Massenspektrometrische Ermittlung der Proteintargets von

Massenspektrometrische Ermittlung der Proteintargets von zytotoxischen Metallkomplexen in Blutserum und E. coli-Zellen

Dissertation

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Chemie an der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Joanna Will

Bochum 2008

Moim rodzicom

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juli 2005 bis Mai 2008 am Lehrstuhl für Analytische Chemie der Ruhr-Universität Bochum erstellt.

An dieser Stelle danke ich ganz besonders Herrn Prof. W. S. Sheldrick, PhD, für die interessante Themenstellung, ständige, gewinnbringende Diskussionsbereitschaft, seine Begeisterungsfähigkeit und den mir gewährten Freiraum bei der Durchführung dieser Arbeit.

I

Inhaltsverzeichnis

II Abkürzungen/Aminosäuren 1

Einleitung

1

2

Problemstellung

5

3

Kenntnisstand

7

3.1

Platinverbindungen

7

3.2

Rutheniumverbindungen

18

3.3

Methoden

21

4

5

6

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

26

4.1

Chromatographische Modellstudien

26

4.2

Massenspektrometrische Studien

35

4.2.1 Modellstudien mit [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)]

37

4.2.2 Modelluntersuchung mit [Pt(dien)(H2O)]2+

40

4.2.3 Modellstudien mit cis-[PtCl2(NH3)2]

42

4.2.4 Schlussfolgerungen für LC2/ESI-MS2-Analysen

46

Proteintargets in Escherichia coli

48

5.1

Proteintargets von [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)]

49

5.2

Proteintargets von [Pt(dien)(H2O)](NO3)2

61

5.3

Proteintargets von cis-[PtCl2(NH3)2]

70

5.4

Diskussion

99

5.4.1 Wechselwirkung von [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] mit E. coli-Zellen

100

5.4.2 Wechselwirkungen von Platinkomplexen mit E. coli-Zellen

105

Serumproteine

114

6.1.

117

Cisplatinaddukte des Serumalbumins

6.1.1 Blutserumproben

117

6.1.2 Serumalbumin:Cisplatin Proben

126

6.2

136

Cisplatinaddukte des Serotransferrins

6.2.1 Blutserumproben

136

6.2.2 Serotransferrin:Cisplatin Proben

143

6.3

154

Cisplatinaddukte des Apolipoproteins A1

6.3.1 Blutserumproben

154

7

6.3.2 Apolipoprotein A1:Cisplatin Proben

158

6.4

Cisplatinaddukte des Alpha-1-Antitrypsins

161

6.5

Cisplatinsddukte des Alpha-2-Macroglobulins

165

6.6

Cisplatinaddukte des Apolipoproteins A2

169

6.7

Cisplatinaddukte weiterer abundanter Proteine

172

6.8

Diskussion

173

Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin

183

7.1

Proteintargets in humanem Thioredoxin

185

7.2

Proteintargets in Thioredoxin E. coli

188

7.3

Vergleich von humanem und E. coli Thioredoxin

194

8

Proteintargets in Cyclooxygenase-2

195

9

Zusammenfassung

200

10 Experimenteller Teil

206

10.1

Ausgangssubstanzen

206

10.2

Biologische Proben

207

10.3

Massenspektrometrische Untersuchungen

208

10.4

Chromatographische Untersuchungen

212

10.5

Kernresonanzspektroskopie

212

11 Anhang

214

12 Literatur

220

II. Abkürzungen (k)Da

(kilo)Dalton

2DE

zweidimensionale Gelelektrophorese

5´-GMP2-

5´-Guanosinmonophosphat

Ac

Acetyl

bpy

2,2-Bipyridin

Cisplatin

cis-Diammindichloroplatin(II)

Cymol

4-Methylisopropylbenzol

dien

2,2'-Diaminodiethylamin

DMSO

Dimethylsulfoxid

DNA

Desoxyribonukleinsäure

en

Ethylendiamin

ESI

Electrospray Ionization

HPLC

High pressure/performance liquid chromatography

HSAB

Hard Soft Acid Base

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

HT-29

Humane Kolonadenkarzinomzelllinie

IC

Inhibitory concentration

ICAT

Isotope-Coded Affinity Tags

ICP

Inductively Coupled Plasma

IP

Ionenpaar

LC

Flüssigkeitschromatographie

MALDI

Matrix Unterstützte Laser Desorption/Ionisation

MCF-7

Humane Mammakarzinomzelllinie

MS/MS

Tandem-Massenspektrometrie

MudPIT

Multidimensionale-Protein-Identifizierungs-Technologie

NAMI-A

ImH[trans-RuCl4(DMSO)Im]), (New Antitumor Metastasis Inhibitor)

NMR

Kernresonanz

PAGE

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

RAPTA

Ruthenium(II)-Aren-PTA (PTA = 1.3.5-Triaza-7-phosphaadamantan)

RP

reversed-phase

SDS

Natriumdodecylsulfat

TOF

Flugzeit, Time-of-flight

Allgemeine Erläuterungen

Angaben zu den stöchiometrischen Verhältnissen (z. B. 1:1-Ansatz) beziehen sich immer auf das Stoffmengenverhältnis von Metallkomplex zu Ligand. Die in dieser Arbeit angegebenen Prozente zur Eluentenzusammensetzung sind als Volumenprozente zu verstehen.

Aminosäuren

Einleitung

1

1. Einleitung Die im normalen Sprachgebrauch als Krebs bezeichnete Krankheit umfasst eine Vielzahl von Formen und verwandten Erkrankungen, bei denen Körperzellen unkontrolliert wachsen, sich teilen und gesundes Gewebe zerstören können. Aus dem unkontrolliert wachsenden Gewebe kann sich ein Tumor entwickeln. Dabei gibt es zwei Formen: benigne und maligne Tumoren. Benigne Tumore sind durch lokal begrenztes Wachstum gekennzeichnet, Zellen maligner Tumore hingegen können sich aus dem Zellverband des Tumors lösen und mit dem Blutstrom oder durch das lymphatische System in andere Körperteile gelangen. So können dort dann Metastasen entstehen. Krebs ist mit 10,9 Millionen Neuerkrankungen jährlich [1] nach wie vor die zweithäufigste Todesursache weltweit, nach Herz-Kreislauferkrankungen. Die folgende Grafik stellt die prozentuale Verteilung der krebsbedingten Sterbefälle ausgewählter Tumorarten nach Geschlecht unterteilt dar.

Abb.1.1: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen aus allen Krebssterbefällen in Deutschland 2004 [2]

Einleitung

2

Zur Behandlung von Krebs stehen den Medizinern immer leistungsfähigere diagnostische Systeme und ein umfangreiches Arsenal an Methoden zur Verfügung. Ein Beispiel stellt die Hyperthermie dar, die auf gezielter lokaler oder einheitlicher Überwärmung beruht und die Temperaturempfindlichkeit von Tumorzellen ausnutzt. Bei der Strahlentherapie wird der Tumor Röntgen- oder Gammastrahlung ausgesetzt, wodurch die erkrankten Zellen geschädigt werden und absterben. Des Weiteren wird sehr häufig ein operativer Eingriff zur Entfernung der Tumoren praktiziert, der jedoch nicht selten nur eingeschränkt möglich ist, da entartetes Gewebe von gesundem nicht exakt abgegrenzt werden kann. Eine wichtige Rolle spielt die medikamentöse Behandlungsweise, die Chemotherapie. Mit der zufälligen Beobachtung ROSENBERGS und seiner Mitarbeiter vor über 40 Jahren, dass Hydrolyseprodukte einer Platinelektrode die Zellteilung von Escherichia coli hemmten [3], entwickelte sich daraus folgend, nach einer Reihe von Untersuchungen Cisplatin mit der Zulassung in den USA 1979 zum bedeutendsten Zytostatikum [4-6]. Weitere intensive Forschungsarbeit, die seit über vier Jahrzehnten andauert, beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer für die gesunden Zellen weniger schädlicher [7] Verbindungen. Andererseits sind aber auch die Resistenzentwicklung und nicht auf alle Krebsarten erweiternde Verwendung Gegenstand vieler Arbeiten. Trotz des hohen Aufwandes sind bislang nur zwei Folgeverbindungen, Carbo- und Oxaliplatin, weltweit als Zytostatika zugelassen worden, während weitere wie Nedaplatin regional beschränkt eingesetzt werden. Cisplatin besitzt eine sehr gute Wirksamkeit bei Hodenkarzinomen, Ovarialtumoren, Tumoren im Kopf-Hals-Bereich und Blasentumoren. Weniger wirksam bis unwirksam ist Cisplatin bei Tumoren des Magen-Darm-Traktes, vor allem bei Kolonkarzinomen, sowie Tumoren der Lunge [8-14]. Nicht zuletzt aus diesem Grund richten sich immer mehr Arbeiten auf die Entwicklung nichtplatinhaltiger Metallkomplexe. Die bekanntesten Beispiele sind das von KEPPLER et al. synthetisierte KP1019 (Indazolium trans-[tetrachlorobis(1H-indazol)ruthenat(III)]) [15-19] und das von SAVA et al. synthetisierte, gegen Metastasen aktive NAMI-A (New Antitumor Metastasis Inhibitor) (Imidazolium [trans-Imidazoldimethylsulfoxidtetrachlororuthenat(III)], ImH[trans-RuCl4(DMSO)Im]) [20-23]. Ebenso zu erwähnen sind die von DYSON beschriebenen Komplexe der RAPTA-Klasse, wobei RAPTA für Ruthenium(II)-Aren-PTA (mit PTA = 1.3.5-Triaza-7-phosphaadamantan) steht [24-27]. Neben den genannten Platin- und Rutheniumverbindungen erwiesen sich weitere Übergangsmetallkomplexe, wie z. B. das Titanocendichlorid im Zellexperiment ebenfalls als wirksam gegen Brust-, Lungen- und Darmkarzinome [28]. Außer dem oben erwähnten

Einleitung

3

Metallocenkomplex zeigten diverse Ferroceniumsalze positive Resultate an verschiedenen Tumorzelllinien.

Daneben

wurden

als

weitere

Substanzklasse auch

Metall-Alkin-

Verbindungen [29, 30] mehrfach untersucht. Cobalt-Alkin-Komplexe, z.B. Co-ASS (Hexacarbonyl[2-propyn-1-ylacetylsalicylat]dicobalt), weisen hohe zytotoxische Wirksamkeit bei Tests an humanen Brustkrebs- und Leukämiezelllinien (z. B. für die humane MCF-7Brustkrebszelllinie gilt für Co-ASS ein IC50-Wert von 1,4 µM) auf [31-33]. Studien, die sich mit der Aufklärung der Wirkungsmechanismen der Antitumormittel beschäftigen, zeigten für Cisplatin, dass eine Koordination der Hydrolyseprodukte des Cisplatins an die DNA für den zytotoxischen Effekt in den Zellen verantwortlich ist. Ferner ist bekannt, dass die Koordination an die DNA eine Hinderung der Replikation und Transkription bewirkt. Cisplatin kann verschiedene Arten von cross-links innerhalb der DNA ausbilden, am häufigsten 1,2-intrastrand cross-links, die zu einer Verkrümmung der DNA führen. Diese wird wiederum durch verschiedene Proteine, unter anderem die HMG-Proteine (high mobility group) erkannt, die ihrerseits eine Reparatur der veränderten DNA-Regionen ausführen, andererseits eine solche Reparatur aber auch verhindern können. In der Literatur wird gar die Verursachung der Apoptose durch diese Proteinreaktionen diskutiert [34, 35]. Eine schematische Darstellung der möglichen DNA-Cisplatin-Addukte findet sich in der folgenden Abbildung.

Abb.1.2.: Hauptaddukte aus DNA und Cisplatin: (a) interstrandcross-link, (b) 1,2-intrastrandcross-link, (c) 1,3-intrastrandcrosslink, (d) Protein-DNA-cross-link [35]

Einleitung

4

Die Wechselwirkung des Metallkomplexes mit der DNA ist zwar für den therapeutischen Effekt Cisplatins verantwortlich, jedoch reagiert nur ein geringer Teil des eingesetzten Zytostatikums tatsächlich mit dieser. Der Großteil (65-98% [36, 37]) des intravenös verabreichten Krebstherapeutikums bindet hauptsächlich an Proteine. Diese eigentlichen Hauptreaktionen des Cisplatins, die für einen Teil der Toxizität verantwortlich gemacht werden, sind bislang deutlich weniger erforscht als die Reaktionen mit der DNA und sind deswegen Gegenstand vieler aktueller Studien.

Problemstellung

5

2. Problemstellung Die Zielsetzung der Arbeit ist es, einen Beitrag zur Aufklärung der Reaktionen von Einzelproteinen

bzw.

Proteinen

in

lebenden

Zellsystemen

und

Blutserum

mit

antitumorwirksamen Metallkomplexen zu leisten. Hierbei soll untersucht werden, ob durch die Kopplung einer ein- oder zweidimensionalen flüssigchromatographischen Trennung mit der ESI-Tandem-Massenspektrometrie grundsätzlich die Möglichkeit besteht Proteintargets bzw. Protein-Bindungsstellen von Metallkomplexen in komplexen Proteingemischen zu bestimmen. Hierfür

werden

die

Modellverbindungen

[Pt(dien)(H2O)](NO3)2

und

[(η6-p-

Cymol)RuCl2(DMSO)] sowie die zytotoxischen Komplexe Hexacarbonyl[2-propyn-1-ylacetylsalicylat]dicobalt (Co-ASS) und Cisplatin untersucht. Zu Beginn der Arbeit soll gezeigt werden, welche Voraussetzungen für eine erfolgreiche „bottom-up“ LC2/MS2 –Analyse von Gemischen von Metall-Protein-Komplexen erfüllt werden müssen. Hierbei muss zunächst geprüft werden, ob bestimmte Metallfragmente an Peptidsequenzen koordiniert bleiben: a) während des enzymatischen Verdaus der Proteinaddukte sowie b) während der chromatographischen Trennung der entstandenen tryptischen Peptide unter Verwendung von reversed phase- und SCX-Säulen. Dies gilt insbesondere für die kinetisch bevorzugten Bindungsstellen an O- und SDonoratome, die möglicherweise beim Verdau bzw. bei der chromatographischen Trennung zu Gunsten von thermodynamisch begünstigten His- und Cys-Resten aufgegeben werden könnten. Gelingt diese Trennung, muss außerdem anschließend festgestellt werden, ob die metallierten Peptidionen: a) massenspektrometrisch detektiert werden können und ob b) die so erhaltenen gasförmigen Ionen anschließend durch CID-MS zu metallierten Ionen der b+- und y+-Reihen fragmentiert werden können. Schließlich muss die Eignung der bisher zur Identifikation von posttranslationalen Modifikationen verwendeten Software der massenspektrometrischen Proteomics für die zuverlässige Bestimmung von Metallierungstellen in Proteintargets überprüft werden. In Voruntersuchungen werden deswegen chromatographische und vor allem ESI-MS2 – Studien von wässrigen Lösungen aus Modellpeptiden mit den jeweiligen Metallkomplexen durchgeführt.

Problemstellung

6

Die Proteintargets des Cisplatins und des Komplexes [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] in dem Bakterium E. coli sollen aufgeklärt werden. Das Darmbakterium wird als einfaches Modell für andere Zellsysteme eingesetzt, vor allem um die Vorgänge in komplexen humanen Zellen besser zu verstehen. Es gilt sowohl die Proteintargets als auch die spezifischen Bindungsstellen der Metallkomplexe in dem Bakterium durch Tandem-Massenspektrometrie zu ermitteln. Außerdem sollen die Cisplatin-Bindungsstellen in den wichtigsten Serumproteinen bestimmt werden. Zwecks Validierung und Überprüfung der Ergebnisse für Blutserumproben werden auch die abundanten Proteine Albumin, Serotransferrin, Alpha-2-Macroglobulin, Apolipoprotein A1 und Alpha-1-Antitrypsin einzeln untersucht. Ein Vergleich der Bindungsstellen des Cisplatins in zwei Proteinen aus unterschiedlichen Organismen (hier bakteriell und human), den Thioredoxinen wird angestrebt. Zusätzlich sollen Bindungsstellen des potentiellen Zytostatikums Co-ASS in der Cocylooxygenase-2 ermittelt werden. Die Messungen werden sowohl mit der LC-ESI-MS/MS-Methode als auch mit Hilfe der MudPIT- Technologie (Multidimensional Protein Identification Technology) erfolgen. Hierbei sollen die Möglichkeiten und Einschränkungen der Methode zur Bestimmung von Proteintargets allgemein durchleuchtet werden. Es soll außerdem geklärt werden, ob die Metallkomplexe bestimmte Aminosäurenreste als Bindungsstellen bevorzugen.

Kenntnisstand

7

3. Kenntnisstand 3.1 Platinverbindungen Wie bereits in Kapitel 1 erwähnt, ist das Ziel aller aktuellen platinhaltigen Chemotherapeutika die DNA. Sowohl Cis- als auch Carboplatin werden ausschließlich intravenös verabreicht. Ein erheblicher Teil des Cisplatins wird an Serumproteine gebunden [36] bevor es zur DNA gelangen kann. Geschwindigkeitsbestimmend bei der Platinierung der Oligonukleotide [3840] ist die Hydrolyse des Cisplatins, welche auf Grund der hohen Chloridkonzentration im Blut (100mM) erst in der Zelle signifikant stattfindet, wie das folgende Schema zeigt.

Abb.3.1: Schematische Darstellung der Aufnahme von Cisplatin in die Zelle nach intravenöser Injektion [41] Eine vollständige Hydrolyse des Cisplatins bei [Cl]- = 4mM, was der Chloridkonzentration in der Zelle entspricht, und einem pH-Wert von 7,4 (T = 37°C) wurde von MILLER und HOUSE bereits nach zwei Stunden beobachtet [42]. Neben der Hydrolyse des Cisplatins ist auch die Ringöffnung des Dicarboxylatringes des Carboplatins Gegenstand vieler Arbeiten. Die Stabilität des Carboplatins ist im Vergleich zu der des Cisplatins deutlich höher. Mit Hilfe der 15

N/ 1H-NMR-Spektroskopie wurde die Ringöffnung in wässrigen Medien durch Nitrat,

Phosphat und Chlorid von SADLER untersucht [43] und dabei die Langlebigkeit des Carboplatins in Wasser bewiesen. Das Platin stellt nach der HSAB-Theorie eine leicht polarisierbare Lewis-Säure dar, die bevorzugt eine Bindung mit einem „weichen“ Liganden eingeht. Als potentielle Koordinationsmöglichkeiten kommen demnach für das (NH3)2Pt(II)-Fragment besonders die Schwefeldonoratome des Methionins bzw. des Cysteins sowie die aromatischen Stickstoffdonoratome des Histidin-Imidazolrings in Frage.

Kenntnisstand

8

Die Gruppe um SHELDRICK führte zahlreiche Untersuchungen der Reaktionen von Cisplatin mit methionin- bzw. histidinhaltigen Oligopeptiden durch. Daraus resultiert [44-48] das folgende Reaktionsschema.

Abb.3.2: Allgemeiner Reaktionsweg methioninhaltiger Peptide mit Cisplatin nach SHELDRICK

Es bildet sich zunächst ein monodentater κS-Komplex aus, dem ein mehrfacher Ringschluss zu bi-, tri- und tetradentaten Komplexen folgen kann. Unter bestimmten Voraussetzungen tritt bei dieser Reaktion eine Peptidspaltung auf. Der trans-Effekt des Schwefels unterstützt hier die Bildung der tridentaten Bischelate und die auftretende Spaltreaktion. Die Thiolfunktion in nicht methyliertem Cystein kann zur Ausbildung von Dimeren mit einer Disulfidbindung führen, die eine wichtige Rolle bei der Strukturbildung von Proteinen spielt. Bei Reaktionen cysteinhaltiger Peptide mit Platinverbindungen, insbesondere Glutathion, konnte eine Spaltung dieser Bindung durch Cisplatin beobachtet werden. Dieser Effekt wurde bei Albuminen beobachtet [49-52] und könnte für einen Teil der Toxizität des Zytostatikums verantwortlich sein. Bei Reaktionen von Histidin mit Pt(II) –Verbindungen stellen die Aminogruppe, die beiden Imidazolstickstoffe (N1 und N3) aber auch die Carboxylat-Sauerstoffatome potentielle Koordinationsstellen dar. APPELTON stellte für die Reaktionen von Histidin und histidinhaltigen Dipeptiden mit Cisplatin mehrere Reaktionsschemata [53] auf. Seinen Untersuchungen zufolge wird zunächst eine kinetisch bevorzugte Sauerstoffkoordination eingegangen. Über mehrere Stufen lagert sich der Komplex zu dem stabilen Endprodukt mit κ2N3,NH-Koordination [53] um. Eine κ2N1,NH Koordination wird aus sterischen Gründen nicht gebildet. Bei monofunktionellen Komplexen wie [Pt(dien)(H2O)]2+ wurde eine Koordination an einem der beiden Stickstoffatome des Imidazolringes als thermodynamisch

Kenntnisstand

9

stabiles Endprodukt der Reaktion beobachtet [54, 55]. Zwischen diesen beiden Modi existiert ein Gleichgewicht, das je nach Reaktionsbedingungen, insbesondere dem pH-Wert, N1-oder N3-Koordination bevorzugen kann. Bei den Umsetzungen mit konkurrierenden methionin- und histidinhaltigen Peptiden bilden sich nach dem Reaktionsschema unter Abb.3.2 Makrochelate, die auf Grund der freien Drehbarkeit und fehlender Ringspannung besonders stabilisiert werden. Werden Peptide mit Sequenzen His-(Aa)n–Met (n = 0-3) mit monofunktionalem [Pt(dien)(H2O)]2+ umgesetzt, so findet zunächst die kinetisch bevorzugte Koordination des Schwefels statt. Anschließend setzt eine langsame Migration zum thermodynamisch bevorzugten N1-Stickstoff ein. Eine Koordination an N3 konnte nur in deutlich geringerem Maße beobachtet werden [56, 57]. Mit Cisplatin und Modellpeptiden, Proteinen sowie Oligonukleotiden wurden zahlreiche Studien durchgeführt, um den Metabolismus des Zytostatikums im Organismus weiter aufzuklären. Dabei kann das Bindungsverhalten unter Verwendung diverser Methoden untersucht werden. Aus [1H,

15

N] und [1H,

13

C]-HSQC-NMR Studien mit dem Serumprotein Serotransferrin

konnte SADLER die Methioninkoordinationen an M256 und M499 als bevorzugte Stellen für [Pt(en)Cl2] und cis-[PtCl2(NH3)2] beobachten. Die Platinierungsgeschwindigkeit des Met256 ist vermutlich höher als die des Met499. Des Weiteren stelle SADLER fest, dass M313 keine bevorzugte Bindungsstelle im Gesamtprotein darstellt. Dieses Methionin liegt beim intakten Protein innen. Der S,N-Chelat des M313 konnte nur bei der Umsetzung mit dem rekombinierten N-Bereich und nicht beim intakten Protein beobachtet werden [58]. Auch die Gruppe um DYSON hat Untersuchungen der Wechselwirkungen Cisplatins mit dem Serumprotein Transferrin durchgeführt. Aus 1:10 Transferrin:Cisplatin-Ansätzen nach 15/30/180 min Inkubation bei 20°C konnte mittels ESI-MS/MS an tryptischen Peptiden sowie UV/Vis-Analysen eine Koordination des Cisplatinfragmentes [(NH3)2PtCl]+ an die Aminosäure Threonin 457 nachgewiesen werden. Dieses Beispiel stellt die einzige bisher veröffentlichte Arbeit dar, in der es gelungen ist eine Bindungsstelle in einem MetallkomplexProteinaddukt durch „bottom-up“ Tandem-Massenspektrometrie zu bestimmen [59]. Die deconvulierten Massenspektren des freien (a) und des koordinierten Transferrins (b) aus dieser Studie sind in der unteren Abbildung dargestellt.

Kenntnisstand

10 a)

b) ∆m/z = 264

Abb.3.3: Massenspektren (a) Serotransferrin sowie (b) eines Reaktionsgemisches Serotransferrin/Cisplatin [59]

Aus der Massendifferenz von 264 zwischen den Peaks in den Spektren m/z = 79519 in a) und m/z = 79786 in b), die dem Fragment [(NH3)2PtCl]+ entspricht, schloss die Gruppe auf eine kovalente Bindung zwischen dem Metallkomplex und dem Protein. Bei theoretischen Modelluntersuchungen konnten sie die Zugänglichkeit der Aminosäure T 457 für eine Cisplatinkoordination bestätigen. Da Serumalbumin mit einer Häufigkeit von etwa 50 % im Organismus vorliegt, ist eine Koordination

eines

verabreichten

Arzneimittels

bzw.

Metallkomplexes

an

dieses

Transportprotein vorauszusehen. KEPPLER führte Untersuchungen durch, die Bindungsrate des Cisplatins an Albumin zu bestimmen. Zur Veranschaulichung dient die von ihm erstellte Verteilung in Abbildung 3.4.

Kenntnisstand

11

Abb.3.4: Bindungsrate von Cisplatin an Serumalbumin [60]

In der Grafik ist die Anzahl gebundener Pt-Atome pro Protein bei den unterschiedlichen Metallkomplex-Protein-Ansätzen gegen die Inkubationszeit aufgetragen. Dabei kennzeichnen a, b, c, b, d die folgenden [Cisplatin]/[HSA]-Verhältnisse: (a) 1:1; (b) 4:1, (c) 10:1 und (d) 20:1. Nach etwa sechs Tagen liegt (wie aus Kurve (a) erkennbar) Cisplatin zu weniger als 10% ungebunden vor. [1H,

15

N]-HSQC-NMR-spektroskopische Daten von SADLER zeigen nach 2h Inkubation bei

37°C in Anwesenheit von Chloridionen einige Pt-O-Kreuzpeaks (δ15N im Bereich von -65 bis -75), transständig zu Amminliganden, die nach 9h nicht mehr beobachtet werden [61] (siehe Abbildung 3.5). 2h

9h

17h

Abb.3.5: [1H, 15N]-HSQC-NMR der 1:1 rHSA-Cisplatingemische als Funktion der Zeit [61]

Kenntnisstand

12

SADLER vermutete wegen beobachteter Pt-S-Kreuzpeaks nach 17 h Inkubation die bevorzugte Bindung einer an der Oberfläche lokalisierten Methioninseitenkette M298, die einer κ2SM,NMKoordination zugeschrieben wurde. Zusätzlich konnten monofunktionale Addukte an die freie Thiolgruppe C34 und einer oder zwei weiteren Methioninseitenketten im Serumalbumin festgestellt werden. Im Folgenden findet sich das Reaktionsschema, welches den oben genannten Befunden entsprechen soll. Dabei stehen die Kennzeichnungen (a) bis (f) und (a´), (d´) für NMRspektroskopisch beobachtete Spezies.

Abb.3.6: Reaktionsschema Albumin/Cisplatin nach SADLER [61]

Bei Reaktionen von Carboplatin mit Cytochrom c, einem in den Mitochondrien vorkommenden Protein, konnte die Gruppe um ZHU mittel ESI-MS wiederum Methionin als Bindungsstelle identifizieren. Hierbei konnten M65 und M80 auf Grund der benachbarten Spaltung der M-X-Bindung charakterisiert werden [62].

Kenntnisstand

13

Über ESI-MS konnte GIBSON ebenfalls Methionin als bevorzugte Koordinationsstelle und die Bildung von vier verschiedenen Adduktypen bei der Rektion von Ubiquitin mit Cisplatin nachweisen [63] (siehe Abbildung 3.7).

Abb.3.7: Deconvuliertes ESI-MS der Ubiquitin-Cisplatin-Addukte [63]

Aus seinen Studien stellte GIBSON einen möglichen Reaktionsweg auf, der von mono- über bidentate zu tridentaten S,N,O-Koordinationen von Cisplatin im Protein führt. Dabei folgt dem Verlust des Aqualiganden (m/z = 8812 zu m/z = 8792) die vermutete Chelatbildung zwischen dem Thioether und dem α-Amin des N-terminalen Methionins (M1). Ein NH3Verlust, durch den trans-Effekt des Thioether-Schwefels ausgelöst, führt zur Reaktion mit einer weiteren Aminosäurenseitenkette und somit zum tridentaten Ubiquitin-CisplatinAddukt. Weitere massenspektrometrische Studien zu Wechselwirkungen des Ubiquitins mit Platinverbindungen führten DYSON und HARTINGER durch. Dabei konnten sie beim Vergleich von MALDI- und ESI-MS die Bildung von diversen Metallkomplex-Protein-Addukten beobachten [64, 65].

Kenntnisstand

14

Abb.3.8: Deconvulierte Massenspektren der 2:1-Ansätze dreier Platinverbindungen mit Ubiquitin [65]

Aus der Abbildung 3.8 ist erkennbar, dass sowohl Cisplatin (CDDP) als auch Transplatin (TDDP) sowie das Oxaliplatin Addukte mit dem Protein ausbilden. Mit Hilfe der „top-down“Methode konnte M1 als Bindungsstelle von Cis- und Oxaliplatin, wie bereits GIBSON zeigen konnte [63, 67], bestätigt werden. Diese Strategie hatten MANDAL et al. 2006 erstmals verwendet, um Hinweise auf die Pt(II)-Koordination der Cysteine C5 und C7 des Metallothioneins zu erhalten [66]. Für die Ubiquitin:Cisplatin-Reaktion stellte DYSON das folgende Schema auf.

Abb.3.9:Hydrolyse und Reaktionsschema für Cisplatin und Ubiquitin [64]

Kenntnisstand

15

Beim Vergleich der von den untersuchten Pt(II)-Komplexen gebildeten Produkte fällt auf, dass Cisplatin eine höhere Tendenz zur Bildung von Addukten des Typs Ub-[Pt(NH3)] und Ub-[Pt(NH3)2] aufweist, was auf stabilere bi- oder tridentate Chelate hindeuten könnte. Die mittels nESI-QToF-MS bestimmten Addukte aus Cis-, Trans-, Oxaliplatin und Ubiquitin nach 3 und 8 Tagen sind in der Tabelle 3.1 dargestellt.

Tab.3.1: Addukte des Ubiquitins mit Cis- (CDDP), Trans- (TDDP) und Oxaliplatins mit den mittels nESI-QToF-MS bestimmten relativen Intensitäten nach 3 oder 8d Inkubation bei 37°C [64]

Die Gruppe um MESSORI beschäftigte sich mit den Reaktionen von mehreren Platinverbindungen und Cytochrom c. Dabei wurden die jeweiligen Platinkomplexe (Cis-, Trans-, Carbo- und Oxaliplatin) mit dem Protein bei unterschiedlichen Metall:ProteinVerhältnissen zwischen 24-168h bei 37°C inkubiert [68]. Deconvulierte ESI-MS-Spektren der Arbeitsgruppe des reinen Proteins (A) und 3:1 Cisplatin:Cytochrom c-Ansatzes nach 72h Inkubation (B) sind in der folgenden Abbildung zu sehen.

Kenntnisstand

16

Abb.3.10: Deconvulierte ESI-MS-Spektren des reinen Proteins (A) und des Cisplatin:Cytochrom c-Gemisches, 3:1, 72h/37°C (B) [68]

Aus dem Spektrum B) konnten MESSORI und PIERACCINI eine 1:1-Koordination (m/z = 12589) des [Pt(NH3)2]2+-Fragmentes an das Cytochrom c (∆m = 227) und eine 2:1Koordination desselben Platinrestes (m/z = 12816) beobachten, wobei noch Protein in der Lösung enthalten ist (m/z = 12361). Die Vermutung, dass M65 des Proteins die bevorzugte Bindungsstelle für die Platinkomplexe darstellen könnte, bestätigten sie in der nachfolgenden NMR-spektroskopischen Studie. Dabei wurden aus der Umsetzung der unten dargestellten Platin-Iminoether-Verbindung trans-[PtCl2{(E)-HN=C(OCH3)CH3}2] (trans-EE) und der äquimolaren Menge an Protein die in der Abbildung 3.12 dargestellten Kreuzpeaks erhalten.

Abb.3.11: Eingesetzter trans-[PtCl2{(E)-HN=C(OCH3)CH3}2]-Komplex

Kenntnisstand

17

Abb.3.12: Überlagerte [1H, 13C]-HSQC-NMR-Spektren des reinen Proteins (blau) und des 1:1 trans-EE:Protein-Ansatzes nach 168h/37°C [69]

Aus der Beobachtung des neuen Kreuzpeaks und den bereits beschriebenen Verschiebungen [Ref. 50 und 51 in 69] konnte M65 als bevorzugte Bindungsstelle bestätigt werden. Dieselbe Gruppe konnte für das Protein Lysozym durch eine Röntgenstrukturanalyse den Imidazolring des Histidins H15 als Bindungsstelle für das Cisplatin bestimmen [70]. Dabei tränkten sie die nach etwa fünf Tagen bei 4°C entstandenen Lysozym Kristalle mit einer 10fach höher konzentrierten Cisplatinlösung und konnten nach 72h Inkubation bei wiederum 4°C die in der Abbildung 3.13 gezeigte Koordination des Cisplatins bei dem Protein röntgenographisch bestimmen. Aus den begleitenden ESI-MS-Studien mit 1:3 ProteinCisplatin-Gemischen konnten sie nach 72h Inkubation bei 37°C eine Koordination des [(NH3)2PtCl]+-Fragmentes an das Lysozym feststellen [70].

Abb.3.13: Schematische Darstellung der Cisplatin:H15-Wechselwirkung im Lysozym [70]

Kenntnisstand

18

3.2 Rutheniumverbindungen Im Bereich der Platinverbindungen sind aus dem Bestreben, die bei Cisplatinbehandlung auftretenden Nebenwirkungen zu senken und dessen Resistenzen zu vermeiden, einige weitere Verbindungen erfolgreich in der Therapie aufgenommen worden (z. B. Carboplatin). Neben Platin als Metallzentrum werden jedoch auch eine Reihe weiterer Metalle getestet. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf Ruthenium und seinen Verbindungen. Die eingangs erwähnten bekanntesten Beispiele sind das KP1019, NAMI-A und RAPTA-Verbindungen. Aus den Arbeiten mit (η6-Aren)Ru(II)-Verbindungen konnte bei Reaktionen mit Aminosäuren die Bildung von Chelatkomplexen beobachtet werden [71]. Weitere Studien zum Reaktionsverhalten mit Aminosäuren führte EXNER durch [72]. Er konnte zeigen, dass aus polymeren Dichloro-η4-dien-Ruthenium(II)-Komplexen und Aminosäuren in wässrigen Lösungen Verbindungen des Typs [Ru(Aminosäure)2(η4-dien)] mit einer N,O(Carboxylat)Koordination entstehen. Eine Besonderheit bei der Verwendung von Rutheniumverbindungen als Antitumorwirkstoffe stellen die Transportmöglichkeiten durch das Blut dar. Analog zum Transport von Eisenverbindungen im Blutkreislauf über Transferproteine wie Albumin oder Transferrin, sind die gleichen Proteine in der Lage Ruthenium(III)-Verbindungen zu befördern [73, 74]. Tumore im Darm etwa haben einen hohen Bedarf an Eisen [75], so dass die Proteine das Eisen bzw. das Ruthenium dorthin transportieren. Aus Zellaufnahmetests konnten KEPPLER et al. einen erhöhten Eintritt der KP1019-Verbindung in die Zelle beobachten, wenn diese mit dem Fe(III)-haltigen Transferrin gebunden vorlag.

Abb.3.14: Zellaufnahme von KP1019 in humane Darmkrebszellen SW480 [75]

Bei diesen Untersuchungen stellen sie mittels ESI-MS fest, dass nach einer Inkubation des KP1019-Komplexes mit Transferrin (3:1) von 10 min bei 37°C zwei Äquivalente des

Kenntnisstand

19

Komplexes an Transferrin gebunden vorliegen. Beim Vergleich der Reaktivität des Komplexes KP1019 konnte jedoch die eindeutige Bevorzugung der Bildung von Albumingegenüber Transferrin-Addukten ermittelt werden [76]. Die Arbeitsgruppe von KOZLOWSKI et al. untersuchte unter anderem mittels UV/Vis- und Fluoreszenzspektroskopie

die

Wechselwirkungen

tetrachlorobis(imidazol)ruthenat(III)]-/

zwischen

dem

Imidazol[trans-

trans-Indazol(bisindazole)tetrachlororuthenat(III)

-

Komplex und dem humanen Serumalbumin. Auf Grund erniedrigter Aktivität in der IIADomäne (in der Umgebung des Trp 214) des Proteins vermuteten sie die Bindung der Komplexe an ein Histidin in der genannten Region, das H242 oder weitere in dieser Domäne lokalisierte Histidinstellen [77, 78]. In seinen Studien der Wechselwirkungen der RAPTA-Komplexe mit Proteinen beobachteten DYSON et al. Bindungen der Ru(II)-Komplexe an recombiniertem Serumalbumin (rHSA) und Ubiquitin [79, 80], wie am Beispiel des rHSA im MALDI-TOF-Spektrum gezeigt (Abbildung 3.15).

Abb.3.15: MALDI-TOF-Spektren des rHSA und des rHSA-RAPTA-Konjugates aus [79]

Aus der Differenz von m/z = 1901 zwischen den erhaltenen Hauptmassenpeaks schlossen sie auf eine drei- bis vierfache Koordination des Metallkomplexes an das Protein. SADLER konnte mittels [1H,

15

N]-HSQC-NMR aus Reaktionen des antitumoraktiven [(η6-

Biphenyl)RuCl(en)](PF6)-Komplexes

mit

Cytochrom

c

Informationen

zu

dessen

Bindungsstellen in dem Protein bekommen. Dabei erhielt er nach einer 2h Inkubation des

Kenntnisstand

20

Metallkomplexes mit dem Protein bei 37°C keine Hinweise auf eine Histidinkoordination, sondern auf α-Amino- oder Carboxylatgruppenkoordinationen [81]. Die kinetische Bevorzugung der (η6-Aren)Ru(II)-Komplexe für anionische Sauerstoffatome wurde von SADLER bereits für Mononucleotide, wie 5´-GMP beobachtet [82], wo einer schnellen Bindung an die 5´-Monophosphatgruppe die lamgsame Migration zum thermodynamisch bevorzugten N7-Atom der Nucleobase des 5´-GMP2- folgt, wie das von ihm aufgestellte Schema in Abbildung 3.16 zeigt.

Abb.3.16: Reaktion des [(η6-Bipy)Ru(en)Cl]+-Komplexes mit 5´-GMP2-, 1:1, pH = 7,15, 25°C (K = Speziesanteil in % nach 55 min Reaktion) [82] Das Vorliegen einer Histidinkoordination des [(η6-p-Cymol)Ru(Aceton)3](CF3SO3)2Komplexes bei Lysozym, einem aus 129 Aminosäuren aufgebauten Protein, konnte SADLER kristallographisch bestätigen [83]. Die Abbildung zeigt die von ihm bestimmte Bindungsstelle H15.

Kenntnisstand

21

Abb.3.17: Links: Proteinstruktur des Lysozyms mit gekennzeichneter Bindungsposition des Ru(II)-Komplexes; rechts: Bindungstasche vergrößert im space-filling Modell [83]

ESI-MS-Studien von MESSORI et al. konnten die Bildung von Ruthenium-Protein-Addukten durch RAPTA-Komplexe sowohl mit Lysozym als auch mit dem oben erwähnten Cytochrom c bestätigen [84]. Auch konnten sie H15, wie unter 3.1 bereits dargestellt, als Cisplatinbindungsstelle im Lysozym zuordnen.

3.3 Methoden Proteine können in ihrer intakten Form ohne vorherige Spaltung nach einer Trennung (z. B. 2D-Gelelektrophorese) durch Tandem-Massenspektrometrie analysiert werden („top-down“Methode) [85]. Proteinmischungen können auch vor der Überführung in die Gasphase enzymatisch in sehr kleine Peptide verdaut und mittels Tandem-Massenspektrometrie aus den erhaltenen Peptidfragmentspektren [86, 87] sequenziert werden („bottom-up“-Methode). Die Komplexität der Protein- bzw. Peptidmischung kann eine Auftrennung der Proteine bzw. der Peptide vor der massenspektrometrischen Analyse erfordern. Eine in der Literatur oft beschriebene Methode ist die Trennung der Proteinmischung auf einem eindimensionalen SDS-Polyacrylamidgel. Nach erfolgter Gelelektrophorese wird der Gelstreifen in einzelne Stücke zerlegt und ein „In-Gel-Verdau“ durchgeführt. Die so entstandenen Peptide werden in der zweiten Dimension über eine reversed phase-Chromatographie getrennt und im angeschlossenen Massenspektrometer durch MS/MS sequenziert [88]. Eine Kombination der ICP- Massenspektromterie mit der 1D- Gelelektrophorese wurde zur Bestimmung der Wechselwirkung des Cisplatins mit dem Protein ompA aus E. coli verwendet [89]. Dabei betrug die Inkubationszeit 30 min bei 37°C mit 10mM Cisplatin in 500 µl wässriger Lösung. Aus der ESI-MS/MS- Analyse der Proteinbande des Gels mit dem höchsten Platinanteil

Kenntnisstand

22

wurde das Membranprotein ompA durch die Übereinstimmung seiner Peptidsequenzen mit dem tatsächlichen Spektrum identifiziert. Dabei wurden Peptidionen von etwa 23% des Proteins erhalten (= 23% coverage). Nach der Inkubation (24h bei 37°C) von humanem Blutplasma mit Cisplatin und NAMI-A konnten DYSON et al. nach der Trennung mittels PAGE, SDS-PAGE und 2DGelelektrophorese und der Identifizierung durch laser ablation inductively coupled plasmaMassenspektrometrie (LA-ICP-MS) Adduktbildung mit drei abundanten Serumproteinen: Albumin, α2-Macroglobulin und Serotransferrrin bestätigen [90]. Beim Vergleich der Peakintensitäten der einzelnen Profile konnten sie feststellen, dass das Cisplatin eine höhere Affinität zum Abumin und NAMI-A hingegen zum Transferrin aufweist. Zur Verdeutlichung dienen beide SDS-Profile des mit dem jeweiligen Metallkomplex inkubierten Blutplasmas.

A

B

Abb.3.18: LA-ICP Massenspektren/ SDS-PAGE des mit Cisplatin (A) oder NAMI-A(B) inkubierten Blutplasmas [90]

Aufgrund hoher Abundanz mancher Proteine (cytosolische oder lösliche) in den Zellen bzw. der resultierenden Peptide werden weniger abundante Membranproteine bzw. Peptide oftmals überlagert und somit nicht detektiert. Diese Tatsache macht es beim Umgang mit gesamten Zellsystemen (wie z. B. dem Bakterium Escherichia coli) wichtig die Zellbestandteile voneinander zu trennen. Der schematische Aufbau einer Bakterienzelle in Abbildung 3.19 soll dies verdeutlichen.

