische Aktivit t

Ho st cell signaling ¥ Mucin- und Defensin-, Cathelicidin-, CalprotectinProduktion ¥ Invasionshemmung (Salmonella, EIEC, AIEC, Shigella, Yersinia, Listeria, Candida)

¥ Wachstumshemm

¥ Abt tung pathoge Bakterien und Pil ¥ Immunmodulation, z.B. IL-10-Induktion ¥ Anti-entz ndliche Effekte (Hemmung von IL-5, IL-6, IFN-γ, TNFα-Wirkung auf IL-8)

Abb. 46 Haupteinsatzgebiete von Mutaflor® nach einer prospektiven Anwendungsbeobachtung Darmepithel (AWB) an 3807 Patienten (nach Krammer et al., 2006). Abb. 45 Wirkungen und Interaktionen von E. coli Nissle 1917 im Darm und an den Epithelzellen der Darmschleimhaut (IL = Interleukin, IFN = Interferon, TNF = Tumornekrosefaktor, EIEC = enteroinvasive E. coli, AIEC = adhärent-invasive E. coli).

66

Nahezu die Hälfte der Patienten (n = 1.746; 47,1 %) wurde wegen protrahierter (n = 339) oder chronisch ­rezidivierender Diarrhöen (n = 728) bzw. ­ iarrhö eines Reizdarm-Syndroms (n = 679) mit Mutaflor® behandelt. Die D war bei 209 Patienten nach einer Magen-Darm-Infektion und bei 252 nach Antibiotika-/Sulfonamid-Behandlung, also nach „klassischen“ Ursachen ­ von Darmmikrobiota-Störungen, aufgetreten. Patienten mit chronisch entzündlichen Darm­erkrankungen (n = 415), Obstipation (n = 253) und ­Mykosen des Gastrointestinaltraktes (n = 281) folgten in der Häufigkeit der Indikationsstellung. Weiterhin behandelt wurden Patienten mit Divertiku­ lose, Kollagener Colitis, Neurodermitis, Nahrungsmittelunverträglichkeit und Infektanfälligkeit, darunter auch Harnwegsinfekte. Die Wirksamkeit von Mutaflor® über alle Indikationen wurde von 78 % der Patienten und von 82 % der ­Therapeuten mit gut bis sehr gut bewertet, womit auch die Erfahrungen von Alfred Nissle bestätigt wurden. 67

¥ St rken auf die Permea ¥ Verhind Leaky-G gest rte ¥ Verbess Transpo Darmze

Unabhängig von dem enormen Erfahrungsschatz, der sich während der jahrzehntelangen Anwendung des Präparates Mutaflor® angesammelt hat, ist es eine berechtigte Forderung, die postulierten Wirksamkeiten in konfirma­to­ri­schen klinischen Studien nachzuweisen. Sie sind heute ein fester Bestandteil der „Evidence-Based Medicine“ und wurden für das Präparat Mutaflor® indika­tions­bezogen durchgeführt. Einige Beispiele werden im Folgenden kurz besprochen. Diarrhö: Die akute infektiöse Diarrhö wird landläufig als eine selbstlimitierende Erkrankung innerhalb der ersten 7 Tage angesehen. Es gibt aber in der Literatur zu dieser Erkrankung auch Angaben, dass zwischen 12 und 30 % der Patienten in der Folgezeit (bis zu einem Jahr nach der Durchfallepisode) einen Reizdarm oder chronisch rezidivierende Diarrhöen entwickeln können. Auf Grund der Kenntnis präklinischer Untersuchungen, ­ armbarriere wonach E. coli Nissle 1917 sich an der Stabilisierung der D beteiligt, wurden Studien zur akuten und zur protrahierten (seit max. 2 Wochen andauernden) Diarrhö durchgeführt. Ein besonderes Interesse bestand, die klinischen Untersuchungen bei Säuglingen, Kleinkindern und Kindern vorzunehmen, weil die Folgen von Diarrhöen bei jungen Patienten gravierend sein können. 113 Patienten (2 – 46 Monate alt) mit akuter Diarrhö erhielten nach Rando­ misierung und im doppelblinden Verfahren je nach Alter täglich 1 x 1 ml (Säuglinge), 2 x 1 ml (1 – 3 Jahre alt) oder 3 x 1 ml (3 – 4 Jahre alt) Mutaflor® ­Suspension (mit 108 KBE/ml) oder Placebo. Unter Verum reduzierte sich die Durchfalldauer drastisch auf 2,5 Tage, während für die Placebo-Gruppe eine mittlere Durchfalldauer von 4,8 Tagen gemessen wurde (p = 0,0007) [Abb. 47]. Nur 3 (5,5  %) der Verumpatienten, aber 19 (32,8  %) der Placebo­ Patienten litten auch am 10. Tag noch an Diarrhö (Henker et al., 2007). 68

Akute Diarrhö

Zeitgewinn: 2,3 Tage

Mutaflor ® Suspension

p = 0,0007

Placebo

0 1 Behandlungstage

2

3

4

2,5 Tage

5 4,8 Tage

Abb. 47 Mutaflor® Suspension reduziert bei der akuten Diarrhö die Durchfalldauer um 2,3 Tage (nach Henker et al., 2007).

In einer weiteren, ebenfalls placebokontrollierten, randomisierten p = 0,0007 pdoppel­ = 0,0001 blinden Studie wurden 151 Patienten (1 – Zeitgewinn: 47 MonateZeitgewinn: alt) mit protrahierter 2,3 Tage 3,3 Tage oder der Placebo-Gruppe zugeordnet. Zu ­Diarrhö entweder der Verum® ® Mutaflor Suspension Mittlere Mutaflor Suspension Beginn erfolgte eine einmalige orale Rehydratation. Die Studienmedika­ tion KrankheitsdauerArt und Menge derjenigen, die auch für die Behandlung entsprach nach vor Therapie: der akuten ­Diarrhö verwendet wurde (s.o.). Die mittlere Durchfalldauer vor Placebo 5,8 Tage ­Therapie­beginn lag fürPlacebo die Verum- wie für die Placebo-Gruppe bei 5,8 Tagen. Auch bei dieser konfirmatorischen Studie offenbarte sich die Effektivität ® einer Mutaflor -Behandlung. Ab Studienbeginn dauerte der 5Durchfall unter 0 10 12 23 3 4 4 5 ® Mutaflor Behandlungstage ­SuspensionBehandlungstage 2,4 Tage, unter Placebo 5,7 Tage (p = 0,0001) [Abb. 48]. 2,5 Tage 2,4 Tage 4,8 Tage 5,7 Tage Die Erfolgsrate nach 21 Tagen betrug unter Verum 99  % (74/75) und unter ­Placebo 72  % (55/76) (Henker, Laass et al., 2008). Akute Diarrhö

Aufschluss über Wirksamkeit und Verträglichkeit der Mutaflor®-Therapie in der Pädiatrie gab ein Patientenkollektiv innerhalb dieser Anwendungsbeobachtung aus 660 Neugeborenen, Säuglingen und Kindern bis 12 Jahre. Die verschiedenen Formen der Diarrhö (n = 298) sowie die chronische Obstipation (n = 75) waren die meistgenannten Indikationen neben dem Reizdarm-Syndrom, Mykosen des Verdauungsstrakts, Nahrungsmittelunverträg­ lichkeiten, Antibiotika-assoziierte-/pseudomembranöse Colitis, Neurodermitis und Infektan­ fälligkeit. Die Wirksamkeit der Therapie mit Mutaflor® wurde bei 84 % und die Verträglichkeit bei 96  % der Kinder als gut bis sehr gut bewertet (Röhrenbach et al., 2007). Der Therapieerfolg bei den insgesamt 298 Kindern, die wegen protrahierter bzw. chronisch rezidivierender Diarrhö behandelt wurden, ­konnte durch zwei doppelblinde, randomisierte und placebokontrollierte Studien mit Mutaflor® bestätigt werden (Henker et al., 2007; Henker, Laass et al., 2008).

Mittlere Krankheitsdauer vor Therapie:

5,8 Tage

p = 0,0001

Zeitgewinn: 3,3 Tage

Mutaflor ® Suspension

Placebo 2,5 Tage 0 1 Behandlungstage

2

3 2,4 Tage

4,8 Tage 4

5 5,7 Tage

Abb. 48 Mutaflor® Suspension reduziert bei der protrahierten Diarrhö die Durchfalldauer um 3,3 Tage (nach Henker, Laass et al., 2008). 69

Fazit: Die enorme Verkürzung der Durchfallzeit um 2,3 bzw. 3,3 Tage sowie die hohe Ansprechrate in beiden Studien beweisen die Wirksamkeit von Mutaflor® bei akuter und protrahierter Diarrhö und belegen einen hohen E ­ videnzgrad. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen: In Deutschland leiden ca. 300.000 Menschen an chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), etwa zu gleichen Teilen an Colitis ulcerosa und Morbus Crohn. Die Ursachen für diese Erkrankungen sind nach wie vor unklar, obwohl sicher ist, dass es sich um einen wie auch immer gearteten Barrieredefekt der Darmschleimhaut handelt. Viele Gründe werden diskutiert und experimentell verfolgt. Im letzten Jahrzehnt des vergangenen Jahrhunderts sind zellvermittelte Reaktionen des Immunsystems und der Einfluss der gebildeten Botenstoffe eingehend untersucht worden, was zu einem enormen, kaum noch zu überschauenden ­Wissenszuwachs über die komplexen Zusammenhänge bei der Entstehung der CED führte. Bei der Fokussierung auf die Erhaltung oder Reparatur der Darmbarriere sind vornehmlich drei Komplexe in den Mittelpunkt der Betrachtungen gerückt: 1. die Darmmikrobiota, die sich zwar an der Aufrechterhaltung der Darm­ barriere beteiligt, aber in diversen Tiermodellen für CED auch proinflamma­torische Effekte zeigt, 2. genetische Defekte, die zur Beeinträchtigung der Barrierefunktion der Darmschleimhaut führen können (z. B. NOD-2-Polymorphismen), 3.  der Mangel an die Barriere erhaltenden Bestandteilen/Substanzen (z. B. Defensine, Cathelicidine, Mucine) und deren Induktions- oder Substitutions­möglichkeiten. Vor diesem Hintergrund ist der Einsatz von Probiotika zur Therapie von ­chronisch entzündlichen Darmerkrankungen eine logische Konsequenz, vor allem dann, wenn wie im Falle von E. coli Nissle 1917 (EcN) Wirkmechanismen bekannt sind, die helfen, die Barriere zu stabilisieren. Für Mutaflor® liegen ­heute 3 g ­ roße doppelblinde klinische Vergleichsstudien und eine Vergleichs­ olitis ulcerostudie mit ­jugendlichen Patienten zur Remissionserhaltung der C sa vor. In diesen Studien hat sich E. coli Nissle 1917 als gleichwertig zur Therapie mit Mesalazin erwiesen (Do et al., 2010; Sang et al., 2010; Schultz, 2008). Die erste an 103 Patienten über einen Zeitraum von 3 Monaten durch­geführte Doppelblind-Studie brachte die Erkenntnis, dass Mutaflor® (1 x 2 Kapseln täglich), gemessen am Verlauf des klinischen Aktivitätsindex, die gleiche Wirksamkeit bei der Aufrechterhaltung der Remission hat wie die Standardmedikation mit dem Entzündungshemmer Mesalazin ­(5-Amino­salicylsäure, 1,5 g täglich). Auch die Rezidivraten waren nicht unterschiedlich, was jedoch bei der relativen kurzen Beobachtungszeit zu erwarten war (Kruis et al., 1997). 70