Kenntnisstand

23

Abb.3.19: Schematischer Aufbau einer Bakterienzelle [91]

Bakterienzellen sind normalerweise von einer festen, schützenden Zellwand umgeben. Die darunter liegende Zellmembran regelt die Stoffpassage in das Zytoplasma (das halbflüssige Zellinnere) und aus diesem heraus. Die DNA, das Erbmaterial, liegt im Nucleoid, dem Kernäquivalent der Bakterien (Bakterien haben keinen von einer Membran umhüllten Zellkern). An den Ribosomen findet die Proteinsynthese statt. Viele Bakterien verfügen über Pili, Strukturen, die aus der Zelle herausragen, um DNA zu einem anderen Bakterium übertragen zu können. Eine Liste der zur Proteinbestimmung in E. coli verwendeten Methoden und der identifizierten Proteine (1627 Proteine identifiziert) findet sich in einem Übersichtsartikel von LEE et al. [92]. Heutzutage finden auch häufig nicht 2D-PAGE basierte Proteomanalysen Anwendung (sog. Shotgun-Verfahren). Bei den Technologien wie ICAT (Isotope Coded Affinity Tags) [93] und MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology) [94] werden die Proteine vor ihrer

Proteolyse

nicht

getrennt,

sondern

nur

die

entstehenden

Peptide

mittels

Flüssigkeitschromatographie in einer bzw. mehreren Dimensionen. Die Peptide werden dann mittels ESI-MS/MS analysiert. In der folgenden Darstellung ist der schematische Aufbau von MudPIT dargestellt.

Kenntnisstand

Denaturated Proteins

Proteingemisch

24

Peptides

2D-LC

Peptidgemisch

Datenbanksuche Database search

2D-LC

Tandem MS

Abb.3.20: Schematischer Aufbau eines MudPIT-Experimentes [94]

Diese Methode erlaubt die zweidimensionale Trennung von Peptiden auf einer Kapillarsäule und ist direkt (online) mit einem ESI-Massenspektrometer gekoppelt. Beim Beladen der Kapillarsäule binden die Peptide zunächst an ein Kationen-Austauschmaterial, von dem sie sequenziell durch die Verwendung eines Salzstufengradienten auf das folgende reversed phase-Material eluiert werden. Die an das reversed phase-Material gebundenen Peptide werden ihrer Hydrophobizität entsprechend mittels organischer Modifier eluiert und direkt im nachfolgenden ESI-Massenspektrometer sequenziert. Die Verwendung moderner ESIMassenspektrometer, welche Scangeschwindigkeiten von bis zu drei MS/MS-Spektren pro Sekunde erlauben, ermöglicht die Identifizierung von bis zu 20.000 Peptiden bzw. 1.500 Proteinen pro Tag unter Verwendung des SEQUEST-Algorithmus. Dieses Verfahren zeichnet sich vor allem für die Identifizierung löslicher bzw. cytosolischer Proteine als sehr erfolgreich aus [95, 96]. Die Auswertung erfolgt bei SEQUEST auf Grund statistischer Berechnungen. Zu der Masse eines gemessenen Peptides werden in einem ersten Schritt 500 Peptide, deren Massen am besten mir der gemessenen Masse übereinstimmen, aus der Datenbank extrahiert. Von diesen 500 Peptiden werden theoretische Sequenzspektren (MS/MS-Spektren) berechnet und ein theoretisches Spektrum wird dazu erstellt. Durch einen bildlichen Vergleich zwischen theoretischen und experimentellen Spektren werden für jedes Peptid die statistischen Parameter

berechnet

[85].

Abschließend

werden

die

Peptide

nach

steigendem

Korrelationsfaktor aufgelistet, wobei das Peptid mit der höchsten Übereinstimmung in den

Kenntnisstand

25

Spektren den größten XCorr-Wert erhält. Ein weiterer Parameter ist der Sp-Wert (preliminary score), der auf dem Vergleich der Übereinstimmung der Anzahl und m/z-Werte der Ionen im theoretischen MS/MS-Spektrum mit dem experimentellen Spektrum basiert. Der RSp-Wert (rank preliminary score) gibt den Rang des zugeordneten Sp-Wertes an. Die Anzahl der Ionen, die im aufgenommenen MS/MS-Spektrum zugeordnet werden können, wird im Verhältnis zu der theoretisch möglichen Anzahl prozentual angegeben. Der ∆Cn-Wert (DeltaCn correlation value) gibt den Unterschied zwischen der erst- und der zweitbesten Zuordnung der Peptidsequenz an. Bei den Angaben in der vorliegenden Arbeit handelt es sich bei den ∆Cn-Angaben der identifizierten Peptidsequenzen stets um die ∆Cn- Werte zur nächsten, unterschiedlichen Peptidsequenz. Die Massendifferenz ∆m berücksichtigt maximale Massendifferenzen zwischen der Masse des experimentellen Vorläuferions und der des theoretischen Ions. Die für die einzelnen Analysen gewählten Einschränkungen für die genannten Parameter finden sich in den dazugehörigen Kapiteln.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

26

4. Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden In Anlehnung an die vorhandenen Ergebnisse mehrerer Arbeitsgruppen [45, 55, 148, 149] bezüglich des Reaktionsverhaltens von Aminosäuren mit Metallkomplexen wurden im Rahmen dieser Arbeit Modellpeptide mit unterschiedlichen Aminosäurensequenzen ausgewählt, Umsetzungen mit Platin- bzw. Rutheniumkomplexen durchgeführt und die dabei entstandenen Produkte chromatographisch bzw. massenspektrometrisch untersucht. Mit Hilfe dieser Voruntersuchungen sollte die prinzipielle Eignung von ausgewählten Metallkomplexen für die vorgesehenen MudPIT-Messungen überprüft werden.

4.1. Chromatographische Modellstudien Mit dem Reaktionssystem AcSerGlyOH/Cisplatin wurden chromatographische Messungen im analytischen Maßstab durchgeführt, um die Speziesentwicklung und deren Stabilität zu analysieren. Dieses Dipeptid enthält zwei potentielle O-Donoratome und wurde ausgewählt, um zu überprüfen, (a) ob κO-koordinierte Platinkomplexe bei einem niedrigen pH-Wert (~2,1)

unter

den

Bedingungen

der

IPRP-HPLC

getrennt

und

(b)

anschließend

massenspektrometrisch detektiert werden können. Die entstandenen Produkte konnten offline massenspektrometrisch charakterisiert werden. Bei der offline-Kopplung werden die Produkte am

Auslass

des

UV-Detektors

aufgefangen

und

manuell

in

den

Einlass

des

Massenspektrometers injiziert. Ein Konzentrationsvergleich ist dabei immer nur für dieselbe Substanz zu unterschiedlichen Zeitpunkten möglich, da mit dem UV-Detektor Absorptionswerte von Substanzen gemessen werden, deren molare Extinktionskoeffizienten unbekannt sind. Das Dipeptid AcSerGlyOH wurde mit der äquimolaren Menge Cisplatin inkubiert. Dabei erfolgte eine kontinuierliche chromatographische Untersuchung der Reaktionslösung während der Inkubation bei 37°C über etwa 500 Stunden. Die Reaktion verlief bei einem pH-Wert von 7,8.

In

der

folgenden

Abbildung

Reaktionsgemisches dargestellt.

ist

die

zeitabhängige

Produktverteilung

des

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

27

Abb.4.1: Zeitabhängige Produktverteilung des Systems Cisplatin:AcSerGlyOH, 1:1, pH = 7,8

Die Cisplatinkonzentration nimmt in den ersten 10 Stunden ab und stabilisiert sich dann über die nächsten 300 Stunden. Unter dem Signal des Cisplatins können sich ebenfalls chromatographisch gleichwertige Hydrolyseprodukte, wie z.B. [(NH3)2Pt(H2O)]2+ verbergen. Bereits nach einer Reaktionszeit von 0,1 Stunden kann das erste Produkt (κOG in der Abbildung 4.1) detektiert werden, welches nach etwa 100 Stunden sein Konzentrationsmaximum erreicht und danach an Peakfläche abnimmt. Aus dem kinetischen Verlauf der beiden gebildeten Spezies kann vermutet werden, dass das κOG-Produkt als Vorläufer des Endproduktes in monodentater Form vorliegt. Es handelt sich dabei um den neutralen Komplex [PtCl(AcSGO-κOG)(NH3)2]. Die Bildung des κ2OG,NG-Folgeproduktes kann erst nach fünf Stunden Reaktionszeit beobachtet werden. Es zeigt nach etwa 500 Stunden seine höchste Peakfläche und verliert danach wieder stetig an Konzentration.

Abb.4.2: Produkte des Systems AcSerGlyOH:Cisplatin

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

28

Für die κOG-Spezies konnten zwei Massenpeaks bei m/z = 467 (theoretisch m/z = 467,5) und bei m/z = 425 (theoretisch m/z = 425,5) für die Abspaltung der Acetylfunktion beobachtet werden. Die Trennung bei pH = 2,1 (IPRP-HPLC) sowie die erfolgreiche Detektion des κOGProduktes bestätigen prinzipiell die Eignung der LC/MS-Kopplungsmethoden zur Identifizierung solcher Pt-Bindungsstellen in tryptisch gespaltenen Peptiden bei MudPITAnalysen. Das Massenspektrum des κ2NG,OG-Produktes ist in der folgenden Abbildung zu sehen.

Abb.4.3: ESI-Massenspektrum des Molekülpeaks [Pt(AcSGOH)(NH3)2-H] + In dem obigen Spektrum ist für den Molekülpeak m/z = 432 des κ2NG,OG-Produktes das für Platin charakteristische Isotopenpattern in der eingefügten Vergrößerung zu erkennen. Eine Abspaltung eines Amminliganden kann neben dem Peak des Hauptproduktes bei m/z = 415 beobachtet werden. Die untere Tabelle 4.1 zeigt eine Auflistung zugeordneter Massenpeaks mit relativen Intensitäten über 25% aus dem ESI-Massenspektrum des κ2NG,OG-Produktes. Die restlichen Massenpeaks enthalten kein Platin, wie aus deren Verteilung erkennbar ist. Eine Zuordnung dieser Peaks war nicht möglich.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

29

Tab.4.1: ESI-Massenspektrum des Molekülpeaks [Pt(AcSGOH)(NH3)2-H] + Komplex [Pt(AcSGOH)(NH3)2-H] + [Pt(AcSGOH)(NH3)-H] + [Pt(AcSGOH)(NH3)2- CH2OH]+

m/z (beob.) 432 415 402

m/z (theor.) 432 415 401

Die vermutliche Struktur des κ2NG,OG-Produktes ist in Abbildung 4.2 dargestellt. Hierbei handelt es sich um einen bidentaten Komplex, der zwei Rotamere bilden kann (Rotation um die C-N-Bindung im Glycin). Um die vorgeschlagene Koordination zu bestätigen, wurden 1HNMR-Spektren des Reaktionsansatzes pH =7,5 in Abhängigkeit von der Zeit aufgenommen. Die Aufspaltung der βS-Protonen (in Abbildung 4.4 (a) Dublett bei δ = 3,6 ppm) zu zwei benachbarten Dubletts (in Abbildung 4.4 (b) bei δ = 3,58-3,6 ppm) beweist ihre chemische Nichtäquivalenz in den Rotameren.

Abb.4.4: 1H-NMR-Spektren des Systems AcSerGlyOH:Cisplatin nach 0,1h (a) und 24h (b) Inkubation bei 37°C

Der Vergleich der αG-Signale im oberen Spektrum des Peptid-Cisplatin-Gemisches nach 0,1 h und 24 h Inkubation zeigt eine Hochfeld-Verschiebung des Signals von 3,7 nach 3,5 ppm. Die

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

30

Aufspaltung der Protonen der Glycingruppe zum Dublett bei δ ≈ 3,5 ppm kann durch die gleichzeitige Koordination des Platins am Sauerstoff der Carboxylgruppe und am Amidstickstoff dieses Glycins erklärt werden. Da die αG-Protonen in einem fünfgliedrigen Chelatring vorliegen, sind sie chemisch nicht äquivalent und weisen unterschiedliche Verschiebungswerte auf. Dieses Verhalten bestätigt die obige Vermutung, dass es sich bei dem gebildeten Komplex um eine Koordination am C-terminalen Sauerstoff handelt. Um die Stabilität der gebildeten Produkte zu prüfen, wurden den Reaktionsgemischen nach längerer Inkubationszeit (mindestens 500h) weitere Aminosäuren als Konkurrenz angeboten. Dazu wurde dem System AcSerGlyOH:Cisplatin die äquimolare Menge an AcMetOH oder AcHisOH hinzugefügt und der Reaktionsansatz wiederum bei 37°C und pH = 4,5 inkubiert. Abhängig

von

der

Zeit

erfolgte

darauf

hin

eine

chromatographische

und

massenspektrometrische Untersuchung dieser Systeme. Hierbei sollte festgestellt werden, ob und wie schnell die mögliche Migration des Cisplatin-Fragmentes von AcSerGlyOH zu den thermodynamisch

bevorzugten

weicheren

S-

bzw.

N(Imidazol)-Donoratomen

der

konkurrierenden Aminosäuren AcMetOH und AcHisOH abläuft. Es sollte untersucht werden, ob ein Koordinationswechsel unter MudPIT-Bedingungen zu erwarten ist. Eine Produktverteilung des Systems nach Reaktion mit AcMetOH in Abhängigkeit von der Zeit ist in Abbildung 4.5 dargestellt.

Abb.4.5: Zeitabhängige Produktverteilung des Systems AcSerGlyOH:Cisplatin mit AcMet, 1:1:1, pH = 4,5

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

31

Aus der Abbildung ist erkennbar, dass bereits nach 0,1h Reaktionszeit die Konzentration der zugesetzten Aminosäure abnimmt. Gleichzeitig entsteht ein Produkt mit einer Retentionszeit von etwa 30min, welches nach etwa 100h sein Konzentrationsmaximum erreicht. Dabei handelt es sich um die κS:κ2OG,NG-Spezies. Ebenso bildet sich ein Produkt mit einer Retentionszeit von etwa 11min, dessen Intensität in den 100h Reaktionszeit zunimmt, vermutlich das κS:κ2NG,NS(SG)-Produkt. Die κO-Spezies wird in der Abbildung 4.5 nicht gezeigt, da sie nach 500h nur noch in geringer Konzentration in Lösung vorliegt. Die parallel beobachtete Abnahme der Intensität des κ2NG,OG-Produktes deutet auf eine Beteiligung dieses Komplexes bzw. der im Gleichgewicht vorliegenden κOG- und κNGSpezies bei der Neubildung der methioninhaltigen Produkte, die vermutlich bei der Bildung der κS:κ2OG,NG-Spezies dem Verlauf in der unteren Formulierung folgt:

Abb.4.6: mögliche Reaktionsfolge des κ2NG,OG-Produktes zum κS:κ2OG,NG-Produkt Von beiden Produkten aus dem Ansatz AcSerGlyOH:Cisplatin mit AcMetOH, 1:1:1 bei 37°C konnten ESI-Massenspektren aufgenommen werden, diese sind in den Abbildungen 4.7 und 4.8 dargestellt. Nachfolgend ist das Massenspektrum des chromatographisch bei etwa 30min retardiernden Produktes aus dem System AcSerGlyOH:Cisplatin und AcMetOH zu finden.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

32

Abb.4.7: ESI-Massenspektrum des Molekülpeaks [Pt(κS:κ2OG,NG)(NH3)+H]+ Es finden sich mehrere Peaks mit dem Platinpattern im Spektrum, z. B. m/z = 644, 606, 589 und 415. Die Tabelle 4.2 listet die Zuordnung der wichtigsten Peaks aus dem ESIMassenspektrum der chromatographisch getrennten Spezies zu. Tab.4.2: ESI-Massenspektrum des Molekülpeaks [Pt(κS:κ2OG,NG)(NH3)+H]+ Komplex [Pt(AcSGOH)(AcM)(NH3)2+Na]+ [Pt(AcSGOH)(AcM)(NH3)+H]+ [Pt(AcSGOH)(AcM)+H]+ [Pt(AcSGOH)(NH3)+H]+

m/z (beob.) 644 606 589 415

m/z (theor.) 645 606 589 415

Die untere Abbildung zeigt das ESI-Massenspektrum des bei etwa 11min chromatographisch retardiernden Produktes aus dem System AcSerGlyOH: Cisplatin und AcMetOH.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

33

Abb.4.8: ESI-Massenspektrum des Molekülpeaks [Pt(κS:κ2NG,NS)(NH3)]+ In dieser Darstellung weisen die zwei Hauptpeaks bei m/z = 373 und m/z = 548, der Massenpeak bei m/z = 563 und auch weitere Peaks das charakteristische Platinpattern auf. Die Peakzuordnung findet sich in der folgenden Tabelle. Die beobachteten m/z-Werte bestätigen das Vorliegen von koordinierten HSerGlyOH und AcMetOH Liganden in dem Komplex, d. h. bei der Bildung des Komplexes muss eine Acetylspaltung stattgefunden haben. Tab.4.3: ESI-Massenspektrum des Molekülpeaks [Pt(κS:κ2NG,NS)(NH3)]+ Komplex [Pt(HSGOH)(AcM)(NH3)]+ [Pt(HSGOH)(AcM)]+ [Pt(HSGOH)(NH3)]+

m/z (beob.) 563 548 373

m/z (theor.) 564 547 373

Aus den Massenspektren der gebildeten Produkte nach Zugabe der N-terminal geschützten Aminosäure Methionin (AcMet) kann die Beibehaltung der Adduktbildung zu AcSerGlyOH bzw. HSerGlyOH bestätigt werden. Beide Produkte weisen entsprechend ihren Massenpeaks

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

34

vermutlich die monodentate κS-Koordination des Methionins auf, da AcMet während der Fragmentierung abgespalten wird. Eine massenspektrometrische Spaltung eines κ2S,Ngebundenen AcMetOH wird in der Regel nicht beobachtet [149, 150]. Diese Studie zeigt außerdem,

dass

die

Pt-O-Bindung

im

κS:κ2OG,NG-Komplex

nicht

von

einer

Schwefelkoordination innerhalb von etwa 100h bei 37°C und pH = 4,5 verdrängt wird. Zu den vorliegenden Beobachtungen lässt sich der folgende mögliche Reaktionsweg aufstellen.

Abb.4.9: Mögliche Reaktionswege von AcSerGlyOH:Cisplatin nach Zugabe von AcMetOH bei pH = 4,5

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

35

Aus der Darstellung lässt sich erkennen, dass beide Endprodukte aus der κO-Spezies entstehen können. Aus dem Reaktionsweg wird deutlich, dass bei dem κS:κ2NG,OG-Komplex die Pt-O-Bindung erhalten bleibt. Wird statt des κ2OG,S-Zwischenproduktes die κ2NG,SSpezies gebildet, dann kann im weiteren Verlauf eine Acetylspaltung auftreten, die durch den trans-Effekt des Schwefels unterstützt wird. Eine analoge Spaltung konnten MANKA et al. für serinhaltige Peptide mit der Sequenz –SerMet- beobachten [44]. In den Studien wurde eine Acetylspaltung für AcSerMetOH ab pH < 4,5 nachgewiesen. Die Endprodukte der Reaktion des Systems AcSerGlyOH:AcMetOH:Cisplatin sind in Abbildung 4.10 gezeigt.

Abb.4.10: Reaktionsprodukte des Systems AcSerGlyOH:Cisplatin nach Zugabe von AcMetOH

Bei der Umsetzung des Systems AcSerGlyOH:Cisplatin mit AcHisOH konnte keine Reaktion mit der Aminosäure bei pH = 4,5 beobachtet werden. Die Anfangskonzentration blieb auch nach etwa 300h Inkubation beinahe unverändert. Ebenso gleich bleibend konnte die Konzentration des κ2NG,OG-Produktes im Verlauf der Reaktionszeit detektiert werden. Dieses Verhalten zeigt, dass die Bindungen im κ2NG,OG-Produkt gegenüber einer möglichen Imidazol-Bindung stabil bleiben.

4.2. Massenspektrometrische Modellstudien Studien zu Stabilitäten der Pt-Peptid-Bindungen unter massenspektrometrischen Bedingungen (MS bzw. MS/MS) wurden mit ausgewählten Metallkomplex-Peptid-Reaktionsansätzen durchgeführt.

Es

wurden

die

folgenden

Metallkomplexe

eingesetzt:

[(η6-p-

Cymol)RuCl2(DMSO)], [Pt(dien)(H2O)](NO3)2 und cis-[PtCl2(NH3)2]. Die Strukturformeln der Verbindungen sind in der nachstehenden Abbildung gezeigt.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

M = 384 g.mol-1

M = 316 g.mol-1

36

M = 300 g.mol-1

Abb.4.11: Strukturen und molare Massen der eingesetzten Metallkomplexe

Für die massenspektrometrischen Untersuchungen sollten die gebildeten Peptid-Komplexe kinetisch relativ stabil sein. Eine umfangreiche Fragmentierung zu b+- und y+-Ionen ist für MudPIT-Charakterisierungen essentiell und die zusätzliche Bestätigung der Zuordnung einzelner metallierter Fragmentionen durch die typische Isotopenverteilung eines Metalls hilfreich.

Die

Fragmentierungsionen

werden

unter

Verwendung

der

Tandem-

Massenspektrometrie erhalten. Im Fall von Peptiden wird die CID-Energie meist so gewählt, dass hauptsächlich die Peptidbindungen fragmentieren. Die so erhaltenen Fragmente werden als b+- und y+-Serie bezeichnet [151]. Zur Veranschaulichung dient die folgende Abbildung.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

N-Terminus

37

C-Terminus

CID

Vorläuferion

m/z Fragmentionen-Spektrum

Fragmentionen

Abb.4.12: Die Bildung von MS/MS-Fragmentionenserien und ihre MS/MS-Spektren [nach 151]

Beide Serien entstehen durch Spaltung der bevorzugt gespaltenen Amidbindung zwischen dem Carbonyl-Kohlenstoff und dem Amid-Stickstoff der Peptidkette. 4.2.1. Modellstudien mit [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] In seinen Untersuchungen mit [(η6–Aromat)Ru]2+-Verbindungen konnte SIEBERT bidentate κ2- und tridentate κ3-Komplexe der Metallfragmente mit unterschiedlichen Aminosäuren und Peptiden mittels IPRP-HPLC erfolgreich trennen [148], womit die Stabilität von RuAddukten unter chromatographischen Bedingungen bei pH ~ 2,1 eindeutig bewiesen wurde. Für die Untersuchung der Möglichkeit Ru-O-Bindungen massenspektrometrisch detektieren und deren Fragmentierungsverhalten prüfen zu können, wurde eine Peptidsequenz mit mehreren O-Donoratomen als potentielle Koordinationsstellen ausgewählt. Aus dem Ansatz des Peptids der Sequenz Ile-Val-Asp-Ala-Gln-Gly-Asn-Asp-Val-Leu-Ile-Pro-Gly (HI-V-D-AQ-G-N-D-V-L-I-P-GOH) mit der äquimolaren Menge des Rutheniumkomplexes wurde das

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

38

unten dargestellte Massenspektrum aufgenommen (Abb. 4.13). Die Inkubation betrug ebenfalls 24h bei 37°C und wurde in einer wässrigen Lösung bei pH = 4,1 durchgeführt.

Abb.4.13: Massenspektrum des Reaktionsgemisches IVDAQGNDVLIPG und [(η6-p-Cymol) RuCl2(DMSO)] nach 24h bei 37 °C (M = [(η6-p-Cymol)Ru(Peptid)H-1]+) Der bei m/z = 1545 mit höchster Intensität beobachtete Massenpeak zeigt das für Ruthenium charakteristische Isotopenmuster auf und entspricht dem berechneten Fragment für [(η6-p-Cymol)Ru(Peptid)H-1]+. Das Spektrum enthält die Ionen b8+ bis b11+ und y10+ und y11+. Daneben sind sowohl mehrere zweifach geladene (b92+ bis b112+) als auch modifizierte Ionen (η6-p-Cymol-Abspaltung) zugeordnet. Diese Befunde lassen vermuten, dass in der Peptidsequenz HI-V-D-A-Q-G-N-D-V-L-I-P-GOH die Asparaginsäure D8 die bevorzugte Bindungsstelle für den eingesetzten Rutheniumkomplex darstellt. Dennoch kann aus dem Vorhandensein des ruthenierten Ions y10+ eine Beteiligung der Asparaginsäure D3 an der Koordination des Rutheniumfragmentes nicht ausgeschlossen werden. In der folgenden Abbildung ist ein MS/MS-Spektrum des Hauptpeaks aus dem Reaktionsansatz des Komplexes [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] mit dem zweiten Peptid PheLys-Val-Gly-His-Phe-Leu-Gly (HF-K-V-G-H-F-L-GOH) nach 24h Inkubation bei 37 °C und

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

39

pH = 2,5 dargestellt. In dieser Peptidsequenz stellt der Histidinrest die thermodynamisch begünstigte Koordinationsstelle dar. Die Masse des Peaks mit m/z = 1138 entspricht der Masse des Peptids mit dem [(p-Cymol)Ru]2+-Fragment; beide Chloride und der DMSOLigand sind bereits abgespalten worden.

Abb.4.14: MS/MS-Spektrum des Molekülpeaks [(η6-p-Cymol)Ru(FKVGHFLG)H-1]+ bei m/z =1138

In dem Massenspektrum lassen sich Zuordnungen für mehrere Fragmente finden. So ist ein Massenpeak für die Koordination des [(η6-p-Cymol)Ru]2+-Fragmentes an das Peptid nach Abspaltung der Carboxy-Gruppe (CO2H) zu sehen (m/z = 1093). Aus dem Massenpeak [Ru(FKVGHFLG)H-1]+ sind die Ionen b5´+, b6´+ und y6´+ durch CID-Fragmentierung erhalten worden. Es kann ein Massenpeak für die erfolgte Abspaltung der letzten drei C-terminalen Aminosäuren [F-L-GOH]+ des [(η6-p-Cymol)Ru(FKVGHFLG)H-1]+-Fragmentes beobachtet werden. Da in dem Massenspektrum der Peak mit höchster relativer Intensität (100%) durch

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

40

die Abspaltung des (p-Cymol)-Liganden entstanden ist (m/z = 1004), wurde diese Beobachtung für weitere Experimente genutzt. Der Verlust des aromatischen Liganden wird als „neutral loss“ bei allen weiteren massenspektrometrischen Untersuchungen mit diesem Komplex einbezogen. In den MudPIT-Untersuchungen wurden CID-MS-Spektren von neutral-loss-Ionen ([M-(p-Cymol)]n+) aus den drei höchsten Massenpeaks [M]n+ angefertigt, falls solche Ionen detektiert wurden. Die Untersuchungen mit den Modellpeptiden weisen darauf hin, dass das Rutheniumatom bei der CID-MS-Fragmentierung koordiniert bleibt. Somit sind die Voraussetzungen für MudPITAnalysen für den Rutheniumkomplex erfüllt. Für [(η6-p-Cymol)RuCl(en)]+ wurde dagegen der Verlust des gesamten Rutheniumfragmentes bei der CID-MS-Fragmentierung beobachtet, mit der Folge, dass eine LC2/MS2-Analyse der Proteintargets dieses Komplexes nicht möglich ist. 4.2.2. Modelluntersuchung mit [Pt(dien)(H2O)]2+ Auch mit dem Metallkomplex [Pt(dien)(H2O)]2+ wurden Reaktionen mit unterschiedlich sequenzierten Peptiden als Modellsysteme untersucht. Der Platinkomplex kann auf Grund seines tridentaten Liganden (dien) nur monodentate Bindungen ausbilden. Deswegen musste zuerst geprüft werden, ob MS/MS-Analysen möglich sein würden. Aus den Arbeiten von WOLTERS [55] sind potentielle Aminosäuren, die von dem Komplex koordiniert werden können bereits bekannt. Darin wurden Reaktionen unter anderem mit methionin- und histidinhaltigen Peptiden chromatographisch analysiert. Die entstandenen Spezies konnten bei pH = 2,1 durch IPRP-HPLC getrennt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Dekapeptid Gly-Ala-Leu-Thr-Ans-Val-Ser-Met-Ala-Lys (HG-A-L-T-N-V-S-M-A-KOH) mit der Thioetherseitenkette des Methionins als Reaktionspartner für das [Pt(dien)]2+-Fragment ausgewählt. Das MS/MS-Spektrum des äquimolaren Reaktionsgemisches nach 24h Inkubation bei 37 °C bei pH = 4,4 mit dem Ausschnitt aus dem Massenspektrum der Reaktionslösung ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

41

Abb.4.15: MS/MS-Spektrum des Molekülipeaks [Pt(dien)(GALTNVSMAK)H-1]+ bei m/z = 1287

Das Massenspektrum zeigt in der Vergrößerung bei m/z = 1287 den Peak des Peptid[Pt(dien)]2+-Adduktes nach der Inkubation von 24h bei 37°C. Es sind zwei platinierte Ionen der b+-Serie zugeordnet, b8+ und b9+ und die nicht platinierten Ionen [y9+-CO2H]+, y8+ und y6+ aus der y+-Serie zu erkennen. Diese Beobachtungen lassen auf eine Koordination an der Aminosäure Methionin M8 schließen. Die Untersuchung mit dem Modellpeptid bestätigt die prinzipielle Eignung des [Pt(dien)]2+-Fragmentes für MudPIT-Analysen. Allerdings wäre die Zahl der b+- und y+-Ionen (4 von 18 möglichen) zu gering, um eine Identifizierung der Sequenz zu ermöglichen.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

42

4.2.3. Modellstudien mit Cisplatin

Ein äquimolarer Ansatz wurde für Cisplatin mit dem Peptid der Sequenz Phe-Lys-Val-SerGly-Thr-Leu-Val-Gly (HF-K-V-S-G-T-L-V-GOH) für 24h in wässriger Lösung (pH = 4,5) bei 37 °C inkubiert. Diese Peptidsequenz enthält sowohl am Threonin- als auch am Serinrest Hydroxygruppen, welche als potentielle Koordinationsstellen für das Cisplatin in Frage kommen können. Diese Lösung wurde direkt ins Thermo Finnigan LCQ Massenspektrometer mit Hilfe einer 100 µl Spritze injiziert und im Bereich von m/z = 300-2000 detektiert. Das Nonapeptid hat eine molare Masse von 907 Da. In der folgenden Abbildung sind das MS/MSSpektrum des intensivsten Massenpeaks (m/z = 1100) und ein Ausschnitt des Gesamtspektrums dargestellt.

Abb.4.16: MS/MS-Spektrum des Molekülpeakss [(Pt(FKVSGTLVG)H-1)]+ bei m/z = 1100

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

43

In dem vergrößerten Ausschnitt des Spektrums sind Massenpeaks für mehrere Peptidaddukte der einzelnen Cisplatinfragmente zu erkennen. Auch das charakteristische Isotopenpattern des Platins ist in der Vergrößerung eindeutig zu sehen. Der intensivste Massenpeak mit der Masse m/z = 1100 entspricht dem Ion [Pt(Peptid)H-1)]+. Es gibt außerdem einen Peak mit der Masse m/z = 1117, welcher dem Peptidkomplex des Fragmentes [(NH3)Pt]2+ zugeordnet werden kann.

Ein

weiterer

Peak

mit

der

Masse

m/z

=

1135

entspricht

dem

Ion

[{(NH3)2Pt]}(Peptid)H-1]+. Außerdem ist der zweitintensivste Massenpeak mit m/z = 1171 für die Koordination des [(NH3)2PtCl]+-Restes an das Peptid zu sehen. Das Massenspektrum bestätigt wieder, dass Platinaddukte ohne Verlust des Pt-Fragmentes unter ESI-Bedingungen ionisiert werden können. Da die Molekülionen mit den [Pt]2+-, [(NH3)Pt]2+- und [(NH3)2Pt]2+Fragmenten

durch

neutral

loss

von

Ammin-

bzw.

Aqualiganden

bei

der

massenspektrometrischen Ionisierung entstehen können, ist eine Bestimmung des in Lösung vorhandenen Platinfragmentes in diesem wie in vielen anderen Fällen nicht möglich. Die Tatsache, dass der [Pt]2+-Komplex das Molekülion mit der höchsten relativen Intensität liefert, spricht jedoch dafür, dass zumindest ein bidentater Chelatkomplex in Lösung vorliegen muss. Um über die Möglichkeit der Peptidspaltung unter Beibehaltung des Platinfragmentes und die über genauere Bindungsstelle des Metallfragmentes Aussagen treffen zu können, wurden von den einzelnen Massenpeaks der Peptid-Cisplatin-Addukte MS/MS-Spektren aufgenommen. Dabei wird das ausgewählte Mutterion mit der zur Spaltung der Peptidbindungen erforderlichen CID-Energie beschossen und somit weiter fragmentiert. Anhand des Abspaltungsmusters der enthaltenen Massendifferenzen, die den Aminosäurenmassen entsprechen, kann die Sequenz des Peptids identifiziert werden. In dem MS/MS-Spektrum des Ions [(Pt(FKVSGTLVGH-1)]+ in Abb. 4.15 sind von 16 möglichen b+- und y+-Ionen (jeweils 8) 10 Ionen zugeordnet, davon drei y+- und sieben b+-Ionen. Die Beobachtung von 62,5% der möglichen

Fragmentionen

würde

unter

MudPIT-Bedingungen

eine

eindeutige

Charakterisierung der Peptidsequenz ermöglichen. Aus der Fragmentierung der Peptidsequenz HF-K-V-S-G-T-L-V-GOH wurden die platinierten Ionen b2+ bis b8+ und die nicht platinierten Ionen y5+ bis y7+ erhalten. Dieser Befund lässt eine Zuordnung der Koordination des [(NH3)2Pt]2+-Fragmentes an der Aminosäure Lysin (K2 in der Sequenz) zu. Ein weiterer äquimolarer Ansatz wurde mit Cisplatin und dem Heptapeptid der Sequenz Val-Ser-Glu-His-Glu-Ala-Thr (HV-S-E-H-E-A-TOH) nach 24h Inkubation bei 37°C und pH = 4,1 massenspektrometrisch untersucht. In diesem Fall bietet der Histidinrest die thermodynamisch günstige Bindungsstelle an.

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

44

Das entsprechende Tandem-Massenspektrum des Hauptpeaks von [(NH3)2Pt(VSEHEAT)H-1]+ findet sich in Abbildung 4.16 Darin ist zur Verdeutlichung des Platinmusters ein Ausschnitt des Massenspektrums des Peptid-Cisplatin-Gemisches eingefügt. Im Gegensatz zum letzten Beispiel weisen die [(NH3)2Ptl]2+- und [(NH3)2PtCl]+-Addukte die höchste relative Intensität auf, was für eine mögliche monodentate [(NH3)2PtCl]+-Koordination spricht.

Abb.4.17: MS/MS-Spektrum des Molekülpeaks [(NH3)2Pt(VSEHEAT)H-1]+ bei m/z = 999 Das MS/MS-Spektrum enthält Abspaltungen der Ammingruppen des Cisplatinrestes (m/z = 983, m/z = 965). Daneben konnten drei b+-Ionen detektiert werden, welche aus den modifizierten Massenpeaks resultieren. Dabei stammen b4´+, b5´+ und b6´+ vom Massenpeak m/z = 965 (Abspaltung beider Ammingruppen) und b4´´+ aus dem Massenpeak bei m/z = 948 (Abspaltung der C-terminalen Hydroxygruppe). Aus dem Vorkommen der drei platinierten Ionen der b+-Serie (b4´+, b5´+ und b6´+) kann vermutet werden, dass das Cisplatinfragment die Aminosäure H4 aus der Peptidsequenz HV-S-E-H-E-A-TOH koordiniert. Das MS/MSSpektrum verdeutlicht, dass neutral loss Vorgänge die Identifizierung einer Peptidsequenz

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

45

erschweren oder verhindern können, wenn nicht genügend b+- und y+-Ionen aus dem ursprünglichen Molekülion zugeordnet werden können. Die relativ geringe Zahl von b+- und y+-Ionen ist auch typsich für kurze Peptidsequenzen (n < 10), was häufig die Charaktrisierung solcher Sequenzen erschweren kann. Ein äquimolarer Ansatz aus Cisplatin und dem längeren Peptid (n = 13) Ile-Val-Asp-Ala-GlnGly-Asn-Asp-Val-Leu-Ile-Pro-Gly (HI-V-D-A-Q-G-N-D-V-L-I-P-GOH) wurde für 24h bei 37°C und pH = 4,2 inkubiert und massenspektrometrisch analysiert. Dieses Modellpeptid wurde ausgewählt, um das Fragmentierungsverhalten von κO-koordinierten Addukten zu überprüfen. Das MS/MS-Spektrum des entstandenen Adduktes [(NH3)2Pt(IVDAQGNDVLIPG)H-1]+ ist in der folgenden Abbildung dargestellt. Wiederum ist ein Ausschnitt des Massenspektrums eingefügt.

Abb.4.18: MS/MS des Molekülpeaks [(NH3)2Pt(IVDAQGNDVLIPG)H-1]+ bei m/z = 1537 Für dieses Peptid dominiert das Molekülion des [(NH3)2Pt]2+-Adduktes, was für eine monobzw. bidentate Koordination spricht. In dem Spektrum sind Abspaltungen der einzelnen

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

46

Aminosäuren des Peptids erkennbar. Aus den Massendifferenzen lässt sich nun der so genannte Fingerabdruck ablesen. Abhängig von der Lage der Ladung sollten in dieser Sequenz bis zu zwölf b+- und zwölf y+-Ionen zugeordnet werden. Im vorliegenden Spektrum konnten tatsächlich sieben b+-Ionen (b5+ bis b11+) und drei y+-Ionen (y6+, y9+ und y10+) zugeordnet werden, d. h. 42% der möglichen Fragmentionen. Eine Zuordnung von mehr als 30-35% reicht in der Regel aus, um eine Peptidsequenz eindeutig zu bestimmen. Das MS/MSSpektrum verdeutlicht, dass im Vergleich zu den Modellpeptiden mit nur sieben oder neun Aminosäureresten anteilig mehr Fragmentionen für das längere Peptid (mit 13 Resten) erhalten wurden. Im Allgemeinen ergeben Peptidsequenzen mit etwa 10-21 Resten die besten MS/MS-Spektren. Bei kürzeren und längeren Peptiden ist häufig der Anteil der möglichen b+und y+-Fragmentionen zu gering, um eine eindeutige Zuordnung zuzulassen. Auch in dieser Darstellung konnten modifizierte Ionen der b+-Serie nach Abspaltung der Amminliganden des Cisplatins zugeordnet werden (b5´+ bis b11´+). Die eingesetzte Peptidsequenz HI-V-D-A-Q-G-N-D-V-L-I-P-GOH enthält zwei Asparaginsäuren (D3 und D8), welche als potentielle Koordinationsstellen für das Cisplatin in Frage kommen. Da platinierte Ionen ab b5+ sowie bis y10+-Ionen zu beobachten sind, kann die Bindungsstelle zu Asparaginsäure D3 zugeordnet werden. Die Abwesenheit der Ionen b1+ bis b3+ sowie der Ionen yk+ für k > 10 steht im Einklang mit dieser Zuordnung. Die MS- und MS/MSUntersuchungen bestätigen, dass eine Fragmentierung zu einer adäquaten Zahl von platinierten b+- und y+-Ionen auch bei gleichzeitigen neutral loss Reaktionen möglich ist. 4.2.4. Schlussfolgerungen für LC2/ESI-MS2-Analysen

Die beschriebenen Voruntersuchungen ergeben eine Reihe von Voraussetzungen an die mittels MudPIT-Analyse zu behandelnden Systeme. Um die Flüssigchromatographie und die Massenspektrometrie miteinander kombiniert einsetzen zu können, muss eine zufriedenstellende Trennung des Reaktionsgemisches möglich sein. Dabei müssen signifikante Anteile der zu trennenden Komplexe bei den relativ niedrigen pH-Werten der IPPR- sowie SCXChromatographie (pH ≈ 2) stabil bleiben. Aus den vorangegangenen Studien wurde deutlich, dass auch die erhaltenen κO-Spezies des Cisplatins diesen Anforderungen genügen. Andererseits werden bei der verwendeten „bottom-up“-Methode, bei welcher die zu untersuchenden Proteine enzymatisch in kleine Peptide gespalten werden, pH-Werte um 7,8 benötigt. Die chromatographischen Untersuchungen bei einem pH- Wert von 7,8 bestätigen, dass auch κO-Komplexe über einen langen Zeitraum (bis 500h) in schwach alkalischer

Reaktionen von metallhaltigen Zytostatika mit Peptiden

47

Lösung stabil sind. Zahlreiche Untersuchungen von Peptid/Cisplatin-Reaktionssystemen haben gezeigt, dass κN- und κS-Addukte unter alkalischen Bedigungen (7 < pH < 9,5) recht stabil sind [45, 149]. Die Metallfragment-Peptid-Bindungen müssen auch während der MS/MS-Fragmentierung aufrecht erhalten bleiben. Gute Übereinstimmungen mit den theoretischen, in Datenbanken vorhandenen Spektren lassen sich nur dann erzielen, wenn die zu untersuchenden Verbindungen/Systeme eine Fragmentierung in möglichst hoher Anzahl an b+- und y+-Ionen (mindestens 30-35%) auch bei neutral loss ergeben. Die

Voruntersuchungen

bestätigen

außerdem,

dass

die

Komplexe

[(η6-p-

Cymol)RuCl2(DMSO)], [Pt(dien)(H2O)](NO3)2 und cis-[PtCl2(NH3)2] alle diese Voraussetzungen erfüllen und deswegen für MudPIT-Analysen prinzipiell geeignet sind. Für die zytotoxische Verbindung [(η6-p-Cymol)RuCl(en)]+ werden sowohl die chromatographischen als auch die massenspektrometrischen Bedingungen nicht erfüllt. Vergleichsuntersuchungen

an

den

vorhandenen

Finnigan

LCQ

und

LTQ

Massenspektrometern belegen, dass die wesentlich höhere Scanzahl des LTQs (bis zu drei MS/MS-Spektren pro Sekunde bei LTQ, ein MS/MS-Spektrum alle zwei Sekunden bei LCQ) für die effektive Adduktcharakterisierung essentiell ist. Bei LCQ-Untersuchungen wurden in der Regel nur etwa 10-20% der bei den LTQ-Messungen gefundenen Proteinaddukte identifiziert.

Proteintargets in Escherichia coli

48

5. Proteintargets in Escherichia coli Wie die Modellsysteme gezeigt haben, können die untersuchten Metallkomplexe kinetisch stabile Bindungen mit den Seitenketten unterschiedlicher Aminosäuren bilden und diese unter den massenspektrometrischen und chromatographischen Messbedingungen bestehen bleiben. Mit den Erkenntnissen aus den Voruntersuchungen konnten Umsetzungen mit Zellsystemen vorgenommen werden. Dabei wurden Metallkomplexe ausgewählt, die cytotoxisch wirksam sind oder als potentielle Zytostatika mit ihren Metallzentren diskutiert werden. Des Weiteren ist es für die massenspektrometrischen Methoden von Vorteil Komplexe zu verwenden, welche unter Abspaltung der Liganden kinetisch bzw. thermodynamisch stabile Bindungen eingehen oder Chelate mit den Peptiden bilden können. Wie in Kapitel 3 bereits beschrieben, wurde als Modell für Reaktionen im zellulären Gesamtsystem das Darmbakterium Escherichia coli in der Forschung mehrfach verwendet. Vor den Umsetzungen mit Metallkomplexen erfolgte die Züchtung des Bakteriums wie im (Kap. 10) beschrieben unter 37°C mit Zugabe des LB-Mediums. Nach der Inkubation einer Suspension der E. coli-Zellen mit dem Metallkomplex wird durch Zentrifungieren ein Pellet erhalten. Nach dem nachfolgenden enzymatischen Verdau werden die (halb-)tryptischen Peptide chromatographisch getrennt und direkt über ESI-MS/MS-Messungen auf die Bindungsstellen der Metallkomplexfragmente in den Proteinen des Bakteriums analysiert. In der Literatur wurde, wie in Kapitel 3 schon erwähnt, ein Protein-Cisplatin-Komplex aus E. coli Zelle bereits von DYSON [89] beschrieben. Hierbei wurde mittels 1D-PAGE, ICP-MS und ESI-MS/MS-Analysen

die

Koordination

des

[(NH3)2PtCl]+-Fragmentes

an

ein

Membranprotein, das ompA festgestellt. Allerdings gelang es den Autoren nicht die Bindungsstelle des Cisplatinfragmentes zu ermitteln. Bei einer MudPIT-Analyse werden die auf SCX-Material geladenen Peptide mittels eines Salzstufen-/RP-Gradienten auf die RP-Phase gewaschen und so aus den einzelnen Zyklen ins ESI-Massenspektrometer eluiert. So können bis zu 1500 Proteine pro Tag identifiziert werden, wobei die Identifizierung von Proteinen durch Zuweisung theoretischer Peptidsequenzen unter Verwendung geeigneter Suchalgorithmen erfolgt. Die Auswertung basiert bei SEQUEST auf statistischen Berechnungen. Dabei werden der Masse eines gemessenen Peptides entsprechend in einem ersten Schritt 500 Peptide, deren Massen am besten mit der gemessenen Masse übereinstimmen, aus der Datenbank extrahiert. Von diesen 500 Peptiden werden theoretische Sequenzspektren (MS/MS-Spektren) berechnet und in einem theoretischen Spektrum abgebildet. Durch einen bildlichen Vergleich zwischen dem

Proteintargets in Escherichia coli

49

theoretischen und dem gemessenen Spektrum wird für jedes Peptid ein so genannter KreuzKorrelationsfaktor (XCorr) berechnet. Abschließend werden die Peptide nach fallendem Korrelationsfaktor aufgelistet, wobei das Peptid mit der höchsten Übereinstimmung den größten XCorr erhält und somit zur Proteinidentifizierung herangezogen wird.

5.1. Proteintargets von [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] Für die nachstehend disktutierte MudPIT-Analyse wurde ein Metallzentrum gewählt, welches ein deutlich erkennbares Isotopenpattern aufweist. Auch auf Grund der aktuellen Studien bezüglich

neuer

Zytostatika

eignet

sich

eine

Rutheniumverbindung

als

Testsystem/Reaktionspartner für das Zellsystem. Es wurde der Komplex [(η6-pCymol)RuCl2(DMSO)] mit einem Arenliganden, DMSO und zwei Chloriden am Rutheniumzentrum gewählt. Wie oben beschrieben (Kapitel 4.2) wurde jedoch in den Vorstudien

das

Abspalten

des

Arenliganden

unter

den

massenspektrometrischen

Ionisierungsbedingungen bei dem Rutheniumkomplex festgestellt und musste deshalb bei der Analyse beachtet werden. Diese Einstellung wurde als „neutral-loss“ beim Messvorgang vorgegeben, so dass die drei höchsten Molekülpeaks nur nach dem Verlust der Liganden als [M-(p-Cymol)]n+-Ionen zur Fragmentierung herangezogen wurden. Die massenspektrometrische Analyse der chromatographisch getrennten Peptide liefert neben nicht koordinierten Proteinstücken auch die mit einem Rutheniumfragment modifizierten Sequenzen. In die Suchoptionen wurden die potentiellen Aminosäuren einbezogen: C, D, E, H, K, Y, W, S, T und M. Für die mit dem Rutheniumfragment koordinierten Peptidsequenzen wurde eine ursprüngliche Liste mit etwa 80 Proteintargets erhalten und prinzipiell nach den im Folgenden beschriebenen Punkten analysiert, um so genannte „false-positive“ Ergebnisse zu vermeiden. Die XCorr-Werte aller Peptidsequenzen betragen mindestens 2,5 für zweifach und 3,5 für dreifach geladene Moleküle, die Sp-Werte sind größer als 500 und die Massenspektren weisen mindestens 30 % Ionenzuordnung bei Di- bzw. Trikationen auf. Alle Sequenzen werden bezüglich ihrer ∆Cn-Werte geprüft, um sicherzustellen, dass nicht auch nicht koordinierte Peptidsequenzen in Frage kommen. Um falsche Zuordnungen von Koordinationen zu vermeiden, werden nicht nur die SEQUEST-Werte sondern auch die einzelnen MS/MS-Spektren der Proteintargets auf ihre Qualität und das Vorhandensein des typischen Ruthenium-Isotopenmusters bei ausgewählten Molekülionen beurteilt. Dabei wird auch darauf geachtet, dass die zugeordneten Ionen nicht im Untergrundrauschen eingeteilt

Proteintargets in Escherichia coli

50

sind (S/N-Verhältnis). Nach der Anwendung dieser Prüfungen/Vergleiche zur Vermeidung von falsch positiven Befunden wird eine Liste mit modifizierten Peptidsequenzen aufgestellt. In der Tabelle ist eine Liste der nach der SEQUEST-Datenbanksuche identifizierten Proteine aus E. coli, die mit dem [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)]-Komplex modifiziert wurden, dargestellt. Tab.5.1: Proteintargets von [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] in E. coli Protein/Peptid

Bindungs- z XCorr ∆Cn stelle

1 PPID_ECOLI V.SD*AASNDTESLAGAEQAAGVK.A D393 2 OSMY_ECOLI V.VT*LSGFVESQAQAEEAVK.V T88 V.VT*LSGFVESQAQAEEAVK.V T88 3 CSPC_ECOLI S.KD*VFVHFSAIQGNGFK.T D27 S.KD*VFVHFSAIQGNGFK.T D27 4 SUCC_ECOLI A.K*GLTDAAQQVVAAVEGK. K372 5 DING_ECOLI K.IAFPPID*SPVVI.T D619 6 TRAI1_ECOLI K.S*VSMMAMLGGDK.R S89 7 DBPA_ECOLI L.T*LCGGQPFGMoxQR.D T105 8 HRPA_ECOLI A.QGAVMAT*EK.V T719 * = Ru2+

Sp

RSp Ionen

2

4,91

0,15 1718,0

1

23/40

2 2

4,28 3,57

0,21 1199,7 0,16 1093,8

1 1

18/34 18/34

2 2

3,05 3,18

0,2 910,5 0,25 732,4

1 1

16/30 16/30

2

3,11

0,19 829,4

1

18/32

2

3,49

0,21 883,7

1

15/22

2

2,70

0,00 999,2

2

14/22

2

2,58

0,01 863,9

1

14/22

2

2,50

0,17 517,9

14

10/16

Die Proteine aus der Tabelle 5.1 können nach ihren Funktionen in der Zelle eingeteilt werden. Es sind vier stressregulierende Proteine (ppiD, osmY, cspC und sucC) und vier Helikasen, eine damage-inducible DNA-Helikase dinG sowie traI, dbpA und hrpA. Die Helikasen traI, dbpA und hrpA erfüllen nicht alle Kriterien bezüglich ihrer SEQUEST-Werte, werden jedoch an dieser Stelle wegen ihrer wichtigen Funktionen in der Zelle aufgelistet. Beispielhaft beträgt der ∆Cn-Wert der Sequenz aus der Helikase traI 0,00 im Vergleich zu einer nicht ruthenierten Sequenz der Proteins purA und sollte danach als koordinierte Sequenz ausgeschlossen werden. Dennoch wurde es als Protein, an welches der Rutheniumkomplex bindet, aufgelistet, da das zugehörige MS/MS-Spektrum eindeutig das Rutheniumpattern bei den entsprechenden Ionen aufweist. Aus dem 192 kDa Protein wurde die Sequenz [89S*VSMMAMLGGDK100]2+

Proteintargets in Escherichia coli

51

an der Aminosäure Serin koordiniert. Die Helikase traI wurde als DNA-Helikase I identifiziert und ist eine DNA-abhängige ATPase. Die folgende Abbildung zeigt das Massenspektrum aus der MudPIT-Analyse.

Abb.5.1: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [S*VSMMAMLGGDK]2+ aus traI In dem Massenspektrum sind 12 der 22 möglichen b+- und y+-Ionen zugeordnet. Davon sind sechs b+- und sechs y+-Ionen sowie zusätzlich ein b2+ und zwei y2+-Ionen in der Abb. 5.1 beschriftet. Koordiniert wurde in der Peptidsequenz anhand der SEQUEST-Parameter die erste Aminosäure der Sequenz Serin 89. Somit enthalten alle b+- jedoch keines der y+-Ionen ein Rutheniumatom, was für ausgewählte Ionen bestätigt werden konnte. In dem Massenspektrum (Abb.5.1) ist die charakteristische Isotopenverteilung des Metalls bei mehreren b+-Ionen erkennbar und wird für b10+ exemplarisch vergrößert eingefügt. Die folgende Tabelle enthält die SEQUEST-Werte des Peptids aus der Helikase traI sowie weitere acht Sequenzen, welche der Masse von m/z = 1328 (mit ∆m ± 2,5) entsprechen.

Proteintargets in Escherichia coli

52

Tab.5.2: SEQUEST-Parameter von [S*VSMMAMLGGDK]2+ aus traI im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz K.S*VSMMAMLGGDK.R D.LFDKET*FAEK.L K.SVS*MMAMLGGDK.R D.NFDEMT*DINK.V R.MoxE*NFTTNLNQ.L I.SWMVC*DMVEK.P K.SVSM*MAMLGGDK.R -.MoxQTQLTEE*M*.R R.IFNDRGEVHIE.A Q.FQK*S*HH*LK.T -.FNIS*GSVFVEK.-

XCorr 2,703 2,7 2,599 2,426 2,421 2,383 2,347 2,338 2,338 2,327 2,174

∆Cn Sp RSp Ionen Protein 0 999,2 2 14/22 TRAI1_ECOLI 0,001 784,8 11 12/18 PURA_ECOLI 0,038 863,7 8 13/22 TRAI1_ECOLI 0,103 910,5 6 12/18 YFGB_ECOLI 0,104 681 22 11/18 CLPA_ECOLI 0,118 960,6 5 13/18 MTFA_ECOLI 0,132 651,8 27 12/22 TRAI1_ECOLI 0,135 559,7 65 10/16 GLCF_ECOLI 0,135 455,7 207 10/20 DMSA_ECOLI 0,139 819,7 10 11/14 GSPA_ECOLI 0,196 1081,5 1 14/20 NUPG_ECOLI

Aus der oberen Tabelle wird deutlich, dass für das Massenspektrum der Sequenz [LFDKET*FAEK]2+ des Proteins pura ebenfalls gute Übereinstimmungen mit dem aufgenommenen Spektrum vorhanden sind. Die Helikase traI weist neben der Aminosäure S89 ein weiteres Serin (S 91) und ein Methionin (M92) als potentielle Angriffsstellen für Ruthenium auf. Aus den bewertenden Werten in Tabelle 5.2 wird jedoch offensichtlich, dass die zweite Bindungsstelle M 92 (mit ∆Cn = 0,132) auf Grund der deutlich schlechteren Übereinstimmung der beobachteten und theoretischen Spektren wenig wahrscheinlich ist. Zwischen S89 und S91 kann dagegen nicht eindeutig entschieden werden, da bj+-Ionen mit j < 3 und yk+ mit k > 9 im MS/MS-Spektrum fehlen. Das Vorhandensein eines potentiellen y112+Ions ist für die SEQUEST-Entscheidung zu Gunsten von S89 ausschlaggebend. Wie aus den zugehörigen SEQUEST-Werten aus der Tabelle 5.2 deutlich wird, würden die traI und die restlichen zwei Helikasen dbpA und hrpA wegen ihrer niedrigen ∆Cn- Werte als unsichere Targets eingestuft werden. Dieselbe potentiell ruthenierte Sequenz der traI Helikase wurde allerdings auch in der zweiten unabhängigen MudPIT-Analyse detektiert, so dass die Bindungsstellen S89 bzw. S91 hierdurch bekräftigt werden. In der folgenden Abbildung findet sich ein Beispiel für ein eindeutig bestimmtes modifiziertes Peptid aus einem Protein des E. coli Bakteriums, die Helikase dinG (probable ATPdependent helicase dinG). Die Helikase dinG besteht aus 716 Aminosäuren mit etwa 81 kDa Molekularmasse. Sie wird als DNA damage-inducible Helikase des Bakteriums E. coli bezeichnet und ist für die folgenden Funktionen verantwortlich: Beteiligung an DNAReparatur und eventuell auch Replikation. Das Massenspektrum des Peptids der Sequenz

Proteintargets in Escherichia coli

53

[613IAFPPID*SPVVI624]2+, mit den Aminosäuren zwischen 613 und 624 ist in der Abbildung 5.2 dargestellt. Modifiziert wurde mit Ruthenium die Aminosäure Asparaginsäure D619.

Abb.5.2: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [IAFPPID*SPVVI]2+ aus dinG In den Vergrößerungen in Abbildung 5.2 wurden zwei ausgewählte Ionen dargestellt, das b7+ (IAFPPID*) und das y6+ (D*SPVVI), um das Rutheniumisotopenpattern bei diesen Ionen zu verdeutlichen. Aus dem Spektrum ist ersichtlich, dass y6+ ein Rutheniumatom enthält, so dass D619 eindeutig als Koordinationsstelle zugeordnet werden kann. Für die MudPITMassenspektren des Rutheniumkomplex/E. coli-Gemisches werden sowohl die Masse des Fragmentes [(p-Cymol)102Ru]2+ als auch mit Berücksichtigung des „neutral loss“ nur die Masse des [102Ru]2+-Restes bei der Modifikation der Peptidionen beachtet. Wenn neutral loss Peaks von den jeweils drei intensivsten Massenpeaks identifiziert werden konnten, wurden MS/MS Spektren dieser Ionen aufgenommen und dem Spektrum mit möglichen theoretischen

Proteintargets in Escherichia coli

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Peptidsequenzen angeglichen. Für die angegebene Masse in der Suchoption wurde der Ladungsausgleich mit Abgabe von zwei Protonen berücksichtigt, so dass sich eine Differenz von 100 Masseneinheiten für das [102Ru]2+-Fragment ergab. Bei dem in Abbildung 5.2 dargestelltem Spektrum wurden insgesamt 15 b+- und y+-Ionen von 22 möglichen zugeordnet. Aus der „Markierung“ dieser Sequenz mit dem Metallfragment wird deutlich, dass alle Ionen der b+-Serie ab b7+ das charakteristische Isotopenmuster des Rutheniums aufzeigen müssen, da diese Fragmente alle das Metall enthalten. Im Gegensatz dazu zeigen in dieser Sequenz die Ionen der y+-Serie bis y5+ dieses Pattern nicht. Die Werte des SEQUEST Algorithmus für dieses Peptid sind in der Tabelle 5.3 dargestellt. Tab.5.3: SEQUEST-Parameter von [IAFPPID*SPVVI]2+ aus dinG im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz XCorr ∆Cn Sp RSp Ionen Protein K.IAFPPID*SPVVI.T 3,494 0 883,70 1 15/22 DING_ECOLI K.IAFPPIDS*PVVI.T 3,211 0,08 591,10 6 13/22 DING_ECOLI K.T*PEVIT*PPEQG.G 2,773 0,21 537,80 10 12/20 PTV3B_ECOLI K.TPE*VIT*PPEQG.G 2,737 0,22 445,60 24 11/20 PTV3B_ECOLI H.E*IIGD*IVPLAK.R 2,667 0,24 524,30 12 12/20 HIS6_ECOLI F.ETVDPVTQAPLAK.I 2,65 0,24 642,60 3 14/24 PUUC_ECOLI A.D*LVVNDTTYK*.F 2,644 0,24 517,40 13 12/18 STFR_ECOLI A.D*LVVNDTT*YK.F 2,635 0,25 435,00 28 11/18 STFR_ECOLI K.IAFPPIDSPVVIT.E 2,593 0,26 652,50 2 14/24 DING_ECOLI A.D*LVVND*TTYK.F 2,592 0,26 455,50 19 11/18 STFR_ECOLI In der Tabelle 5.3 sind zehn mögliche Peptidsequenzen eingetragen. Drei der zehn Peptidsequenzen stammen aus dem Protein dinG, die restlichen stammen aus vier weiteren Proteinen, ptv3B, his6, puuC und stfR. Zwei der Sequenzen sind nicht mit einem Rutheniumfragment koordiniert, sechs weisen eine potentielle zweifache Koordination auf. Wie aus den Werten erkennbar ist, zeigt die Koordination der Asparaginsäure D619 die am besten übereinstimmende Zuordnung. Die Modifikation des Serins 620 ist nach den XCorr-, Sp- und RSp-Werten weniger wahrscheinlich als die der Asparaginsäure D619. Da das zugehörige b7+-Ion das Rutheniumpattern aufweist, kann die Koordinationsstelle S620 eindeutig ausgeschlossen werden. Ein weiteres Proteintarget aus dem Bakterium E. coli, für welches ein von Ruthenium koordiniertes Peptid gefunden wurde, ist das cspC (cold shock-like protein cspC). Dabei handelt es sich um ein 7 kDa großes Protein, in welchem an der Aminosäure D27 der Peptidsequenz [26KD*VFVHFSAIQGNGFK41]2+ Ruthenium koordiniert wird. Das Protein ist

Proteintargets in Escherichia coli

55

für die Regulierung der Expression zweier wichtiger Stressproteine (rpoS und uspA) verantwortlich [92]. In der Abbildung 5.3 ist das zugehörige Massenspektrum zu dem detektierten Proteinausschnitt gezeigt.

Abb.5.3: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [KD*VFVHFSAIQGNGFK]2+ aus cspC Das Massenspektrum enthält 18 Peaks der möglichen 30 b+- und y+- Ionen. In der Vergrößerung ist ein Beispiel aus der b+-Ionenserie eingefügt. Auch in diesem Fall ist bei dem b8+-Ion das Rutheniumpattern klar erkennbar. Diese Beobachtung entspricht der schrittweisen Fragmentierung der Peptidsequenz, die dazu führt, dass alle b+-Ionen ab b2+ sowie das y15+Ion rutheniert vorliegen. Die Sequenz des Proteins mit der Koordination des Rutheniumfragmentes an die Asparaginsäure D27 konnte in zwei unabhängigen MudPITAnalysen beobachtet werden. Die SEQUEST-Parameter des Peptides aus cspC und weiterer der Masse von m/z = 1896 (∆m ± 2,5) entsprechender Sequenzen sind in Tabelle 5.4 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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Tab.5.4: SEQUEST-Parameter von [KD*VFVHFSAIQGNGFK]2+ aus cspC im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz S.KD*VFVHFSAIQGNGFK.T S.K*DVFVHFSAIQGNGFK.T A.TPLIPQPVTDAIGLQGMoxK.T L.VTDMT*DPDW*EPIMoxK.K R.YRT*QLENTE*IQWL.E R.YRT*QLENT*EIQWL.E S.KDVFVH*FSAIQGNGFK.T R.YRT*QLE*NTEIQWL.E R.HGHNEADEPSATQPLMY.Q R.TLVTASTPGAD*MT*PGKMox.D

XCorr 3,051 2,959 2,45 2,324 2,22 2,203 2,188 2,181 2,06 2,049

∆Cn 0 0,03 0,2 0,24 0,27 0,28 0,28 0,29 0,33 0,33

Sp RSp Ionen Protein 910,5 1 16/30 CSPC_ECOLI 910,5 1 16/30 CSPC_ECOLI 530,4 3 15/34 CYSX_ECOLI 348,1 51 10/26 PPSA_ECOLI 455,2 8 11/24 CYDC_ECOLI 455,2 8 11/24 CYDC_ECOLI 528,3 4 13/30 CSPC_ECOLI 363,3 37 10/24 CYDC_ECOLI 285 150 10/32 ODO1_ECOLI 340,7 55 11/32 FLGF_ECOLI

Die Tabelle enthält zehn Sequenzen aus sechs unterschiedlichen Proteinen des Bakteriums (cspC, cysX, ppsA, cycD, odo1 und flgF), wobei nur die Zuordnungen im cspc Protein die gewählten Kriterien erfüllen (z. B. Sp-Wert > 500). Das Massenspektrum enthält keinen eindeutigen Hinweis darauf, dass die Koordination des Lysin 26 ausgeschlossen werden kann. Das für das y15+-Ion beobachtete Isotopenmuster lässt eine eindeutige positive Identifizierung der Isotopenverteilung des Rutheniums nicht zu. Somit wird keine der beiden benachbarten Koordinationsmöglichkeiten (K26 und D27) abgelehnt. Eine zusätzliche Möglichkeit der Bestätigung/Bekräftigung oder Ablehnung der angegebenen Koordination des Metalls bzw. des Komplexfragmentes an das Peptid besteht darin, sich die räumliche „Zugänglichkeit“ der Seitenkette einer Aminosäure bei Vorhandensein einer Kristallstruktur des Proteins anzuschauen. Liegt die Seitenkette sterisch günstig, ist eine Koordination an diese Aminosäure wahrscheinlich. Dieses Kriterium kann dann auch herangezogen werden, wenn aus den Parametern und den Ionenzuordnungen im Massenspektrum nicht eindeutig geklärt werden kann, welche Aminosäure koordiniert wurde. In der folgenden Abbildung ist die Struktur des Proteins cspA (Struktur bekannt und vergleichbar mit cspC) mit der Sequenzfolge Serin 2 bis Leucin 70 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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Abb.5.4: Die Proteinstruktur des cspA Proteins mit den gekennzeichneten Seitenketten von K14, T20 und D27 (PDB ID: 1mjc, [97])

In der Abbildung sind die Seitenketten möglicher Koordinationsstellen dargestellt. Es sind auch Aminosäuren berücksichtigt, deren Seitenketten in der Tertiärstruktur des Proteins räumlich in der Umgebung liegen. In diesem Fall sind drei Aminosäuren als potentielle Bindungsstellen in der Illustration hervorgehoben, die sterisch für eine tridentate faciale Koordination bevorzugt sein könnten. Die Anordnung spricht für eine D27-Koordination. Das Massenspektrum des Peptids eines ebenfalls stressregulierenden Proteins sucC (succinylCoA synthetase beta chain) ist in der folgenden Abbildung dargestellt. Es handelt sich hierbei um die Sequenz [372K*GDLTDAAQQVVAAVEGK388]2+, in welcher an der Aminosäure Lysin K372 Ruthenium koordiniert.

Proteintargets in Escherichia coli

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Abb.5.5: MudPIT-MS/MS von [K*GDLTDAAQQVVAAVEGK]2+ aus sucC Das Spektrum enthält insgesamt 19 der 32 möglichen b+- und y+-Ionen, wovon elf aus der b+und acht aus der y+-Serie stammen. Nur 18 dieser Ionen wurden für die SEQUESTAuswertung eingesetzt. Die Vergrößerung in dem Massenspektrum zeigt das b9+-Ion, welches das Pattern des koordinierten Rutheniums aufweist. Bei einer K372-Koordination sind alle b+und keine der y+-Ionen rutheniert. In der angegebenen Sequenz kommen außer der Aminosäure K372 auch die Seitenketten von T375 und D376 als potentielle Koordinationsstellen für Ruthenium vor (siehe Tabelle 5.5).

Proteintargets in Escherichia coli

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Tab.5.5: SEQUEST-Parameter von [K*GDLTDAAQQVVAAVEGK]2+ aus sucC im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz A.K*GLTDAAQQVVAAVEGK. A.KGLT*DAAQQVVAAVEGK. A.KGLTD*AAQQVVAAVEGK. V.MoxGKAVETED*EDWNF. K.GMLTTDVESYDKLSLD.Q V.MoxGKAVE*TEDEDWNF. T.MAADSS*S*TVM*ELLK.L T.T*MAADSSSTVM*ELLK.L K.TTMAADSSSTVM*ELLK.L R.GMoxSLPM*FGKLM*ATNA.A

XCorr 3,105 2,776 2,747 2,525 2,489 2,469 2,444 2,435 2,43 2,386

∆Cn 0 0,106 0,115 0,187 0,198 0,205 0,213 0,216 0,218 0,232

Sp RSp Ionen Protein 829,4 1 18/32 SUCC_ECOLI 581,6 2 16/32 SUCC_ECOLI 554,3 3 16/32 SUCC_ECOLI 273,2 82 11/26 RIR4_ECOLI 457,6 4 15/30 PITA_ECOLI 232,8 179 10/26 RIR4_ECOLI 257,3 120 12/26 YDJF_ECOLI 363,8 21 14/28 YDJF_ECOLI 339,5 28 14/30 YDJF_ECOLI 305 50 12/28 ALN_ECOLI

Die Tabelle listet zehn Sequenzen mit der Masse m/z = 1787 (∆m ± 2,5) auf, dabei stammen die drei Peptide, deren Parameter die Kriterien erfüllen, alle aus dem sucC Protein. Im Falle der Koordination des Threonins 375 sollte das b3+-Ion nicht das typische Rutheniumpattern aufweisen, bei der Asparaginsäure 376 auch das b4+-Ion nicht. Da die charakteristische Verteilung jedoch im MS/MS-Spektrum (Abb.5.5) für beide Ionen klar erkennbar ist, sind diese Bindungsstellen als unwahrscheinlich einzustufen. Auch nach der ∆Cn-Begrenzung (∆Cn < 0,10) können diese Stellen vernachlässigt werden. Aus der Betrachtung der Seitenketten der oben genannten Aminosäuren in der Proteinstruktur kann jedoch festgestellt werden, dass neben K372 die Seitenketten der Aminosäuren T375 und D376 auch räumlich ebenfalls potentielle Bindungsstellen für den Rutheniumkomplex darstellen können. Eine gleichzeitige Beteiligung aller drei Stellen (Abb.5.6) an der Bindung (z. B. unter Bildung eines Chelatkomplexes) wäre ebenfalls möglich. Die Abbildung 5.6 stellt die Struktur des etwa 41 kDa Proteins sucC aus E. coli von Aminosäure Methionin 1 bis Valin 385 dar.

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Abb.5.6: Die Gesamtstruktur des Proteins sucC (PDB ID: 2scu, [98])

In der Gesamtstruktur wird deutlich, dass die Seitenketten der denkbaren Bindungsstellen sterisch gut zugänglich an der Oberfläche des Proteins lokalisiert sind. Die Succinyl-CoASynthetase besteht aus zwei Untereinheiten, einer α- und einer β-Untereinheit. Die β-chainUntereinheit ist als Enzym aktiv, wenn alle Substratbindungsseiten belegt sind und katalytisch kooperieren, sofern unterschiedliche Substrate wechselwirken und katalysiert werden sollen. In der Vergrößerung (Abbildung 5.7) wird die räumliche Nähe der potentiellen Seitenketten offensichtlicher. Es sind neben den drei oben genannten Aminosäuren (K372, T375 und D 376) auch die Seitenketten der Aminosäuren Q379 und Q380 gekennzeichnet.

Proteintargets in Escherichia coli

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Abb.5.7: Mögliche Koordinationsstellen des [(η6-p-Cymol)Ru]2+-Fragmentes in dem Protein sucC

Aus der Vergrößerung des koordinierten Bereiches wird erkennbar, dass auf Grund vergleichbarer Zugänglichkeit der Seitenketten z. T. mehrere Bindungsstellen für ein Metallfragment nicht ausgeschlossen sind.

5.2. Proteintargets von [Pt(dien)(H2O)](NO3)2 Die im Folgenden beschriebene Analyse erfolgte nach der Umsetzung des E. coli Bakteriums mit dem Komplexkation [Pt(dien)(H2O)]2+. Der Komplex [PtCl(dien)Cl] ist als nicht zytotoxische Verbindung [99] in der Literatur diskutiert/verwendet worden und eignet sich besonders für Modelluntersuchungen von Platin(II)-Komplexen wegen seines tridentaten Liganden dien (Diethylentriamin). Da für die weiteren Reaktionen mit Biomolekülen die Hydrolyse des Komplexes [Pt(dien)Cl]Cl der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist [57], wurde im Rahmen dieser Arbeit die Aqua-Spezies [Pt(dien)H2O]2+ für die Reaktionen gewählt. Bei höheren pH-Werten (pH > 4) dominieren das [Pt(dien)(OH)]+ und hydroxoverbrückte Spezies [100]. Da bei beiden Verbindungen die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht ist, wurde für die Inkubation mit E. coli eine kurze Zeit von 30 min gewählt. Nach der SEQUEST-Analyse der in dieser Messung detektierten Peptide des Ansatzes [Pt(dien)]2+/E. coli konnte nach Überprüfung der einzelnen Spektren um falsch positive Zuordnungen zu vermeiden eine Tabelle von sieben platinierten Peptidsequenzen, die unter

Proteintargets in Escherichia coli

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5.6 zu finden ist, aufgestellt werden. Berücksichtigt wurden Modifikationen mit der Masse 296 des [Pt(dien)]2+-Fragmentes, mit Abzug von zwei Protonen für den Ladungsausgleich. Tab.5.6: Proteintargets von [Pt(dien)]2+ in E. coli Protein/Peptid

Bindungs- z XCorr ∆Cn stelle

1 RL7_ECOLI [email protected] M15 2 ALDB_ECOLI [email protected] E427 3 SSB_ECOLI R.PQQSAPAAPSNEPPMDFD@DDIPF. D172 4 YICC_ECOLI [email protected] M97 5 EFTU_ECOLI [email protected] E343 6 RBSA_ECOLI [email protected] E2 7 DNAK_ECOLI [email protected] E429 @ = [Pt(dien)]2+

Sp

RSp Ionen

3

7,20

0,69 2648,3

1

43/96

3

5,94

0,54 2236,7

1

41/88

3

3,86

0,43 824,4

1

33/88

2

2,85

0,25 771,1

1

17/28

3

6,91

0,39 1761,5

1

38/92

2

3,16

0,10 534,3

6

13/30

3

5,40

0,50 1544,6

2

33/92

Die Tabelle enthält sieben Proteine, welche die eingestellten SEQUEST-Bedingungen erfüllen. Dabei muss der XCorr- Wert mindestens 1,8 für einfach, 2,5 für zweifach und 3,5 für dreifach geladene Moleküle, der Sp-Wert mindestens 500, der RSp-Wert weniger als 10 und die Zuordnung der Ionen im Massenspektrum aus der Peptidequenz mindestens 30% betragen. Die MS/MS-Spektren der von SEQUEST aufgelisteten Proteine wurden gesondert betrachtet und auf das Vorliegen von Platinmuster in, als platiniert zugeordneten Fragmentionen sowie auf Unterschiede zu anderen möglichen platinierten oder nicht platinierten Peptiden, welche derselben Masse entsprechen, geprüft. Es wurden als potentielle Koordinationsstellen die Seitenketten der Aminosäuren M, H, C, D, E, S, T, K, W und Y berücksichtigt. Das Beispiel aus der Proteinliste (Tab.5.6), welches diese Kriterien am besten erfüllt, ist das 13 kDa Protein rl7 (50S ribosomal protein L7/L12). Das Protein bietet in der Zelle die Bindungsstelle für Faktoren, die an der Proteinsynthese beteiligt sind. Bei der massenspektrometrischen

Analyse

wurde

das

Fragment

der

Sequenz

[6DQIIEAVAAM@SVMDVVELISAMEEK30]3+ identifiziert. Das Peptid ist an der

Proteintargets in Escherichia coli

63

Aminosäure Methionin 15 von dem [Pt(dien)]2+-Fragment koordiniert. Das zugehörige MS/MS-Spektrum ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Abb.5.8: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [DQIIEAVAAM@SVMDVVELISAMEEK]3+ aus rl7

Von 96 möglichen Fragmentionen (für einfach und zweifach geladene Ionen) des Peptids sind 17 (nur einfach geladene in Abbildung 5.8 dargestellt, SEQUEST teilt insgesamt 43 Ionen zu) in dem Massenspektrum zugeordnet worden. Da der eingesetzte Komplex als Metallzentrum Platin enthält, welches eine charakteristische Isotopenverteilung seiner drei Hauptisotope besitzt, können die entsprechenden Fragmente des Peptids auf das Vorhandensein des Musters geprüft werden. Dabei sollten bei der Koordination dieser Aminosäure M15 die b+-Ionen ab b10+ und die y+-Ionen ab y16+ das Platinmuster aufweisen. In dem oberen Spektrum (Abb.5.8) ist exemplarisch die Verteilung des b10+-Ions vergrößert eingefügt. Das Isotopenmuster für b10+, b12+ und b15+ steht im Einklang mit einer M15-Koordination. Die y+-Ionen ab y16+ werden nicht beobachtet, was ebenso auf die Bindung von M15 hindeutet. In der unten dargestellten Tabelle sind die SEQUEST-Werte und die anderen möglichen Sequenzen zu dieser Fragmentmasse von m/z = 3019 (∆m ± 2,5) aufgelistet.

Proteintargets in Escherichia coli

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Tab.5.7: SEQUEST-Parameter von [DQIIEAVAAM@SVMDVVELISAMEEK]3+ aus rl7 im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz XCorr ∆Cn Sp RSp Ionen Protein [email protected] 7,198 0 2648,3 1 43/96 RL7_ECOLI [email protected] 7,115 0,012 2282,7 3 41/96 RL7_ECOLI [email protected] 6,601 0,083 2356,3 2 40/96 RL7_ECOLI [email protected] 4,296 0,403 1128,3 4 32/96 RL7_ECOLI [email protected] 3,767 0,477 798,1 5 28/96 RL7_ECOLI [email protected] 2,241 0,689 195,8 52 18/92 RFAK_ECOLI [email protected] 2,204 0,694 138,8 263 17/96 RNFC_ECOLI R.QMLMoxSDSCKIAIAAGIDDPQNPIGTDAVK.V 2,193 0,695 263,1 15 22/112 DHAM_ECOLI [email protected] 2,172 0,698 205,6 40 18/88 EUTR_ECOLI R.QMoxLMSDSCKIAIAAGIDDPQNPIGTDAVK.V 2,166 0,699 298,4 10 23/112 DHAM_ECOLI Es sind Fragmente aus fünf unterschiedlichen Proteinen mit den jeweiligen Peptiden in der Tabelle eingetragen. Dabei enthält das Proteinfragment des rl7 zwei weitere Aminosäuren S16 und M18, die als potentielle Bindungsstellen für den Metallkomplex nach der SEQUESTAnalyse in Betracht kommen. Beim Prüfen der Zuordnungen, der SEQUEST-Werte und der einzelnen Ionen des Peptids wird jedoch deutlich, dass die Aminosäure M15 des rl7Fragmentes als Bindungsstelle zugeordnet werden kann. Durch das Vorliegen des nicht platinierten y15+-Ions für die Sequenz von S16-K30 kann zu Gunsten von M15 statt S16 entschieden werden, obwohl S16 einen XCorr-Wert aufweist, der nur geringfügig kleiner ist als der für die M15-Koordination. Einen zusätzlichen wichtigen Hinweis darauf gibt der Abbruch der Fragmentierung in der y+-Ionen-Reihe (ab y15+), welcher häufig durch das koordinierte Metall verursacht wird. Dessen positive Ladung kann zusätzliche Spaltungen in der Peptidsequenz nach sich ziehen. Die Peptide der restlichen vier Proteine (rfaK, rnfC, dhaM und eutR) aus der Tabelle 5.7 können auf Grund der geringen Übereinstimmung mit dem theoretischen MS/MS-Spektrum und der daraus resultierenden niedrigen SEQUESTParameter (∆Cn ≥ 0,69, Sp < 300, RSp ≥ 10) eindeutig vernachlässigt werden. Die Bindungsstelle des Metallfragmentes an die Seitenkette des Methionins M15 kann in der bekannten Struktur des Proteins dargestellt werden. Aus der Sequenz des Proteins ist der Bereich Serin 2 bis Lysin 121 einbezogen. Abbildung 5.9 zeigt die Proteinstruktur unter besonderer Kennzeichnung der Aminosäure M15.

Proteintargets in Escherichia coli

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M15

Abb.5.9: Die Proteinstruktur von rl7 (PDB ID: 1ctf [101])

Die Seitenkette der Aminosäure ist wie in der Darstellung erkennbar sterisch gut zugänglich, da sie in einer Schleife zwischen zwei Helices liegt und koordiniert werden kann. Ein weiteres mit [Pt(dien)]2+ modifiziertes Protein ist das 43 kDa große Protein eftU (elongation factor Tu). Es ist in der Zelle für die GTP -abhängige Bindung der AminoacyltRNA an die Ribosome während der Proteinbiosynthese zuständig. Eine Beteiligung des Proteins an der Zellwachstumsregulierung wird vermutet. Es besteht aus 394 Aminosäuren. Detektiert wurde bei der MudPIT- Analyse des Pt(dien)2+-E coli- Ansatzes das Fragment der Sequenz [335TTDVTGTIE@LPEGVEMVMPGDNIK358]3+, welches die Modifikation an der Aminosäure Glutaminsäure E343 enthält. Das MS/MS-Spektrum des 24 Aminosäuren langen Peptids ist in der Abbildung 5.10 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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Abb.5.10: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [TTDVTGTIE@LPEGVEMVMPGDNIK]3+ aus eftU

Das Peptid enthält 92 Ionenfragmente (einfach und zweifach geladene Ionen), davon sind 17 einfach geladene Ionen im Massenspektrum in Abb.5.10 (insgesamt 38 Ionen von SEQUEST) zugeordnet worden. Es sind sieben b+- und zehn y+-Ionen einbezogen. Die Serie der b+-Ionen ab dem b9+ sollte bei einer Koordination an der Glutaminsäure 343 das charakteristische Platinpattern des Metallfragmentes enthalten, aus der y+-Ionen-Serie y16+ bis y23+, wobei nur die Ionen b10+ und b15+ beobachtet werden. Im oberen Spektrum ist das Isotopenmuster für das b10+-Ion in der Vergrößerung gezeigt, welches eindeutig für eine Platinierung an E343 oder an einer N-terminal zu diesem liegenden Aminosäure spricht. In der nachfolgenden Tabelle ist eine Liste der zehn Peptide aufgestellt, welche nach den SEQUEST-Parametern in Frage kommen.

Proteintargets in Escherichia coli

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Tab.5.8: SEQUEST-Parameter von [TTDVTGTIE@LPEGVEMVMPGDNIK]3+ aus eftU im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected]

XCorr 6,912 6,336 5,878 5,618 5,15 5,13 4,859 4,791 4,724 4,223

∆Cn 0 0,083 0,15 0,187 0,255 0,258 0,297 0,307 0,317 0,389

Sp RSp Ionen Protein 1761,5 1 38/92 EFTU_ECOLI 1550,2 2 37/92 EFTU_ECOLI 1255,7 4 33/92 EFTU_ECOLI 1291,7 3 36/92 EFTU_ECOLI 715,3 9 27/92 EFTU_ECOLI 657,2 10 26/92 EFTU_ECOLI 909 5 33/92 EFTU_ECOLI 843,7 7 32/92 EFTU_ECOLI 881,3 6 32/92 EFTU_ECOLI 396,3 55 22/92 EFTU_ECOLI

In der Peptidsequenz des eftU Proteins sind neun weitere Aminosäuren als potentielle Bindungsstellen vorhanden. Die SEQUEST-Werte zeigen, dass nur zwei Sequenzen aus der Tabelle abgelehnt werden würden, wenn nur die Parameter XCorr, Sp und RSp (XCorr > 3,5; Sp ≥ 500; RSp ≤ 10) betrachtet werden. Jedoch weisen die platinierten Sequenzen 3-10 aus Tabelle 5.8 alle ∆Cn > 0.1 gegenüber Sequenz 1 auf. Es verbleibt somit nur T341 als weitere potentielle Bindungsstelle, wenn die Spektrenübereinstimmung berücksichtigt wird. Die Ionen b7+ und b8+ im Massenspektrum in Abb. 5.10 sollten bei der Koordination von T341 mit [Pt(dien)]2+ platiniert vorliegen, was nicht eindeutig bestätigt werden konnte. Einen Hinweis auf die Koordination von E343 liefert jedoch das Fehlen der Ionen yk+ für k > 15. In der nachstehenden Abbildung ist die Struktur des Proteins (Aminosäuren Threonin 8 bis Serin 394) dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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E343

T341

Abb.5.11:Die Proteinstruktur von eftU aus E. coli mit der Kennzeichnung von T341 und E343 (PDB ID: 1efc [102])

Die gekennzeichneten Seitenketten von T341 und E343 liegen, wie in der Illustration erkennbar ist, für eine Koordination sterisch günstig. Sowohl die Glutaminsäure 343 als auch das Threonin 341 sind in einem β-Faltblatt lokalisiert. Ein Peptid des Proteins ssb (single- stranded DNA- binding protein) wurde aus dem Ansatz [Pt(dien)]2+/E. coli Bakterium ebenfalls mit einer koordinierten Aminosäure detektiert. Es handelt sich hierbei um ein 19 kDa Protein mit 178 Aminosäuren, welches in der Zelle essentiell für die Chromosomenreplikation ist. Es ist somit in die DNA-Rekombination und Reparatur einbezogen. Aus der Gesamtsequenz des ssb Proteins wurde das Peptid [155PQQSAPAAPSNEPPMDFD@DDIPF177]3+ mit der Modifikation der Asparaginsäure D172 identifiziert. Das zugehörige Massenspektrum ist in Abbildung 5.12 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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Abb.5.12: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [PQQSAPAAPSNEPPMDFD@DDIPF]3+ aus ssb

Im MS/MS-Spektrum zugeordnet sind 15 Ionen (nur einfach geladene dargestellt, 33 insgesamt zugeordnet) von 88 (einfach und zweifach geladene Moleküle) möglichen Ionen. Die Ionen b18+ bis b22+ sollten die typische Verteilung des koordinierten Metalls enthalten, werden im Spektrum jedoch nicht beobachtet. Aus der y+-Serie ist das Muster bei den Ionen y6+ bis y22+ zu erwarten, beobachtet werden die y2+, y6+, y8+ sowie y10+- y12+-Ionen. Im MS/MS-Spektrum des Peptids (Abbildung 5.12) sind zwei Ausschnitte der Ionen mit unterschiedlichen Ionenverteilungen dargestellt. Das b8+-Ion trägt, wie erwartet keine Isotopenverteilung des Platins, wobei die vergrößerte Darstellung des y11+-Ions das erwartete Pattern aufweist. Die folgende Tabelle listet die mit der Massengenauigkeit von 2,5 vorkommenden Peptide unterschiedlicher Proteine auf.