In einer zweiten in Großbritannien durchgeführten ebenfalls ­doppelblinden ­ olitis randomisierten Vergleichsstudie wurden Patienten mit einer aktiven C ulcerosa (n = 116) eingeschlossen. Für die vergleichende Beobachtung über ein Jahr wurden aber nur die Patienten einbezogen, bei denen unter der Standardmedikation mit Prednisolon zuzüglich einer initialen e ­ inwöchigen Gentamicinbehandlung eine Remission erreicht w ­ orden war. Entsprechend britischer Standards wurde die tägliche Gabe von 3 x 400 mg Mesalazin mit 1 x 2 Kapseln Mutaflor® verglichen. Im Verlauf der Beobachtungszeit von 1 Jahr erlitten in der Mesalazingruppe 32/44 Patienten (73  %) und in der Mutaflor®-Gruppe 26/39 (67 %) ein Rezidiv. Zwischen den beiden Behandlungsarmen war kein signifikanter Unterschied festzustellen, was sich auch anhand des Krankheitsverlaufs (Kaplan-Meier-Analysen) belegen lässt (Rembacken et al., 1999). Die in dieser Studie sehr eng gefasste Definition eines akuten Schubs erklärt die hier beobachtete relativ hohe Rezidivrate. In der dritten großen klinischen Studie, die in zehn europäischen L ­ ändern durchgeführt wurde, konnten 327 Patienten mit Colitis ulcerosa in der Remission in die Studie aufgenommen werden und erhielten entweder ­ 1,5 g Mesalazin oder 1 x 2 Kapseln Mutaflor® täglich für die Dauer von 1 Jahr. 222 Patienten (112 Patienten mit Mesalazin, 110 Patienten mit Mutaflor®) schlossen die Studie protokollgerecht ab. In der ­Mesalazingruppe erlitten 38/112 Patienten (33,9 %) und in der Mutaflor®-Gruppe 40/110 Patienten (36,4 %) ein Rezidiv [Abb. 49]. Die Äquivalenz zwischen beiden Medikamenten konnte mit der großen Wahrscheinlichkeit von p = 0,003 statistisch gesichert werden, mithin sind beide Präparate gleich wirksam (Kruis, Fri cˇ et al., 2004). Rezidivrate innerhalb eines Jahres Per-Protokoll-Analyse (N = 222) 100% 80% 60%

Äquivalenz signifikant mit p = 0,003 36,4 %

33,9 %

40% 20% 0%

Mutaflor®

Mesalazin

Abb. 49 Multizentrische randomisierte Doppelblindstudie Mutaflor® vs. Mesalazin zur Remissions­erhaltung bei Colitis ulcerosa. Rezidivrate innerhalb eines Jahres anhand der Per-Protokoll-Analyse von 222 Patienten (nach Kruis, Fricˇ et al., 2004). 71

In einer weiteren klinischen Colitis-ulcerosa-Studie über 1 Jahr Beobachtungszeit, die mit 36 Kindern und Jugendlichen im Alter zwischen 11 und 18 Jahren durchgeführt wurde, zeigte sich ebenfalls die gleiche Wirksamkeit von Mesalazin und Mutaflor® bei der Remissionserhaltung. Hier erlitten 6/24 ­Patienten (25 %) der Mutaflor®-Gruppe und 3/10 (30 %) der Mesalazin-Gruppe ein Rezidiv innerhalb eines Jahres (Henker, Müller et al., 2008). Die bisherigen erfolgreichen Anwendungen von Mutaflor® bei der Behandlung von Patienten mit Colitis ulcerosa in der Remissionsphase wurden mit der oralen Verabreichung magensaftresistenter Kapseln erzielt. Durch diese D ­ ­ arreichungsform ist es gewährleistet, dass der Wirkstoff E. coli ­Nissle 1917 unbeschadet seinen Wirkort, den Dickdarm, erreicht. Eine ­weitere klinische Studie zeigte, dass Patienten mit akuter distaler Colitis auch durch die r­ ektale Anwendung von Mutaflor® Suspension, verabreicht als Klysma, in Remission gebracht werden können (Matthes et al., 2010). In der placebokontrollierten, doppelblinden Studie an 90 Patienten mit leicht bis mittel­gradig aktiver d ­ istaler Colitis ulcerosa wurden 10, 20 und 40 ml Klysmen mit 108 KBE/ml E. coli Nissle 1917 oder Placebo einmal täglich über mindestens 4 Wochen verabreicht. In der Mutaflor®-Gruppe zeigte sich eine deutliche Dosis­abhängigkeit bei der Einleitung der Remission. Die Remission erreichten in der Placebo-Gruppe 2/11 Patienten, in der Mutaflor®-Gruppe mit 10 ml 3/11, mit 20 ml 8/18 und mit 40 ml 9/17 ­Patienten [Abb. 50]. Damit ist Mutaflor® eine gut verträgliche Alter­ native zum topischen Einsatz von Aminosalizylaten oder Glukokortikoiden. Remissionsrate in Abhängigkeit von der Dosierung 60% 50%

Rangfolgentest p = 0,0446

52,9% 44,4%

40% 27,3%

30% 20%

18,2%

10% 0%

Placebo

10 ml

20 ml

40 ml

Mutaflor®-Klysmen

Abb. 50 Dosisabhängige Remissionsrate beim Einsatz von Mutaflor®-Klysmen bei leichten bis ­mittelschweren Schüben einer distalen Colitis ulcerosa (Per-Protokollanalyse n = 57) (nach Matthes et al., 2010). 72