Proteintargets in Escherichia coli

70

Tab.5.9: SEQUEST-Parameter von [PQQSAPAAPSNEPPMDFD@DDIPF]3+ aus ssb im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz R.PQQSAPAAPSNEPPMDFD@DDIPF. R.PQQSAPAAPSNEPPMDFDDD@IPF. R.PQQSAPAAPSNEPPMDFDD@DIPF. R.PQQSAPAAPSNEPPM@DFDDDIPF. R.PQQSAPAAPSNEPPMD@FDDDIPF. R.PQQSAPAAPSNE@PPMDFDDDIPF. R.PQQSAPAAPS@NEPPMDFDDDIPF. [email protected] [email protected] [email protected]

XCorr 3,863 3,804 3,777 3,715 3,628 3,174 3,099 2,368 2,272 2,209

∆Cn 0 0,015 0,022 0,038 0,061 0,179 0,198 0,387 0,412 0,428

Sp RSp Ionen Protein 824,4 1 33/88 SSB_ECOLI 690,4 4 31/88 SSB_ECOLI 755,9 2 32/88 SSB_ECOLI 658,7 5 30/88 SSB_ECOLI 725 3 31/88 SSB_ECOLI 535,5 6 28/88 SSB_ECOLI 476,1 7 26/88 SSB_ECOLI 207,8 57 22/84 YNEI_ECOLI 191,7 94 21/84 YNEI_ECOLI 193,6 86 21/84 YNEI_ECOLI

Daraus lässt sich erkennen, dass aus dem Protein ssb außer D172 eine Reihe weiterer potentiellen Koordinationsstellen (D174, D173, M169, D170 mit ∆Cn < 0,1) in Frage kommen. Neben den Asparaginsäuren-Seitenketten können Methionin, Glutaminsäure oder Serin aus ssb prinzipiell gebunden werden. Aus der Verteilung im Massenspektrum und den SEQUEST-Werten aus der Tabelle 5.9 wird deutlich, dass neben D172 auch eine Koordination von D173 oder D174 aus ssb möglich wäre. Nach dem Parameter ∆Cn ≤ 0,1 kommen außerdem auch D170 und M169 in Betracht. Da bj+-Ionen mit j > 13 und yk+-Ionen mit 6 > k > 2 fehlen, kann nicht eindeutig zwischen den drei D-Resten D172-D174 entschieden werden.

5.3. Proteintargets von cis-[PtCl2(NH3)2]

Das in der medizinischen Praxis am häufigsten eingesetzte Krebstherapeutikum aus der Klasse der Metallkomplexe ist Cisplatin [41]. Zu dem Reaktionsverhalten von Cis- und Carboplatin mit Biomolekülen sind, wie im Kapitel 3 erwähnt, zahlreiche Studien durchgeführt worden, jedoch ist die Rolle ihrer Wechselwirkungen mit den Proteinen bisher kaum geklärt. Die MudPIT-Analysen mit diesem Metallkomplex sollen einen Beitrag zum besseren Verständnis leisten. Dazu wurde wiederum das Darmbakterium E. coli als Modell für eine lebende Zelle mit dem Zytostatikum umgesetzt und auf Modifikationen der Proteine untersucht. Welche Fragmente aus dem Metallkomplex gebildet werden und koordinieren können, wurde in den Modellstudien (Kapitel 4) untersucht. Es sind Fragmente mit den folgenden Massen

Proteintargets in Escherichia coli

71

möglich: [195Pt]2+ mit 193, [(NH3)195Pt]2+ mit 210, [(NH3)2195Pt]2+ mit 227 und [(NH3)2195PtCl]+ mit 263. Bei den jeweiligen Massen wurde der Ladungsausgleich mit der Abgabe von Protonen berücksichtigt. Zu den einzelnen Massen erscheinen in den SEQUEST-Listen mehrere Proteine, die mindestens ein modifiziertes Peptid enthalten. Aus diesen Listen wurden zusätzlich zu den SEQUEST-Werten, wie im Experiment mit dem Ruthenium- und [Pt(dien)]2+-Komplex, die jeweiligen Massenspektren zur Beurteilung herangezogen, um eine Endliste mit den modifizierten Proteinen zu erhalten. Die so erhaltenen Proteintargets können in fünf Gruppen (DNA- und RNA- bindende Proteine, stressregulierende Proteine, katalytisch funktionierende Proteine, Effluxproteine und Proteine mit anderen Funktionen) gegliedert werden, die nach ihren Funktionen eingeteilt wurden. Diese Aufteilung ist in der unteren Tabelle gezeigt.

Tab.5.10: Proteintargets von Cisplatin in E. coli (Teil I, Teil II auf Seite 72) Protein

arti eftU

Peptidsequenz DNA- und RNA-bindende Proteine R.HYEIVFM§VHPDQSEQVPGMIER.Y K.MoxECID~NEVVVTVNEKLK.D T.C~DGYEIEEGEFR.I R.FMELIDALAQE~TADMPL.H S.FISDILYADIE~SK.A V.PNMS~HSEIMoxEDIKKA. K.MoxRPGD#VLGALTGDIGLDGADIG.K K.MoxRPGD~VLGALTGDIGL.D R.RM#LIITGPNMGGKSTYM.R Stressregulierende Proteine .M§QGSVTEFLKPR.L E.MoxGYDWLGRMoxPY§K.G A.M#LQDIATLTGGTVISEEIGMELEK.A I.VMoxDDADLELAVK#AIVDSR.V Effluxproteine R.QE§LDAQQALVSETEGTIKADEASV.A R.KAQALGVAID#DINDTLQ.T Proteine mit anderen Funktionen K.FIM§DKHPEITTVPYDSYQNAK.L K.MVVTLIHPIAM§DDGLR.F

pthP mukE fimA1 ceaN

.M§FQQEVTITAPNGLHTR.P R.STT#LIPRSVLSELDMMVG.K A.LSLS#STAALAAATTVNGGTVHFK.G K.LIDAESIK#GTEVYTF.H

rs6 finQ top1 uvrD rep5 intD dbpA muts rpoA ompA ch60 aldA mdtA acrD

Bindungsstelle

z

XCorr ∆Cn Ionen

M9 (E5, Y4, H3) D193 (C191, E190) C689 E471 (T472) E15(S16, K17) S376 D399 D399 M609

3 2 2 2 2 2 3 2 2

6,50 4,01 2,81 2,56 2,74 2,54 4,17 2,88 2,97

0,38 0,13 0,47 0,13 0,14 0,13 0,19 0,1 0,1

35/84 16/32 12/22 16/32 13/24 15/28 26/84 15/30 14/32

M1 (S4) Y84 (K85) M288(D291) K271

2 2 2 2

2,89 2,54 5,20 3,09

0,24 0,12 0,51 0,14

13/22 12/22 24/46 15/34

E164 (D166) D742(D743)

2 2

3,48 3,06

0,40 18/46 0,28 15/32

M142 M369 (M359, H365, T362) M1 (T9) T90(T89,S88,S96) S17 (S15, S18, T19) K129

3 2

4,41 3,59

0,37 33/80 0,32 16/30

2 2 2 2

3,58 3,75 2,98 2,60

0,38 0,14 0,13 0,14

§ = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

20/32 18/34 19/44 15/28

Proteintargets in Escherichia coli

72

Tab.5.10: Proteintargets von Cisplatin in E. coli (Fortsetzung von Seite 71) Protein enO g3p1 cisY ebgC tdcE his2 speA yciA mdH thiO dceA

Peptidsequenz Bindungsstelle Katalytisch funktionierende Proteine R.GNPT§VEAEVHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR.E T20 (E22, E24, H26) K.RSD§IEIVAINDLLDADYMAYMLK.Y D26 (S25, E28) R.HTM§IHEQITR.L M113 V.HE§GQIVICDIHEAYR.F E112 (H111) K.T§APLMoxDDVLDYDKVMDSL.D T467 H.AVSGEVLMLGYM$NPEALDK.T M37 (Y36) R.MoxADKMYVNFS$LFQSMPD.A S490 L.MoxSQMDIGGAILAKEIAH~GR.V H51 K.SIGTLSAFEQNALEGMLDT~.L T298 (D297) I.H~LTDDSFDTDVLK.A H7 F.EMDFAELLLEDY#K.A Y441(K442,D440)

z

XCorr ∆Cn Ionen

3 3 2 2

6,88 6,06 3,62 3,07 3,09 3,84 3,11 3,63 3,56 3,56 3,09

2 2 2 2 2 2 2

0,52 41/116 0,53 37/88 0,39 15/18 0,13 15/28 0,23 0,13 0,22 0,18 0,28 0,22 0,25

§ = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+ Es werden einzelne Proteine mit relevanten Funktionen und/oder bekannten Kristallstrukturen aus den Funktionsklassen beschrieben.

Stressregulierende Proteine Aus der Gruppe der stressregulierenden Proteine konnten vier koordinierte Peptidsequenzen aus vier Proteinen ch60, aldA, ompA und rpoA identifiziert werden. In der unteren Abbildung ist das Massenspektrum für das Peptid des Proteins aldA (aldehyde dehydrogenase A) aus dem Bakterium E. coli dargestellt. Das aus 479 Aminosäuren bestehende, etwa 52 kDa große Protein katalysiert Oxidationen der Aldehydsubstrate zu den korrespondierenden

Carboxysäuren

[260VMoxDDADLELAVK#AIVDSR277]2+

[103]. wurde

Das mit

Peptid dem

mit Fragment

der

Sequenz

[(NH3)2PtCl]+

modifiziert. Mox steht für den Mthionin-Rest, der häufig unter MS-Bedingungen gebildet wird und eine Masse [Methionin]+16 aufweist.

17/34 16/36 14/32 17/36 18/36 22/24 14/24

Proteintargets in Escherichia coli

73

Abb.5.13: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [VMoxDDADLELAVK#AIVDSR]2+ aus aldA Das Massenspektrum enthält 16 zugeordnete b+- und y+- Ionen, wobei insgesamt aus der Sequenz 34 vorkommen könnten. Bei der SEQUEST-Auswertung wurden 15 dieser Ionen berücksichtigt. Von den neun einbezogenen b+- Ionen sind für eine K271-Koordination b12+b17+ platiniert. Bei den sieben einbegriffenen y+- Ionen lässt sich dieses Verhalten ebenfalls für y7+ bis y17+ beobachten. In der oberen Abbildung ist die charakteristische Isotopenverteilung am Beispiel des y11+-Ions in der Vergrößerung verdeutlicht. In einem zusätzlichen Ausschnitt aus dem Massenspektrum (Abb. 5.14) wird auf das y11+-Ion besonders eingegangen. Am Beispiel dieses Ions kann sowohl das Fragmentierungsmuster des Cisplatins als auch die Abspaltung der einzelnen Liganden bekräftigt werden.

Proteintargets in Escherichia coli

74

Abb.5.14: y11+-Ion aus [VMoxDDADLELAVK#AIVDSR]2+ aus aldA Das an die Aminosäure K271 koordinierte Cisplatinfragment ist [(NH3)2PtCl]+. Wie aus der Abbildung ersichtlich, ist die neutral loss-Abspaltung von beiden Ammoniakliganden eindeutig erkennbar. Die Beobachtung dieses Verhaltens kann bei der Zuordnung und Bewertung weiterer Massenspektren als hilfreiches Kriterium hinzugezogen werden. Die erfolgte SEQUEST-Zuordnung bestätigt die für die Modellpeptide festgestellte Möglichkeit einer erfolgreichen Analyse von b+- und y+-Ionen trotz begleitender neutral loss. Zu dem Peptid aus dem Protein aldA ist in der folgenden Tabelle eine Darstellung der SEQUEST-Werte der Peptide zu der Masse von m/z = 2240 (∆m ± 2,5) zu sehen. Tab.5.11: SEQUEST-Parameter von [VMoxDDADLELAVK#AIVDSR]2+ aus aldA im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz I.VMoxDDADLELAVK#AIVDSR.V D.KMDTLAGIFGIGQH#PK#.G I.VMoxDDADLELAVKAIVD#SR.V K.D#TQPVTGQSPGQFRDVPF.G K.DT#QPVTGQSPGQFRDVPF.G -.MLRNGNKYLLMoxLVSIIMLT.A -.MoxLRNGNKYLLMLVSIIMLT.A

XCorr 3,088 2,643 2,559 2,455 2,449 2,435 2,395

∆Cn 0 0,144 0,171 0,205 0,207 0,212 0,225

Sp RSp Ionen Protein 595,6 1 15/34 ALDA_ECOLI 439,5 12 13/30 SYGB_ECOLI 407,3 23 13/34 ALDA_ECOLI 354,1 34 12/34 SGBU_ECOLI 354,1 34 12/34 SGBU_ECOLI 321,2 53 12/36 PGAB_ECOLI 389,8 26 14/36 PGAB_ECOLI

Wie aus der Tabelle erkennbar ist, sind zwei Aminosäuren in dem Peptid aus dem Protein aldA als unterschiedliche Modifikationen für eine Zuordnung der Massenpeaks möglich. Neben dem Lysin K271 könnte die Asparaginsäure D275 auch koordiniert werden. Das Platinpattern bei den Ionen b13+ und b14+ in dem Massenspektrum weist jedoch darauf hin, dass eine Bindung des Metallfragmentes am Lysin vorliegen muss. Auch der hohe ∆Cn-Wert

Proteintargets in Escherichia coli

75

von 0,171 für eine D275-Koordination spricht gegen diese Bindungsstelle. In der Tabelle kommen außerdem Peptide der Proteine sygb, apc, sgbu, pgab und apc mit den entsprechenden Molekülmassen vor. Nach Betrachtung der SEQUEST-Werte wird jedoch deutlich, dass diese Zuordnung der Peaks im Massenspektrum unzureichend ist. Ein weiteres stressregulierendes Protein, welches nach der Umsetzung des Bakteriums mit Cisplatin ein Platinfragment bindet, ist das Protein ompA (outer membrane protein A). Es wurde bereits bei einer Umsetzung des Bakteriums mit Cisplatin als bindendes Protein identifiziert [89]. In der Studie von DYSON wurde das 37 kDa große Protein mit dem Platinfragment [(NH3)2PtCl]+ modifiziert gefunden. Jedoch gelang es seiner Arbeitsgruppe nicht die Bindungsstelle zu ermitteln. Nach der Umsetzung im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Peptidfragment aus dem Protein mit Platin nach Abspaltung aller Liganden koordiniert identifiziert. Wie zuvor erläutert kann das [Pt]2+-Fragment auch bei der MS-Ionisierung durch Verlust des Chloridions bzw. durch neutral loss eines oder beider Amminliganden entstehen. Das zugehörende Massenspektrum ist in Abbildung 5.15 dargestellt.

Abb.5.15: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [MoxGYDWLGRMoxPY§K]2+ aus ompA

Proteintargets in Escherichia coli

76

Das Fragment des Proteins, welches mit dem Platinrest [Pt]2+ modifiziert wurde, besteht aus der Sequenz [74MoxGYDWLGRMoxPY§K85]2+. In dem Massenspektrum sind 12 von 22 Ionen des Peptids zugeordnet. Die eingefügte Vergrößerung zeigt das Platinpattern des Ions y9+, welches als Fragment des Peptids das Metall enthält. Die folgende Tabelle zeigt neun weitere mögliche Zuordnungen anderer Peptide zu dem Massenspektrum. Tab.5.12: SEQUEST-Parameter von [MoxGYDWLGRMoxPY§K]2+ aus ompA im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz E.MoxGYDWLGRMoxPY§K.G E.MoxGYDWLGRMoxPYK§.G R.ALLAY§RDGARIH§.A -.M§GPVMoxLD§VEGYE.L P.KLQIDFMoxTIHAS§K.G -.M§GPVMoxLDVE§GYE.L -.MoxGPVM§LD§VEGYE.L P.KLQIDFMoxTIH§ASK.G F.YE§LFY§D§DAK.R K.RLPE§GSTLPWHRV.V -.SLYCATSRDMoxIK§F.-

XCorr 2,713 2,477 2,407 2,394 2,257 2,245 2,185 2,164 2,155 2,139 1,521

∆Cn 0 0,087 0,113 0,118 0,168 0,173 0,195 0,203 0,206 0,212 0,44

Sp 535,4 463,5 468,2 421,5 409,2 287,1 423,4 409,2 338,4 286,7 734,8

RSp 12 28 27 52 56 302 50 56 147 307 1

Ionen 12/22 11/22 11/22 11/22 11/24 10/22 11/22 11/24 8/16 9/24 13/24

Protein OMPA_ECOLI OMPA_ECOLI TETR3_ECOLI NAGZ_ECOLI HELD_ECOLI NAGZ_ECOLI NAGZ_ECOLI HELD_ECOLI MUTS_ECOLI YBAZ_ECOLI IUCA_ECOLI

Es sind in der Tabelle zwei Peptidfragmente aus dem Protein ompA vorhanden, welche jeweils eine Modifikation aufzeigen (Tyrosin 84 und Lysin 85). Eine genaue Zuordnung der Bindungsstelle kann in diesem Fall nicht erfolgen, da yk+-Ionen mit k < 3 nicht im MS/MSSpektrum (Abb. 5.15) dargestellt und die m/z-Werte für b11+ (M74-Y84) und y11+ (G75-K85) identisch sind. Somit ist die Zuordnung von b11+unzuverlässig. Die Sequenzen der Peptide der sechs weiteren Proteine können auf Grund ihrer niedrigen SEQUEST-Werte (∆Cn > 0,11) alle ausgeschlossen werden. Das ompA Protein gehört mit seinen 346 Aminosäuren zu den Hauptmembranproteinen von E. coli bzw. anderen gramnegativen Bakterien [104]. Es wird diskutiert, dass die Aufgabe des Proteins die Bildung von Kanälen und Transport durch die Membran sein könnten. In der folgenden Illustration ist die Struktur des Proteins mit der eingekreisten Seitenkette der potentiell koordinierten Aminosäure Tyrosin 84 dargestellt. Zusätzlich ist die Seitenkette von K85 hervorgehoben.

Proteintargets in Escherichia coli

77

K85

Y84

Abb.5.16: Proteinstruktur von ompA mit gekennzeichneten Seitenketten Y84 und K85 (PDB ID:1gjp [105])

In der Struktur des Proteins ist die Zugänglichkeit der Seitenkette des Tyrosins 84 in einer Schleife klar zu erkennen und bestätigt somit die Bevorzugung dieser Position (bzw. K85). Fehlende Stücke in den Schleifen der Proteinstruktur in der oberen Abbildung sind durch Fehlstellen in der Kristallstruktur zu erklären.

DNA- und RNA-bindende Proteine In der Gesamtliste der Proteintargets aus E. coli findet sich das Protein mutS, ein Protein aus der mismatch repair -Gruppe (DNA mismatch repair protein mutS). Dabei handelt es sich um ein etwa 95 kDa großes Protein, welches in der Region 614 bis 621 das ATP-Zentrum enthält. ATP ist dabei ein Nucleotid, Adenosintriphosphat, ein energiereicher Baustein der DNA und RNA. Außerdem ist ATP die Energiequelle einer Zelle und reguliert die energieliefernden Prozesse darin. Bei der Hydrolyse von ATP entsteht das ADP (Adenosindiphosphat), ein energiereiches Molekül in den Zellen. Aus dem Protein wurde massenspektrometrisch aus der MudPIT-Analyse die halbtryptisch gespaltene Peptidsequenz [608RM#LIITGPNMGGKSTYM624]2+ mit der [(NH3)2PtCl]+ Modifikation an der Stelle Methionin M609 gefunden. Das zugehörige Massenspektrum ist nachfolgend dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

78

Abb.5.17: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [RM#LIITGPNMGGKSTYM]2+ aus mutS Wie aus der Abbildung erkennbar, sind 10 b+- und 11 y+- Ionen von möglichen 32 Ionen im Massenspektrum zugeordnet. Für die SEQUEST-Analyse wurden 14 Ionen verwendet. Die Ionen b2+ bis b16+ und y16+ sollten das charakteristische Pattern des Metallzentrums des koordinierten Fragmentes aufzeigen. In dem Massenspektrum ist eine Vergrößerung des Ions b14+

eingefügt,

welche

die

charakteristische

Isotopenverteilung

des

koordinierten

Metallfragmentes verdeutlicht. In der unteren Tabelle sind weitere Peptide aufgelistet, deren Masse mit m/z = 2133 der des koordinierten Fragmentes aus mutS entspricht (∆m ± 2,5).

Proteintargets in Escherichia coli

79

Tab.5.13: SEQUEST-Parameter von [RM#LIITGPNMGGKSTYM]2+ aus mutS im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz R.RM#LIITGPNMGGKSTYM.R D.RM#LDMoxGFSDAIDDVIR.F R.H#TKMoxNVGDVQRLSVAVV.V R.HT#KMoxNVGDVQRLSVAVV.V P.TGLLNEMoxIAYLNS#EER.N R.DGVGGNSSFAT#MoxIDREPT.Q K.TASIPINSNLIVHVGNNVRI.D R.ATLCILD#PRLLLDEKSA.S D.WTFDLLDVYLAE#IDR.V P.TGLLNE#MoxIAYLNSEER.N -.TMRIID#T#NINVMDA.-

XCorr 2,791 2,504 2,477 2,456 2,283 2,245 2,24 2,227 2,216 2,146 2,051

∆Cn 0 0,103 0,113 0,12 0,182 0,196 0,198 0,202 0,206 0,231 0,265

Sp RSp Ionen Protein 564,7 3 14/32 MUTS_ECOLI 467,3 20 13/30 DBPA_ECOLI 370,4 63 11/32 FLIF_ECOLI 370,4 63 11/32 FLIF_ECOLI 354,5 83 12/30 YDEO_ECOLI 362,9 73 12/34 YMFK_ECOLI 287,8 213 11/38 YTFN_ECOLI 432 27 12/32 YEIR_ECOLI 513,2 7 12/28 YCGB_ECOLI 327 130 12/30 YDEO_ECOLI 713,8 1 13/26 CDAR_ECOLI

Die Tabelle enthält neben dem Protein mutS zehn Sequenzen anderer Proteine, welche ebenfalls von dem Cisplatinfragment [(NH3)2PtCl]+ koordiniert sein könnten. Darin kommt ein Peptid vor, welches an zwei Aminosäuren jeweils das Metallfragment gebunden haben sollte. Da diese mehrfache Modifizierung im Metallmuster der Ionen nicht feststellbar ist, wird sie als Koordinationsmuster ausgeschlossen. Aus der detektierten Sequenz von mutS ist außer Methionin 609 keine der potentiellen Aminosäuren (z. B. Threonin 613) als Koordinationsstelle in der SEQUEST-Liste zu finden. Auf Grund des ∆Cn-Kriteriums (∆Cn > 0,10) können die restlichen Peptidsequenzen ausgeschlossen werden. Die Lokalisierung der Aminosäure und ihrer Seitenkette kann in der Tertiärstruktur des Proteins mutS betrachtet werden. Die Koordination ist räumlich in der folgenden Abbildung in der Gesamtstruktur des Proteins dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

80

ADP-Zentrum

Abb.5.18: Struktur des DNA mismatch repair Proteins mutS (PDB ID: 1e3m [106])

Das 95 kDa Protein liegt als Tetramer vor und enthält in der eingekreisten Region das ADPZentrum. In der folgenden Abbildung ist zur Verdeutlichung ein Ausschnitt aus der Gesamtstruktur dargestellt, welcher die mit dem Cisplatinfragment modifizierte Stelle (Methionin 609) und die ADP-Region zeigt.

Abb.5.19: Vergrößerung der Struktur des DNA mismatch repair Proteins mutS

Proteintargets in Escherichia coli

81

Die Modifikation der Aminosäure M609 liegt räumlich in der Nähe des Energiezentrums des DNA-bindenden Proteins mutS, so dass bei der Koordination des Metallkomplexrestes eine Beeinflussung dessen vermutet werden kann. Im Zusammenhang mit mutS wird in der Literatur die DNA-Helikase uvrD (DNA helicase II) diskutiert [107]. Dabei handelt es sich um ein Protein, welches an dem NER-Mechanismus beteiligt ist. Der uvrD Helikase werden mehrere Funktionen zugeschrieben. Einerseits kontrolliert sie die Rekombinase recA [108], andererseits entwindet sie die DNA und vermittelt die Bindung der Polymerase I [109]. Das Massenspektrum des modifizierten Peptids [461FMELIDALAQE~TADMPL477]2+ der 720 Aminosäuren langen Helikase ist in der Abbildung 5.20 dargestellt. Wie an der Kennzeichnung in der Sequenz erkennbar, wurde die Glutaminsäure E 471 koordiniert.

Abb.5.20: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [FMELIDALAQE~TADMPL]2+ aus uvrD

Aus der Fragmentierung des Peptids ist ersichtlich, dass einer Koordination der Glutaminsäure 471 bei den Ionen b11+ bis b16+ das Platinpattern bei den Massenpeaks vorhanden sein muss. Bei den y+-Ionen ist das für die Ionen y7+ bis y16+ der Fall. Die

Proteintargets in Escherichia coli

82

Vergrößerung in der oberen Abbildung 5.20 zeigt das Ion y7+ mit der diskutierten Isotopenverteilung. Von den 32 möglichen Ionen, werden in dem oberen Spektrum 18 Fragmentionen beobachtet, wobei SEQUEST 16 für die Analyse einbezieht. Die SEQUEST-Parameter des Peptids aus dem Protein uvrD sind in der unteren Tabelle dargestellt. Dabei sind zehn weitere Peptide aufgeführt, welche die Masse m/z = 2136 (mit der Massengenauigkeit ∆m ± 2,5) tragen. Tab.5.14: SEQUEST-Parameter von [FMELIDALAQE~TADMPL]2+ aus uvrD im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz R.FMELIDALAQE~TADMPL.H R.FMELIDALAQET~ADMPL.H R.FMELIDALAQETAD~MPL.H D.FT~PGNSTANAELLC~DK.F G.WY~IS~AEIDDLNWR.S E.CGDS~LDSINATSS~AIVK.Y E.CGD~SLDSINATSS~AIVK.Y G.TKEGT~EEPWY~VVDK.D E.C~GDSLDSINATSS~AIVK.Y K.S~Y~WILMTVLLVTQN.G -.VGCTS~KQSVSQC~VK~.-

XCorr 2,562 2,513 2,286 2,235 2,206 2,195 2,195 2,177 2,141 2,134 1,532

∆Cn 0 0,019 0,108 0,128 0,139 0,143 0,143 0,15 0,164 0,167 0,402

Sp RSp Ionen Protein 671,3 3 16/32 UVRD_ECOLI 671,3 3 16/32 UVRD_ECOLI 666,7 4 16/32 UVRD_ECOLI 532,5 11 15/30 YZBC_ECOLI 498,7 13 14/24 YBCH_ECOLI 452,4 17 14/32 RIR1_ECOLI 452,4 17 14/32 RIR1_ECOLI 254,8 199 11/26 TRMU_ECOLI 452,4 17 14/32 RIR1_ECOLI 242,1 248 10/26 YHFK_ECOLI 825,4 1 15/26 RZOD_ECOLI

In der Tabelle sind die Zuordnungen der Massenspektren nach fallenden XCorr-Werten für die einzelnen Peptidsequenzen aufgelistet. Für das uvrD Protein sind Modifikationen mit dem Platinfragment an mehreren Aminosäuren (E471, T472 und D474) prinzipiell möglich. Die Sp- und XCorr-Werte dieser Modifikationen unterscheiden sich nur unwesentlich voneinander, wobei der ∆Cn-Wert für letztere (D474) das ∆Cn-Kriterium knapp nicht erfüllt (∆Cn > 0,1). Auch anhand der zugeordneten b+-Ionen (bj+ ≤ b9+, b13+, b14+) und der y+-Ionen (yk+ ≤ y5+, yk+ ≥ y7+) kann eine genaue Feststellung der modifizierten Aminosäure in dem Protein nicht erfolgen, es kommen somit zwei Bindungsstellen in Frage: E471 und T472. Die restlichen Peptide der sechs Proteine (uvrD, yzbC, rir1, trmU, yhfK und rzoD) aus der Tabelle weisen alle mehrfache Koordinationen auf, für diese geben die Isotopenverteilungen der Ionen im MS/MS-Spektrum jedoch keinen Hinweis. Zur Verdeutlichung der möglichen Bindungsstelle E471 in der Gesamtstruktur des Proteins dient die folgende Abbildung. Das Protein uvrD weist sowohl die Aktivität einer ATPase als auch die einer Helikase auf.

Proteintargets in Escherichia coli

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E471 Abb.5.21: Die Proteinstruktur der DNA-Helikase (PDB ID: 1pjr [110])

Es ist die Struktur einer vergleichbaren DNA-Helikase (DExx box) gezeigt. In der Illustration ist der Bereich der bekannten Kristallstruktur des Proteins zwischen Aminosäure M1 und K680 zu sehen. Aus der Darstellung ist ersichtlich, dass die Seitenkette der Glutaminsäure 471 für eine Koordination sterisch gut zugänglich ist. Die unten stehende Vergrößerung des koordinierten Bereiches dient zur Verdeutlichung der Zugänglichkeit beider möglicherweise koordinierter Seitenketten der Aminosäuren E471 und T472.

T472

E471

Abb.5.22: Vergrößerung der Strukutr von uvrD im Bereich der möglichen Koordinationsstellen E471/T472

Proteintargets in Escherichia coli

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Beide Aminosäuren sind in einer Helix lokalisiert und ihre Seitenketten sind, wie aus der Abbildung erkennbar, leicht für ein koordinierendes Platinfragment zugänglich. Ein weiteres DNA-bindendes Protein des Darmbakteriums, welches von Cisplatin koordiniert wurde, ist eine DNA-Topoisomerase top1. Topoisomerase ist als Enzym an der Replikation der DNA einer Zelle beteiligt und spielt dementsprechend im Zusammenhang mit Krebs eine bedeutende Rolle. Die Topoisomerase I in E. coli ist zusammen mit zwei weiteren Topoisomerasen an der Regulation des Überspiralisierungsgrades und der DNA-Topologie beteiligt [111]. Mit einer Blockierung der Topoisomerase würde das unkontrollierte Wachsen/Fortpflanzen der Zelle beeinflusst werden. Bei dem durchgeführten Experiment bindet das Fragment [(NH3)2Pt]2+ des Cisplatins an die Aminosäure C689 des 97 kDa Proteins. Das Massenspektrum des Peptids der Sequenz [689C~DGYEIEEGEFR700]2+ ist in der Abbildung 5.23 dargestellt.

Abb.5.23: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [C~DGYEIEEGEFR]2+ aus top1

Das Massenspektrum enthält von 22 möglichen Fragmentionen zugeordnete 12 Ionen. Alle b+-Ionen des Peptids enthalten Platin als Fragment und weisen somit das charakteristische Pattern auf. Dagegen fehlt dieses bei den y+-Ionen des Peptids. Der vergrößerte Ausschnitt

Proteintargets in Escherichia coli

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des Ions y4+ weist der Koordinationsstelle des [(NH3)2Pt]2+-Fragmentes (C689) entsprechend keine Platinverteilung auf. Im obigen Spektrum werden zwei der genannten b+-Ionen und alle yk+-Ionen für k ≥ 2 beobachtet. Die folgende Tabelle zeigt die möglichen Sequenzen, welche mit der gefundenen Masse von m/z = 1674 (∆m ± 2,5) aus dem Bakterium detektiert werden könnten. Tab.5.15: SEQUEST-Parameter von [C~DGYEIEEGEFR]2+ aus top1 im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz T.C~DGYEIEEGEFR.I T.CD~GYEIEEGEFR.I T.CDGY~EIEEGEFR.I Y.LPKT~QQLQMGFR.K V.Y~LFSGIVSALYGR.E R.C~FMLCTSHAMMoxR.D Y.LPK~TQQLQMGFR.K T.CDGYE~IEEGEFR.I K.ALGAPVELIKVHNTPD.G E.HAIGM~MMoxTLNRR.I

XCorr 2,807 2,407 1,771 1,497 1,462 1,444 1,407 1,394 1,364 1,341

∆Cn 0 0,143 0,369 0,467 0,479 0,486 0,499 0,503 0,514 0,522

Sp RSp Ionen Protein 526 1 12/22 TOP1_ECOLI 435,2 2 11/22 TOP1_ECOLI 275,8 11 9/22 TOP1_ECOLI 379,6 4 11/22 RUMA_ECOLI 261,9 19 9/24 YFDE_ECOLI 162,7 147 9/22 YOAA_ECOLI 315,4 6 10/22 RUMA_ECOLI 192,4 65 8/22 TOP1_ECOLI 236,9 25 11/30 MANB_ECOLI 228,8 26 10/22 LDHD_ECOLI

Es ist ersichtlich, dass fünf Fragmente anderer Proteine nach der Gesamtmasse des Peptids zugeordnet werden könnten. Aus den SEQUEST-Werten der Sequenzen von rumA, yfdE, yoaA, amnB und ldhD, die in der Tabelle dargestellt sind, wird jedoch deutlich, dass eine passende Zuordnung und Übereinstimmung des aufgenommenen Massenspektrums nur mit dem der Peptidsequenz C689-R700 aus der Topoisomerase erreicht wurde. Auf die ∆Cn- und Sp-Werte der neun Sequenzen, die neben der Koordination des Cysteins 689 in der Topoisomerase aufgelistet sind, bezogen, erfüllt keine dieser Modifikationen die erforderlichen Kriterien. Somit wird deutlich, dass C689 der Topoisomerase I vom Cisplatinfragment koordiniert wird.

Katalytisch funktionierende Proteine Eine weitere Proteingruppe, aus welcher modifizierte Peptidfragmente identifiziert werden konnten, enthält katalytisch funktionierende Proteine. Ein Beispiel davon stellt das Protein yciA (acyl-CoA thioester hydrolase) dar. Es handelt sich hierbei um ein 14 kDa Protein, welches die Hydrolyse der Thioesterbindung zweier Coenzyme A katalysiert. Aus dem Protein wurde die Sequenz [35MoxSQMDIGGAILAKEIAH~GR53]2+ mit dem Platinfragment

Proteintargets in Escherichia coli

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[(NH3)2Pt]2+ an der Aminosäure H51 modifiziert. Das zugehörige Massenspektrum aus der MudPIT-Analyse ist in der unteren Abbildung dargestellt.

Abb.5.24: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [MoxSQMDIGGAILAKEIAH~GR]2+ aus yciA In dem Spektrum sind von 36 Ionen 17 zugeordnet worden. Die Ionen y3+ bis y18+ sollen das charakteristische Platinpattern aufweisen. Bei den b+-Ionen kommen aus der Modifizierung resultierend nur b17+ und b18+ mit dem Isotopenmuster vor, werden im obigen Spektrum jedoch nicht beobachtet. Die Vergrößerung in dem Spektrum in Abbildung 5.24 zeigt das Ion y15+, welches platiniert vorliegt. Das vorliegende Peptid wurde an der Aminosäure Histidin 51 koordiniert. Eine Auflistung weiterer möglicher Peptide aus ycia und aus sonstigen Proteinen, welche die Masse m/z = 2242 (mit ∆m ± 2,5) tragen, ist in der Tabelle 5.16 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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Tab.5.16:SEQUEST-Parameter von [MoxSQMDIGGAILAKEIAH~GR]2+ aus yciA im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz L.MoxSQMDIGGAILAKEIAH~GR.V L.MoxSQMDIGGAILAKE~IAHGR.V L.MSQMoxDIGGAILAKEIAH~GR.V F.NYMoxSHEQDWQEFRDAIR.I L.MoxSQMDIGGAILAK~EIAHGR.V K.K~NPD~EVAAWLADDSQE.L L.MSQMoxDIGGAILAKE~IAHGR.V K.RQGLKVPEDLSIIGFDNIDL.T -.M~HINIAWQDVDTVLLDM.D R.Y~SQT~GTLKFSDPTVDE.T

XCorr 3,632 3,246 3,138 2,98 2,84 2,781 2,752 2,639 2,576 2,478

∆Cn 0 0,106 0,136 0,179 0,218 0,234 0,242 0,273 0,291 0,318

Sp RSp Ionen Protein 888,2 2 17/36 YCIA_ECOLI 524 5 14/36 YCIA_ECOLI 762,9 3 16/36 YCIA_ECOLI 999,3 1 15/32 BETA_ECOLI 338,2 47 12/36 YCIA_ECOLI 404,5 15 12/30 KORB1_ECOLI 436,4 10 13/36 YCIA_ECOLI 246 220 10/38 CYTR_ECOLI 476,7 8 13/32 YRFG_ECOLI 279,5 133 11/30 MDTE_ECOLI

In der modifizierten Peptidsequenz M35-R53 des Proteins yciA gibt es weitere potentielle Aminosäuren, die durch das [(NH3)2Pt]2+-Fragment möglicherweise koordiniert sein könnten. Dabei gibt es neben Histidin 51 die Glutaminsäure 48 und das Lysin 47, an die [(NH3)2Pt]2+ binden könnte. An den ∆Cn- Werten (∆Cn > 0,10) lässt sich jedoch erkennen, dass die Koordination des Histidins 51 (mit Oxidation des Methionins 35) eine wesentlich bessere spektrale Übereinstimmung liefert. Außerdem werden modifizierte Peptidsequenzen weiterer drei Proteine in der Tabelle aufgelistet (betA mit oxidiertem Methionin, korbI, yrfG und mdtE). Die Sp- und die XCorr-Werte für diese Sequenzen erfüllen jedoch, mit Ausnahme des betA-Proteins, nicht die gewählten Kriterien (Sp ≥ 500, XCorr ≥ 2,5). Die Zuordnung des Proteins betA kann ebenfalls ausgeschlossen werden, da wie unter Abb 5.24 am Beispiel des y15+-Ions dargestellt eine Platinierung in der zum MS/MS-Spektrum gehörenden Peptidsequenz vorliegt. In der folgenden Abbildung ist die Struktur des Proteins dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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H51

Abb.5.25: Proteinstruktur des Proteins yciA (PDB ID: 2g6s [112])

In der Darstellung ist der Imidazolring des Histidins als sterisch leicht zugängliche Seitenkette für eine Koordination erkennbar. Die modifizierte Aminosäure des Proteins ist in einer Schleife lokalisiert. Es ist die Struktur eines vergleichbaren Thioesterase-Proteins dargestellt. Ein weiteres Protein mit katalytischer Funktion, welches von einem Platinfragment koordiniert wurde, ist das etwa 46 kDa große Protein enO (enolase). Das Enzym überführt unter Abspaltung von Wasser 2-Phosphoglycerat in Phosphoenolpyruvat. Das Peptid aus diesem Protein mit der Sequenz [17GNPT§VEAEHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR46]3+ wurde an der Aminosäure Threonin 20 mit dem Platinfragment [Pt]2+ modifiziert. Das MS/MS-Massenspektrum des Peptids ist in der Abbildung 5.26 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

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Abb.5.26: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [GNPT§VEAEHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR]3+ aus enO

Aus den gekennzeichneten Zuordnungen ist ersichtlich, dass von den insgesamt 116 Ionen (für ein- und zweifach geladene) 19 einfach geladene Peaks im Spektrum (von 41 von SEQUEST gefundenen Ionen) zugeordnet werden konnten. Die b+-Ionen, welche das Pattern des Metalls aufzeigen sollen, sind alle b+-Ionen ab b4+. Bei den y+-Ionen sind es die Ionen y27+ bis y29+. Viele der aufgezählten Ionen können im MS/MS-Spektrum unter Abb 5.26 beobachtet werden. In der oberen Abbildung ist das b15+-Ion als Vergrößerung dargestellt. Es weist erwartungsgemäß das Platinpattern auf, wenn die Koordination am Threonin 20 vorliegt. Auch in dieser Sequenz sind mehrere Aminosäuren enthalten, welche als potentielle Bindungsstellen für ein Platinfragment in Frage kommen würden. Zum Vergleich dient die Auflistung in Tabelle 5.17, welche auch Peptide aus anderen Proteinen berücksichtigt, die eine Masse von m/z = 3051 (mit ∆m ± 2,5) tragen.

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Tab.5.17:SEQUEST-Parameter von [GNPT§VEAEHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR]3+ aus enO im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz R.GNPT§VEAEVHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR.E R.GNPTVEAE§VHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR.E R.GNPTVE§AEVHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR.E R.GNPTVEAEVH§LEGGFVGMAAAPSGASTGSR.E R.GNPTVEAEVHLE§GGFVGMAAAPSGASTGSR.E R.ILE§LRD§VQLIGHNSYEQIRAT§.L K.NAGVMoxTNNVD§VSGGILNNAGEMTAQITMox.N R.QVE§GVYGAQIVAGGGELHLNGAMoxPERW.R R.LNVTLT§RDDVMoxGE§SLYNPMLPGIV.A R.LNVTLTRD§DVMoxGE§SLYNPMLPGIV.A

XCorr 6,884 6,748 6,636 6,59 5,823 3,43 3,396 3,339 3,326 3,277

∆Cn 0 0,02 0,036 0,043 0,154 0,502 0,507 0,515 0,517 0,524

Sp RSp Ionen Protein 1451,5 1 41/116 ENO_ECOLI 1149,6 3 38/116 ENO_ECOLI 1318,2 2 40/116 ENO_ECOLI 973 4 36/116 ENO_ECOLI 730 5 32/116 ENO_ECOLI 453,2 22 23/80 YAIV_ECOLI 328,3 164 24/108 YDBA_ECOLI 455 21 27/104 FAEI_ECOLI 440,9 25 26/92 SYR_ECOLI 440,9 25 26/92 SYR_ECOLI

Den Massen entsprechend könnten auch Peptide aus den Proteinen yaiv, ydby, faei oder syr mit ihrem Massenspektrum zugeordnet werden. Beim Betrachten der SEQUEST-Werte zu diesen Peptidsequenzen fällt jedoch auf, dass die Zuordnungen für eine wesentlich geringere Ionenzahl erfolgen konnten, so dass diese Proteinmodifikationen ausgeschlossen werden können. In dem Peptid aus eno finden sich neben Threonin 20 drei Glutaminsäuren (E22, E24 und E28) sowie Histidin 26, die mit ihren Seitenketten ebenfalls nach der Tabelle als Angriffsstellen für ein Cisplatinfragment dienen. Auf Grund der fehlenden bj+-Ionen mit j ≤5 kann keine sichere Zuordnung zu T20 bzw. E22 erfolgen. In der folgenden Abbildung ist ein Ausschnitt aus der Struktur des Proteins mit den potentiellen Bindungsstellen dargestellt.