In einer Kurzzeitstudie (7 Wochen) wurde untersucht, ob E. coli Nissle 1917 oder Ciprofloxacin bzw. Kombinationen beider Wirkstoffe, Colitis ulcerosa Patienten aus einem akuten Entzündungsschub in die Remissionsphase führen konnten (Petersen et al., 2014). E. coli Nissle 1917 war in dieser Zeitspanne nicht in der Lage, Patienten in die Remission zu bringen. In einer doppelblind angelegten Pilotstudie zur Erhaltung der R ­ emission bei 28 Morbus-Crohn-Patienten durch Mutaflor® wurden Patienten mit ausschließ­lichem Dickdarmbefall und einem Crohns Disease Activity Index (CDAI) von > 150 randomisiert auf zwei Gruppen verteilt. 16 Patienten erhielten Prednisolon plus Mutaflor®, 12 Patienten Prednisolon plus Placebo für die Dauer von 1 Jahr. In der Mutaflor®-Gruppe erlitten in dieser Zeit 33,3 % und in der ­Placebo-Gruppe 63,6 % der Patienten ein Rezidiv. Darüber hinaus wurde in der Verumgruppe ein Prednisolon-Einspareffekt beobachtet (Malchow, 1997). Dieser mit einer kleinen Zahl von Patienten erhaltene Hinweis auf eine mögliche remissionserhaltende Wirksamkeit bei Morbus Crohn konnte bisher nicht in konfirmatorischen klinischen Studien bestätigt werden. Fazit: Mutaflor® ist bei Patienten mit Colitis ulcerosa zur Aufrechterhaltung der Remission gleich gut wirksam wie Mesalazin und zudem neben­ wirkungs­arm. E. coli Nissle 1917 wurde in nationalen Leitlinien (Dignass et al., 2011; Fuchssteiner et al., 2014) sowie in der europäischen ECCO-Leitlinie (Travis et al., 2008) als probio­tischer Wirkstoff zur Remissionserhaltung der Colitis ulcerosa an­erkannt. Wie zu erwarten war, ist E. coli Nissle 1917 zur Behandlung eines akuten Schubes eher nicht geeignet (Petersen et al., 2014). Obstipation: Die chronische Obstipation ist wie die chronische Diarrhö sehr stark mit dem Reizdarm v­erwoben. Die Ergebnisse weniger kon­ trollierter ­Studien weisen darauf hin, dass bestimmte probiotische Arznei­mittel Symptome einer chronischen Obstipation lindern oder dauerhaft be­heben können (Chmielewska & Szajewska, 2010). In welchem Ausmaß Mutaflor® hier einzugreifen vermag, war Gegenstand kontrollierter klinischer Studien. In einer vergleichenden randomisierten Untersuchung (Mutaflor®, täglich 3  x 1 Kapsel vs. Laktulose, 2 x 15 ml) an 108 ambulanten Patienten mit chronischer Obstipation, die seit mindestens einem Jahr vorliegen musste, erhöhte sich die wöchentliche Stuhlzahl in beiden Gruppen nach insgesamt 14-wöchiger Behandlung. Hierbei war die Steigerung der wöchentlichen ­Stuhlfrequenz (Mutaflor® 6,3 vs. Laktulose 5,5) signifikant unterschiedlich (p < 0,026) zugunsten des E. coli-Präparats (Bruckschen & Horosiewicz, 1994). Unerwünschte Arzneimittelwirkungen (vor allem Blähungen) traten unter der Laktulose-Behandlung dreimal häufiger auf als unter der Mutaflor®-Behandlung. 73

In einer zweiten randomisierten klinischen Studie wurde Mutaflor® gegen ein Placebo getestet bei Patienten, die ebenfalls seit mindestens 1 Jahr obstipiert waren. Der eigentlichen Studie wurde eine einwöchige Periode („Run-in-Phase“) vorangestellt, bei der alle Patienten ein Placebo bekamen. Von ursprünglich 134 Patienten konnten danach 64 nicht in die Therapie­ studie aufgenommen werden, weil sich ihr Problem bereits mit der Placebo-Gabe lösen ließ. Anschließend wurden die verbliebenen 70 Patienten (wöchentliche Stuhlzahl ≤ 2) randomisiert in einem doppelblinden D ­ esign der Verum- oder der Placebo-Gruppe zugeordnet. Zu Beginn erhielten die ­Patienten zum Abführen einmalig 10 mg Bisacodyl, um vergleichbare Ausgangs­verhältnisse zu schaffen, danach zuerst 3 x 2 Mutaflor®- oder Placebo-Kapseln täglich und ab dem 3. Tag 1 x 4 Kapseln für den Rest der Studiendauer. Nach 4 Wochen hatten die Patienten der V ­ erumgruppe eine wöchentliche Stuhlzahl von 4,9. Nach weiteren 4 Wochen erhöhte sich bei den Patienten der Verumgruppe die wöchentliche Stuhlzahl auf 6,0 [Abb. 51]. In der Placebo-Gruppe zeigte sich nach 4 Wochen ein leichter Anstieg der Stuhlfrequenz, der aber nach 8 Wochen wieder zurückging auf < 2 Stühle/Woche. Beim Wechsel der Studien­medika­tion nach 4-wöchiger Behandlung waren es bei den zuvor mit Verum behandel­ten Patienten insgesamt nur zwei, die auf Mutaflor® nicht mit einer signifikanten Steigerung der wöchentlichen Stuhlzahl reagiert hatten, und die nach weiteren 4 ­Wochen unter Placebo ebenfalls keine Besserung zeigten. Dagegen verbesserte sich die wöchentliche Stuhlzahl bei 13 Patienten, die wegen Unwirksamkeit der Placebo-Behandlung in die Verumgruppe wechselten, in den ­folgenden 4 Wochen auf 5,2 pro Woche (Möllenbrink & Bruckschen, 1994). Stuhlfrequenz / Woche 10 8

Placebo Mutaflor¤ p < 0,001

6

p < 0,001

4 2 0

0

4

8

Wochen

Abb. 51 E insatz von Mutaflor® bei chronisch obstipierten Patienten. Randomisierte Doppelblindstudie Mutaflor® vs. Placebo über 8 Wochen. Mutaflor® führt zu einer signifikanten Erhöhung der wöchent­lichen Stuhl­frequenz (nach Möllenbrink & Bruckschen, 1994). 74

Die Wirksamkeit von Mutaflor® bei der chronischen O ­ bstipation scheint auf der Fähigkeit von E. coli Nissle 1917 zu beruhen, in erhöhtem Maße Essig­säure zu bilden. Die Essigsäure hat einen stimulierenden Effekt auf die Darmmotilität, indem sie die Ringmuskulatur des Dickdarms direkt anregt (Bär et al., 2009). Auswirkungen der Mutaflor®-Gabe auf die intestinale Gasbildung konnten in einer ­doppelblinden randomisierten Studie mit 30 gesunden F ­ reiwilligen dagegen nicht festgestellt werden. Die tägliche Verabreichung von 2  x 1 Kapsel Mutaflor® zeigte keine signifikante Wirkung auf die intestinale Gasdynamik (Hernando-Harder et al., 2008). Fazit: Die Gabe von Mutaflor® steigert bei langfristig obstipierten Personen die wöchentliche Stuhlzahl auf die physiologischen Normalwerte. Dies ist von besonderer Be­deutung für Patienten mit Laxantienabhängigkeit sowie für Schwangere und Stillende. Kolonisationsprophylaxe bei Neugeborenen: Bereits Escherich hatte sich über die „Constanz der im Säuglingsdarm gefundenen Arten“ ­Gedanken gemacht und „eine auffällige Reinheit in Bezug auf die bakteriologischen Verhältnisse und ein merkwürdiges Bestreben ... dieselbe ungetrübt zu erhalten“ bemerkt. 30 Jahre später berichtete Nissle über den Coli-­ Antagonismus, den Escherich vielleicht ahnen, aber noch nicht erkennen konnte, als ein Wirk­ mecha­ nis­­ mus zur Stabilisierung mikroökologischer ­Verhältnisse im Intes­tinal­trakt. Weitere 80 Jahre später wurde in kontrollierten klinischen S ­ tudien an Neu­ geborenen nachgewiesen, dass bereits eine kurzzeitige tägliche orale Gabe von 1 ml Mutaflor® Suspension mit 108 KBE/ml während der ­ersten fünf ­ Lebenstage im Vergleich zu einer nichtbehandelten Kontrollgruppe (Schröder, 1992) bzw. zu Placebo (Lodinová-Žádníková & Sonnenborn, ­ 1997) eine deutliche Reduzierung der Ansiedlung pathogener und potenziell pathogener Keime im Säuglingsdarm bewirkt [Abb. 52 + 53]. Das „Zufalls­ produkt Darmmikrobiota“ kann so in physiologische Bahnen gelenkt werden.