T 20

Abb5.27: Die Struktur des Proteins enO (PDB ID: 2fym [113])

Proteintargets in Escherichia coli

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Die Seitenkette des Threonins, die in der oberen Abbildung eingekreist ist, liegt in einem βFaltblatt. Die Zugänglichkeit der Aminosäure für eine Koordination wird beim Betrachten der Illustration deutlich. Auch die in Tabelle 5.17 aufgelisteten potentiellen Angriffsstellen sind auch in dem Faltblatt lokalisiert und liegen ebenfalls sterisch zugänglich. Somit kann bei dem Peptid [17GNPT§VEAEHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR46]3+ aus dem Protein enO keine genaue Bindungsstelle angegeben werden. Aus den SEQUEST-Werten wird deutlich, dass außer Threonin 20 und Glutaminsäure 22 auch E24 sowie H26 von dem Cisplatinfragment koordiniert werden könnten. Jedoch deutet die Platinierung der Ionen bj+ für j ≥ 6, wie oben bereits erwähnt, auf T20 und E22 als die wahrscheinlichen Bindungsstellen hin. Ein ebenfalls mit katalytischer Funktion von einem Platinfragment koordiniertes Protein ist das 48 kDa Protein cisY (citrate synthase). Das Enzym aus dem Citratzyklus katalysiert die Kondensation von Oxalacetat mit Acetyl-CoA zu Citrat. Aus diesem Protein wurde das tryptisch gespaltene Peptid [111HTM§IHEQITR120]2+ an der Aminosäure M113 mit dem Metallfragment [Pt]2+ modifiziert. Das MS/MS Spektrum des Peptids ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Abb.5.28: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [HTM§IHEQITR]2+ aus cisY

Proteintargets in Escherichia coli

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Eine Zuordnung der Peptidfragmente erfolgte bei der SEQUEST-Analyse für 15 von 18 möglichen Ionen. In Abb. 5.28 sind 14 dieser Ionen beschriftet. Die b+-Ionen ab b3+ sind platiniert, dagegen sind es bei den y+-Ionen nur die Ionen y8+ und y9+. Der vergrößerte Ausschnitt in der Abbildung zeigt das y8+-Ion, welches die Platinverteilung aufweist. Weitere Möglichkeiten von Peptiden auch aus anderen Proteinen mit der Masse m/z = 1459 (∆m ± 2,5), welche von dem Platinfragment koordiniert sein könnten, sind in der Tabelle 5.18 zu sehen. Tab.5.18: SEQUEST-Parameter von [HTM§IHEQITR]2+ aus cisY im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz R.HTM§IHEQITR.L R.HTMIH§EQITR.L R.HT§MIHEQITR.L R.H§TMIHEQITR.L R.HTMIHE§QITR.L Y.T§QLFEEQITR.P D.FQGTES§LNTLR.D I.QLE§S§PKITR.N T.LNWPMIGEQLTR.R P.VGFK§NGTDGNTR.I

XCorr 3,619 3,195 2,95 2,794 2,756 2,214 2,211 2,158 2,086 2,084

∆Cn 0 0,117 0,185 0,228 0,238 0,388 0,389 0,404 0,424 0,424

Sp RSp Ionen Protein 580,3 1 15/18 CISY_ECOLI 357,1 4 13/18 CISY_ECOLI 393,2 3 13/18 CISY_ECOLI 354,6 5 12/18 CISY_ECOLI 188,9 67 11/18 CISY_ECOLI 273,7 12 11/18 AMPH_ECOLI 164,3 130 11/20 FTSX_ECOLI 271,2 13 11/16 YAIW_ECOLI 219,2 33 11/22 HIS7_ECOLI 198,8 54 11/22 AROH_ECOLI

Es sind vier andere Proteine (ampH, ftsX, yaiW und aroH) mit einer Modifikation durch ein Cisplatinfragment in der Tabelle aufgelistet. Ein Peptid aus dem Protein his7 erscheint in der Aufstellung ohne eine Koordination. Die SEQUEST-Parameter zeigen jedoch, dass die Übereinstimmung mit dessen theoretischem Massenspektrum in diesem Fall gering ist. Die Isotopenverteilung des Metalls bei den Ionen im Massenspektrum zeigt außerdem, dass eine Platinkoordination vorliegen muss. Mögliche Bindungsstellen des Proteins cisy sind die Aminosäuren Methionin 113, Histidin 115 und 111, Threonin 112 und Glutaminsäure 116. Beim Betrachten der Sp- und der XCorr-Werte der aufgezählten Varianten fällt jedoch auf, dass nur die Übereinstimmung mit den Datenbankdaten für die Koordination an Methionin 113 zufrieden stellend (Sp > 500, ∆Cn < 0,10) ist und die weiteren Aminosäurereste somit als Bindungsstelle ausgeschlossen werden können. In der Abbildung 5.29 ist die Struktur des Proteins dargestellt, welche die Möglichkeit bietet, sich die Koordination des Proteins mit dem Platinfragment in räumlicher Verteilung anzuschauen.

Proteintargets in Escherichia coli

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M113

Abb.5.29: Die Struktur des Proteins cisY (PDB ID: 1k3p [114])

Die von Cisplatin koordinierte Aminosäure ist in der Darstellung eingekreist. Die Zugänglichkeit der in einer Schleife zwischen zwei Helices lokalisierten Seitenkette wird so verdeutlicht.

Proteine mit anderen Funktionen Neben den katalytisch funktionierenden Proteinen wurden auch Proteintargets mit anderen Funktionen aus dem Bakterium identifiziert. So wurde beispielhaft das Protein eftU, ein Elongationsfaktor mit einer koordinierten Aminosäure aus dem Bakterium-Cisplatin- Gemisch gefunden. Es handelt sich hierbei um das 43 kDa große abundante Protein, welches bereits bei der Umsetzung mit [Pt(dien)]2+ koordiniert wurde. Das Protein ist in der Zelle unter anderem an der Proteinsynthese beteiligt. Aus dem Protein wurde das Peptid der Sequenz [359MVVTLIHPIAM§DDGLR374]2+ mit der Molekülmasse m/z = 1974 (∆m ± 2,5) massenspektrometrisch detektiert. Das Peptid ist von dem Platinrest [Pt]2+ an der Aminosäure M369 koordiniert. Das MS/MS-Spektrum des Peptids ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

94

Abb.5.30: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [MVVTLIHPIAM§DDGLR]2+ aus eftU

Das MS/MS-Spektrum enthält Zuordnungen von 19 Ionen des Proteinfragments, wobei insgesamt 30 b+- und y+-Ionen von der Sequenz entstehen können. Die b+-Ionen ab dem Ion b11+ sind platiniert, bei den y+-Ionen ist das ab dem Ion y6+ der Fall. Dieses Verhalten ist an einem Beispiel, dem y8+ in dem vergrößerten Ausschnitt verdeutlicht. Die Isotopenverteilung des eingesetzten Metalls ist bei y8+ und vielen der restlichen Ionen eindeutig zu erkennen. Die folgende Tabelle zeigt zehn der Massengenauigkeit von ∆m ± 2,5 für m/z = 1974 entsprechenden Peptide.

Proteintargets in Escherichia coli

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Tab.5.19: SEQUEST-Parameter von [MVVTLIHPIAM§DDGLR]2+ aus eftU im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz K.MVVTLIHPIAM§DDGLR.F K.M§VVTLIHPIAMDDGLR.F K.MVVTLIH§PIAMDDGLR.F K.MVVT§LIHPIAMDDGLR.F K.MVVTLIHPIAMD§DGLR.F I.LTMLAAGES§NK§EIGR.A I.LTMLAAGE§SNK§EIGR.A I.LTMLAAGES§NKE§IGR.A K.MVVTLIHPIAMDD§GLR.F I.LTMLAAGE§SNKE§IGR.A

XCorr 3,589 3,556 3,529 3,43 2,886 2,451 2,409 2,372 2,361 2,329

∆Cn 0 0,009 0,017 0,044 0,196 0,317 0,329 0,339 0,342 0,351

Sp RSp Ionen Protein 664 1 16/30 EFTU_ECOLI 612 2 17/30 EFTU_ECOLI 437,3 5 14/30 EFTU_ECOLI 463,3 4 15/30 EFTU_ECOLI 412,7 7 14/30 EFTU_ECOLI 350 13 13/28 YHJB_ECOLI 350 13 13/28 YHJB_ECOLI 350 13 13/28 YHJB_ECOLI 289,3 32 13/30 EFTU_ECOLI 350 13 13/28 YHJB_ECOLI

Neben sechs Koordinationsstellen an unterschiedlichen Aminosäuren des Proteins eftu sind in der Tabelle 5.19 vier Bindungsmöglichkeiten im Protein yhjB aufgelistet. Alle vier Peptide erfüllen jedoch die Kriterien bezüglich ihrer SEQUEST-Werte nicht (∆Cn > 0,1 und Sp < 500) und werden nicht näher betrachtet. In eftU sind insbesondere zwei Methioninstellen als potentielle Bindungsstellen zu erwähnen, M369 und 359. Die restlichen Modifikationen dieser Sequenz (z. B. H365, T362) werden auf Grund ihrer niedrigen Sp-Werte ausgeschlossen. Einen Hinweis auf die Bevorzugung des Methionins 369 gibt das in Abb. 5.30 dargestellte y8+-Ion, welches das Platinpattern aufweist. Bei einer Koordination an Methionin 359 sollte dieses Ion sich nicht im MS/MS-Spektrum befinden. Außerdem ist das Fehlen von bis zu zwei nicht platinierten bj+-Ionen (b6+, b7+) mit j < 11 und das Vorhandensein aller bj+-Ionen mit j ≥ 11 im Einklang mit einer M369-Koordination. In der unteren Abbildung ist die Struktur des Proteins eftU zu finden.

Proteintargets in Escherichia coli

96 T341

E343 M 359 M 369

Abb.5.31: Die Struktur des Proteins eftU (PDB ID: 1efc [102])

In der abgebildeten Struktur sind die Seitenketten beider möglichen Methioninstellen (M359 und M369) gekennzeichnet. Zusätzlich sind die möglichen Bindungsstellen des [Pt(dien)]2+Fragmentes T341/E343 in der Struktur hervorgehoben. Alle vier Seitenketten sind im vergleichbaren Bereich des Proteins eftU lokalisiert. Die räumliche Darstellung deutet ebenfalls darauf hin, dass eine Koordination an M369 wahrscheinlich ist, da dessen Seitenkette sterisch leicht zugänglich ist. Das Protein Thioredoxin-1 thiO, ein etwa 12 kDa großes Protein wird im Zusammenhang mit der Krebstherapie diskutiert, es wird zum Beispiel in Tumorzellen überexprimiert und führt zur Resistenz von humanen Zellen gegen Cisplatin [155, 161]. Es ist in der Zelle für die redoxchemischen Abläufe zuständig, speziell bei der Umwandlung von Ribose zu Desoxyribose bei der DNA-Synthese. Eine Inaktivierung des Proteins würde Einfluss auf das Wachstum der Zelle haben. Von dem 109 Aminosäuren enthaltenden Protein wurde massenspektrometrisch das Peptid der Sequenz [7H~LTDDSFDTDVLK20]2+ mit der Modifikation mit dem Platinfragment [(NH3)2Pt]2+ identifiziert. Es wurde von dem Metallfragment an der Aminosäure H7 koordiniert. Das aufgenommene Massenspektrum des Peptids ist in Abbildung 5.32 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

97

Abb.5.32: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [H~LTDDSFDTDVLK]2+ aus thiO Eine Zuordnung von 20 b+- und y+- Ionen ist im MS/MS-Spektrum zu sehen, für die SEQUEST-Analyse wurden 22 Ionen berücksichtigt. Aus dem Proteinfragment können maximal 24 b+- und y+- Ionen entstehen, was auf eine Zuordnung von etwa 92% bedeutet. Wie aus der Peptidsequenz erkennbar, sollen alle b+-Ionen das Platinpattern aufweisen. Bei den y+-Ionen soll das Muster des Metall nicht vorkommen. In der Abbildung ist zur Verdeutlichung die Isotopenverteilung des b11+-Ions vergrößert zu sehen. Bei allen y+-Ionen fehlt das typische Platinisotopenmuster. Da in der Sequenz des Peptids weitere potentielle Bindungsstellen für das Platinfragment vorhanden sind, müssen diese auch mit Hilfe anderer Kriterien geprüft werden. Die untere Tabelle listet die in Frage kommenden Peptide mit der jeweiligen Kennzeichnung der koordinierten Aminosäure auf. Es werden ebenfalls der Masse m/z = 1734 (∆m ± 2,5) entsprechende Peptide anderer Proteine aufgelistet.

Proteintargets in Escherichia coli

98

Tab.5.20: SEQUEST-Parameter von [H~LTDDSFDTDVLK]2+ aus thiO im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen Sequenz I.H~LTDDSFDTDVLK.A K.H~LPEPFRIRVIE.P I.HLT~DDSFDTDVLK.A K.MoxICH~EGMTVILDSGS.T K.MoxIHE~GMTVILDSGS.T D.GT~LVDS~EVICSR.A K.MoxIHEGMT~VILDSGS.T D.GT~LVDSE~VICSR.A D.GTLVD~S~EVICSR.A K.MoxIHEGM~TVILDSGS.T

XCorr 3,558 2,781 2,563 2,51 2,431 2,33 2,283 2,253 2,245 2,219

∆Cn 0 0,218 0,28 0,295 0,317 0,345 0,358 0,367 0,369 0,377

Sp 1931,2 419,9 1175,7 367,9 368 204,2 211,9 204,2 204,2 211,9

RSp 1 17 2 29 28 397 345 397 397 345

Ionen 22/24 13/22 19/24 13/26 13/26 9/22 11/26 9/22 9/22 11/26

Protein THIO_ECOLI TNAA_ECOLI THIO_ECOLI GATR_ECOLI GATR_ECOLI YIEH_ECOLI GATR_ECOLI YIEH_ECOLI YIEH_ECOLI GATR_ECOLI

Wie in der Tabelle zu sehen ist, sind aus weiteren Proteinen drei Peptide mit der oben angegebenen Massengenauigkeit eingetragen. Aus den Sp- und XCorr- Werten dieser Peptide geht jedoch hervor, dass diese Spektrenzuordnungen wenig Übereinstimmung einbringen. Somit ist die Koordination an eine Aminosäure im Protein Thioredoxin bestätigt. Die SEQUEST-Parameter zeigen, dass nur die Modifikation des Histidins 7 in Frage kommt, für T9 erfüllt der ∆Cn-Wert mit ∆Cn = 0,28 nicht die Kriterien. Aus der Abbildung kann die Proteinstruktur zur Veranschaulichung herangezogen werden.

C34

H7

C32

Abb.5.33: Die Struktur des Proteins thiO (PDB ID: 2trx [115])

Proteintargets in Escherichia coli

99

In der räumlichen Darstellung wird die gute Zugänglichkeit der Seitenkette des koordinierten Histidins erkennbar. Die Seitenkette des Methionins 1 liegt in unmittelbarer Nähe des Histidins und könnte gegebenenfalls von einer Migration zu H7 kinetisch bevorzugt gewesen sein. Gekennzeichnet sind in der Gesamtstruktur des Thioredoxins auch die Cysteinstellen C32 und C34. Diese stellen das aktive Zentrum des Proteins dar. Verglichen mit der Tabelle 5.6, die Proteintargets aus dem Ansatz [Pt(dien)]2+ und E. coliBakterium auflistet, sind von den mit einem der Cisplatinfragment koordinierten Peptide wesentlich mehr Proteintargets (31 Proteine, siehe Tab. 5.10) identifiziert worden. Dies kann vor allem an der Möglichkeit Cisplatins liegen, stabile Chelate und Bischelate auszubilden, was die Pt(dien)2+-Verbindung nicht kann. Die Funktionen, Bedeutungen und Aufgaben der einzelnen Proteine werden im nachfolgenden Kapitel diskutiert.

5.4. Diskussion Voraussetzung für eine erfolgreiche MudPIT-Analyse mit Metallkomplexen und ganzen Zellsystemen ist eine kinetisch stabile Metall-Protein-Bindung, welche sowohl gegenüber der biphasischen chromatographischen Trennung als auch den massenspektrometrischen Bedingungen bestehen bleibt. Eine große Anzahl an b+- und y+- Ionen, die sich unter den MS/MS-Ionisierungen bilden konnten, wirkt sich positiv auf eine genauere Zuordnung der Peptidsequenz

des

theoretischen

Massenspektrums

aus.

Eine

charakteristische

Isotopenverteilung des reagierenden Metalls ist bei der Identifizierung der metallierten Ionen hilfreich. Beide für die Analysen mit dem Bakterium Escherichia coli verwendeten Metalle, Platin und Ruthenium zeigen ein charakteristisches Isotopenpattern auf. E. coli wird in der Forschung als Modellsystem häufig verwendet. Mit der gekoppelten HPLC und Tandem-Massenspektrometrie wurden 1147 Proteine einer Gesamtzahl von 4288 aus dem Bakterium identifiziert [120]. Durch seine unkomplizierte Handhabung hat E. coli seine hohe Bedeutung in den Laboren erlangt. Untersuchungen haben gezeigt, dass der Ablauf vieler grundlegender Vorgänge in menschlichen Zellen im Wesentlichen dem der E. coli-Zellen gleicht [116]. Deswegen wird das Bakterium als Zellsystem häufig dafür verwendet, um die Vorgänge in menschlichen Zellen besser verständlich zu machen.

Proteintargets in Escherichia coli

100

5.4.1. Wechselwirkung von [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] mit E. coli-Zellen Aus früheren Studien ist bekannt, dass eine Migration von [(η6-Aren)Ru]-Fragmenten zu anderen Bindungsstellen oder deren Verlust unter den sauren Bedingungen der SCXChromatographie bei monodentaten Komplexen wahrscheinlich ist [82, 128]. Für bidentate Ru-Aminosäure Komplexe, wie [(η6C6H6)Ru(L-Ala-κ2N,O)Cl], wurde aber eine hohe Stabilität bei RP-Trennungen unter Einsatz von Trifluoressigsäure (TFA, pH = 2) beobachtet [128]. Für die massenspektrometrischen Untersuchungen bzw. MudPIT-Analysen eignen sich damit bi- oder tridentate Chelate aus Peptiden und Metallkomplexen besser. Der hier gewählte Komplex [(p-Cymol)RuCl2(DMSO)] kann nach Abspaltung der drei labilen Liganden, wie die Chloride und das DMSO, bi- oder tridentate Komplexe ausbilden. Für die in Kapitel 5.1 diskutierten Möglichkeiten in einer Peptidsequenz mehrere Bindungsstellen aufzulisten (Tabelle 5.1) sollte beachtet werden, dass der Rutheniumkomplex unter der niedrigen Chloridkonzentration in den E. coli Zellen schnell folgende Komplexe bilden kann: [{(pCymol)Ru}2(OH)3]+, [(p-Cymol)Ru(DMSO)(H2O)2]2+ oder [(p-Cymol)Ru(H2O)3]2+. Alle drei Komplexe haben ebenfalls drei labile Liganden, deren Abspaltungen eine tridentate Bindung begünstigen. Bei dem verwendeten pH-Wert von 7 könnte der Komplex κ2N,O-Chelate mit thermodynamisch stabilen Fünf- oder Sechsringen unter Einfügen der Aminosäuren S, T oder D ausbilden [129]. Aus Tabelle 5.1 lässt sich für die ersten vier koordinierten Sequenzen feststellen, dass jeweils die erste oder zweite Aminosäure als Bindungsstelle fungiert. Alle NTermini dieser Peptide sind nicht tryptisch gespalten. Diese Beobachtung könnte vermuten lassen, dass eine Hydrolyse der benachbarten Amidgruppe von dem koordinierten RuFragment gefördert wird, wie es bereits von KLEINE für Platin bestimmt wurde [46]. Eine Nterminale Chelatisierung ist für eine gute Fragmentierung der b+-Ionen mit enthaltenem Rutheniumkomplexrest und y+-Ionen ohne das Metall unter massenspektrometrischen Bedingungen von Vorteil. Bei einer Koordination des Metallkomplexes an einer weiter zum C-Terminus lokalisierten Aminosäure in der Sequenz fehlt diese Möglichkeit der Stabilisierung. Der Tabelle 5.1 kann entnommen werden, dass das [(p-Cymol)Ru]2+-Fragment bevorzugt die harten Sauerstoffatome der Aminosäuren D, T und S koordiniert. Auch ist die Aminogruppe des Lysins ein Target des Rutheniumfragmentes. Diese zum Teil zweifach bestätigten Koordinationen in zwei unabhängigen Proben lassen vermuten, dass diese Aminosäuren mit ihren Seitenketten spezifische Targets für den Komplex darstellen. Diese Ergebnisse scheinen unerwartet zu sein, da bisher hauptsächlich die Imidazolatome aus Histidylresten oder die

Proteintargets in Escherichia coli

101

weichen Schwefelatome aus Cysteinyl- oder Methionylresten als potentielle Targets für Rutheniumkomplexe diskutiert wurden [52]. Zudem wurde in der Arbeitsgruppe SADLER ein [(p-Cymol)RuCl2(Lysozym)]-Komplex

kristallographisch

mit

einer

koordinierten

Histidylseitenkette in der H15 Aminosäure charakterisiert [83]. Für den zytotoxischen Komplex [(Biphenyl)RuCl(en)](PF6) nach Umsetzung mit dem Protein Cytochrom c wurden allerdings NMR-spektroskopisch die Koordinationen von Carboxylat- und Aminogruppen identifiziert [81]. Die kinetische Bevorzugung von [(η6-Aren)Ru]-Verbindungen anionische Sauerstoffatome zu koordinieren, wurde bei einer 2h-Reaktion mit 5´-MonophosphatNucleotiden festgestellt [82]. Hierbei wurde auch nach einer schnellen Bindung an die 5´Monophosphatgruppe eine langsame Migration des Rutheniumfragmentes zum N7-Atom der Nucleobase

im

5´-GMP

beobachtet.

Mit

diesen

bisherigen

Erkenntnissen

zum

Koordinationsverhalten von Rutheniumkomplexen wird deutlich, dass die unter den im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen (3 Stunden Inkubation bei 37°C und pH = 7) identifizierten Bindungsstellen für den Rutheniumkomplex (D, T, S und K) im Einklang mit bisherigen Studien stehen. In den beiden MudPIT-Analysen mit dem Rutheniumkomplex sind zweimal identische Proteine ermittelt worden. Es handelt sich hierbei um die Proteine cspC und osmY, in denen die Aminosäuren D/K und S/T modifiziert wurden. Zur Veranschaulichung sind in Abbildung 5.34 zwei MS/MS Spektren des Proteins cspC dargestellt, die aus den unterschiedlichen Analysen stammen.

Proteintargets in Escherichia coli

102

Abb.5.34: MudPIT-MS/MS-Spektren des Proteins cspC aus zwei unabhängigen Analysen des E. coli Bakteriums

Proteintargets in Escherichia coli

103

Die Vergleichbarkeit der beiden Spektren wird beim Betrachten dieser schnell deutlich. Bis auf geringe Intensitätsunterschiede und leicht abweichende SEQUEST-Werte sind beide Spektren beinahe identisch. Das cspC Protein gehört der cspA-Familie an, welche neun Homologe enthält. Nur zwei davon, cspC und cspE werden bei 37°C gebildet. Beide Proteine sind in der Expressionsregulierung einbezogen, wobei sie für die Encodierung der Gene für die Proteine ppiD, osmY und sucC verantwortlich sind. Im

Einklang

mit

durchgeführten

Studien

zur

Reaktionseigenschaften

der

[(η6-

C6H6)Ru(H2O)3]2+-Spezies mit 5´-ATP2- werden stabile Produkte/Makrochelate aus dem eingesetzten Rutheniumkomplex bzw. seiner Aquaspezies mit Biomolekülen aus der Zelle erwartet. Bei der oben genannten Reaktion mit 5´-ATP2- entstanden nämlich stabile κ3N7,O(Pβ),O(Pγ)-Makrochelate [130], wobei die Bildung das energieliefernde Zentrum des Moleküls zerstört. Bei der Koordination des [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)]-Komplexes an das Protein cspC ist zu beobachten, dass die benachbarten Seitenketten der Aminosäuren Threonin 20, Asparaginsäure 27 und Lysin 14 für eine tridentate κ3O,O´,N Anordnung des Metallfragmentes beinahe optimal liegen. Zur Veranschaulichung dient die Abbildung 5.35.

H31 mögliche Cisplatinbindungsstelle

K26

D27 K14

T20

Abb.5.35: Struktur des Proteins cspC mit gekennzeichneten möglichen Koordinationsstellen

Proteintargets in Escherichia coli

104

Aus der Darstellung der Struktur wird deutlich, dass eine Alternative κ3O,N´,N-Bindung mit dem Amidstickstoff der Aminosäure D27 und Lysin K26 zu einem Sechschelatring möglich wäre. Diese Formation kann als Schritt vor der tryptischen Spaltung angenommen werden und würde das Vorkommen der durchgehenden b+-Ionenreihe von b8+ bis b15+ erklären (siehe Abbildung 5.3). Eingekreist wurde in der Abbildung 5.40 die Seitenkette des H31, welche möglicherweise

ein

Cisplatinfragment

koordiniert.

Die

modifizierte

Peptidsequenz

[FVH~FSAIQGNGFK]2+ erscheint nicht in Tab 5.10, da der ∆Cn-Wert mit ∆Cn = 0,06 nicht das Mindestkriterium erfüllt. Die Struktur (Abb. 5.6) und das MS/MS Spektrum (Abb. 5.5) für das sucC Protein wurden in Kapitel 5.1 bereits diskutiert. Die für cspC vorgestellte Erläuterung der Stabilität der Bindung gilt auch für das sucC Protein. In der koordinierten Peptidsequenz kommen nämlich in der Nachbarschaft die Seitenketten anderer Aminosäuren ebenfalls für die Formation von stabilen Makrochelaten in Frage. Dies ist in Abbildung 5.41 dargestellt.

K372

T375

D376

Abb.5.36: Vergrößerung der Struktur des Proteins sucC mit möglichen Koordinationsstellen

Eine mögliche Wechselwirkung des Metallfragmentes mit den Aminosäuren K372, T375 und D376 wird aus der Abbildung ersichtlich. Die Einbindung der Aminosäure K372 in den Metallproteinkomplex wird durch das Vorhandensein des Rutheniumisotopenpatterns für das Ion b3+ bestätigt (siehe Abb. 5.5).

Proteintargets in Escherichia coli

105

Weitere koordinierte Proteine (siehe Tabelle 5.1) aus dem Rutheniumkomplex E. coli Ansatz sind die Helikasen. Das sind Enzyme, welche die Doppelstränge der DNA oder RNA trennen. Sie sind für viele zelluläre Prozesse notwendig, wie z. B. Replikation, Reparatur oder Transkription. Eine schematische Darstellung der Funktionsweise ist in Abbildung 5.37 gezeigt. In der Abbildung sind die allgemeinen Vorgänge bei der Replikation gezeigt. An der Reparatur von Schäden der DNA beteiligt sind aus E. coli nur zwei Helikasen: dinG und uvrD. Von dem eingesetzten Rutheniumkomplex koordiniert wurde aus dieser Analyse die Helikase dinG massenspektrometrisch identifiziert. Eine der identifizierten Helikasen ist die RNA-Helikase hrpA, sie gehört wie die ermittelte Helikase dbpA der DEAD Helikasenfamilie an, wobei ihre Funktionen nicht vollständig geklärt sind. Es wird diskutiert, dass die hrpA Helikase an der Stressregulierung teilnimmt. Die DNA-Helikase traI1 wurde ebenfalls als mögliches von dem Rutheniumkomplex koordiniertes Protein identifiziert. Aus den koordinierten Aminosäuren der in Tabelle 5.1 aufgelisteten Proteine wird deutlich, dass die Carboxygruppe aus der Asparaginsäure, die Hydroxygruppen aus Serin und Threonin und die Stickstoffe der Aminogruppen aus Lysin häufige Targets für den [(η6-pCymol)RuCl2(DMSO)]-Komplex im neutralen pH-Bereich darstellen. Die fehlende Koordination der weichen Aminosäuren Methionin oder Histidin kann einerseits durch die kinetische Benachteiligung bedingt sein, andererseits aber schlechtere Zugänglichkeit im Protein bedeuten. Eine zusätzliche Erklärung kann der Ladungsausgleich liefern. Die Koordination der Aminosäuren D, S oder T reduziert die Anfangsladung des [(η6-pCymol)Ru]2+-Fragmentes zu 1+. Bei der Bindung der Aminosäuren M oder H wird die Ladung von 2+ nicht verändert. Diese Tatsache könnte eine erfolgreiche SEQUEST- Analyse wegen zusätzlicher MS/MS Fragmentierung und einer daraus resultierenden zu kleinen Zahl an b+- und y+-Ionen einschränken.

5.4.2. Wechselwirkungen von Platinkomplexen mit E. coli-Zellen Die Tabelle 5.6 gibt alle vom [Pt(dien)]2+-Fragment koordinierten Proteine des Bakteriums an. Alle MS/MS-Spektren der sieben Proteine wurden auf das Vorhandensein des Platinpatterns geprüft. Die SEQUEST-Parameter der modifizierten Proteine erfüllen alle die Auswahlkriterien bezüglich der XCorr-, der Sp-, der ∆Cn-Werte und auch der Ionenübereinstimmung. Der für die Analysen gewählte pH-Wert von etwa 7 verursacht eine Deprotonierung der Carboxylatgruppen in Asparagin- und Glutaminsäuren. Die Seitenketten dieser Aminosäuren

Proteintargets in Escherichia coli

106

und die Thioether-Schwefelatome aus Methionin stellen kinetisch bevorzugte Bindungsstellen für Cisplatin dar [99, 54]. Ebenso sind die Hydroxysauerstoffe der Serine, Threonine und Tyrosine kinetisch attraktive Koordinationsstellen für die Metallfragmente. Obwohl der Metallkomplex [Pt(dien)Cl]Cl keine zytotoxische Wirkung aufweist, eignet er sich als Modellsystem für die Untersuchungen des Bindungsverhaltens von Platinkomplexen [99]. Das [(dien)Pt]2+-Fragment mit dem tridentaten Liganden (dien) kann nur monodentat koordiniert werden, so dass die erste Bindungsstufe an Proteine und DNA für mehrfach chelatisierte Komplexe wie Cisplatin mit Hilfe von [Pt(dien)(H2O)]2+ untersucht werden kann. [Pt(dien)(H2O)]2+ mit einem pKa von 5,87 und das bei höheren pH-Werten überwiegende [Pt(dien)(OH)]+ reagieren schnell mit Peptiden, wie FRÖHLING und SHELDRICK zeigen konnten [46, 56]. Dabei bildete sich der κS-Komplex aus dem [Pt(dien)]2+-Fragment und HHisMet-OH bei 37°C und pH = 6,5 bereits zu etwa 50% nach 30 min Reaktionszeit. Wie ebenfalls

in

früheren

Studien

gezeigt

wurde,

wandert

das

[Pt(dien)]2+-Fragment

intramolekular vom Thioether-Schwefel in [Pt(dien)(H-Met-OH-κS)]2+ zum terminalen Stickstoff in [Pt(dien)(H-Met-OH-κN)]2+ [117]. Eine langsame intermolekulare κS zu κN Isomerisierung wurde auch bei weiteren Migrationsuntersuchungen für M-koordinierte [Pt(dien)]2+-Komplexe beobachtet [118]. Diese zeigten, dass Pt(II)-Fragmente intramolekular vom Schwefelatom einer Aminosäure zum N7-Atom einer Nukleobase [119] bzw. zum Imidazol-N-Atom in H-His-Met-OH [46] wandern können. So kann die Vermutung aufgestellt werden, dass die identifizierten K- und H-Bindungsstellen des [Pt(dien)]2+Fragmentes in E. coli möglicherweise von einer derartigen intramolekularen Migration von einer Schwefelbindung in den Peptiden stammen könnten, wenn dies wie bei M1 in Thioredoxin in der unmittelbaren Nachbarschaft zu einem K- oder H-Rest liegt. Aus der Analyse nach der Umsetzung des [Pt(dien)]2+-Komplexes mit dem Darmbakterium wurden sieben koordinierte Proteintargets identifiziert (siehe Tabelle 5.6). Davon können drei (rl7, eftU und dnaK) der Proteine in hohen Konzentrationen während des Wachstums in einer Zelle vorgefunden werden [120]. Die Proteine rl7 und eftU sind an der Biosynthese beteiligt. Das 69 kDa Protein dnaK (chaperone protein) ist am Ausgleich des osmotischen Schocks beteiligt [92]. Eine für die Zellteilung und das Wachstum wichtige Aufgabe des Proteins ist, dass es in die DNA-Replikation eingebunden ist. Bei den restlichen in Tabelle 5.6 aufgelisteten Proteinen finden sich ebenfalls die kinetisch bevorzugten Aminosäuren Methionin, Serin und Glutaminsäure als Bindungsstellen. Diese Proteine (aldB, ssb und rbsA) werden von der Zelle unter Stressbesingungen überproduziert [92], was ersichtlich bei einer Behandlung des Bakteriums mit dem Metallkomplex der Fall ist. Das Protein yicC, welches

Proteintargets in Escherichia coli

107

auch mit dem Platinfragment koordiniert detektiert wurde, ist für das Überleben der E. coliZellen in stationären Kulturen und Wachstum unter speziellen Bedingungen erforderlich [121]. Besonderer Aufmerksamkeit bedarf aus der Liste in Tabelle 5.6 das Protein ssb. Es ist wie oben erwähnt an der DNA- Replikation beteiligt. Es hat die Aufgabe die während der Replikation entstandenen Gabeln auseinander zu halten. Die folgende schematische Darstellung soll dies verdeutlichen.

Abb.5.37: Schematische Darstellung der DNA-Replikation [122]

Die DNA-Helikase bewegt sich in 5'-3'-Richtung entlang des Stranges, an den sie gebunden ist und entwindet die Doppelhelix unter Verbrauch von ATP. Die entstehenden EinzelstrangBereiche werden durch Einzelstrang-bindende-Proteine (ssb-Proteine) abgedeckt. Diese binden die DNA im Bereich der Aminosäuren W55-F61. Eine Koordination des Platinfragmentes an dieses Protein würde eine strukturelle Veränderung und damit Funktionsbeeinflussung bis zur Inaktivierung mit sich führen. Auch im menschlichen Organismus trägt das ssb-Protein dieselbe Rolle, so dass seine Koordination eine Störung sowohl im Replikations- als auch im Reparaturmechanismus einer Zelle bedeuten würde. Für die Analyse des Bindungsverhaltens von Cisplatin an die Proteine des Bakteriums wurde eine Reaktionszeit von drei Stunden gewählt. Wie aus der Tabelle 5.10 ersichtlich, wurde für diesen Ansatz eine Gesamtzahl von 31 mit einem Cisplatinfragment koordinierter Proteine identifiziert. Dabei sind sieben Proteine DNA-und RNA-bindend (uvrD, top1, finQ, mutS, dbpA, rep5, intD und rs6) und vier stressregulierend (ch60, aldA, rpoA und ompA) sowie weitere 20 Proteine mit anderen Funktionen. In drei Proteinen wurden die Koordinationen an

Proteintargets in Escherichia coli

108

die thermodynamisch bevorzugten Aminosäuren Histidin und Cystein (H51 in yciA, H7 in thiO und C689 in top1) begründet in der längeren Inkubationszeit beobachtet. Im Vergleich zu den bisherigen Studien, in denen Cisplatin mit einzelnen Proteinen inkubiert und auf Bindungsstellen analysiert wurde, kann man eine Bestätigung finden, dass die Koordination an die thermodynamisch bevorzugten Seitenketten der Aminosäuren und H mit längerer Inkubationszeit an Bedeutung gewinnen. So wurden im Protein Ubiquitin von zwei Gruppen das Methionin M1 und Histidin H68 als Pt(II)-Koordinationsstelle unter Verwendung der NMR-Spektroskopie und massenspektrometrisch mit der „top-down“Methode charakterisiert [65, 67]. Dabei wurden von den Arbeitsgruppen Reaktionszeiten zwischen einem und sechs Tagen bei 37°C gewählt. In Abbildung 5.38 ist die kristallographische Darstellung des Proteins mit den von Cisplatin koordinierten Aminosäuren zu sehen [67].

Abb.5.38: Kristallstruktur des Proteins Ubiquitin mit M1 und H68 [67]

Die Bildung eines Chelatringes zwischen der Aminosäure Methionin M1 des Proteins und der terminalen Aminogruppe würde die Koordination stabilisieren. Im Zusammenhang mit Cisplatin oder anderen Metallkomplexen werden in der Krebstherapie unterschiedliche

Proteine

diskutiert.

Eine

graphische

Darstellung

des

/Wirkmechanismus von Cisplatin nach LIPPERT ist in Abbildung 5.39 zu sehen.

Bindungs-

Proteintargets in Escherichia coli

109

Abb.5.39: Auswirkungen der Cisplatin-DNA-Addukte auf einige Proteine [123]

Wie aus der Abbildung 5.39 erkennbar sind mehrere Proteingruppen an den Mechanismen beteiligt. So sind die high-mobility-group Proteine (HMG) bei der Reparatur der beispielhaft durch die Koordination eines Metallfragmentes veränderten DNA wirksam, können aber ebenso eine Reparatur verhindern. In der Diskussion steht auch die Verursachung der Apoptose durch diese Proteinreaktionen [124]. Bevorzugt binden die HMG-Proteine an gestörte oder geknickte DNA, wie z. B. durch eine Bindung an Cisplatin verursacht. Die Struktur eines Cisplatin-DNA-Adduktes mit einem High-mobility-group-Protein nach OHNDORF ist in Abb. 5.40 dargestellt.

Proteintargets in Escherichia coli

110

Abb.5.40: Struktur der an die DNA gebundenen HMG-Proteine [124]

Durch die Bindung der Proteine wird eine Reparatur der betroffenen DNA verhindert. So wirkt Cisplatin besonders effektiv bei Tumoren, in denen eine Überexpression der Proteine vorliegt, wie z. B. Hoden- oder Brustkrebs [125] Eine Inhibition der Replikation beschädigter DNA wird durch einen Kontrollmechanismus gewährleistet, in welchem das Genregulatorprotein p53 eine Rolle spielt. Es aktiviert die Transkription eines Gens, welches letztendlich der beschädigten DNA bei ihrer Reparatur verhilft. Bei Fehlen oder einem Defekt von p53 führt die ungehemmte Replikation der DNA zu einer hohen Mutationsrate und zur Bildung von Zellen, die zu Krebs neigen. Bei etwa der Hälfte aller Krebserkrankungen beim Menschen finden sich Mutationen im p53-Gen [116]. Eine zentrale Rolle in der Cisplatindiskussion stellt die Gruppe der MMR-Proteine (Mismatch-Reparatur) dar. Die Bedeutung dieser Proteine beim Menschen wurde erkannt, als entdeckt wurde, dass eine vererbte Veranlagung für bestimmte Krebsarten, z. B. bestimmte Dickdarmkrebsformen, von einer Mutation im Gen für eines der Mismatch-ReparaturProteine verursacht wird. Da die meisten Krebsarten aus Zellen entstehen, in denen sich viele Mutationen anhäufen, besteht für eine Zelle mit defekter Mismatch-Reparatur-Funktion ein großes Risiko zu einer Krebszelle zu entarten. Die Reparaturproteine korrigieren Fehler, die bei

der

DNA-Replikation

entstehen.

Die

durch

die

Fehlpaarung

erzeugte

Geometrieverzerrung der Doppelhelix wird von den Proteinen erkannt und behoben. Eine DNA-Polymerase kann die entstandene Lücke in der Helix auffüllen und eine DNA-Ligase schließt diese (siehe Abbildung 5.37).

Proteintargets in Escherichia coli

111

In E. coli ist das Protein mutS eines der Proteine aus der MMR-Gruppe, welche für eine schnelle Fehlpaarungskorrektur verantwortlich sind. Die Struktur des Proteins mit einem DNA-Fragment ist in der Abb.5.41 dargestellt.

Abb.5.41 Struktur des mutS-Proteins mit DNA und ADP-Region (rot) [106]

Das asymmetrisch erscheinende Dimer des Proteins „umfasst“ die DNA (in der Abbildung 5.41 oben, rot dargestellt). Unten ist in der Struktur (Abb.5.41, ebenfalls rot) des mutSProteins das gebundene ADP-Molekül zu sehen.

Bei der Umsetzung des Darmbakteriums mit Cisplatin wurde das Protein mutS, mit dem Fragment [(NH3)2PtCl]+ modifiziert. Die koordinierte Aminosäure Methionin 609 befindet sich in der ADP-Region. Durch diese Bindung wird einerseits die Konformation des Proteins geändert und andererseits die Hydrolyse von ATP beeinflusst. Eine indirekte Deaktivierung dieses Proteins würde eine Unterbrechung oder Verhinderung der Reparatur von fehlerhafter/geschädigter DNA bedeuten. Könnte ein zytotoxischer Metallkomplex das mutS Protein spezifisch koordinieren, würde die mutierte DNA nicht repariert werden und die Zelle nicht überleben. Auch würde das Protein nicht agieren um den Fehler der DNA zu korrigieren, welcher durch die Cisplatinbindung und damit Verkrümmung entstanden ist. Ein weiteres Protein, welches in den Replikationsmechanismus der Zellen involviert ist, wurde ebenfalls mit der Cisplatinmodifikation beschrieben. Die DNA-Helikase uvrD gehört zu einer der in Abbildung 5.34 dargestellten Gruppe der NER-Proteine (nucleotide excision repair). Eine Helikase nutzt in der Zelle die Energie aus der Hydrolyse von ATP, um sich auf

Proteintargets in Escherichia coli

112

der DNA zu bewegen und sie zu entwinden. Die uvrD-Helikase aus E. coli wird in der Literatur im Zusammenhang mit dem MMR-Mechanismus diskutiert. Dabei entwindet uvrD die DNA, nachdem mutS, mutL und mutH den beschädigten oder fehlerhaften Strang repariert haben. Weitere Proteine, welche z. B. in die Replikation, Transkription und Transkription der DNA eingebunden sind, sind die Topoisomerasen. Es gibt drei Topoisomerasen, mit unterschiedlichen Funktionen. Die Topoisomerase 1, die wie die Topoisomerase 3 energieunabhängig Einzelstrangbrüche verurscht, wurde bei der MudPIT-Analyse des Bakteriums E. coli von einem Cisplatinfragment an der thermodynamisch bevorzugten Aminosäure Cystein koordiniert. Das Protein Thioredoxin 1 wurde in der MudPIT-Analyse an der Aminosäure H7 mit Cisplatin koordiniert identifiziert. Die Thioredoxin-Reduktase, welche das Thioredoxin oxidieren

und

reduzieren

kann,

reguliert

eine

Vielzahl

von

Rezeptoren

und

Transkriptionsfaktoren. In einer Studie mit dem [(bpy)Pt]2+-Komplex wurden mittels MALDI-TOF-MS diese Bindungsstellen aus einem 1:10 Ansatz identifiziert [126]. Die Massenspektren des reinen Proteins und des Gemisches mit dem [(bpy)Pt(en)]Cl2-Komplex sind in der Abbildung 5.42 dargestellt.

Abb.5.42: MALDI-TOF MS-Spektrum des T. thermophilus HB8 Thioredoxins (A) und nach der Umsetzung mit Pt(bpy)(en)2+ (B) [126]

Eine Zuordnung der Bindungsstelle erfolgte in dieser Studie nach weiterer Fragmentierung und Hinzuziehen der UV/Vis Spektroskopie. Im Vergleich zum humanen Thioredoxinsystem

Proteintargets in Escherichia coli

113

wird die Aktivität des TRX-TRXR-Systems in E. coli nur unwesentlich von Cisplatin beeinflusst [127]. Aus den ermittelten Proteintargets für Cisplatin in E. coli lässt sich über die Spektrenzahl (ni) des jeweiligen Proteins feststellen, dass von den niedrig abundanten Proteinen in den Zellen mindestens 10% koordiniert vorliegen müssen. Besonders die Modifikation der Proteine mutS, uvrD oder top 1 mit Cisplatin würde somit die DNA-Reparatur-Funktion gestört werden. In der folgenden Tabelle ist eine grobe Übersicht der Cisplatin Proteintargets gegenüber der erwarteten Zahl an Peptiden in nicht koordinierter Form Oi dargestellt. Tab.5.21:Konzentrationsbereiche für Cisplatin Proteintargets Konzentrationsbereich Hohe Abundanz 4 (~10 -105) 50 ≥ ni/Oi > 5.0 Mittlere Abundanz (~103-104) 5.0 ≥ ni/Oi > 0,5 Niedrige Abundanz (~102-10+) ni/Oi < 0,5 Nicht beobachtet (~102-103)

Protein (ni/Oi) g3p1 (485/29,7) eftU (324/34,4) mdH (145/22,5) cisY (123/29,0) enO (91/ 34,7) rs6 (23/11,4) artI (8/22,6) top1 (4/80,7) mutS, aldA, acrD, ceaN, finQ, dceA, mdtA, ebgC,

rpoA (167/27,5) pthp (38/6,68) ch60 (224/45,3) ompA (39/25,8) speA (23/36,4) thiO (17) uvrD (2/58,3) intD, yciA, mukE, rep5 his2, fimA1, dbpA, tdcE,

Da für Proteine höherer oder mittlerer Abundanz Addukte mit 1% oder weniger Kopien massenspektrometrisch detektierbar sind, resultieren sicherlich diese Proteintargets aus Wechselwirkungen von O- und S-Donoratomen an den Oberflächen der Proteine [131].

Serumproteine

114

6. Serumproteine Proteine stellen für Cisplatin nach der Infusion den primären Reaktionspartner dar. Studien zu Interaktionen von Cisplatin mit Proteinen ergaben folgende prozentuale Bindungsanteile für Cisplatin an Serumproteine: 72,3% ± 6,5% für Albumin, 39,5% ± 2,5% für α1-acidGlycoprotein und 49,2% ± 1,9% für γ-Globulin [52, 132]. In der Abbildung 6.1 ist ein silbergefärbtes Gel-Elektropherogram der Serumproteine dargestellt.

Abb.6.1: Silbergefärbtes Gel-Elektropherogram der Serumproteine [133]

Es ist eindeutig aus der 2D-PAGE-Untersuchung erkennbar, dass das Serumalbumin unter den Serumproteinen in beträchtlicher Häufigkeit vorkommt. Daneben sind unter anderem die Ig-Faktoren,

Fibrinogene,

Haptoglobine,

Serotransferrin,

Apolipoproteine

und

Serumproteine

115

Macroglobuline vertreten. Diese Proteine stellen insgesamt 90 % der Serumproteine dar, wie ANDERSON gezeigt hatte (siehe Abbildung).

Abb.6.2: Verteilung der abundanten Serumproteine [134]

Im Rahmen dieser Arbeit sollen mit Hilfe der mit Flüssigchromatographie kombinierten Tandem-Massenspektrometrie die Adduktbildung zwischen Serumproteinen und Cisplatin analysiert werden. Dabei werden Proteintargets des Metallkomplexes aus zwei unabhängigen Proben von Blutserum sowie den wichtigsten Serumproteinen gesucht bzw. aus NMRUntersuchungen bekannte Bindungsstellen bestätigt. Das Antitumormittel Cisplatin wird in der Krebstherapie intravenös verabreicht. Der größte Teil des Metallkomplexes erreicht (wie in Kapitel 1 und 3 erwähnt) nicht die DNA, sondern bindet vor dem Erreichen der DNA an Serumproteine. Bisher konnte die Bildung von Cisplatin-Addukten durch die drei abundanten Serumproteine Albumin, Serotransferrin und Alpha-2-Macroglobulin massenspektrometrisch bestätigt werden [90], jedoch konnten bei dieser Studie für die Proteine keine Angaben über die Koordinationsstellen getroffen werden. Aus ESI-MS/MS Untersuchungen gelang es allerdings DYSON et al. Threonin T457 als Cisplatinbindungsstelle in Serotransferrin aus einem 1:10 (Cisplatin:Serotransferrin)-Gemisch nach 15 oder 30 min Inkubation bei 20°C und nach vorangegangenem Trypsinverdau zu identifizieren. Für die MudPIT-Analysen wurden die tryptisch gespaltenen Proteinmischungen aus den Blutserumproben bzw. aus den einzelnen Serumproteinen Albumin, Serotransferrin, Apolipoprotein A1, Alpha-1-Antitrypsin und Alpha-2-Macroglobulin auf die SCX-Säule geladen und unter Verwendung von 12 chromatographischen Salzgradientenstufen massenspektrometrisch analysiert. Die Gemische der jeweiligen Proteinproben sind nach der

Serumproteine

116

Vorbereitung auf eine eindimensionale RP-C18- Säule geladen und mit einem linearen Acetonitril/Wasser/TFA-Gradienten über 180 min chromatographisch getrennt und ins Finnigan LTQ Massenspektrometer eingeführt worden. Nach der Messung werden die aufgenommenen ESI-MS/MS-Spektren unter Verwendung des SEQUEST- Algorithmus mit den in Datenbanken eingetragenen Peptidspektren aus humanen Proteinen verglichen. Die SEQUEST- Datenbanksuche beinhaltete die folgenden potentiellen platinierten Aminosäurereste: C, D, E, H, K, M, S, T und Y. Die Massen dieser Reste wurden nach den vier Massen 193, 210, 227 und 263 für die Cisplatinfragmente [195Pt]2+, [(NH3)195Pt]2+, [(NH3)2195Pt]2+ und [(NH3)2195PtCl]+ entsprechend modifiziert. Für den Ladungsausgleich wurden Protonenverluste bei den einzelnen Fragmenten berücksichtigt (ein Proton bei [(NH3)2195PtCl]+, bei den drei restlichen oben genannten Cisplatinfragmenten zwei Protonen). Es wurden bei der Datenbanksuche folgende Kriterien bezüglich der SEQUEST- Parameter verwendet: XCorr-Wert für einfach geladene XCorr ≥ 1,8, für zweifach XCorr ≥ 2,5 und für dreifach geladene Moleküle XCorr ≥ 3,5; Sp-Werte ≥ 500; Ionenzuordnung ≥ 30%; ∆CnWerte ≥ 0,1; RSp-Werte ≤ 6 und ∆m ± 2,5. Nach dem Erstellen einer ersten Liste der Peptidsequenzen, die diese Bedingungen erfüllen, wurden die einzelnen MS/MS-Spektren nach den folgenden Kriterien kritisch überprüft, um false-positive Zuordnungen zu vermeiden: (a) Vorhandensein einer adäquaten Zahl von platinierten b+- und y+-Ionen (b) Vorliegen vom charakteristischen Isotopenmuster in einer signifikanten Zahl der als platiniert zugeordneten b+- und y+-Ionen (c) Vorliegen einer ausreichenden Zahl von b+- und y+-Ionen im Messbereich m/z > 1000, welche relative Intensitäten aufweisen, die sich klar vom Untergrundrauschen unterscheiden. Nach dem Entfernen von Einträgen, die diese Kriterien nicht erfüllen, wurden die in den nachfolgenden Unterkapiteln erläuterten Listen von Proteintargets erhalten. Es ist davon auszugehen, dass in mehreren Fällen tatsächliche Proteintargets auf Grund von false-negative Bewertungen aus der ursprünglichen Liste entfernt wurden. Aus den Analysen der einzelnen Proteine mit Cisplatin werden ausschließlich Sequenzen aufgeführt, deren XCorr-Werte ≥ 2,4 für zweifach geladene und XCorr ≥ 3,3 für dreifach geladene Moleküle betragen. Außerdem müssen die Sp-Werte ≥ 500, ∆Cn-Werte ≥ 0,1, RSpWerte ≤ 5, ∆m ± 2,5 betragen und die Ionenzuordnung mindestens 30 % ergeben. Die Analysen der Ansätze aus Cisplatin und Serumproteinen wurden nach unterschiedlichen

Serumproteine

117

Inkubationszeiten (3h, 168h) und z. T. mit drei- oder fünffachen Überschüssen an Metallkomplex durchgeführt.

6.1. Cisplatinaddukte des Serumalbumins

6.1.1. Blutserumproben Aus der MudPIT-Analyse der Blutserumproben konnten zahlreiche Cisplatin-Protein-Addukte detektiert werden. Im Folgenden wird zunächst das Serumalbumin behandelt und mit den Messungen des einzelnen Proteins mit Cisplatin verglichen. Mit diesem abundanten Protein wurden mehrere Reaktionen mit Cisplatin angesetzt. Um die Ausbildung unterschiedlicher Addukte zu ermöglichen, wurden die Reaktionszeiten und Verhältnisse der Ansätze variiert. Mit 3h Inkubationszeit bei 37 °C wurden Reaktionen im Verhältnis 1:1, 1:3 und 1:5 (Albumin:Cisplatin) untersucht. Eine Inkubationszeit von 168h bei 37 °C wurde für das Verhältnis 1:5 gewählt. Die Blutserumanalyse für die erste unabhängige Probe ergab eine Liste von modifizierten Peptiden aus Serumalbumin, die in der untenstehenden Tabelle aufgeführt sind.

Tab.6.1: Proteintargets von Cisplatin in Serumalbumin aus der MudPIT-Analyse der ersten Blutserumprobe Peptid

Bindungsstelle

z XCorr ∆Cn

K.ALVLIAFAQYLQQCPFEDH$V.K C34/E37/D38/H39 2 K.DVFLGM$FLYEYA.R 2 D324/M329

Sp

RSp Ionen

4,20 3,03

0,25 0,34

1165,1 585,2

3 1

18/38 14/22

K.DVFLGM$FLYEYAR.R K.VFD$EFKPLVEEPQNLIK.Q K.AVM$DDFAAFVE.K

1 D324/M329 D375/E376/K378 2 M548/D549/D550 2

4,10 4,06 2,97

0,24 0,12 0,18

1018,4 817,7 674,2

6 1 1

21/48 19/32 14/20

F.DE~FKPLVEEPQNLIK.Q

D375/E376/K378 2

4,66

0,01

771,5

1

19/28

K.AVM~DDFAAFVE.K

M548/D549/D550 2

2,85

0.12

542,3

6

12/20

K.ALVLIAFAQYLQQC#PFED.H C34/E37/D38/H39 3 3,95 0.17 1059,5 R.H#PYFYAPELLFF.A 2 3,02 0,35 685,7 H146/Y148 R.H#PYFYAPELLFFA.K 0,40 1102,1 H146/Y148/Y150 2 4,13 R.RH#PYFYAPELLFFA.K 0,29 606,6 H146/Y148/Y150 2 3,20 P.Y#FYAPELLFFAKR.Y 2 2,82 0,17 963,2 Y148 2+ 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt] , # = [(NH3)2PtCl]+

3 1 1 1 1

23/68 15/22 19/24 16/26 18/24

Serumproteine

118

Unter den Bindungsstellen sind, falls mehrere potentielle Aminosäurereste vorhanden sind, die wahrscheinlich bevorzugten Bindungsstellen aus der angegebenen Peptidsequenz fett gedruckt. Die angegebenen ∆Cn-Werte beziehen sich auf die nächste, sich von der ersten unterscheidende Peptidsequenz. Hierbei werden Eintragungen für gleiche Peptidsequenz aber mit anderen Bindungsstellen (z. B. C34, E37 oder D38 statt H39 in der ersten Sequenz der Tabelle) nicht berücksichtigt. Es wurden insgesamt 12 Peptidsequenzen aus Serumalbumin identifiziert, wobei fünf mit dem [(NH3)Pt]2+-, zwei von dem [(NH3)2Pt]2+- und fünf von [(NH3)2PtCl]+-Fragment koordiniert wurden. Der Tabelle kann außerdem entnommen werden, dass zweimal C34/E37/D38/H39, viermal der Bereich/H146/Y148/Y150, zweimal M329/D324, zweimal D375/E376/K378 und zweimal M548/D549/D550 platiniert wurden. Nachstehend ist die Liste der modifizierten Proteintargets aus Serumalbumin mit Cisplatin aus der MudPIT-Analyse mit der zweiten unabhängigen Blutserumprobe dargestellt.

Tab.6.2: Proteintargets von Cisplatin in Serumalbumin aus der MudPIT-Analyse der zweiten Blutserumprobe Peptid

Bindungsstelle

z XCorr ∆Cn

K.VFD$EFKPLVEEPQNLIK.Q D375/E376 2 K.ALVLIAFAQYLQQCPFED$HV.K C34/E37/D38/H39 2

Sp

RSp Ionen

3,88 4,31

0,12 525,1 0,18 970,6

1 1

16/32 16/38

3,64

0,26 556,3

1

16/28

-.DE#FKPLVEEPQNLIK.D375/E376 3 3,77 0,11 712,3 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

4

26/56

F.DE~FKPLVEEPQNLIK.Q

D375/E376

2

Insgesamt sind vier Peptidsequenzen in der zweiten Tabelle aufgelistet. Davon wurden nach den besten XCorr-Werten aus den jeweiligen Sequenzen dreimal D375/E376 und einmal C34/E37/D38/H39 koordiniert. Aus dem Vergleich der Tabellen 6.1 und 6.2 lässt sich erkennen, dass in beiden Blutserumproben die Bindungsstellen C34/E37/D38/H39 und D375/E376 identifiziert wurden.

Die

restlichen

Koordinationsstellen

D324/M329,

M548/D549/D550

und

H146/Y148/Y150 sind aus der ersten Blutserumprobe identifiziert worden und müssen deswegen in den Einzelproben validiert werden. Die in den Tabellen 6.1 und 6.2 aufgelisteten Peptidsequenzen wurden bezüglich ihrer MS/MS-Spektren geprüft und bei gleichen Koordinationsstellen miteinander verglichen, um

Serumproteine

119

falsche Zuordnungen zu vermeiden bzw. um im Falle von benachbarten möglichen Bindungsstellen, falls möglich, die wahrscheinlichere Position zu ermitteln. Dazu wird im Folgenden eine Auswahl an Beispielen mit den unterschiedlichen Platinfragmenten erläutert. Zu der mit [(NH3)Pt]2+ in der ersten Tabelle aufgeführten koordinierten Sequenz [373VFD$EFKPLVEEPQNLIK389]2+ ist in der folgenden Abbildung 6.3 das zugehörige MS/MS-Spektrum dargestellt. Die gleiche Sequenz konnte mit einem XCorr-Wert von 3,88 (statt 4,06 hier) auch in der zweiten Blutserumprobe detektiert werden.

Abb.6.3: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [VFD$EFKPLVEEPQNLIK]2+ in Serumalbumin aus der ersten Blutserumprobe In dem MS/MS-Spektrum sind von 32 möglichen Peptidionen 19 zugeordnet. Alle acht b+Ionen liegen platiniert vor, bei den y+-Ionen ist keines der 11 dargestellten Ionen platiniert. Das an Asparaginsäure 375 gebundene [(NH3)Pt]2+-Fragment ruft diese Verteilung bei den einzelnen Ionen hervor. In der Abbildung 6.3 wird das charakteristische Platinmuster für das Ion b10+ gezeigt. In der Tabelle 6.3 sind weitere potentielle Sequenzen, welche der Masse m/z = 2256 (mit ∆m ± 2,5) entsprechen mit ihren SEQUEST-Werten dargestellt. Es sind zehn

Serumproteine

120

Peptidsequenzen nach abnehmenden XCorr-Werten aufgelistet, deren theoretische MS/MSSpektren teilweise Übereinstimmung mit dem experimentellen Spektrum aufweisen. Tab.6.3: SEQUEST-Parameter von [VFD$EFKPLVEEPQNLIK]2+ im Vergleich zu den anderen potentiellen Peptidsequenzen in Serumalbumin aus der ersten Blutserumprobe Sequenz K.VFD$EFKPLVEEPQNLIK.Q K.VFDEFK$PLVEEPQNLIK.Q K.LPEFAPGEEESGC$SGVVK$.P K.VFDE$FKPLVEEPQNLIK.Q K.LPEFAPGEEE$SGCSGVVK$.P K.VFDEFKPLVE$EPQNLIK.Q M.YVYWTQLNM$FQTLK$.Y K.LPEFAPGEEESGCS$GVVK$.P Q.EKLPMTFQS$C$VITK$.E K.TKQNQILDE$EFQNSPPAS.V

XCorr 4,065 3,592 3,589 3,514 3,494 3,327 3,112 3,083 3,056 3,004

∆Cn 0 0,116 0,117 0,136 0,14 0,182 0,234 0,241 0,248 0,261

Sp 817,7 508,7 316 634 235,3 357,9 252,3 223,5 216,4 268,2

RSp 1 3 21 2 126 7 89 169 196 63

Ionen 19/32 16/32 15/34 17/32 13/34 15/32 12/26 13/34 11/26 13/34

Protein ALBU_HUMAN ALBU_HUMAN DDR2_HUMAN ALBU_HUMAN DDR2_HUMAN ALBU_HUMAN RIB2_HUMAN DDR2_HUMAN THS7A_HUMAN NEIL3_HUMAN

Aus der Auflistung lässt sich erkennen, dass von den 16 Aminosäuren der Peptidsequenz neben D375 weitere zwei Reste (Lysin 378 und Glutaminsäure 376) als Koordinationsstellen für das [(NH3)Pt]2+-Fragment in Frage kommen könnten. Die Modifikationen D375, E376 und K378 des Albumins erfüllen wie aus der Tabelle erkennbar die SEQUEST-Kriterien bezüglich ihrer Sp- und XCorr-Werte. Allerdings weisen beide Sequenzen ∆Cn-Werte größer als 0,1 sowie deutlich niedrigere Sp-Werte auf und können deshalb als weniger wahrscheinlich eingeordnet werden Die Abwesenheit der Ionen yk+ für k ≥ 15 und das Vorhandensein des charakteristischen Platinpatterns bei b3+ stellen klare Hinweise für die Bevorzugung der Koordination der Asparaginsäureseitenkette (D375) dar. Jedoch ist eine Unterscheidung zwischen zwei benachbarten Bindungsstellen anhand eines einzelnen Ions im Bereich 300 < m/z < 800 wegen der Vielzahl mit unterschiedlichen Fragmentionen immer mit Vorsicht zu bewerten. Aus

der

MudPIT-Analyse

der

zweiten

Blutserumprobe

konnten

fünf

platinierte

Peptidsequenzen detektiert werden. Ein Beispiel eines mit dem [(NH3)2Pt]2+-Fragment koordinierten Peptids stellt die Sequenz [375DE~FKPLVEEPQNLIK389]2+ dar, welche auch bei der ersten Blutserumprobe detektiert werden konnte. In diesem Fall wird allerdings E376 statt D375 als die wahrscheinlichere Bindungsstelle aufgelistet. Das MS/MS-Spektrum ist in der folgenden Abbildung zu sehen.

Serumproteine

121

Abb.6.4: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [DE~FKPLVEEPQNLIK]2+ in Serumalbumin aus der zweiten Blutserumprobe Die Sequenz könnte insgesamt 28 b+- und y+-Ionen bei einer vollständigen Fragmentierung bilden, davon sind 13 im oberen Spektrum und 16 in der Tabelle 6.4 von SEQUEST zugeordnet. Bei den dargestellten b+-Ionen sind alle (ab b2+) platiniert, für die y+-Ionen würde das nur für das Ion y14+ gelten, welches jedoch nicht detektiert wurde. Es sind die y+-Ionen y3+, y6+ bis y9+, y11+ und y12+ im oberen Spektrum zugeordnet. Die nachstehende Tabelle zeigt drei weitere Sequenzen aus der SEQUEST-Liste, welche der Masse m/z = 2027 (mit ∆m ± 2,5) entsprechen. Tab.6.4: SEQUEST-Parameter von [DE~FKPLVEEPQNLIK]2+ im Vergleich zu den anderen potentiellen Peptidsequenzen in Serumalbumin aus der zweiten Blutserumprobe Sequenz F.DE~FKPLVEEPQNLIK.Q F.D~EFKPLVEEPQNLIK.Q F.DEFK~PLVEEPQNLIK.Q K.E~K~CKNSHLYPLIE.T

XCorr 3,636 3,588 3,13 2,695

∆Cn 0 0,013 0,139 0,259

Sp RSp Ionen Protein 556,3 1 16/28 ALBU_HUMAN 556,3 1 16/28 ALBU_HUMAN 403,2 8 14/28 ALBU_HUMAN 243,2 294 11/24 THS7A_HUMAN

Serumproteine

122

Potentiell können Modifizierungen der Aminosäuren D375 oder K378 in der Peptidsequenz mit dem Cisplatinfragment [(NH3)2Pt]2+ ebenfalls vorliegen. Die vierte Sequenz mit einer zweifachen Koordination weist, wie aus den SEQUEST-Werten erkennbar, nur wenig Übereinstimmung auf und wird nicht weiter diskutiert. Auch K378 kann mit Sp < 500 und ∆Cn > 0,1 als Koordinationsstelle ausgeschlossen werden. Aus den Sp- und ∆Cn-Werten der beiden ersten möglichen Bindungsstellen E376 und D375 wird deutlich, dass eine Entscheidung zu Gunsten einer dieser Stellen anhand der SEQUEST-Parameter nicht möglich ist. Für beide Sequenzen wird die gleiche Zahl von b+- und y+-Ionen zugeordnet. Die zur Unterscheidung zwischen D375 und E376 benötigten y13+- und y14+-Ionen werden nicht beobachtet (s. Abb. 6.4). Ein Vergleich der SEQUEST-Parameter aus Tabelle 6.3 verdeutlicht, dass dort für die Koordination von E376 der ∆Cn-Wert mit 0,116 auf eine wesentlich schlechtere Übereinstimmung hindeutet, als die Zuordnung von D375. In der folgenden Abbildung sind die Seitenketten beider Aminosäuren in dem Ausschnitt aus der Proteinstruktur gezeigt.

D375

E376

Abb.6.5: Vergrößerter Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serumalbumins [PBD ID: 1n5uA [135])

Beide Seitenketten sind in einer Helix lokalisiert. Es ist dabei auch erkennbar, dass D375 an der Oberfläche des Proteins wesentlich besser zugänglich ist. Beim Betrachten der in den Tabellen 6.1 und 6.2 aufgelisteten Peptidsequenzen mit D375/E376 Koordinationen aus den Analysen beider Blutserumproben und deren zugehöriger MS/MS-Spektren sowie

Serumproteine

123

SEQUEST-Tabellen konnte festgestellt werden, dass D375 die bevorzugte Bindungsstelle für Cisplatin darstellt. Ein weiteres Beispiel aus der MudPIT-Analyse der ersten Blutserumprobe bietet das Peptid der Sequenz [546AVM$DDFAAFVE556]2+. Die Koordination dieser Peptidsequenz wurde aus der

ersten

Blutserumprobe

zweimal

beobachtet,

wobei

auch

die

benachbarten

Asparaginsäuren potentielle Bindungsstellen bieten. Das MS/MS-Spektrum der am Methionin 548 mit dem [(NH3)Pt]2+-Rest koordinierten Peptidsequenz ist in Abbildung 6.6 dargestellt.

Abb.6.6: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [AVM$DDFAAFVE]2+ in Serumalbumin aus der ersten Blutserumprobe Das oben dargestellte Spektrum enthält 14 zugeordnete b+- und y+-Ionen, wobei 20 durch eine schrittweise Fragmentierung der Sequenz erhalten werden können. Daneben finden sich zwei b2+- und zwei [bj-NH3]+-Ionen im Spektrum. Entsprechend der Modifizierung von M548 sind die dargestellten Ionen b3+-b10+ platiniert. Die Tabelle 6.5 listet die SEQUEST-Werte aus der

Serumproteine

124

Übereinstimmung mit den theoretischen MS/MS-Spektren für weitere neun Sequenzen mit der Masse m/z = 1425 (∆m ± 2,5) mit abnehmenden XCorr-Werten auf Tab.6.5: SEQUEST-Parameter von [AVM$DDFAAFVE]2+ im Vergleich zu den anderen potentiellen Peptidsequenzen in Serumalbumin aus der ersten Blutserumprobe Sequenz K.AVM$DDFAAFVE.K R.MoxVFD$RGTKVF.V L.YCVFFGC$FTK.K R.MoxVFDRGT$KVF.V H.YTKTSDGLC$VK.L K.AVMD$DFAAFVE.K M.YTEVWNNLGTTK.S K.AVMDD$FAAFVE.K H.ELAEAFQKDFTK.S R.MoxDTD$LETMoxDL.D

XCorr 2,967 2,436 2,423 2,301 2,298 2,268 2,25 2,2 2,195 2,19

∆Cn 0 0,179 0,183 0,224 0,225 0,236 0,241 0,259 0,26 0,262

Sp 674,2 363,7 283,4 322,6 245,8 388,9 320,6 271,9 415,3 331,1

RSp Ionen Protein 1 14/20 ALBU_HUMAN 35 10/18 FANCB_HUMAN 187 9/18 UBP22_HUMAN 85 10/18 FANCB_HUMAN 431 9/20 FRK_HUMAN 23 12/20 ALBU_HUMAN 89 11/22 S35B4_HUMAN 247 10/20 ALBU_HUMAN 12 11/22 CH3L2_HUMAN 72 10/18 U520_HUMAN

Die Peptidsequenz [AVM$DDFAAFVE]2+ des Serumalbumins stellt mit der Bindungsstelle M548 die eindeutig beste Zuordnung in der Tabelle dar, was die deutlich höheren SEQUESTParameter im Vergleich zu den restlichen Sequenzen beweisen. Zwei weitere potentielle Bindungsstellen in dem Proteinausschnitt wären die Aminosäuren D549 und D550, jedoch ist die Übereinstimmung mit dessen theoretischem Spektrum wesentlich schlechter, was in den Werten Sp < 500, RSp > 5 und ∆Cn > 0,1 deutlich wird. Bei der Koordination von D449 oder D550 sollte im MS/MS-Spektrum in Abb. 6.6 das intensive nicht platinierte y8+-Ion nicht zu beobachten sein. Da das Metallpattern nicht für y8+ beobachtet wird und außerdem keine yk+Ionen mit k > 8 vorhanden sind, ist die Koordination der Aminosäure M548 am wahrscheinlichsten. In der ersten Blutserumprobe konnten vier Peptidsequenzen mit den möglichen Bindungsstellen H146, Y148 und/oder Y150 identifiziert werden. Da es sich bei diesen potentiellen Koordinationsstellen um benachbarte Aminosäuren in der Proteinsequenz handelt, wird als Beispiel das MS/MS-Spektrum der vom [(NH3)2PtCl]+-Fragment koordinierten

Peptidsequenz

[148Y#FYAPELLFFAKR160]2+

gezeigt,

das

eine

H146

Koordination ausschließt. Das Proteinstück bindet an der Aminosäure Tyrosin 148 das Cisplatinfragment. Das MS/MS-Spektrum ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Serumproteine

125

Abb.6.7: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [Y#FYAPELLFFAKR]2+ in Serumalbumin aus der ersten Blutserumprobe

Das oben dargestellte MS/MS-Spektrum enthält 15 (18 von SEQUEST zugeordnet) von 24 möglichen Ionen. Davon sind sieben b+- und acht y+-Ionen zugeordnet. Wie aus der koordinierten Sequenz erkennbar, sind alle b+- (b1+-b4+, b8+, b10+ und b12+ im Spektrum dargestellt) aber keine y+-Ionen (y4+, y5+ und y7+ bis y12+) platiniert. Eine Auflistung sonstiger möglicher Peptidsequenzen, welche die Masse m/z = 1929 (mit ∆m ± 2,5) tragen, ist in der Tabelle 6.6 aufgeführt.

Serumproteine

126

Tab.6.6: SEQUEST-Parameter von [Y#FYAPELLFFAKR]2+ im Vergleich zu den anderen potentiellen Peptidsequenzen in Serumalbumin aus der ersten Blutserumprobe Sequenz P.Y#FYAPELLFFAKR.Y L.E#T#T#AYFFMK.P E.VYYFGE#VHM#KK.G E.VYYFGE#VHMK#K.G E.VYYFGE#VHMKK#.G Y.PMPVMoxAYIQD#AQKR.L G.S#RDGGASS#T#GSR.D G.S#RDGGASST#GS#R.D Y.VY#LS#MAYYFSR.D L.ILELKLPPTDAYY#K.L

XCorr 2,824 2,353 2,238 2,217 2,139 2,048 2,024 2 1,985 1,968

∆Cn 0 0,167 0,207 0,215 0,242 0,275 0,283 0,292 0,297 0,303

Sp 963,2 331,4 357,5 357,5 357,5 275,1 272,5 289,7 361,7 320,2

RSp 1 67 45 45 45 197 207 154 42 86

Ionen 18/24 8/16 11/20 11/20 11/20 11/26 11/22 11/22 10/20 10/26

Protein ALBU_HUMAN FMN2_HUMAN KCNF1_HUMAN KCNF1_HUMAN KCNF1_HUMAN MA2A2_HUMAN MINP1_HUMAN MINP1_HUMAN FTMT_HUMAN U5S1_HUMAN

In der Tabelle sind neben der an Y148 koordinierten Peptidsequenz aus Serumalbumin weitere Sequenzen aus sechs verschiedenen Proteinen (fmn2, kcnf1, ma2a2, minp1, ftmT und u5s1) aufgelistet. Beim Betrachten deren SEQUEST-Werte wird jedoch deutlich, dass diese Sequenzen die erforderlichen Kriterien eindeutig nicht erfüllen (für alle Sequenzen gilt Sp < 500, RSp >> 6, ∆Cn > 0,1). Da Übereinstimmungen der theoretischen Spektren mit den beobachteten massenspektrometrischen Fragmentierungen alle nicht zufrieden stellend sind, kann Y148 als Koordinationsstelle zugeordnet werden. Interessant ist hier die Tatsache, dass Y150 nicht als Bindungsstelle in der SEQUEST-Liste vorkommt, d.h. ∆Cn für Y150 muss größer als 0,303 sein. Hierfür ist die eindeutige Zuordnung von b1+, y11+ und y12+ entscheidend.

6.1.2. Serumalbumin:Cisplatin Proben

Für eine Validierung der bei den Blutserumproben erhaltenen Bindungsstellen wurden Ansätze mit den einzelnen Proteinen und dem Zytostatikum nach unterschiedlichen Inkubationszeiten analysiert. Die Untersuchungen dienen auch der Überprüfung der Reproduzierbarkeit der LC/ESI-MS2- bzw. MudPIT-Analysen. Dazu sind die jeweiligen Reaktionslösungen über eine RP-C18-Säule ohne vorherige SCX-Extraktion getrennt und direkt ins gekoppelte Finnigan LTQ Massenspektrometer injiziert worden, um ESI-MS/MSMessungen durchzuführen. Im Folgenden werden die Tabellen der einzelnen Analysen aufgeführt.

Serumproteine

127

Tab.6.7: Koordinierte Peptidsequenzen aus dem 1:1 Ansatz Albumin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Peptid P.Y§FYAPELLFFAK.R Y.FY§APELLFFAK.R

Bindungsstelle Y148/Y150 D375

z XCorr ∆Cn Sp RSp Ionen 2 3,39 0,82 1453,2 1 17/22 2 3,11 0,71 866,9 1 17/20

K.VFD$EFKPLVEEPQNLIK.Q D375 2 V.FD$EFKPLVEEPQNLIK.Q D375 3 Y.FY$APELLFFAK.R Y150 2 R.H$PYFYAPELLFFAK.R H146/Y148/Y150 2 P.Y$FYAPELLFFAK.R Y148/Y150 2 K.DVFLGM$FLYEY.A M329 2 A.VM$DDFAAFVEK.C M548 2

5,35 4,25 3,15 2,88 2,79 2,54 2,47

0,54 0,69 0,53 0,69 0,81 0,65 0,77

924,6 1010,6 1111,5 760,9 791,7 513,2 615,5

1 1 1 1 1 1 1

20/32 29/60 16/20 15/26 16/22 11/20 16/20

F.DE~FKPLVEEPQNLIK.Q E.FAEVSK~LVTDLTK.V K.VFD~EFKPLVEEPQNLIK.Q V.FD~EFKPLVEEPQNLIK.Q

3,85 3,81 3,71 3,59

0,67 0,81 0,65 0,81

949,0 1540,1 1442,7 864,7

1 2 1 1

25/56 18/24 32/64 26/60

F.DE#FKPLVEEPQNLIK.Q D375/E376 2 3,66 0,51 508,0 F.DEFK#PLVEEPQNLIK.Q K378/E376/D375 3 3,48 0,46 910,0 F.Y#APELLFFAK.R Y150 2 2,60 0,77 781,9 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

1 1 1

16/28 24/56 14/18

D375/E376 K233 D375 D375

3 2 3 3

Die Tabelle 6.7 enthält die koordinierten Sequenzen des äquimolaren Systems Cisplatin:Serumalbumin mit den vier möglichen Platinfragmenten. Es wurde sechsmal die Seitenkette des Bereiches H146/Y148/Y150, einmal K233, einmal M329, siebenmal D375/E376/K378 und einmal M548 koordiniert. Von den in den Blutserumproben identifizierten Bindungsstellen (siehe Tabelle 6.1 und 6.2) konnten in dieser Analyse H146/Y148/Y150, M329, D375/E376/K378 und M548 wiederholt identifiziert werden und können somit als charakteristische Koordinationspositionen für Cisplatin eingeordnet werden. Die mögliche Bindungsstelle K233 ist in der äquimolaren Albumin:Cisplatin-Analyse zum ersten Mal bestimmt und muss deswegen bei weiteren Ansätzen validiert werden. Aus dem 1:3 Ansatz Serumalbumin:Cisplatin konnten nach 3h Inkubation bei 37°C die in der Tabelle 6.8 aufgelisteten koordinierten Peptidsequenzen identifiziert werden. In dieser Untersuchung konnten aus dem Bereich C34-H39 des Proteins E37 und C34 als potentielle

Serumproteine

128

Bindungsstellen identifiziert werden. Diese und die weiteren Sequenzen sind in der folgenden Tabelle zu sehen.

Tab.6.8: Koordinierte Peptidsequenzen aus dem 1:3 Ansatz Albumin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Peptid K.VFD$EFKPLVEEPQNLIK.Q

Bindungsstelle D375

z XCorr ∆Cn Sp RSp Ionen 3 3,52 0,58 940,6 1 28/64

K.ALVLIAFAQYLQQCPFE~DHV.K C34/E37/D38/H39 3 K.VFD~EFKPLVEEPQNLIK.Q D375 3 E.FAE~VSKLVTDLTK.V E230 2

4,34 3,36 2,48

0,66 1715,1 0,72 1207,8 0,73 1460,5

2 1 1

34/76 30/64 16/24

K.ALVLIAFAQYLQQC#PFEDHV.K C34/E37/D38 3 3,35 0,65 715,8 P.Y#FYAPELLFFAK.R Y148/Y150 2 3,13 0,65 1931,5 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

1 1

24/76 19/22

Bei diesem Verhältnis sind die in den Blutserumproben gefundenen Bindungsstellen C34/E37/D38/H39, Y148/Y150 und D375 wieder identifiziert worden. Zum ersten Mal wurde die Glutaminsäure E230 als Bindungsstelle zugeordnet und bedarf noch einer Bestätigung. Allerdings wurde die benachbarte Aminosäure K233 als potentielle Koordinationsstelle bei dem 1:1 Ansatz (Tab. 6.7) identifiziert. Die Seitenkette aus dem Bereich C34/E37/D38/H39 ist zweimal, Y148/Y150 einmal, E230 einmal und D375 zweimal als Bindungsstelle zugeordnet worden. Eine weitere Liste (Tabelle 6.9) koordinierter Peptide des Serumproteins wurde aus dem Reaktionsansatz Albumin-Cisplatin im Verhältnis 1:5 nach 3h Inkubation bei 37°C erhalten. Es konnten erneut Bindungsstellen (Y148/Y150, M329, D375) aus den Analysen der Blutserumproben und der Protein:Cisplatin-Gemische bestätigt werden. Diese sind in der untenstehenden Tabelle gezeigt. Zusätzlich wurde ein Ansatz aus Serumalbumin und Cisplatin im Verhältnis 1:5 nach einer Inkubation von 168h bei 37 °C untersucht. Mit der längeren Reaktionszeit sollte sowohl die kinetische Langzeitstabilität der gefundenen Bindungsstellen als auch die mögliche langsame Ausbildung von thermodynamisch bevorzugten Koordinationen (z. B. Histidinreste) geprüft werden. Eine Liste der von einem Cisplatinfragment koordinierten Peptide des Serumalbumins aus diesem Ansatz findet sich ebenfalls in der nachstehenden Tabelle.

Serumproteine

129

Tab.6.9: Koordinierte Peptidsequenzen aus den 1:5 Ansätzen Albumin:Cisplatin nach 3h und nach 168h Inkubation bei 37°C Peptid 1:5 nach 3h bei 37°C K.VFD$EFKPLVEEPQNLIK.Q K.DVFLGM$FLYEYAR.R P.Y$FYAPELLFFAK.R

Bindungsstelle

z

XCorr

D375 M329 Y148/Y150

3 3 2

4,15 4,07 2,64

0,60 1051,4 0,74 1079,7 0,77 1310,7

1 2 1

30/64 23/48 18/22

F.DE~FKPLVEEPQNLIK.Q K.VFD~EFKPLVEEPQNLIK.Q

E376/D375 D375

3 3

3,69 3,57

0,69 1034,7 0,69 994,7

3 1

27/56 28/64

C34/E37/D38/H39 3 C34/E37/D38/H39 2 2 Y150

4,64 4,53 3,74

0,82 1193,9 0,75 523,5 0,87 1497,8

2 1 1

30/72 15/36 17/20

K.ALVLIAFAQYLQQCPFED$H.V C34/E37/D38/H39 2 K.ALVLIAFAQYLQQCPFEDH$VK.L C34/E37/D38/H39 0 K.VFD$EFKPLVEEPQNLIK.Q 2 D375 F.Y$APELLFFAK.R 2 Y150 Y.FY$APELLFFAK.R 2 Y150

4,19 3,80 4,38 3,07 2,82

0,47 722,4 0,63 676,4 0,48 624,7 0,81 1210,4 0,39 601,2

1 1 1 1 1

23/72 26/80 17/32 17/18 14/20

P.Y#FYAPELLFFAK.R 2 3,40 0,75 1797,8 Y148/Y150 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

1

19/22

1:5 nach 168h bei 37°C K.ALVLIAFAQYLQQCPFE§DH.V K.ALVLIAFAQYLQQC§PFEDH.V Y.FY§APELLFFAK.R

∆Cn

Sp

RSp Ionen

Aus diesen Analysen wurden insgesamt 14 Proteinfragmente erhalten. Die Bindungsstellen Y148/Y150, M329 und D375/E376 (in zwei unterschiedlichen Sequenzen) konnten wieder als bevorzugte Stellen nach 3h Reaktion bei 37°C bestätigt werden und können als spezifische Koordinationsstellen für Cisplatin betrachtet werden. Alle nach 168h Inkubation identifizierten Peptidsequenzen weisen die bekannten Bindungsstellen C34/E37/D38/H39 (bei zwei unterschiedlichen Sequenzen), Y148/Y150 (bei drei unterschiedlichen Sequenzen) und D375 auf. Interessant ist die Tatsache, dass die O-Donorreste Y148/Y150 und D375 auch nach 168h Inkubation detektierbar sind. Dieser Befund bestätigt die hohe kinetische Stabilität solcher

Bindungsstellen.

Außerdem

weist

die

Analyse

darauf

hin,

dass

Histidinbindungsstellen für eine Cisplatinkoordination in Serumalbumin offensichtlich weniger begünstigt sind als bisher angenommen. In der unten stehenden Abbildung ist aus der Analyse nach 3h Inkubation das MS/MSSpektrum des Peptids [324DVFLGM$FLYEYAR336]3+, welches mit [(NH3)Pt]2+ koordiniert

Serumproteine

130

wurde, dargestellt. Es muss hier noch geklärt werden, ob die benachbarten Aminosäuren D324 oder Y332 auch als Cisplatinbindungsstellen in Frage kommen.

Abb.6.8: MS/MS-Spektrum von [DVFLGM$FLYEYAR]3+ aus dem 1:5 Ansatz Albumin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C

In dem Spektrum sind von den 48 möglichen (für einfach- und zweifach geladene, von SEQUEST 23 zugeordnet) Ionen des Proteinstückes [324DVFLGM$FLYEYAR336]3+ 10 einfach geladene Ionen zugeordnet worden. Wie aus der Bindungsstelle des [(NH3)Pt]2+Fragmentes in der Sequenz erkennbar, sind die Ionen b6+ bis b12+ und y8+ bis y12+ platiniert. Es sind im oberen Spektrum die Ionen b2+, b7+ und b8+ sowie y1+ bis y7+ dargestellt. Das Nichtvorhandensein von yk+-Ionen mit k > 7 bei der gleichzeitig hohen relativen Intensität des y7+-Ions spricht eindeutig für M329 als Bindungsstelle. Für die Molekülmasse von m/z = 1835 (∆m ± 2,5) sind weitere koordinierte Peptidsequenzen grundsätzlich möglich. Diese Modifikationen sind in der Tabelle 6.10 dargestellt.