Grampositive Isolate

Gramnegative Isolate

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Staphylococcus haemolyticus Streptococcus agalactiae andere hämolysierende Streptokokken

Acinetobacter spp. Citrobacter freundii Enterobacter cloacae und andere Escherichia coli, hämolysierend Klebsiella pneumoniae, diverse Subspezies

Kluyvera ascorbata Proteus mirabilis Providencia alcalifaciens Serratia liquefaciens Yersinia enterocolitica

Abb. 52 Pathogene und potenziell pathogene Keime im Neugeborenendarm (nach Lodinová-Žádníková & Sonnenborn, 1997; Sonnenborn et al., 1990; Schröder, 1992). 75

Prozent der Kinder mit pathogenen Keimen

Neben dem kolonisationsprophylaktischen Effekt der gezielten Besiedlung des Säuglingsdarms mit E. coli Nissle 1917 hat die Verabreichung dieses probiotischen E. coli-Stamms einen deutlichen stimulierenden Einfluss auf die Entwicklung des lokalen Darmimmunsystems und die Antikörper­ bildung im Blutserum (Lodinová-Žádníková et al., 1992). Die Verabreichung von Mutaflor® ­Suspension führte bei 34 Frühchen in einer verblindeten, randomisierten, p ­ lacebokontrollierten klinischen Studie im Vergleich zur Kontrolle zu einem signifikanten Anstieg der Proliferation von Blutlymphozyten bei Ex-vivo-Kontakt mit bakte­riellen Bestandteilen von E. coli Nissle 1917 wie auch einem anderen nichtverwandten E. coli-Stamm (Cukrowska et al., 2002). Im Blut der mit E. coli Nissle 1917 kolonisierten Frühchen wurden im Vergleich zur Kontrolle sowohl signifikant höhere IgA-Anti­körper­ spiegel festgestellt, die gegen den oral verabreichten E. coli-Stamm gerichtet waren, als auch eine starke Erhöhung des Spiegels an unspezi­fischen polyklonalen IgM-Antikörpern. L ­ etzteres zeigt, dass die Darmbesiedlung mit E. coli Nissle 1917 neben der ­Stimulierung spezifischer zellulärer wie humoraler Immun­ant­worten gleich­zeitig zu einer Aktivierung der unspezifischen natürlichen ­Immunität führt. 100 80

Fazit: Eine Reihe von klinischen Studien mit Mutaflor® Suspension zur gezielten Kolonisierung des Darms bei frühgeborenen und ausgetragenen Kindern hat gezeigt, dass die Gefahr einer frühen Besiedlung des Gastro­ intestinaltrakts mit pathogenen und potenziell pathogenen Keimen durch die Gabe von E. coli Nissle 1917 deutlich reduziert wird. Dies ist von besonderer Bedeutung, da Neugeborene in den ersten Lebenswochen nur unvollständig geschützt sind gegen Fehlbesiedlungen und nosokomiale Infektionen, z. B. mit multiresistenten Hospitalkeimen. Weitere Indikationen: Es liegen publizierte Daten von P ­ ilotuntersuchungen und Kasuistiken vor, die das eingangs erwähnte breite Anwendungsspektrum von Mutaflor® untermauern [Abb. 54].

Weitere intestinale und extraintestinale Indikationen lt. klinischen Studien

lt. Erfahrungsberichten/Kasuistiken

–  Morbus Crohn

–  Non-Ulcer-Dyspepsie / Reizmagen

– Pouchitis

– Nahrungsmittelunverträglichkeiten / Malabsorptionen

–  Kollagene Colitis

kolonisierte Kinder placebobehandelte Kinder

60

– Antibiotika-assoziierte Colitis/ pseudomembranöse Colitis

– Halitosis

– Reizdarm-Syndrom

– Mykosen des Orogastrointestinal-Trakts

– Divertikulose

– Andere: z.  B. Neurodermitis, reaktive  Arthritis, Strahlen­ enteritis, Harnwegsinfekte, ... 

– Leberzirrhose 40

–  Polymorphe Lichtdermatosen

20 0

1. Tag

2. Tag

3. Tag

5. Tag

21. Tag

6. Monat

Studiendauer

– Infektanfälligkeit

Abb. 54 Weitere Indikationen für Mutaflor® (nach Goerg, 2001, 2008; Goerg & Schlörer, 1998; Fricˇ & Zavoral, 2003; Henker et al., 2001; Kruis, Chrubasik et al., 2004; Lata et al., 2007; Plassmann & Schulte-Witte, 2007; Tromm et al., 2004; Wurzel, 1999)

Abb. 53 Randomisierte Doppelblindstudie zur gezielten Kolonisierung des Darms neugeborener Kinder mit E. coli Nissle 1917. Die Verabreichung von Mutaflor® bewirkt eine signifikante Kolonisations­ prophylaxe gegenüber der Ansiedlung pathogener und potenziell pathogener Mikroorganismen (nach Lodinová-Žádníková & Sonnenborn, 1997).

76

77

Ausblick Seit seiner Entdeckung 1885 hat Escherichia coli wie kein anderes Bakterium die Aufmerksamkeit der Mediziner, B ­ akteriologen und Infektiologen, aber auch die der Biochemiker, Molekularbiologen und Genetiker auf sich gelenkt. Grundlegende Erkenntnisse, beispielsweise zur Genetik, zur Stoffwechsel­regulation, zum Gentransfer, zur Antibiotika-Resistenz sowie zu den molekularbiologischen Prinzipien der Pathogenese von Infektions­ erkrankungen, sind an diesem außergewöhnlichen Mikroorganismus, der in der Natur in ­vielen tausend Varianten vorkommt, erforscht worden. Die mikro­ökologische Bedeutung von E. coli im Gastrointestinaltrakt – erstmals beschrieben von Escherich (1885) – wurde durch Nissles Entdeckung des C ­ oli-Antagonismus untermauert (Nissle, 1916) und findet seitdem erfolgreich thera­peutische Anwendung durch Verwendung von E. coli ­Nissle 1917 (EcN) als Wirkstoff des Präparats Mutaflor®. Als Isolat aus der ­Darmmikrobiota ­(„E. coli-Wildtyp“) besitzt der EcN-Stamm ­Eigenschaften, vor allem hinsichtlich seiner Apathogenität, kombiniert mit Fitness und Kolonisa­ ­ahren für Genetiker und tions­ fähigkeit, die ihn in den letzten J Molekular­biologen, Infektionsbiologen, Mediziner und andere Forscher zu einem weiteren „beliebten Versuchstier“ unter den Coli-Bakterien gemacht haben. So wird dieser besondere E. coli-Stamm in der wissenschaft­ lichen Grundlagen­ for­ schung gern als Referenzstamm für die verschiedensten Untersuchungen und als Modellorganismus für die Unter­suchung des „Cross Talk“ zwischen den Darmbakterien und den Epithelzellen des ­ enutzt (Altenhoefer et al., 2004; Brader et al., 2008; Hafez et al., ­Wirtes g 2012; Mundy et al., 2006; Schierack et al., 2011; Stritzker et al., 2007). Die moderne molekulare Gentechnik erlaubt die schnelle und gezielte Beeinflussung der genetischen Ausstattung von Bakterien. Damit könnten maßgeschneiderte Bakterienstämme, z. B. gentechnisch veränderte E. coli, mögliche neue therapeutische Ansätze für die Behandlung einer Reihe von Erkrankungen darstellen, wie etwa chronisch entzündliche Darmerkrankungen, bakteriell verursachte Durchfallerkrankungen oder Darmfunktionsstörungen. Weiterhin gibt es erste Versuche zur Prävention von HIV-Infektionen durch genetisch modifizierte Coli-Bakterien. E. coli Nissle 1917 ist prinzipiell in der Lage, den Darm zu besiedeln, besitzt keine Virulenzfaktoren und ist apathogen. Der Stamm könnte so als „Transportvehikel“ für die Synthese rekombinanter Therapeutika im Darm ver­ wendet werden (Buddenborg et al., 2008; Duan et al., 2008; Duan & March, 2008; Loessner et al., 2009; Remer et al., 2009 ; Whelan et al., 2014). 78

Möglich wäre eine gezielte therapeutische Beeinflussung des bei den ­ hronisch entzündlichen Darm­­­erkrankungen gestörten mucosalen Immun­ c systems durch den Einsatz von E. coli Nissle 1917 als rekombinanter ­Träger für immunmodula­torische Moleküle, wie anti-inflamma­torische Zytokine oder antimikrobiell wirkende Defensine (Seo et al., 2012). Neben einer lokalen Immunmodulation durch gezielte ­ Wirkstofffreisetzung im Darm ließe sich möglicherweise auch eine systemische Beeinflussung von Autoimmun­erkrankungen erzielen. Eine mögliche Prävention von HIV-Infektionen könnte der Schutz der Schleimhäute von Darm und Vagina, den häufigsten Übertragungswegen für AIDS-Viren, mit Hilfe antiviraler Medikamente sein. Eine ­amerikanische Forschergruppe an den National Institutes of Health in Bethesda hat ­untersucht, ob E. coli Nissle 1917 als Vehikel für antiviral wirksame Peptide (fusionshemmende Wirkstoffe) verwendet werden kann (Rao et al., 2005). Die Fusionshemmer lagern sich an einer für das Eindringen des Erregers in den menschlichen ­Körper wichtigen Stelle auf der Oberfläche von HIV an und blockieren das Eindringen des Virus in die Wirtszelle. In-vitro-Versuche mit Fusionshemmern an mononukleären Blutzellen zeigten, dass die Hemmung einer HIV-Infektion konzentrationsabhängig erfolgte. E ­rste Tier­ versuche an Mäusen ergaben eine erfolgreiche Kolonisation unterer Darm­ abschnitte und in geringen Konzentrationen auch der Vagina [Abb. 55]. Durch eine stabile Besiedlung der Schleimhäute mit einem so genmodifizierten E. coli Nissle 1917 könnte in der Zukunft ein längerfristiger Schutz vor AIDS erreicht werden. Auf der Basis eines E. coli-Trägersystems wird auch an der Entwicklung und Herstellung von rekombinanten Lebendimpfstoffen gearbeitet (­Paton et al., 2005; Rosenthal et al., 2014). Im Gegensatz zu den klassischen Lebend­ impfstoffen ­ (Lebendvakzine), die auf abgeschwächten Erregern beruhen, müssen ­Keime des E. coli ­Stamms Nissle 1917 nicht erst attenuiert (infek­ tionsmäßig abgeschwächt) werden, da sie keine Virulenzfaktoren besitzen und apathogen sind. Ziel ist es, lebende, apathogene, genetisch modifizierte Darmbakterien zur mucosalen Immunisierung als mögliches Trägersystem für oral applizierbare heterologe Antigene zu nutzen. Eine mucosale ­Immunisierung würde zu einer Aktivierung des Immunsystems der Schleimhäute führen und somit Schutz vor Pathogenen, wie z. B. Durchfallerregern (EHEC, ETEC) oder den Erregern der Legionärs­krankheit und Chlamydien bieten. Mit Hilfe gentechnischer Verfahren lassen sich EcN-Zellen schonend „entkernen“ (Langemann et al., 2010). Diese von allen intrazellulären Komponenten (DNA, RNA, Protein u.s.w.) befreiten Bakterienhüllen, sog. 79

„­ bacterial ghosts“, können in vielfältiger Art und Weise verwendet werden (Langemann et al., 2010), so z.B. als Trägersystem von Wirksubstanzen für ophthalmologische Erkrankungen (Stein et al., 2013). Colon

Anus Duodenum Ileum

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Rectum Magen

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Duodenum

Jejunum

Ileum

Caecum

Colon

Rectum

Vagina

Abb. 55 Nachweis eines rekombinanten Derivats von E. coli Nissle 1917 (EcN) in verschiedenen Darmabschnitten bei Mäusen nach oraler (grüne Balken) bzw. rektaler Verabreichung (gelbe Balken) von 5 x 108 lebenden Zellen. Der EcN-Stamm wurde so modifiziert, dass er ein antiviral wirkendes Anti-HIV-Peptid sezernierte. Dies führte im Mausmodell zum Schutz vor einer Infektion mit einem HIV-verwandten, mäusepathogenen Virus (Rao et al., 2005).