Serumproteine

131

Tab.6.10: SEQUEST-Parameter von [DVFLGM$FLYEYAR]3+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen aus dem 1:5 Ansatz Albumin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Sequenz K.DVFLGM$FLYEYAR.R K.D$VFLGMFLYEYAR.R K.DVFLGMFLY$EYAR.R K.DVFLGMFLYE$YAR.R K.PLVEEPQNLIK$QNC.E V.PQVST$PT$LVEVSR.N V.PQVS$TPT$LVEVSR.N V.PQVST$PTLVE$VSR.N V.PQVST$PTLVEVS$R.N F.QNALLVRY$T$K$.K

XCorr 4,07 3,441 1,647 1,122 1,056 1,054 0,955 0,946 0,934 0,876

∆Cn 0 0,154 0,595 0,724 0,741 0,741 0,765 0,768 0,771 0,785

Sp RSp Ionen 1079,7 2 23/48 1103,5 1 23/48 258,3 3 15/48 157,5 15 13/48 239,4 4 14/52 217,1 5 13/48 172,7 10 1248 183,4 8 1248 171,1 11 1248 203,6 6 11/36

Wie aus den SEQUEST-Parametern zu entnehmen ist, kommen nur die beiden ersten Proteinstücke als koordinierte Sequenzen in Betracht. Für die restlichen Peptidsequenzen sind die Sp-Werte alle Sp < 500 und ∆Cn > 0,59. Aus der Sequenz [DVFLGM$FLYEYAR]3+ stellen die Aminosäuren D324, M329, Y332 und E333 potentielle Bindungspartner für ein Cisplatinfragment dar. Die einzigen zufriedenstellenden Übereinstimmungen zu dem aufgenommenen MS/MS-Spektrum werden für die theoretischen MS/MS-Spektren zu dieser Peptidsequenz mit der Koordinaiton an der Aminosäure M329 oder D324 erreicht (48% Ionenzuordnung). Anhand der wesentlich besseren XCorr- und ∆Cn-Werte im Vergleich zu D324 kann M329 als Bindungsstelle zugeordnet werden. Die Lokalisierung der Seitenketten der beiden denkbaren Bindungsstellen D324 und M329 im Protein ist in der folgenden Abbildung zu sehen.

Serumproteine

132

M329

D324

Abb.6.9: Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serumalbumins

In der Vergrößerung ist der Ausschnitt der gesamten Proteinstruktur mit den zwei Seitenketten dargestellt, welche für das [(NH3)Pt]2+-Fragment als Koordinationsstellen in Frage kommen: D324 und M329. Es ist aus der Darstellung deutlich ersichtlich, dass das Methionin sterisch am besten zugänglich für eine Koordination ist. Wie schon erläutert, lassen die SEQUEST-Parameter häufig bei benachbarten Resten, wie zum Beispiel zwischen C34 und E37, keine eindeutige Zuordnung zu. Da auf Grund der SEQUEST-Parameter die Zuordnung eines bestimmten Restes in dem Bereich C34-H39 nicht bestätigt möglich ist, wird an dieser Stelle als Beispiel das MS/MS-Spektrum der mit [Pt]2+ koordinierten Sequenz [ALVLIAFAQYLQQC§PFEDH]2+ aus dem 1:5 Ansatz nach 168h (Tab. 6.9) näher analysiert.

Serumproteine

133

Abb.6.10: MS/MS-Spektrum von [ALVLIAFAQYLQQC§PFEDH]2+ aus dem 1:5 Ansatz Serumalbumin:Cisplatin nach 168h Inkubation bei 37°C

Im Spektrum wurden 15 Massenpeaks den Fragmentionen des Peptids zugeordnet. Aus der Sequenz ist erkennbar, dass je 18 b+- und y+-Ionen gebildet werden können. Fünf dieser b+Ionen (b14+ bis b18+) und 13 der y+-Ionen (y6+ bis y18+) sollen platiniert sein. Im Spektrum sind aus der b+-Serie nur die Ionen b5+ - b8+, b10+, b12+ und b13+ sowie asu der y+-Serie die Ionen y6+, y7+, y9+ -y14+ einbezogen. Die Beobachtung von nur platinierten yk+-Ionen mit k ≥ 6 sowie das Fehlen der platinierten Ionen bj+ für j > 13 steht eindeutig im Einklang mit der Zuordnung von C34 als Bindungsstelle. In allen weiteren Peptidsequenzen mit den möglichen Koordinationsstellen C34, E37, D38, H39 fehlen auch die analogen b+-Ionen mit Aminosäure-Resten n ≥ 34. Die folgende Tabelle enthält weitere potentielle Peptidsequenzen aus Serumalbumin, deren Masse ebenfalls m/z = 2400,5 (∆m ± 2,5) beträgt.

Serumproteine

134

Tab.6.11: SEQUEST-Parameter von von [ALVLIAFAQYLQQC§PFEDH]2+ im Vergleich zu den anderen potentiellen Peptidsequenzen aus dem 1:5 Ansatz Serumalbumin:Cisplatin nach 168h Inkubation bei 37°C Sequenz XCorr K.ALVLIAFAQYLQQC§PFEDH.V 4,533 K.ALVLIAFAQYLQQCPFE§DH.V 4,168 K.ALVLIAFAQYLQQCPFED§H.V 4,161 K.ALVLIAFAQYLQQCPFEDH§.V 4,132 K.ALVLIAFAQY§LQQCPFEDH.V 2,578 K.D§VFLGM§FLYEYARRHP.D 1,124 K.ATKEQLKAVM§DDFAAFVE§.K 1,065 K.ATKEQLKAVMD§DFAAFVE§.K 0,951 K.ATKEQLKAVMDD§FAAFVE§.K 0,911 K.ATKEQLKAVM§D§DFAAFVE.K 0,89

∆Cn 0 0,081 0,082 0,089 0,431 0,752 0,765 0,79 0,799 0,804

Sp 523,5 523,5 523,5 523,5 163,5 81,3 55,4 55,4 55,4 53,6

RSp 1 1 1 1 2 3 6 6 6 7

Ionen 15/36 15/36 15/36 15/36 10/36 7/30 6/34 6/34 6/34 6/34

Anhand der SEQUEST-Parameter kann jedoch wiederum die bevorzugte Koordination einer der vier Aminosäuren des Proteinstückes [ALVLIAFAQYLQQC§PFEDH]2+ nicht eindeutig bestätigt werden. Neben dem Cystein 34 stehen E37, D38 und H39 mit ihren Seitenketten als potentielle Bindungsstellen für das Metallfragment zur Verfügung. Verglichen mit der Bindungsstelle C34 weisen die drei Reste E37/D38/H39 relativ hohe ∆Cn-Werte von 0,0810,089 auf. Allerdings können für alle vier potentiellen Bindungsstellen 15 b+- und y+-Ionen zugeordnet werden. Die restlichen Sequenzen aus der Tabelle 6.11 können auf Grund sehr niedriger SEQUEST Werte (z. B. Sp-Werte < 200) eindeutig als Bindungsstellen ausgeschlossen. Die Zugänglichkeit der oben genannten Aminosäuren ist in dem Ausschnitt der Proteinstruktur in Abb.6.11 gezeigt.

Serumproteine

135

C34 D38

E37

H39

Abb.6.11:Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serumalbumins

Die Abbildung zeigt eine Vergrößerung des von Cisplatin koordinierten Bereiches im Protein, wobei die Seitenketten der Aminosäuren C34, E37, D38 und H39 auf ihre Zugänglichkeit für eine Bindung betrachtet werden. Wie aus der Darstellung erkennbar, ist eine Koordination der Aminosäuren C34, E37 oder D38 begünstigt. Der Imidazolring von H39 liegt nicht an der Oberfläche der Helix, wie das bei den restlichen gekennzeichneten Bindungsstellen der Fall ist und wird somit als weniger wahrscheinlich als Koordinationsstelle vermutet. Dabei ist auch zu bemerken, dass die freie Thiolatgruppe des Cysteins 34 schon von mehreren Autoren als Bindungsstelle des Cisplatins identifiziert wurde, z. B. durch Blockierung der Thiolatfunktion [12-15]. Zusammenfassend konnten aus der Untersuchung zweier unabhängiger Blutserumproben und der Serumalbumin:Cisplatin-Ansätze die Seitenketten der Aminosäuren C34 (E37, D38), Y150 (Y148), M329, D375 und M548 als Cisplatinbindungsstellen ermittelt werden. Somit können diese Bindungsstellen als spezifisch für das Zytostatikum angesehen werden. Die Lokalisierung der wahrscheinlich koordinierten Seitenketten C34, Y150, M329, D375 und M548 wird in der folgenden Abbildung illustriert.

Serumproteine

136

Abb.6.12: Serumalbuminstruktur mit bevorzugten Cisplatinbindungsstellen

Die Seitenketten von drei bevorzugten Bindungsstellen für Cisplatin liegen auf der Oberfläche des Proteins verteilt. Die Aminosäuren M329, D375 und M548 sind dabei in α-Helices des Transportproteins lokalisiert, dagegen sind die Aminosäuren C34 und Y150 in zu Bindungstaschen gehörenden flexiblen Schleifen (L55-P59 und R144-Y150) positioniert.

6.2. Cisplatinaddukte des Serotransferrins 6.2.1. Blutserumproben

Ein

weiteres

abundantes

Serumprotein,

dessen

Bindungsverhalten

sowohl

aus

Reaktionsansätzen des Proteins mit Cisplatin als auch aus der Blutserumanalyse massenspektrometrisch untersucht wurde, ist das Serotransferrin. Für die Untersuchungen mit dem Einzelprotein wurden wieder Ansätze aus Protein:Cisplatin 1:1 und 1:5 nach 3h Inkubation bei 37 °C und 1:5 nach 168h Inkubation bei 37 °C verwendet. Aus den MudPIT-Analysen der beiden Blutserumproben konnte eine Liste aus koordinierten Peptiden des Serotransferrins erhalten werden, die in Tabelle 6.12 gezeigt wird.

Serumproteine

137

Tab.6.12: Proteintargets von Cisplatin in Serotransferrin aus den MudPIT-Analysen der Blutserumproben Peptid erste Blutserumprobe K.IM§NGEADAMSLDGGFVYIAGK.C

Bindungsstelle

z XCorr ∆Cn

RSp Ionen

4,49

0,48 560,3

1

22/40

2

2,86

0,10 890,1

1

15/22

D.NCED~TPEAGYFAVAVVK.K C418/E419/D420 2 K.IM~NGEADAMoxSLDGGFVYIAGK.C M382/E385/D387 2

3,94 5,14

0,40 837,8 0,50 870,5

1 1

21/32 19/40

M.NGE#ADAMoxSLDGGFVYIAGK.C E385/D387 2 4,57 0,23 1503,6 2+ 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt] , # = [(NH3)2PtCl]+

1

20/36

zweite Blutserumprobe K.MoxY$LGYEYVTAIR.N

M382/E385/D387 2

Sp

Y314

Bei den Analysen wurden insgesamt fünf Peptidsequenzen des Serotransferrins mit einer möglichen Cisplatinkoordination identifiziert. Bei den in Tabelle 6.12 angegebenen Peptidsequenzen handelt es sich um drei mögliche Bindungsbereiche/-stellen: Y314, C418/E419/D420 und M382/E385/D387. In beiden Blutserumproben ist somit der Bereich M382/E385/D387 als Bindungsstelle identifiziert worden. Die restlichen Positionen für eine Cisplatinkoordination müssen in den Einzelanalysen bestätigt werden. Die Peptidsequenzen aus der Tabelle wurden auf die Qualität der MS/MS-Spektren geprüft, um wiederum falsche Zuordnungen auszuschließen und bei denkbaren benachbarten Aminosäuren zu Gunsten einer Bindungsstelle entscheiden zu können. In der folgenden Abbildung ist das MS/MS-Spektrum der mit [(NH3)2Pt]2+ koordinierten Sequenz

[381IM~NGEADAMoxSLDGGFVYIAGK401]2+

dargestellt.

Hierbei

soll

die

Bevorzugung einer der drei möglichen Koordinationsstellen M382/E385/D387 festgestellt werden.

Serumproteine

138

Abb.6.13: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [IM~NGEADAMoxSLDGGFVYIAGK]2+ in Serotransferrin aus der zweiten Blutserumprobe In dem oberen Spektrum konnten von 40 möglichen Ionen 19 b+- und y+-Ionen (17 im Spektrum dargestellt) zugeordnet werden. Aus den Abspaltungen der einzelnen Aminosäuren sollten der Bindungsstelle Methionin 382 entsprechend die Ionen b2+ bis b20+ und aus der ySerie das y20+ platiniert sein. Den Massenspeaks in Abbildung 6.13 wurden Ionen b8+ und b12+ sowie y4+, y5+ und y7+ bis y19+ zugeordnet. Für eine Entscheidung zu Gunsten einer der drei potentiellen Bindungsstellen sind vor allem die Ionen yk+ mit k ≥ 15 bei D387 und k ≥ 17 bei E395 als Koordinationsstellen ausschlaggebend. Die folgende Tabelle listet die Peptidsequenzen auf, welche der Masse von m/z = 2403 (mit ∆m ± 2,5) entsprechen.

Serumproteine

139

Tab.6.13: SEQUEST-Parameter von [IM~NGEADAMoxSLDGGFVYIAGK]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen in Serotransferrin aus der zweiten Blutserumprobe Sequenz K.IM~NGEADAMoxSLDGGFVYIAGK.C K.IMNGE~ADAMoxSLDGGFVYIAGK.C K.IMNGEAD~AMoxSLDGGFVYIAGK.C K.IMoxNGE~ADAMSLDGGFVYIAGK.C K.IMoxNGEAD~AMSLDGGFVYIAGK.C V.DLIGGKCELLSDDSLAVSS~PR.L

XCorr 5,144 4,245 3,423 2,718 2,712 2,546

∆Cn 0 0,175 0,335 0,471 0,473 0,505

Sp RSp Ionen Protein 870,5 1 19/40 TRFE_HUMAN 533,5 4 16/40 TRFE_HUMAN 368,3 29 14/40 TRFE_HUMAN 259,4 197 12/40 TRFE_HUMAN 259,4 197 12/40 TRFE_HUMAN 412 19 14/40 ACPH_HUMAN

Die Peptidsequenz [IM~NGEADAMoxSLDGGFVYIAGK]2+ enthält 20 der insgesamt 698 Aminosäuren des Transferrins. Wie aus der Tabelle 6.13 erkennbar, weist das Peptid weitere potentielle Angriffsstellen für ein Metallfragment auf: E385 und D387. Aus den zugehörigen SEQUEST-Werten dieser Koordinationsstellen wird deutlich, dass nur M382 und E285 in Betracht gezogen werden. Die Zuordnung der nicht platinierten yk+-Ionen für k = 17-19 in hoher relativer Intensität spricht in diesem Fall für die M382.Koordination. Aus der Tabelle 6.12 wird ersichtlich, dass die Aminosäurefolge [IMNGEADAMSLDGGFVYIAGK]2+ (einmal mit der Oxidation des M389) mit M382 als Platinierungsstelle in beiden Blutserumproben jeweils einmal identifiziert werden konnte. Daneben konnte für die zweite Blutserumprobe zusätzlich die Peptidsequenz [NGEADAMoxSLDGGFVYIAGK]2+ mit einer Platinierung der Aminosäure E385 detektiert werden. Da aus den experimentellen MS/MSSpektren die Platinverteilung bei den Ionen bj+ für j ≤ 5 nicht eindeutig hervorgeht, kann eine Koordination des des Methionin M382 in den beiden ersten Sequenzen nicht eindeutig bestätigt werden.Das Vorhandensein der nicht platinierten y17+-y19+-Ionen kann auch durch Verlust des [(NH3)2Pt]2+-Fragmentes verursacht sein. Eine Betrachtung der Proteinstruktur ist hier hilfreich. Der vergrößerte Bereich ist in der untenstehenden Abbildung zu sehen.

Serumproteine

140

E385

M382

Abb.6.14: Ausschnitt aus der Gesamtstruktur des Serotransferrins (PDB ID: 2hau [136])

In der Illustration sind die Seitenketten des Methionins und der Asparaginsäure hervorgehoben. M382 ist in einer Helix, E385 in einer Schleife lokalisiert. Bezogen auf die Zugänglichkeit der Seitenketten für eine Koordination wäre die Asparaginsäure 385 eindeutig als bevorzugte Stelle einzustufen. Bei den beiden Peptidsequenzen mit M382 als zugeordnete Bindungsstelle liegt ein [Pt]2+- bzw. [(NH3)2Pt]2+-Fragment vor. Die Bildung eines κ2SM382,OE385-Makrochelates wäre deshalb jeweils möglich. Bei der dritten Sequenz sowie bei zwei Sequenzen aus den Serotransferrin:Cisplatin-Ansätzen (Tab. 6.15 und 6.17) mit E385Koordination wird dagegen das monodentate [(NH3)2PtCl]+-Fragment gefunden, was andere Koordinationsstellen ausschließen würde. Außerdem weisen diese Sequenzen alle N383 als N-treminalen Rest auf. In der Tabelle 6.12 findet sich eine weitere Peptidsequenz mit einer möglichen Cisplatinkoordination an C418/E419/D420: [417NCED~TPEAGYFAVAVVK433]2+. Um eine dieser Aminosäuren möglicherweise als bevorzugte Bindungsstellen einteilen zu können, wird das MS/MS-Spektrum der koordinierten Peptidsequenz aus Serotransferrin in der folgenden Abbildung dargestellt.

Serumproteine

141

Abb.6.15: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [NCED~TPEAGYFAVAVVK]2+ in Serotransferrin aus der zweiten Blutserumprobe Aus der Sequenz [417NCED~TPEAGYFAVAVVK433]2+ wird deutlich, dass bei der Koordination des [(NH3)2Pt]2+ -Fragmentes an D420 alle b+-Ionen ab b4+ und alle y+-Ionen ab y14+ platiniert sind. Von den 32 möglichen Ionen sind 18 im Spektrum zugeordnet (SEQUEST konnte insgesamt 21 Ionen zuordnen). Zu erkennen sind die platinierten Ionen b5+, b6+, b8+, b10+, b11+ und b13+ bis b16+ sowie die nicht platinierten Ionen y3+ - y9+, y12+, y13+, wie am Beispiel des platinierten b6+-Ions in der Vergrößerung im Spektrum gezeigt. Das Fehlen der Ionen bj+ für j < 5 und yk+ für k > 13 bietet einen wichtigen Hinweis darauf, dass D420 die bevorzugte Bindungsstelle sein könnte. Zu der Fragmentmasse m/z = 2041 (∆m ± 2,5) sind in der folgenden Tabelle die theoretisch möglichen Peptidsequenzen aufgelistet, welche mit den zehn besten XCorr-Werten von SEQUEST gefunden wurden.

Serumproteine

142

Tab.6.14: SEQUEST-Parameter von [NCED~TPEAGYFAVAVVK]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen in Serotransferrin aus der zweiten Blutserumprobe Sequenz D.NCED~TPEAGYFAVAVVK.K D.NC~EDTPEAGYFAVAVVK.K D.NCE~DTPEAGYFAVAVVK.K D.NCEDT~PEAGYFAVAVVK.K D.NCEDTPE~AGYFAVAVVK.K D.NCEDTPEAGY~FAVAVVK.K T.YTPSQE~GPYM~VSVK.Y R.SMPTAEATH~PMoxPT~AGA.T T.YTPS~QEGPYM~VSVK.Y R.TELSM~PIQSHVIMTPQ.S

XCorr 3,937 3,855 3,802 3,661 2,922 2,799 2,38 2,341 2,32 2,259

∆Cn 0 0,021 0,034 0,07 0,258 0,289 0,395 0,405 0,411 0,426

Sp RSp Ionen Protein 837,8 1 21/32 TRFE_HUMAN 825,5 2 21/32 TRFE_HUMAN 825,5 2 21/32 TRFE_HUMAN 697,4 3 20/32 TRFE_HUMAN 349,2 8 16/32 TRFE_HUMAN 345 10 15/32 TRFE_HUMAN 283,3 45 12/26 FLNB_HUMAN 331,7 12 13/30 CX055_HUMAN 283,3 45 12/26 FLNB_HUMAN 220,1 212 13/30 ATF7_HUMAN

Aus Tabelle wird deutlich, dass in der oben angegebenen Peptidsequenz mehrere potentielle Bindungsstellen

für

ein

Cisplatinfragment

enthalten

sind.

Dazu

gehören

neben

Asparaginsäure 420, Cystein 418, Glutaminsäure 419 und Threonin 421. Außerdem wird aus den zugehörigen ∆Cn-Werten erkennbar, dass die theoretischen MS/MS-Spektren aller vier möglichen Koordinationsstellen D420, C418, E419 und T421 vergleichbar gute Übereinstimmungen mit dem aufgenommenen Spektrum liefern (∆Cn ≤ 0,07 und 20 bzw. 21 von 32 Ionen). Alle weiteren Peptidsequenzen in der Tabelle erfüllen die Sp-, ∆Cn- und RSpKriterien nicht (Sp < 500, ∆Cn > 0,1 und RSp > 6) und können als mögliche Bindungsstellen eindeutig ausgeschlossen werden. Die Vergrößerung des Bereiches mit den vier potentiellen Bindungsstellen ist in der folgenden Abbildung gezeigt.

Serumproteine

143 C418

E419

D420

T421

Abb.6.16: Ausschnitt aus der Struktur von Serotransferrin

In der Abbildung 6.16 ist der oberhalb diskutierte Bereich im Ausschnitt aus der Proteinstruktur dargestellt. Alle vier Aminosäuren sind in einer Schleife zwischen zwei βFaltblättern lokalisiert. Aus der Positionierung der Seitenketten kann nicht eindeutig zu Gunsten einer der vier möglichen Bindungsstellen entschieden werden. Für Cisplatin konnte aus beiden Blutserumanalysen somit E385 (M382) eindeutig als Bindungsstelle bestätigt werden. Die möglichen Y314 und D420 Koordinationen müssen dagegen bei den Einzeluntersuchungen validiert werden.

6.2.2. Cisplatin:Serotransferrin Proben

Aus dem äquimolaren Ansatz von Transferrin mit Cisplatin konnten die in der Tabelle 6.15 aufgelisteten koordinierten Peptidsequenzen detektiert werden.

Serumproteine

144

Tab.6.15: Koordinierte Peptidsequenzen aus dem 1:1 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Peptid K.M§YLGYEYVTAIR.N

Bindungsstelle z XCorr ∆Cn Sp RSp Ionen M313/Y314 2 3,80 0,65 1641,6 1 20/22

M.NGE$ADAMoxSLDGGFVYIAGK.C K.IM$NGEADAMSLDGGFVYIAGK.C

E385 M382/E385

2 2

4,25 2,96

0,73 828,3 0,74 500,2

1 1

18/36 17/40

M.NGE~ADAMSLDGGFVYIAGK.C D.LIWE~LLNQAQEHFGK.D

E385 E265

2 2

6,25 4,04

0,79 2299,8 0,43 1637,9

1 1

27/36 19/28

M.NGE#ADAMSLDGGFVYIAGK.C E385 2 4,65 0,73 1065,0 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

1

19/36

Es sind insgesamt sechs Proteinabschnitte von einem der Cisplatinfragmente koordiniert. Dabei wurde jeweils einmal E265, M313/Y314 und M382/E385 und dreimal E385 platiniert. Von den in den Blutserumproben gefundenen Bindungsstellen konnten M313/Y314 und M382/E385 erneut identifiziert werden. Die Stelle C418/D420 wurde dagegen in dieser Analyse bzw. in den weiteren Untersuchungen nicht wieder beobachtet und kann deswegen nicht als spezifische Bindungsstelle gelten. Da Y314 als Bindungsstelle neben der oxidierten Methionin 313 Stelle in der ersten Blutserumprobe (siehe Tabelle 6.12) identifiziert wurde, ist es interessant die erste Peptidsequenz des äquimolaren Ansatzes nach 3h Inkubation zu überprüfen. Die Abbildung 6.17 zeigt ein MS/MS-Spektrum dieser Sequenz, welche mit dem [Pt]2+Fragment

modifiziert

wurde.

Es

handelt

sich

dabei

um

[313M§YLGYEYVTAIR324]2+ des Transferrins mit der Masse m/z = 1673.

das

Peptid

Serumproteine

145

Abb.6.17: MS/MS-Spektrum von [M§YLGYEYVTAIR]2+ aus dem 1:1 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C In dem Spektrum sind 17 von 22 möglichen Ionen zugeordnet, davon sind sieben aus der b+und zehn aus der y+-Serie. Von den 22 möglichen Ionen sind 20 bei der SEQUEST-Analyse berücksichtigt worden. Alle 11 b+-Ionen und keines der y+-Ionen sind für eine M313Koordination platiniert. Die folgende Tabelle enthält die für eine Masse von m/z = 1673 (∆m ± 2,5) möglichen weiteren Peptidsequenzen aus dem Serumprotein Transferrin. Diese können einerseits Koordinationen des Cisplatinfragmentes an einer anderen Aminosäure der oben angegebenen Sequenz aufweisen (d. h. Y314, Y317, E 318 oder Y319) oder weitere koordinierte Peptide des Proteins mit der entsprechenden Masse sein.

Serumproteine

146

Tab.6.16: SEQUEST-Parameter von [M§YLGYEYVTAIR]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen aus dem 1:1 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Sequenz K.M§YLGYEYVTAIR.N K.MY§LGYEYVTAIR.N K.MYLGY§EYVTAIR.N K.MYLGYE§YVTAIR.N K.MYLGYEY§VTAIR.N H.S§TIFENLANKADR.D H.ST§IFENLANKADR.D H.STIFE§NLANKADR.D K.MYLGYEYVT§AIR.N K.C§D§EWS§VNSVG.K

XCorr 3,801 3,558 2,376 1,941 1,579 1,325 1,293 1,265 0,888 0,698

∆Cn 0 0,064 0,375 0,489 0,585 0,651 0,66 0,667 0,766 0,816

Sp 1641,6 1623,5 519,1 371,1 308,3 185,1 161 161 90,7 57,8

RSp 1 2 3 4 5 6 7 7 8 12

Ionen 20/22 20/22 15/22 13/22 13/22 9/24 8/24 8/24 10/22 5/18

Aus den SEQUEST-Werten und dem MS/MS-Spektrum (Abb 6.17) der Sequenz M313-R324 wird deutlich, dass sowohl die Zuordnung des Methionins 313 als auch die des Tyrosins 314 als Bindungsstelle für [Pt]2+ eine akzeptable Übereinstimmung mit dem theoretischen Spektrum liefern. Da im obigen MS/MS-Spektrum das b1+-Ion nicht beobachtet wird und das zugeordnete y11+ von sehr geringer Intensität ist, kann hier keine Entscheidung zu Gunsten von M313 bzw. Y314 resultieren. Die folgende Abbildung zeigt den Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serotransferrins, wobei die Seitenketten des M313 und Y314 von besonderem Interesse sind.

M313

Y314

Abb.6.18: Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serotransferrins

Serumproteine

147

Beide Aminosäuren sind in einer Helix lokalisiert, jedoch ist aus der Position der Methioninseitenkette erkennbar, dass diese durch mögliche Wechselwirkungen mit den Aminosäuren der benachbarten Helices für eine Koordination weniger bevorzugt ist. Diese Beobachtung steht mit den Befunden von SADLER in Einklang, der mittels NMRSpektroskopie keine Anhaltspunkte für eine M313-Koordination im gesamten Protein feststellen konnte [58]. Es ist interessant, dass die von SADLER bzw. DYSON identifizierten Stellen M256, M499 und T457 bei den 1:1 Ansätzen nach 3h Inkubation nicht beobachtet wurden. Die Produkte der Reaktion zwischen Serotransferrin und Cisplatin nach einer Inkubation von 3h bei 37 °C im Verhältnis 1:5 wurden ebenfalls massenspektrometrisch untersucht. Die Liste der koordinierten Peptide daraus findet sich in Tabelle 6.17 Neben den schon beim 1:1 Ansatz identifizierten Bindungsstellen M313/Y314 und M382/E385 wird bei dieser höheren Konzentration erstmals auch die schon von DYSON ermittelte T457Koordination bestätigt. Offensichtlich sind hierfür höhere Konzentrationen an Metallkomplex notwendig, wobei von DYSON sogar ein zehnfacher Überschuss an Cisplatin verwendet wurde [137].

Tab.6.17: Koordinierte Peptidsequenzen aus dem 1:5 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Peptid Bindungsstelle z Xcorr ∆Cn Sp RSp Ionen K.IM§NGEADAMSLDGGFVYIAGK.C M382/E385 2 4,21 0,72 1412,6 1 26/40 K.MY§LGYEYVTAIR.N Y314 2 3,59 0,65 732,7 1 14/22 A.KM§YLGYEYVTAIR.N M313/Y314 2 2,82 0,58 1225,6 1 17/24 R.T§AGWNIPMoxGLLYNK.I T457 2 2,72 0,62 628,2 1 15/26 M.NGE$ADAMoxSLDGGFVYIAGK.C R.T$AGWNIPMoxGLLYNK.I K.M$YLGYEYVTAIR.N

E385 T457 M313/Y314

2 2 2

4,34 3,73 2,65

0,75 1047,9 0,43 711,7 0,83 760,7

1 1 1

20/36 15/26 14/22

M.NGE~ADAMSLDGGFVYIAGK.C

E385

2

6,07

0,80 1829,4

1

24/36

M.NGE#ADAMSLDGGFVYIAGK.C E385 2 5,49 0,83 1783,2 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

1

23/36

Wie der Tabelle zu entnehmen ist, wurden im Serotransferrin nach der 1:5 Umsetzung mit Cisplatin insgesamt neun koordinierte Peptidsequenzen detektiert. Es konnte dreimal die Koordination des Bereiches M313/Y314, viermal M382/E385 und zweimal T457 identifiziert werden.

Serumproteine

148

Das nachstehende Massenspektrum zeigt die ESI-MS2-Fragmentierungen der koordinierten Sequenz [457T$AGWNIPMoxGLLYNK470]2+, welche an der Aminosäure Threonin 457 [(NH3)Pt]2+ bindet.

Abb.6.19: MS/MS-Spektrum von [T$AGWNIPMoxGLLYNK]2+ aus dem 1:5 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C

Es konnten 15 Ionen von 26 möglichen den Peaks im oberen Spektrum zugeordnet werden. Die Ionen b1+ bis b13+ aber keine der beobachteten y+-Ionen sind platiniert. Es wurden im aus der b+-Serie die Ionen b4+-b6+, b8+, b11+ und b12+ sowie aus der y+-Serie y2+-y4+, y6+, y8+, y9+y11+ und y102+ beobachtet. Die folgende Tabelle listet Peptidsequenzen des Serumproteins auf, welche für den Vergleich des beobachteten MS/MS-Spektrums mit dem theoretischen Spektrum die besten SEQUESTWerte lieferten.

Serumproteine

149

Tab.6.18: SEQUEST-Parameter von [T$AGWNIPMoxGLLYNK]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen aus dem 1:5 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Sequenz R.T$AGWNIPMoxGLLYNK.I V.GRTAGWNIPMoxGLLYNK.I R.TAGWNIPMoxGLLY$NK.I R.TAGWNIPMoxGLLYNK$.I R.TAGWNIPMGLLYNKIN.H R.DD$T$VCLAKLHDR.N R.M$D$AKMYLGYEY.V R.MD$AKM$YLGYEY.V R.D$DT$VCLAKLHDR.N R.MD$AKMY$LGYEY.V

XCorr 3,734 2,138 2,113 1,784 1,767 1,173 1,159 1,158 1,081 1,081

∆Cn 0 0,427 0,434 0,522 0,527 0,686 0,69 0,69 0,711 0,711

Sp 711,7 334,2 161,8 136,1 144,1 162 74 31,2 162 31,2

RSp Ionen 1 15/26 2 12/30 4 10/26 6 9/26 5 10/30 3 7/22 10 7/20 38 5/20 3 7/22 38 5/20

In der Tabelle 6.18 finden sich zehn Peptidsequenzen, welche der Masse m/z = 1805 (mit ∆m ± 2,5) entsprechen. Aus den Sp- und ∆Cn-Werten dieser Proteinstücke wird deutlich, dass keine andere Sequenz in Frage kommt. In der unteren Darstellung ist ein Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Transferrins präsentiert, welche die koordinierte Aminosäure T457 zeigt.

T457

Abb.6.20: Ausschnitt aus der Gesamtstruktur des Serotransferrins

Die Zugänglichkeit der Seitenkette des Threonins aus Tabelle 6.17 lässt sich in der Darstellung gut erkennen. Die modifizierte Aminosäure ist in einer Schleife lokalisiert. Sie

Serumproteine

150

dient im Protein als Bicarbonat-Bindungsstelle, was bei einer Koordination dieser Threoninstelle eine Blockierung mit sich bringt. Von den in der Literatur diskutierten Bindungsstellen im Serumalbumin konnte somit bisher die von SADLER beobachtete M256 und M499 Koordination [58] nicht identifiziert werden. Mit einem fünffachen Überschuss an Cisplatin wurden deswegen die Reaktionsprodukte auch nach 168h Inkubation bei 37°C mit Serotransferrin untersucht. Eine Tabelle der mit einem Cisplatinfragment modifizierten Peptidsequenzen aus dem Serumprotein findet sich unter 6.19.

Tab.6.19: Koordinierte Peptidsequenzen aus dem 1:5 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 168h Inkubation bei 37°C Peptid Bindungsstelle z XCorr ∆Cn Sp RSp Ionen R.SM§GGKEDLIWELLNQAQEHFGK.D S255/M256 3 5,19 0,76 1874,2 1 32/84 K.IM§NGEADAMSLDGGFVYIAGK.C M382/E385/D387 2 4,39 0,76 1373,1 1 25/40 K.M§YLGYEYVTAIR.N M313/Y314 2 4,13 0,72 1944,8 1 21/22 R.T§AGWNIPMGLLYNK.I T457 2 3,25 0,62 970,1 1 17/26 M.Y§LGYEYVTAIR.N Y314 2 2,67 0,68 1926,1 1 17/20 R.SM$GGKEDLIWELLNQAQEHFGK.D R.T$AGWNIPMoxGLLYNK.I K.IM$NGEADAMSLDGGFVYIAGK.C M.Y$LGYEYVTAIR.N K.MoxY$LGYEYVTAIR.N

S255/M256 T457 M382/E385 Y314 Y314

3 2 2 2 2

4,84 3,89 3,59 3,11 2,93

0,48 1881,3 0,57 996,7 0,82 882,8 0,70 888,8 0,75 750,8

1 1 1 1 1

33/84 19/26 18/40 13/20 13/22

M.NGE~ADAMSLDGGFVYIAGK.C E385 2 6,33 0,73 2187,1 D.LIWE~LLNQAQEHFGK.D E265 2 3,27 0,42 1079,8 2+ 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt] , # = [(NH3)2PtCl]+

1 1

25/36 17/28

Die oben dargestellte Tabelle listet insgesamt 12 modifizierte Peptidsequenzen des Serotransferrins auf. Es konnten die in den Blutserum- und/oder den Einzelanalysen identifizierten Bindungsstellen M382/E385, M313/Y314 und T457 bestätigt werden. Bei dieser Umsetzung nach 168h Inkubation konnte auch die von SADLER beobachtete M256Koordination zum ersten Mal ermittelt werden. Ebenfalls zum ersten Mal wurde die Koordination der Glutaminsäure 265 beobachtet. Neben der Methioninseitenkette weist die Peptidsequenz mehrere potentielle Koordinationsstellen (S255 oder E260) auf. Das MS/MS-Spektrum der Peptidsequenz [255SM§GGKEDLIWELLNQAQEHFGK276]3+ des Transferrins ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Serumproteine

151

Abb.6.21: MS/MS-Spektrum von [SM§GGKEDLIWELLNQAQEHFGK]3+ aus dem 1:5 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin, nach 168h Inkubation bei 37°C

Das Spektrum beinhaltet 25 zugeordnete Ionen (einfach und zweifach geladene), wobei aus der Sequenz 84 Fragmentionen möglich sind und von SEQUEST 36 zugeordnet wurden. Von der Bindungsstelle des Cisplatinrestes resultierend weisen alle bj+-Ionen für j ≥ 2 und nur y21+ die Platinierung auf. Mit der Molekülmasse m/z = 2741 (∆m ± 2,5) wurden in Tab. 6.20 dargestellte weitere mögliche Peptidsequenzen durch SEQUEST ermittelt. Es handelt sich bei den ersten acht Sequenzen um Koordinationen des Cisplatinfragmentes an unterschiedlichen Aminosäuren der gleichen Sequenz, die als potentielle Bindungsstellen möglich sind. Um genau festzustellen, welche der gefundenen Koordinationen zutreffend ist, wird zunächst die Liste aus der untenstehenden Tabelle 6.20 betrachtet.

Serumproteine

152

Tab.6.20: SEQUEST-Parameter von [SM§GGKEDLIWELLNQAQEHFGK]3+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen aus dem 1:5 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin, nach 168h Inkubation bei 37°C Sequenz R.SM§GGKEDLIWELLNQAQEHFGK.D R.S§MGGKEDLIWELLNQAQEHFGK.D R.SMGGK§EDLIWELLNQAQEHFGK.D R.SMGGKED§LIWELLNQAQEHFGK.D R.SMGGKE§DLIWELLNQAQEHFGK.D R.SMGGKEDLIWE§LLNQAQEHFGK.D R.SMGGKEDLIWELLNQAQE§HFGK.D R.SMGGKEDLIWELLNQAQEH§FGK.D Q.QH§LFGS§NVTD§CSGNFCLFR.S K.DCH§LAQVPSHT§VVARSMGGKED.L

XCorr 5,189 5,18 5,177 5,15 5,127 4,425 1,566 1,515 1,252 1,179

∆Cn 0 0,002 0,002 0,008 0,012 0,147 0,698 0,708 0,759 0,773

Sp RSp Ionen 1874,2 1 32/84 1874,2 1 32/84 1826,7 2 32/84 1776,2 3 32/84 1689,4 4 31/84 1179,1 5 28/84 257,7 6 17/84 216,7 7 16/84 194,9 8 14/72 81,5 32 10/84

In der Auflistung sind insgesamt zehn Proteinfragmente mit den besten theoretischen Übereinstimmungen aufgeführt. Aus den SEQUEST-Parametern in der Tabelle 6.20 wird deutlich, dass die Bindungen des Platinrestes an S255, K259, E260 und D261 auch in Frage kommen (∆Ch < 0,1). Entscheidend für eine Zuordnung zu Gunsten einer der möglichen Koordinationsstellen wären beispielsweise die Ionen b1+ für S255 oder y18+-y21+ für K259. Diese Ionen werden allerdings im Spektrum in Abbildung 6.21 nicht beobachtet. Die folgende Abbildung zeigt die Lokalisierung der fünf möglichen Bindungsstellen in der Proteinstruktur.

D261 S255 M256

E260

K259

Abb.6.22 Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serotransferrins

Serumproteine

153

In der Abbildung 6.22 ist der Bereich der Gesamtstruktur des Proteins vergrößert dargestellt, um

die

räumliche

Verteilung

der

möglicherweise

koordinierten

Seitenketten

zu

veranschaulichen. Aus der Darstellung wird deutlich, dass keine der Aminosäuren als Bindungsstelle für ein Cisplatinfragment eindeutig ausgeschlossen werden kann. Jedoch wird besonders für M256 die gute Zugänglichkeit auch in der unteren Abbildung bestätigt.

M256

Abb.6.23 Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serotransferrins

In der Illustration wird die Lokalisierung der genannten Aminosäure an der Oberfläche der Proteinstruktur (in einer Schleife) deutlich. Für das Vorliegen von M256 als Cisplatinbindungsstelle sprechen die NMR-spektroskopischen Beobachtungen von SADLER, die eine Koordination dieser Aminosäure bestätigen [58]. Auch bei dem 1:5 Ansatz Serotransferrin:Cisplatin nach 168h Inkubation konnte das von SADLER als Bindungsstelle ermittelte Methionin 499 nicht bestätigt werden. Die aus den unabhängigen Blutserumanalysen und/oder den Einzeluntersuchungen ermittelten Aminosäuren M256, E265, Y314, E385 und T457 können als spezifische Bindungsstellen für Cisplatin eingestuft werden. Die von SADLER in seinen NMR-spektroskopischen Untersuchungen beobachtete Koordination von M499 konnte in den vorliegenden Analysen nicht bestätigt werden. Bei den oben genannten Bindungsstellen des Cisplatins wird die Bevorzugung der Koordination der kinetisch begünstigten O-Donoratome bestätigt, wie sie bereits bei den Serumalbumin-Studien beobachtet werden konnten. Die Lokalisierung und Verteilung der

Serumproteine

154

fünf Bindungsstellen im Protein ist in der folgenden Abbildung dargestellt. D420 wurde nur in der zweiten Blutserumprobe gefunden und konnte nicht durch die Serotransferrin:Cisplatin Ansätze bestätigt werden.

E385

M256

T457

Y314

E265 Abb.6.24: Struktur des Serotransferrins mit den bevorzugten Cisplatinbindungsstellen

Aus der Abbildung 6.24 wird deutlich, dass die Bindungsstellen auf der Oberfläche des Proteins bzw. in den Bindungstaschen lokalisiert sind.

6.3. Cisplatinaddukte des Apolipoproteins A1 6.3.1. Blutserumproben

In den beiden Blutserumproben konnte neben den beiden Proteinen Serumalbumin und Serotransferrin eine Reihe weiterer abundanter Proteine als Cisplatin-Targets detektiert werden. Eines davon ist das abundante Serumprotein Apolipoprotein A1 (ApoA1), das ein Molekülgewicht von etwa 30 kDa aufweist. Es besteht aus 267 Aminosäuren, wird hauptsächlich in der Leber und im Darm synthetisiert und transportiert wasserunlösliche Lipide im Blut. Eine Auflistung der mit einem Metallkomplexfragment modifizierten Peptidsequenzen findet sich in der folgenden Tabelle.

Serumproteine

155

Tab.6.21: Koordinierte Peptidsequenzen aus Apolipoprotein A1 aus den MudPIT-Analysen der beiden Blutserumproben Peptid erste Bluserumprobe K.WQE§EMELYR.Q

Bindungsstelle z XCorr ∆Cn

Sp

RSp Ionen

E110

2

3,77

0,11

774,5

5

14/16

K.DLATVYVDVLK~.D K.VSFLSALEEYT~.K K.LREQLGPVTQEFWD~N.L

K23 T237 D73

2 2 2

3,02 4,33 3,34

0,28 710,5 0,31 1021,8 0,22 1104,1

1 1 1

15/20 18/20 16/28

K.VS#FLSALEEYT.K

S228

2

3,08

0,23

1

15/20

1

16/26

998,7

zweite Bluserumprobe K.LLD$NWDSVTSTFSK.L D48 2 3,50 0,15 885,2 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

In der Tabelle sind sechs Sequenzen aufgezählt, welche aus beiden Untersuchungen erhalten wurden. Dabei sind alle vier möglichen Cisplatinfragmente als Koordinationspartner zu beachten. Der Aminosäure Serin 228 wurde das [(NH3)2PtCl]+-Fragment zugeordnet. Aus beiden Blutserumproben wurden die möglichen Koordinationen von K23, D48, D73, E110, S228 und T237 mit einem der Cisplatinfragmente beobachtet. Ein Beispiel einer koordinierten Peptidsequenz des Apolipoprotein A1 aus der ersten Blutserumanalyse 60

ist

die

mit

[(NH3)2Pt]2+

markierte

Aminosäurefolge

74 2+

[ LREQLGPVTQEFWD~N ] . Das zugehörige MS/MS-Spektrum ist nachfolgend dargestellt. Die Peptidsequenz weist neben Asparaginsäure 73 weitere potentielle Koordinationsstellen wie Glutaminsäure 70 für ein Cisplatinfragment auf. Diese Möglichkeiten werden durch Überprüfung der Zuordnungen im MS/MS-Spektrum und der SEQUEST-Werte für die weiteren Aminosäuren betrachtet.