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Fazit: Escherichs Wunsch „Mögen die hier gewonnenen Anschauungen nicht ohne Nutzen und praktische Verwerthung bleiben …“ ist in Erfüllung ge­ gan­gen, wie die Ausführungen im vorliegenden Text aufzeigen konnten. Die von Escherich bereits bei der Entdeckung des Bakteriums gestellte Frage nach dem „inneren Zusammenhang, … nach der ­Constanz in dem Vorkommen gewisser Arten und wodurch dieselbe bedingt ist“, ist auch heute noch nicht vollständig beantwortet und bedarf weiterer intensiver Forschungen.

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Sachverzeichnis Acinetobacter 75 Adhäsine – pathogene

12, 32 20 - 23

Allergien – Graspollen – Hausstaubmilben

61- 63 61- 63 62

Antagonismus – bakterieller – Anti-Invasionseffekt / Anti-Invasionswirkung – Test

Antigene – bakterielle – luminale – Nahrungsantigene

25 - 28, 75 - 77 38 - 43 25

12, 33 47, 48 47, 53

Arthritis 77 Arzneimittel – mikrobielle – probiotische – rekombinante

27, 30 - 32, 78 - 80 31 15 - 16, 78 - 80

B Bacterial Ghosts

79 - 80 7 - 10, 19

Bacteroides

17, 18

Bakteriophagen

23, 24

Bakteriocine Bifidobacterium

17, 18

Biofilm – Bildung

33, 35 - 37, 39

C Calprotectin

44, 46, 66

Campylobacter 9 Candida albicans

Antibiotika 29, 30 –N  ebenwirkungen 29 – – Allergien –F  olgen – – Antibiotika-assoziierte Colitis / 67, 68, 77 pseudomembranöse Colitis – Resistenzen 29 - 30

Bacterium coli commune

94

Bifidobakterien

A

34, 35, 65 17, 41, 59 - 60

18, 28, 66

Cathelicidine CED

44, 46, 66, 70 s. Darmerkrankungen, chronisch entzündliche

Chromosom s. Escherichia coli, Chromosom Citrobacter

11, 75

Clostridien 18 Colitis – akute – – Therapie 72 – Antibiotika-assoziierte / 68, 77 pseudomembranöse – DSS-induzierte 52 - 54, 59 – durch T-Zell-Transfer induzierte 61 21, 24 – hämorrhagische – kollagene 67, 77 Colitis ulcerosa – Pathogenese – Therapie Colon – mikrobielle Besiedlung Cross Talk Cyclooxygenase-2 (COX-2)

44 - 46, 47, 70 43, 64, 70 - 73 17 - 18 34, 38, 43, 65, 66 58

D Darm – Darmschleim 33, 35 - 37, 44 – Immunsystem 31, 44 - 46, 47, 55 - 63, 76 95

– Keimspektrum 18 – mikrobielle Besiedlung 7 - 10, 17 - 18, 34 - 37, 56 - 57, 75 - 77 – Milieu 17 – Neugeborene 7 - 10, 17 - 18, 75 - 77 Darmepithel – Barrierefunktion

34 - 37, 38 - 39, 41, 43 - 46, 47 - 54, 55 - 63 38, 44, 47 - 54

Darmschleimhaut – Barrierefunktion – Permeabilität≠

18, 34, 38, 41, 44, 46, 47 - 54, 55 - 63, 65, 66 38, 44, 47 - 54, 55 - 63 47 - 48, 53 - 54

Darmerkrankungen 19-24, 67-77, 78 - 79 –C  hronisch entzündliche 44 - 46, 61, 67, 70 - 73, 78 - 79 – Therapie – – Probiotika 30, 31, 32, 67 - 77 Darmflora 14 Darmmikrobiota 14 – Bakteriocine 34, 35 – Entwicklung 17, 18 – Infektionsbarriere 34, 35 Defensine – HBD-1 – HBD-2 – HD-5 – HD-6

33, 38, 44 - 46, 70, 79 44 44 - 46 44 44

Dendritische Zellen Dermatitis – Allergen-induzierte Desmosomen

60 62 49 - 50

Diarrhö 19 - 22, 27, 38, 67, 68 - 70 68, 69 – akute – chronisch rezidivierende 67 – infektiöse 19 - 22, 68 – protrahierte 67, 69 - 70 – Therapie 67 - 70 Divertikulose Duodenum – mikrobielle Besiedlung 96

67, 77 18

Dyspepsie / Reizmagen

67, 77

E EcN 32 Entamoeba 18 Enterobacter Enterobacteriaceae Enterobakterien

11, 18, 75 9, 11 18, 35

Enterococcus 17 Enterokokken 18 Escherich, Theodor

7 - 10, 75, 80

Escherichia coli (E. coli) 9 - 12, 17, 18, 23 - 24 – Chromosom 12, 33 – Genom 14, 15 - 16, 23 - 24 – hämolysierend 75 – K-12 13 - 14, 23 – – Genom 14, 23 – Nissle 1917 27 - 28, 32 - 33 – – Adhäsion 33, 37 – – Antagonismus 27, 28, 38 - 40, 66, 75  nti-invasiver Effekt / – – a anti-invasive Wirkung 38 - 43   – – antimutagene Wirkung 64 - 65 – – Biofilmbildung 35 - 37 – – Chromosom 33 – – Fimbrien 33, 35, 36 – – Fitnessfaktoren 32, 33 – – Flagellen 32, 33, 35, 45, 46, 56 – – Flagellin 45, 46 – – Genom 32, 33 – – Indikationsspektrum 67 - 77 – – Kapsel 33, 57 – – Persistenz 37 – – Phänotyp 33 33, 43 – – Plasmide – – Sicherheit / Unbedenklichkeit 32, 33 – – Trägersystem 79 - 80 – – W 27, 28, 34 - 54,  irkungen und Wirkmechanismen 55 - 63, 64 - 66 –p  athogene 19-24 – – AIEC 66 – – DAEC 22, 24

– – EAggEC 20, 22, 24 – – EHEC 20, 21, 24, 39, 40 – – EIEC 20, 22, 24, 66 20, 21, 24, 28, 51 – – EPEC – – ETEC 20, 21, 22, 24 – – NTEC 22 – – SEPEC/MENEC 20, 23, 24 – – UPEC 20, 22, 24 – Plasmide 12, 13, 15, 23, 24 – rekombinante 16, 78, 80 – Serologie 12 – Serotypen / Serovare 12, 19, 20, 23, 32, 33 – Zelle 12 – Zellwandaufbau 12 – Eubakterien 18

F Fimbrien

12, 21, 22, 23, 33, 35, 36

Flagellen

12, 32, 33, 35, 45, 46, 55, 56

Flagellin

45, 46, 55, 56

I Infektanfälligkeit Interferon – IFN-γ

48, 67, 68, 77 16, 66 61, 66

IgA

47, 48, 76

IgG

61, 62

Ileum – mikrobielle Besiedlung

18

Immunsystem – Darm-assoziiertes s. Darm, Immunsystem Interleukine – 1b – IL-2 – IL-4 – IL-5 – IL-6 – IL-8 – IL-10

Fusobakterien 18

J

G

Jejunum – mikrobielle Besiedlung

58 62 61 62, 66 61, 66 56, 57, 58, 66 59, 60, 62, 66

18

Gastritis 53

K

Genom – menschliches – Inseln

14 23

Gentransfer – horizontaler

23, 24, 78

Hämolytisch-urämisches Syndrom (HUS) Hefen HIV

36, 72 23 9, 11, 75

Kluyvera 75

Halitosis 77

Helicobacter pylori

Kerngenom – bakterielles Klebsiella

H

Harnwegsinfektionen

Kapsel – magensaftresistente

21, 24

Kolonisation – mikrobielle

35 - 37

Kolonisationsprophylaxe

75 - 77

19, 22 - 24, 77 s. Candida albicans

L

18

Lactobacillus

17, 59, 60, 63

79, 80

Laktobazillen

18, 29 97

Leaky Gut

47 - 54

Lebendimpfstoffe – rekombinante

79

Leberzirrhose

48, 77

Legionella 43 Lipopolysaccharid (LPS) 12, 32, 33, 55 - 57, 59, 61, 62 Listeria

43, 66

O

Serotypisierung s. Escherichia coli, Serologie

Obstipation – chronische – – Therapie

Serratia 75 67, 68, 73 - 75

Shigella

P Pathogenitätsfaktoren

23, 32, 33

Pathogenitätsinseln 24 Peptide, antimikrobielle 33, 38, 44-46, 79

M

Peptostreptokokken 18

Magen – mikrobielle Besiedlung

Phagen

Makrophagen Mesalazin (5-Aminosalicylsäure)

18 47, 60 36 - 37, 64, 70 - 73

s. Bakteriophagen

Pinin 50 Plasmazellen

47, 48

Mucosa Mucin

44 - 46, 47, 70 73, 77 s. Darmschleimhaut 38, 39, 66, 70

Mutaflor® 27, 29, 32, 35, 36, 64, 67 - 77, 78 68 - 70, 72, 75 - 77 – Suspension Mutagenitätstest Mykosen

64 - 65 67, 68, 77

Nahrungsmittel- unverträglichkeiten

67, 68, 77

Neurodermitis

67, 68, 77

Nitric Oxide Synthase – induzierbare (iNOS) NOD-Rezeptoren 98

Proteus

15 - 16 18, 28, 75

38, 48, 49 49, 52 49 - 51 49

Zytokine

59 - 62, 79

Staphylokokken 18 Strahlenenteritis 77 Streptococcus 75 Streptokokken

18, 75

stx-Genexpression 39

Thrombotisch-Thrombozytopenische ­Purpura (TTP) Tight Junctions

21

34, 38, 47-52

T-Helfer-Zellen 61-63 – TH-1-dominierte Immunantwort 61, 63 – TH-2-dominierte Immunantwort 61 47, 60 - 63

Providencia 75

T-Zellen

47, 60 - 63

Pseudomonaden 18

Toll-like-Rezeptoren (TLR)

55-57, 59

Q

Transkriptionsfaktoren 55 – NF-κB 53 34

Reizdarm-Syndrom

Salmonella

Translokation

41, 47, 48

Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) 67, 68, 77

S

16, 57 - 62, 66

V Veillonellen 18

11, 24, 27, 28, 38, 39, 41, 42

25 - 28

Salmonellen

58 - 59

Sepsis – LPS-induzierte

55 - 57, 70

49, 50

Zonula occludens – ZO-1-Protein – ZO-2-Protein – ZO-3-Protein

T-Lymphozyten

Quorum Sensing

Z Zonula adhaerens

Protozoen 18

R

N

Nissle, Alfred

Proteine – rekombinante

42, 43, 66, 75

Yersininien 38

Staphylococcus 75

tcpC-Modulatorprotein 45

Probiotika 30 - 31, 38, 45, 59, 65, 70 – Sicherheit / Unbedenklichkeit 30 - 31, 32

Yersinia

22, 27, 38

T

77

Mikrobiota 14

Morbus Crohn – Pathogenese – Therapie

Shigellen

Polymorphe Lichtdermatosen

Pouchitis 77

32, 33, 35, 41, 43

21, 39, 40 11, 24, 28, 42, 43, 66

Plasmide s. Escherichia coli, Plasmide

Mikrobiom 14

Mikrocine

Shiga-Toxin

Y

27, 38, 39, 41 - 43, 65 19, 23, 32 62

Vibrionen 28 Virulenzfaktoren / -merkmale

20, 21, 24, 57, 78, 79

Virulenzgene 24

Septikämie 22 99

M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller E. coli – Bedeutung in Forschung und Medizin

ISBN 3-9811198-4-3

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E. coli Bedeutung in Forschung und Medizin

3., überarbeitete Auflage

M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller

26.05.15 12:54