Serumproteine

156

Abb.6.25: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [LREQLGPVTQEFWD~N]2+ in Apolipoprotein A1 aus der ersten Blutserumprobe Das obere Spektrum enthält 14 b+- und y+-Ionen, wobei bis zu 28 aus der Fragmentierung entstehen können und SEQUEST 16 zuordnen konnte. Aus der b+-Serie konnten die Ionen b4+ bis b12+ und aus der y+-Reihe y4+, y7+, y10+, y11+ sowie y13+ zugeordnet werden. Aus der Peptidsequenz und der koordinierten Position D73 resultiert, dass die Ionen b14+ und y2+-y14+ platiniert sind, wobei im Spektrum unter Abb. 6.25 fünf der genannten y+-Ionen beobachtet werden können. Die nachfolgende Tabelle listet fünf weitere Proteinbruchstücke auf, welche der Masse m/z = 2060 (∆m ± 2,5) entsprechen und deren theoretische MS/MS-Spektren mit dem aufgenommenen Spektrum teilweise übereinstimmend sind.

Serumproteine

157

Tab.6.22: SEQUEST-Paramter von [LREQLGPVTQEFWD~N]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen in Apolipoprotein A1 aus der ersten Blutserumprobe Sequenz K.LREQLGPVTQEFWD~N.L K.VS~LLGPVTT~PEH~Q.L K.VS~LLGPVTTPE~H~Q.L K.VS~LLGPVTT~PE~HQ.L R.S~T~RPTQQFYQPPR.A K.VS~LLGPVT~TPEH~Q.L

XCorr 3,344 2,614 2,559 2,515 2,421 2,402

∆Cn Sp RSp Ionen Protein 0 1104,1 1 16/28 APOA1_HUMAN 0,218 615,5 13 12/24 RGAP1_HUMAN 0,235 468,6 84 11/24 RGAP1_HUMAN 0,248 615,5 13 12/24 RGAP1_HUMAN 0,276 591,3 17 12/24 TDRD3_HUMAN 0,282 493,3 63 11/24 RGAP1_HUMAN

Außer der oben genannten Peptidsequenz des ApoliproteinA1 können auf Grund der SEQUEST-Parameter alle aufgeführten Proteinstücke eindeutig als koordinierte Sequenzen ausgeschlossen werden. Diese Aminosäurenfolgen wurden zwei- oder dreifach von einem Cisplatinfragment koordiniert zugeordnet. Das MS/MS-Spektrum (Abb. 6.25) weist jedoch bei keinem der dargestellten Ionen ein Isotopenpattern auf, welches auf Mehrfachkoordination hindeuten würde. Eine Darstellung der Bindungsstelle D73 für ein Cisplatinfragment in dem Serumprotein Apolipoprotein A1 ist in der nachstehenden Illustration zu sehen.

D73

Abb.6.26: Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Apolipoproteins A1 (PBD ID: 2a01A [138])

Der Ausschnitt aus der Struktur in Abb. 6.26 zeigt die gute Zugänglichkeit von D73 für eine Koordination. Die Asparaginsäure ist auf der Oberfläche des Proteins in einer Helix lokalisiert.

Serumproteine

158

6.3.2. Apolipoprotein A1:Cisplatin Proben Für eine Validierung der identifizierten möglichen Bindungsstellen K23, D48, D73, E110, S228 und T237 wurde das Serumprotein mit Cisplatin inkubiert und auf entstandene Addukte untersucht. Es wurden zwei Analysen mit dem Apolipoprotein A1 und Cisplatin durchgeführt. Bei diesen Reaktionen wurden die Protein-Metallkomplex-Verhältnisse von 1:1 bei einer Inkubation von 3h und 1:5 bei 168h und jeweils 37 °C gewählt. In der Tabelle 6.23 ist die Liste der koordinierten Peptide aus dem äquimolaren Reaktionsansatz nach 3h Inkubation und aus dem 1:5 Ansatz nach 168h Inkubation bei 37°C dargestellt.

Tab.6.23: Koordinierte Peptidsequenzen aus den 1:1 und 1:5 Ansätzen Apolipoprotein A1:Cisplatin nach 3h und nach 168h Inkubation bei 37°C Peptid Bindungsstelle z XCorr ∆Cn 1:1 Ansatz nach 3h/37°C R.VKDLATVYVDVLKD§.S D24 2 2,60 0,64 K.DLATVYVDVLK§D.S K23 2 2,53 0,67

Sp

RSp Ionen

642,2 605,6

1 1

15/26 13/22

K.VS$FLSALEEYTK.K

S228

2

3,58

0,89 1321,1

1

19/22

V.K#DLATVYVDVLK.D R.VKDLATVYVD#V.L R.VK#DLATVYVDVLK.D V.S#FLSALEEYTK.K

K12 D20 K12 S228

2 2 2 2

3,69 2,85 2,68 2,64

0,81 1783,2 0,74 746,6 0,65 655,9 0,76 1123,9

1 1 1 1

19/22 14/20 14/24 15/20

1:5 Ansatz nach 168h/37°C K.LLD$NWDSVTSTFSK.L

D48

2

3,68

0,75 1274,2

1

18/26

K.LLDNWDSVTSTFSK~L.R K59 2 3,09 0,81 608,3 1 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

16/28

Die Tabelle enthält neun mit einem der vier Cisplatinfragmente modifizierte Peptide des Apolipoproteins A1. Von den bei dem 1:1 bzw. 1:5 Ansatz ermittelten Bindungsstellen wurden K23 und S228 in der ersten und D48 in der zweiten Blutserumprobe identifiziert. Für die sowohl aus der ersten Blutserumprobe als auch aus dem äquimolaren Protein:Cisplatin Ansatz identifizierte mögliche Bindungsstelle aus der Sequenz [227VS$FLSALEEYTK338]2+, in der das Serin 228 mit [(NH3)Pt]2+ koordiniert wird, ist nachfolgend das experimentell bestimmte MS/MS-Spektrum abgebildet.

Serumproteine

159

Abb.6.27: MS/MS-Spektrum von [VS$FLSALEEYTK]2+ aus dem 1:1 Ansatz ApoA1:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Von 22 möglichen Ionen der genannten Sequenz wurden von SEQUEST 19 b+- und y+- Ionen (im Spektrum 14 Ionen) zugeordnet. Die Ionen b5+ bis b11+, aber keines der y+-Ionen (y11+ im Spektrum nicht dargestellt) sind platiniert. In benachbarter Position zu S228 finden sich ein weiteres Serin (S231), Glutaminsäuren (E234 und E235) sowie Tyrosin (Y236), welche als potentielle Bindungsstelle für Cisplatin in Frage kommen könnten. Wie aus den SEQUESTParametern der Tabelle 6.24 und der fehlenden Platinverteilung der Ionen y8+- y10+ ersichtlich, können diese Koordinationspositionen alle ausgeschlossen werden.

Serumproteine

160

Tab.6.24: SEQUEST-Parameter von [VS$FLSALEEYTK]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen aus dem 1:1 Ansatz ApoA1:Cisplatin nach 3h Inkubation bei 37°C Sequenz K.VS$FLSALEEYTK.K K.VSFLS$ALEEYTK.K K.VSFLSALE$EYTK.K K.VSFLSALEE$YTK.K K.VSFLSALEEY$TK.K -.MKAAVLTLAVLFL.T Q.E$E$MELY$R.Q Q.EE$M$ELY$R.Q -.M$KAAVLTLAVLFL.T Q.E$EM$ELY$R.Q

XCorr 3,578 2,371 1,458 1,018 0,551 0,41 0,391 0,364 0,36 0,351

∆Cn 0 0,337 0,593 0,715 0,846 0,885 0,891 0,898 0,899 0,902

Sp 1321,1 410,3 133,3 88,1 32,9 18,6 63,8 38,1 18,6 38,1

RSp 1 2 3 4 8 17 5 7 17 7

Ionen 19/22 13/22 8/22 7/22 5/22 4/24 4/12 3/12 4/24 3/12

Weitere mögliche Peptidsequenzen mit der Masse m/ = 1597 (innerhalb der Genauigkeit von ∆m ± 2,5) sind in der Tabelle aufgelistet. Da jedoch bei allen diesen Sequenzen die SEQUEST-Werte unzureichend sind (alle Sp-Werte < 500), wird deutlich, dass die Zuordnung der Bindungsstelle in [VS$FLSALEEYTK]2+ für die Aminosäure S228 eindeutig ist. Werden nun die Bindungsstellen aus allen Analysen verglichen (sowohl Blutserum als auch einzelne Protein:Cisplatin-Ansätze), lässt sich erkennen, dass drei Bindungsstellen bestätigt werden konnten: K23, D48 und S228. In der folgenden Abbildung ist die Gesamtstruktur des Serumproteins mit den drei Seitenketten zu sehen, die als bevorzugte Bindungsstellen für Cisplatin identifiziert werden konnten. D48

K23

S228 Abb.6.28: Struktur des Proteins Apolipoprotein A1

Serumproteine

161

Aus der Abbildung wird deutlich, dass die gekennzeichneten Seitenketten leicht zugänglich für eine Cisplatinkoordination lokalisiert sind. Aus der Struktur wird jedoch auch ersichtlich, dass der parallele Aufbau der α-Helices des Proteins mehrere nicht spezifische Angriffsstellen für Metallkomplexe bietet. So ist es auch zu erklären, dass weitere Bindungsstellen (D20, K59, D73, E110 und T237) bei den einzelnen Analysen gefunden wurden. Es fällt auf, dass nur N(Amino)- bzw. O-Donoratome ermittelt wurden. Die geringe Zahl der identifizierten Bindungsstellen (zwei Peptidsequenzen, s. Tab. 6.23) bei dem 1:5 Ansatz spricht auch dafür, dass Apolipoprotein A1 keine spezifischen Koordinationspositionen aufweist. Nach 168h Inkubation ist deswegen eine gleichmäßige Verteilung der Cisplatinfragmente über viele Positionen zu vermuten.

6.4. Cisplatinaddukte des Alpha-1-Antitrypsins Blutserumproben

In den MudPIT-Analysen der beiden Blutserumproben konnten platinierte Peptidsequenzen des abundanten Serumproteins Alpha-1-Antitrypsin detektiert werden. Davon sind sechs Proteinabschnitte mit einem Metallkomplexrest modifiziert. Die Liste der koordinierten Proteinstücke ist in Tabelle 6.25 zu sehen.

Tab.6.25: Koordinierte Peptidsequenzen aus Alpha-1-Antitrypsin aus den MudPIT-Analysen der ersten und zweiten Blutserumprobe Peptid erste Blutserumprobe K.FNK§PFVFLMIEQNTK.S

Bindungsstelle z XCorr ∆Cn

Sp

RSp Ionen

K368

3

4,67

0,16 1018,7

3

24/56

L.NQPD$SQLQLTTGNGLFLSEGLK.L

D107

2

3,12

0,28 651,1

2

15/42

zweite Blutserumprobe K.FNK§PFVFLMoxIEQNTK.S

K368

3

4,69

0,24 1157,1

1

25/56

Q.HLE$NELTHDIITK.F L.NQPD$SQLQLTTGNGLFLSEGLK.L

E264 D107

2 2

3,66 3,44

0,21 1365,7 0,34 781,4

1 1

18/24 16/42

N.K#PFVFLMoxIEQNTK.S K368 2 4,84 0,31 1617,9 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

1

21/24

Serumproteine

162

Das Alpha-1-Antitrypsin ist ein etwa 47 kDa großes Protein, welches aus 418 Aminosäuren besteht. Das Antitrypsin hemmt Serinproteasen und schützt das Körpergewebe vor an Entzündungsprozessen beteiligten Enzymen [139]. Von den insgesamt sechs Peptidsequenzen aus Tabelle 6.25 sind die Koordinationsstellen D107 und K368 aus beiden und E264 aus der zweiten Blutserumprobe identifiziert worden. Das MS/MS-Spektrum des fragmentierten Molekülpeaks der an der Aminosäure Lysin 368 mit [Pt]2+ koordinierten Sequenz [366FNK§PFVFLMIEQNTK380]3+ ist exemplarisch für die koordinierten Peptidsequenzen aus diesem Protein in der Abbildung 6.29 dargestellt.

Abb.6.29: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [FNK§PFVFLMIEQNTK]3+ in A1AT aus der ersten Blutserumprobe

Das Spektrum enthält 14 der möglichen 56 (einfach und zweifach geladene, so dass SEQUEST 24 zuordnet) b+- und y+-Ionen der Sequenz [FNK§PFVFLMIEQNTK]3+. Entsprechend der Koordination an K368 sind die Ionen b3+ bis b14+ und y13+ und y14+ platiniert. Bei vielen der im Spektrum zugeordneten b+-Ionen lässt sich diese Verteilung erkennen.

Serumproteine

163

Die nachfolgende Tabelle listet weitere Peptidsequenzen auf, deren theoretische MS/MSSpektren mit dem aufgenommenen Spektrum Übereinstimmungen ergeben. Dabei sind neun Proteinstücke mit absteigenden XCorr-Werten dargestellt. Tab.6.26: SEQUEST-Parameter von [FNK§PFVFLMIEQNTK]3+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen in A1AT aus der ersten Blutserumprobe Sequenz K.FNK§PFVFLMIEQNTK.S K.NLY§KDVMoxLENFRNLA.S T.VC§H§HIENVLKEDAR.G K.NLYK§DVMoxLENFRNLA.S K.NLYKD§VMoxLENFRNLA.S T.VC§HH§IENVLKEDAR.G T.VCH§H§IENVLKEDAR.G N.K§AVQLENELENFT§K.Q L.TVRC§E§ALTGELETLK.E -.APRT§LLQVLQDPALK§.-

XCorr 4,666 3,919 3,597 3,562 3,344 3,341 3,307 3,042 3,041 2,635

∆Cn 0 0,16 0,229 0,236 0,283 0,284 0,291 0,348 0,348 0,435

Sp 1018,7 938,6 1056 772,2 561,6 824,8 848 604,3 527,1 1148,8

RSp 3 5 2 23 234 17 10 140 373 1

Ionen 24/56 23/56 24/52 22/56 19/56 22/52 22/52 18/52 19/56 25/56

Protein A1AT_HUMAN ZN177_HUMAN DTX1_HUMAN ZN177_HUMAN ZN177_HUMAN DTX1_HUMAN DTX1_HUMAN MFN1_HUMAN CCD89_HUMAN ICB1_HUMAN

Die SEQUEST-Werte der Proteine zn177, dtx1, mfn1, ccd89 und icb1 sind im Vergleich zu der oben diskutierten Sequenz deutlich schlechter, obgleich ihre Sp-Werte die gewählten Kriterien (Sp-Wert ≥ 500) erfüllen. Die schlechtere Zuordnung zeigt sich jedoch in den ∆CnWerten deutlich (∆Cn ≥ 0,16). Somit kann bei diesem Proteinstück auf Grund des Vorliegens von platinierten Ionen im MS/MS-Spektrum und der SEQUEST-Parameter die Aminosäure K368 als Bindungsstelle eindeutig bestätigt werden. Diese Bindungsstelle konnte, wie aus Tabelle 6.25 hervorgeht, zweimal bei der zweiten Blutserumprobe ebenfalls identifiziert werden. Die Zugänglichkeit der Seitenkette des Lysins lässt sich in dem in der Abbildung 6.30 dargestellten Ausschnitt aus der Proteinstruktur zeigen.

Serumproteine

164

K368

Abb.6.30: Ausschnitt aus der Proteinstruktur von Alpha-1-Antitrypsin (PDB ID: 1hp7 [139])

Die Seitenkette ist, wie aus der Abbildung erkennbar, in einer Schleife lokalisiert, die zu einer Bindungstasche gehört. Somit kann K368 von dem Cisplatinfragment leicht koordiniert werden. Mit dem reinen Serumprotein Alpha-1-Antitrypsin wurden ebenfalls Reaktionsansätze mit Cisplatin untersucht. Dabei sind wiederum Produkte des äquimolaren Protein-CisplatinGemisches nach 3h und des 1:5 -Gemisches nach 168h Inkubation bei 37 °C analysiert worden. Beide Analysen ergaben jedoch keine mit einem Cisplatinfragment koordinierten Peptidsequenzen, deren SEQUEST-Parameter die gewählten Kriterien erfüllen (XCorr ≥ 3,3 für dreifach, XCorr ≥ 2,4 für zweifach geladene Molekülionen; ∆Cn ≥ 0,1; Sp-Wert ≥ 500; RSp-Wert ≤ 5; ∆m ± 2,5 und 30% Ionenzuordnung). Aus den beiden Blutserumproben konnten somit D107 und K368 als Cisplatinbindungsstellen ermittelt werden. Die Koordination von E264 konnte nicht bei A1AT:Cisplatin Ansätzen bestätigt werden. Die zweifach beobachtete Koordination des O- und die des N(Amino)Donoratoms weist darauf hin, dass es sich bei D107 und K368 um spezifische Bindungsstellen des Cisplatins handelt. Beide Seitenketten können in der folgenden Darstellung in der Gesamtstruktur des Alpha-1-Antitrypsins betrachtet werden.

Serumproteine

165

D107

K368 Abb.6.31: Proteinstruktur von Alpha-1-Antitrypsin

Die Seitenketten der koordinierten Aminosäuren D107 und K368 sind in flexiblen Schleifen lokalisiert, wobei D107 an der Oberfläche und K368 in einer Bindungstasche gelegen sind.

6.5. Cisplatinaddukte des Alpha-2-Macroglobulins

In der Literatur [90] wurde aus Reaktionen von Cisplatin und NAMI-A mit Blutserum das Alpha-2-Macroglobulin (A2MG) als Proteintarget massenspektrometrisch charakterisiert. In dieser Studie konnte jedoch keine Bindungsstelle bestimmt werden, lediglich eine Adduktbildung zwischen dem Protein und Cisplatin wurde bestätigt. Aus der MudPITAnalyse der zweiten Blutserumprobe konnte das koordinierte Protein ebenfalls detektiert werden (siehe Tabelle 6.27).

Tab.6.27: Koordinierte Peptidsequenzen von A2MG aus der zweiten Blutserumprobe Sp RSp Ionen Peptid Bindungsstelle z XCorr ∆Cn R.LLIYAVLPTGDVIGDS~.A S532 2 2,88 0,33 744,3 1 22/30 S.NE#EVMoxFLTVQVK.G E75 2 4,32 0,12 1511,5 1 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

17/22

Serumproteine

166

Die Tabelle enthält zwei Peptidsequenzen aus dem etwa 168 kDa großen Protein. Es wurden die Seitenketten eines Serin und einer Glutaminsäure des Proteins platiniert. Die Peptidsequenz [74NE#EVMoxFLTVQVK85]2+ wurde von dem Metallrest [(NH3)2PtCl]+ an der Glutaminsäure 75 koordiniert. In direkt benachbarter Position steht für eine mögliche Cisplatinkoordination eine weitere Glutaminsäure zur Verfügung. Das zugehörige MS/MSSpektrum in der nachstehenden Abbildung soll klären, ob eine Entscheidung zu Gunsten einer dieser Aminosäuren als Koordinationsstelle gefällt werden kann.

Abb.6.32: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [NE#EVMoxFLTVQVK]2+ in A2MG aus der zweiten Blutserumprobe

In dem Spektrum konnte eine Zuordnung von 17 Ionen von insgesamt 22 möglichen erfolgen. Die Ionen b2+, b5+- b11+ und y2+- y4+ und y6+- y10+ sind dargestellt. Bei einer E75-Koordination sollen alle beobachteten b+-Ionen platiniert sein. In der folgenden Tabelle sind andere mögliche Peptidsequenzen mit der Masse m/z = 1717 (∆m ± 2,5) aufgelistet.

Serumproteine

167

Tab.6.28: SEQUEST-Parameter von [NE#EVMoxFLTVQVK]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen in A2MG aus der zweiten Blutserumprobe Sequenz S.NE#EVMoxFLTVQVK.G -.NEE#VMoxFLTVQVK.-.K#NEM#LLSKVK.-.FVKSLNK#QMNPF.-.IYDGGARTE#DEVQ.-.PYLTVDQMoxMDFINL.-.IYDGGARTED#EVQ.-.FVKSLNKQM#NPF.-.K#NE#MLLSKVK.-.PYLTVDQMMoxDFINL.-

XCorr 4,324 4,022 3,795 3,65 3,498 3,469 3,434 3,408 3,404 3,342

∆Cn 0 0,07 0,122 0,156 0,191 0,198 0,206 0,212 0,213 0,227

Sp RSp Ionen Protein 1511,5 1 17/22 A2MG_HUMAN 1121,6 2 15/22 A2MG_HUMAN 919,4 9 13/18 CCD93_HUMAN 1031,3 3 15/22 XPOT_HUMAN 733,3 38 13/24 CLD18_HUMAN 815,1 23 15/26 PLCB1_HUMAN 725,5 44 13/24 CLD18_HUMAN 780,6 29 14/22 XPOT_HUMAN 715 49 12/18 CCD93_HUMAN 811,5 24 15/26 PLCB1_HUMAN

Aus der Tabelle wird deutlich, dass neben E75 auch die benachbarte Glutaminsäure E76 als potentielle Bindungsstelle in Frage kommt. Anhand des beobachteten b2+-Ions in dem MS/MS-Spektrum (Abb. 6.32), welches bei der Bindung an E76 nicht vorkommen sollte und kein Platinpattern aufweisen dürfte, kann E75 als die wahrscheinlich bevorzugte Stelle angesehen werden. Die vergleichbaren ∆Cn-Werte (und weitere Parameter, wie Sp-Werte) der Peptidsequenzen beider Koordinationsstellen lassen jedoch keine eindeutige Entscheidung zu Gunsten einer dieser Bindungsstellen zu. Das Serumprotein Alpha-2-Macroglobulin wurde außerdem mit Cisplatin nach 3h und nach 168h Inkubation bei 37 °C bei einem Protein:Metallkomplex-Verhältnis von 1:5 sowie beim 1:1 Verhältnis nach 3h Inkubation auf entstandene Produkte untersucht, die in der Tabelle 6.29 aufgelistet sind.

Serumproteine

168

Tab.6.29: Koordinierte Peptidsequenzen aus den Ansätzen A2MG:Cisplatin nach 3h (1:1 und 1:5) und nach 168h (1:5) Inkubation bei 37°C Peptid 1:1 Ansatz nach 3h/37°C L.FFT§VLQDVPVR.D

Bindungsstelle z XCorr ∆Cn

Sp

RSp Ionen

T1409

2

2,85

0,31

532,4

1

11/20

1:5 Ansatz nach 3h/37°C L.FFT§VLQDVPVR.D

T1409

2

2,66

0,14

580,4

2

11/20

L.IY~AVLPTGDVIGDSAK.Y

Y520

2

3,34

0,44

659,3

1

20/30

S.NE#EVMoxFLTVQVK.G S.NE#EVMFLTVQVK.G

E75 E75

2 2

4,33 4,06

0,31 1286,7 0,33 1473,1

1 1

16/22 17/22

1:5 Ansatz nach 168h/37°C K.M§VSGFIPLKPTVK.M F.FT§VLQDVPVR.D

M1362 T1409

2 2

2,87 2,86

0,57 1906,9 0,55 1366,5

1 1

22/24 14/18

K.DMYSFLED~MoxG.L

D649

2

2,78

0,58

1

12/18

1 1

28/60 15/22

801,0

L.LQQVS#LPELPGEYSMK.V S1281 3 4,04 0,52 1037,1 S.NE#EVMFLTVQVK.G E75 2 3,04 0,29 1087,2 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

In der Tabelle findet sich beim 1:1 Ansatz die Peptidsequenz [1430FFT§VLQDVPVR1440]2+, welche an der Seitenkette des Threonins 1409 von [Pt]2+ koordiniert wird. Dieses Ergebnis, dass nur eine metallierte Peptidsequenz in ausreichender Konzentration vorliegt um identifiziert werden zu können, erscheint nachvollziehbar, wenn die Größe des Proteins (1474 Aminosäuren und etwa 163 kDa) gegenüber der äquimolaren Umsetzung mit Cisplatin in Betracht gezogen wird. Die Reaktionen mit einem 5:1 Metallkomplexüberschuss liefern dagegen mehrere koordinierte Peptidsequenzen. Nach 3h Inkubation sind vier Peptide aus dem Serumprotein von einem der Cisplatinfragmente koordiniert und identifiziert worden. Die Aminosäuren T1409 und Y250 sowie zweimal E75 wurden mit einem Metallfragment modifiziert. Bei dem 1:5 Ansatz mit längerer Inkubationszeit von 168h bei 37°C konnten fünf von einem Cisplatinfragment koordinierte Peptidsequenzen identifiziert werden. Dabei wurden jeweils einmal M1362, T1409, S1282, D649 und E75 modifiziert. Eine Betrachtung der Cisplatin-Bindungsstellen in der Gesamtproteinstruktur entfällt an dieser Stelle, da von der Struktur nur kurze Fragmente bekannt sind und die entsprechenden

Serumproteine

169

Bindungsstellen nicht dargestellt werden können. Es lässt sich feststellen, dass eine spezifische Bindung des Cisplatins an die Aminosäuren E75 und T1409 vermutet werden könnte, da diese jeweils aus drei unterschiedlichen Analysen als Koordinationsstellen identifiziert werden konnten.

6.6. Proteintargets in Apolipoprotein A2

Aus beiden Blutserumproben konnten Peptidsequenzen eines weiteren abundanten Proteins detektiert werden, des Apolipoproteins A2 (ApoA2). Es handelt sich hierbei um ein etwa 11 kDa großes Protein mit 100 Aminosären, welches die HDL-Struktur (high density lipoprotein) stabilisieren kann. Die Liste der identifizierten Peptide, welche mit einem Cisplatinfragment modifiziert wurden, ist in der Tabelle 6.30 dargestellt.

Tab.6.30: Koordinierte Peptidsequenzen des Apolipoproteins A2 aus der ersten und zweiten Blutserumprobe Sp RSp Ionen Peptid Bindungsstelle z XCorr ∆Cn erste Blutserumprobe K.KAGTELVNFLSYFVELGT§QP.A T72 2 4,19 0,38 1288,4 1 21/38 E.PC$VESLVSQYFQTVTDYGK.D

C6

2 3,94

0,26

542,3

1

17/36

K.KAGTELVNFLSYFVELGT~QPA.T V.E~SLVSQYFQTVTDYGK.D

T72 E8

2 3,65 2 5,46

0,18 1252,1 0,52 1886,5

1 1

21/40 22/30

P.C#VESLVSQYFQTVTDYGK.D

C6

2 3,65

0,25 1186,7

1

21/34

zweite Blutserumprobe P.C§VESLVSQYFQTVTDYGK.D C6 2 4,54 0,49 1193,5 § = [Pt]2+, $ = [(NH3)Pt]2+, ~ = [(NH3)2Pt]2+, # = [(NH3)2PtCl]+

1

22/34

In der Tabelle finden sich sechs von einem der Cisplatinfragmente koordinierte Peptide. Es lässt sich erkennen, dass in beiden Blutserumproben Cystein 6 bzw. Glutaminsäure 8 koordiniert vorliegt. Es wurde aus der ersten Blutserumprobe zweimal die Modifizierung von T72 identifiziert, wobei sich beide Sequenzen um eine Aminosäure (Alanin am C-Terminus) unterscheiden.

Serumproteine Das

MS/MS-Spektrum

170 des

halbtryptisch

gespaltenen

Peptids

der

Sequenz

[6C#VESLVSQYFQTVTDYGK23]2+, welches in beiden Serumproben mit dem Fragment [(NH3)2PtCl]+ platiniert wurde, ist in der Abbildung 6.33 zu finden.

Abb.6.33: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [C#VESLVSQYFQTVTDYGK]2+ in ApoA2 aus der ersten Blutserumprobe

Aus der an der Aminosäure C6 koordinierten Sequenz sind insgesamt 18 Fragmentionen (21 Ionen von SEQUEST zugeordnet) mit sechs b+- und 12 y+-Ionen zugeordnet worden. Die Ionen b1+ bis b17+ und keine aus der y+-Reihe sollten für eine C6-Koordination platiniert sein. Jedoch kann diese Tatsache nicht für die bj+-Ionen mit j ≤ 4 eindeutig bestimmt werden. Das Peptid enthält neben C6 mit E8 und S9 weitere potentielle Bindungsstellen für das Cisplatin. Die potentiellen Sequenzen mit der Masse von m/z = 2331 (Massenbereich ∆m ± 2,5) sind in der Tabelle 6.31 aufgelistet.

Serumproteine

171

Tab.6.31: SEQUEST-Parameter von [C#VESLVSQYFQTVTDYGK]2+ im Vergleich zu anderen potentiellen Peptidsequenzen in ApoA2 aus der ersten Blutserumprobe Sequenz XCorr P.C#VESLVSQYFQTVTDYGK.D 3,653 P.CVE#SLVSQYFQTVTDYGK.D 3,614 P.CVES#LVSQYFQTVTDYGK.D 3,432 I.C#STAQRMoxYQSLEHELQK.H 2,735 P.CVESLVS#QYFQTVTDYGK.D 2,696 R.C#IDSGLWVPNSKASEAK#.E 2,596 R.C#IDSGLWVPNSK#ASEAK.E 2,582 R.T#FAAQSLVQLLSKLPCGEY.A 2,574 R.C#IDSGLWVPNSKAS#EAK.E 2,518 R.C#IDSGLWVPNSKASE#AK.E 2,438

∆Cn 0 0,011 0,06 0,251 0,262 0,289 0,293 0,295 0,311 0,333

Sp RSp Ionen Protein 1186,7 1 21/34 APOA2_HUMAN 945,2 2 19/34 APOA2_HUMAN 812,5 3 18/34 APOA2_HUMAN 274,2 154 11/32 SYNE1_HUMAN 355,6 30 13/34 APOA2_HUMAN 437 7 14/32 CDC37_HUMAN 382,6 18 13/32 CDC37_HUMAN 256,6 223 12/36 CNDD3_HUMAN 382,6 18 13/32 CDC37_HUMAN 382,6 18 13/32 CDC37_HUMAN

Aus dem Protein Apolipoprotein A2 ist die oben genannte Sequenz mit den drei unterschiedlichen Bindungsstellen in der Tabelle aufgeführt. Die Bindungsstellen C6, E8 und S9 ergeben mit dem theoretischen Spektrum des Peptids die besten Übereinstimmungen mit dem aufgenommenen Spektrum, so dass nur diese Modifikationen die SEQUEST-Kriterien erfüllen. Bei den unter Abb. 6.33 zugeordneten Ionen b1+ und b2+ lässt sich keine Platinverteilung erkennen, die im Falle einer Koordination an Cystein zu beobachten sein müsste. Die yk+-Ionen werden außerdem nur für k ≤ 15 beobachtet, was möglicherweise für die E8-Koordinaiton sprechen würde. Ein weiterer Hinweis auf eine Platinierung von E8 ist die Identifizierung einer Peptidsequenz aus der ersten Blutserumprobe, welche an Valin 7 gespalten wurde (siehe Tab. 6.30). Die vermutlich spezifische Koordinationsstelle E8 (oder C6, S9) für Cisplatin ist in der folgenden Abbildung 6.34 dargestellt.

S9 E8

C6 Abb.6.34: Ausschnitt aus der Proteinstruktur von Apolipoprotein A2 (PDB ID: 2ou1 [140])

Serumproteine

172

Die Vergrößerung aus der Struktur in der oberen Abbildung enthält den vermutlich von Cisplatin koordinierten Bereich des Proteins. Die Seitenketten der drei möglichen Koordinationsstellen C6, E8 und S9 sind alle sterisch für eine Cisplatinkoordination leicht zugänglich, wie in der Abbildung zu erkennen ist.

6.7. Cisplatinaddukte weiterer abundanter Proteine

Neben den bisher diskutierten abundanten Serumproteinen konnten aus den MudPITAnalysen der beiden Blutserumproben weitere Proteintargets detektiert werden. Im Folgenden ist eine Auswahl von sieben Proteinen dargestellt, welche mit entsprechenden Peptidsequenzen aus beiden Messreihen identifiziert werden konnten.

Tab.6.32: Weitere koordinierte Serumproteine aus beiden Blutserumproben Protein A1AG1_HUMAN APOC2_HUMAN CERU_HUMAN HV305_HUMAN IGHG2_HUMAN IGHG3_HUMAN TTHY_HUMAN

BindungsPeptid stelle z XCorr ∆Cn K.T~YMLAFDVNDE.K T109 2 3,07 0,19 A.AM#STYTGIFTDQVLSVLK.G M60 2 3,77 0,21 I.S~VDTEHSNIYLQNGPDR.I S27 2 6,01 0,46 -.EVQLVESGGGLVQPGGS~L.R S17 2 3,46 0,19 V.S~VLTVVHQDWLNGK.E S183 2 5,05 0,43 V.S~VLTVLHQNWLDGK.E S147 2 5,62 0,38 R.YTIAALLSPYSYSTTAVVT~N.P T123 2 4,29 0,36 2+ 2+ 2+ § = [Pt] , $ = [(NH3)Pt] , ~ = [(NH3)2Pt] , # = [(NH3)2PtCl]+

Sp RSp Ionen 1181,1 1 15/20 640,8 2 15/34 1560,6 1 21/32 1194,6 1 19/34 2351,1 1 23/26 2830,0 1 23/26 1254,0 1 25/38

Es handelt sich dabei um die Proteine: Alpha-1-Glycoprotein, Apolipoprotein C2, Ceruloplasmin, Ig heavy chain V-III-Protein, Ig gamma-2 und -3 chain C-Proteine und das Prealbumin. Auch bei diesen Proteinen wurden im Wesentlichen die kinetisch bevorzugten Bindungsstellen für Cisplatin identifiziert (Methionin, Serin und Threonin). Aus beiden Blutserumanalysen konnten auch einige nicht abundante Proteine identifiziert werden, deren experimentelle MS/MS-Spektren mit den theoretischen Spektren gute Übereinstimmungen ergeben. Bei seiner Studie mit S. cerevisiae konnte YATES [141] zeigen, dass 71,6% aller abundanten Proteine mit etwa 104-105 Kopien pro Zelle aus einem MudPIT-Lauf identifiziert werden können, wogegen es nur noch 6,5% sind bei 102-103 Kopien pro Zelle sind. Wird die Tatsache berücksichtigt, dass durchschnittlich nur etwa 30-50% der Peptidsequenzen bei abundanten Proteinen durch MudPIT detektiert werden, bedeutet dies, dass sicherlich nur ein kleiner Anteil der nicht abundanten Proteintargets durch MudPIT identifiziert werden können.

Serumproteine

173

Es konnten nur wenige Proteine als Targets für Cisplatin in beiden Analysen identifiziert werden, vor allem auch wenige Proteine mit für die DNA-Reparatur oder Apoptose-Induktion relevanten Funktionen. Um falsche Schlussfolgerungen zu vermeiden, wird auf eine detaillierte Auflistung dieser Proteine verzichtet. Bemerkenswert ist die CisplatinKoordination von Proteinen wie MSH6 (DNA mismatch repair protein), Helikasen, unterschiedliche Zinkfinger-Formen, Topoisomerasen oder HMGA2 (high mobility group protein), die allerdings nur jeweils in einer der beiden Blutserumproben identifiziert wurden. In beiden Blutserumproben konnte allerdings eine Koordination an ein ssbP3-Protein (singlestranded DNA-binding protein 3) detektiert werden, jedoch ist diese an zwei unterschiedlichen Serinseitenketten (S142 und S306) erfolgt, so dass daraus nicht auf eine spezifische Wechselwirkung des Cisplatins mit dem Protein geschlossen werden kann.

6.8. Diskussion Für die einzelnen Serumproteine wurden in den zugehörigen Unterkapiteln Tabellen mit den koordinierten Peptidsequenzen des jeweiligen Proteins zu allen durchgeführten Analysen aufgelistet. An dieser Stelle werden die Bindungsstellen des Cisplatins in den Proteinen erneut betrachtet, um mögliche charakteristische Wechselwirkungen zu erkennen. Bei den Untersuchungen der Interaktionen zwischen Metallkomplexen wie Cisplatin und Serumproteinen ist bisher nur wenig über genaue Bindungsstellen bekannt. Beispielweise konnte aus der Reaktion zwischen Serotransferrin und Cisplatin eine Koordinationsstelle des [(NH3)2PtCl]+-Fragmentes an Threonin 457 durch „bottom-up“ ESI-MS/MS identifiziert werden (siehe Kapitel 3) [137]. Das Cystein 34 im Serumalbumin wurde von den Arbeitsgruppen GONIAS und PIZZO [142] und MOMBURG et al [143] durch biochemische Techniken als Bindungsstelle des Cisplatins identifiziert. Wie aus den Tabellen 6.1, 6.2, 6.8 und 6.9 ersichtlich wird, konnten in den unterschiedlichen Analysen Cystein 34 bzw. die benachbarten Seitenketten E37, D38 und H39 des Serumalbumins als eine Cisplatinbindungsstelle identifiziert werden. Wie jedoch bereits beim Beispiel aus Tabelle 6.11/Abb. 6.10-6.13 deutlich wird, stellen diese durch SEQUEST bevorzugten Koordinationsstellen meist nicht die einzig möglichen Bindungsstellen dar. In allen MS/MS-Spektren der betroffenen Sequenz konnten keine bj+-Ionen für Fragmente mit Aminosäureresten ab 34 beobachtet werden. Das gilt für die nicht dargestellten MS/MSSpektren

dieser

Sequenz

und

deutet

auf

eine

tatsächliche

Koordination

des

Cisplatinfragmentes an Cystein. Der in Tabelle 6.1 angegebene XCorr-Wert für die Histidin-

Serumproteine

174

Koordination als beste Zuordnung ist durch eine SEQUEST-Zuordnung von y+-Ionen im niedrigen Massenbereich entstanden. Die Peaks solcher Ionen weisen allerdings häufig vernachlässigbare Intensitäten auf und befinden sich in einem Bereich (m/z ≤ 800) mit hohem Untergrundrauschen. Die Zuordnung ist deswegen vielfach unzuverlässig. Im Einklang mit den Beobachtungen anderer Gruppen [142-144] deuten diese darauf hin, dass die freie Thiolgruppe des C34 in der Tat die bevorzugte Bindungsstelle für das Cisplatin aufweist. Die Gruppe um NEAULT [144] konnte mit Hilfe von IR-Studien zeigen, dass Tyrosinseitenketten aus dem Serumalbumin an einer Cisplatinbindung beteiligt sind. Sowohl bei den einzelnen Analysen mit Blutserum als auch mit dem reinen Protein konnten Peptidsequenzen mit den koordinierten Tyrosinresten Y148 oder Y150 identifiziert werden. Dabei wurden Sequenzen mit unterschiedlichen Spaltungen beobachtet, die keine klare Zuordnung von Y148 bzw. Y150 ermöglichen. SADLERS NMR-Studien fanden kein Indiz dafür, dass Histidin in die Cisplatinbindung involviert sein könnte, so dass die benachbarte Aminosäure H146 als Angriffsstelle ausgeschlossen wird. Wie aus den Auflistungen erkennbar, scheinen die Tyrosinseitenketten des Y148 und Y150 als Bindungsstellen zu konkurrieren.

Aus

der

äquimolaren

Cisplatin-Albumin-Analyse

konnte

auch

eine

2+

Modifizierung mit dem [Pt] -Rest identifiziert werden, so dass bei dieser Koordination eine Beteiligung beider Seitenketten nicht ausgeschlossen wird. Die Möglichkeit einer gleichzeitigen Koordination lässt sich in der Vergrößerung aus der Proteinstruktur gut zeigen.

Y150

Y148 Abb.6.35: Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serumalbumins

Serumproteine

175

Aus Abbildung 6.35 wird deutlich, dass beide Seitenketten in einer Schleife liegen und in direkter Nachbarschaft zueinander stehen. Zu der mit [(NH3)2PtCl]+ koordinierten Peptidsequenz [145RH#PYFYAPELLFFA158]2+ aus Tabelle 6.1 wird an dieser Stelle das MS/MS-Spektrum dargestellt (Abb. 6.36).

Abb.6.36: MudPIT-MS/MS-Spektrum von [RH#PYFYAPELLFFA]2+ aus Serumalbumin der ersten Blutserumprobe

Das Ausschließen der Histidin-Koordination wurde oben diskutiert. In dem dargestellten Spektrum der oben genannten Peptidsequenz wird deswegen nach Hinweisen für Y148 oder Y150 als Bindungsstelle gesucht. Ein Anhaltspunkt für die Bevorzugung der Koordination an Y148 bietet die fragliche Zuordnung des Ions y12+ in Abbildung 6.36, die als Einzellinie zu beobachten ist. Die sehr geringe Intensität dieses Peaks stellt die Zuordnung in Frage, so dass sie Anzeichen auf die bevorzugte Bindung an Aminosäure Y148 darstellt. Die Tatsache, dass die y9+- und y10+-Ionen ebenfalls im Vergleich zu y7+ und y8+ sehr wenig intensiv sind, lässt jedoch auch eine Y150-Bindungsstelle zu. Mittels NMR-Spektroskopie (1H,

15

N HSQC) konnte aus dem Gemisch aus Serumalbumin

und Cisplatin nach einer Inkubation von 24h/37°C ein κ2SM,NM-Komplex charakterisiert

Serumproteine

176

werden [61]. Wegen seiner Lokalisierung auf der Oberfläche des Proteins wurde von den Autoren das Methionin 298 als Bindungsstelle vermutet. Bei dieser Studie wurden auch Addukte mit der Thiolgruppe des Cysteins 34 und an weiteren Methioninstellen beobachtet. Die Lage der M298 in der Proteinstruktur ist in der folgenden Abbildung gezeigt.

M298 Abb

Abb.6.37: Proteinstruktur des Serumalbumins

Die 2D-NMR-Analysen weisen somit daruf hin, dass die Aminosäure Cystein C34 nicht die einzige bevorzugte Angriffsstelle für Cisplatin darstellt [61]. Außer M298 wurden auch die Methioninpositionen 87 und 446 auf Grund ihrer Zugänglichkeit an der Oberfläche auch als mögliche Koordinationsstellen diskutiert. Das von SADLER aufgestellte Reaktionsschema zur Reaktion von Serumalbumin mit Cisplatin ist in Kapitel 3 in der Abildung 3.6 gezeigt. Das

Serumprotein

Albumin

weist

in

seiner

Proteinsequenz

insgesamt

sechs

Methioninpositionen auf: M87, M123, M298, M329, M446 und M548. Aus Tabellen 6.1, 6.2, 6.7-6.9 ist erkennbar, dass von den sechs Methioninseitenketten zwei (M329 und M548) sowohl aus den MudPIT- als auch aus den LC-MS/MS-Analysen für die einzelnen Protein-Cisplatin-Analysen als Bindungsstellen für Cisplatin bestätigt werden konnten. Die tryptisch gespaltenen Fragmente mit diesen Methioninstellen würden Peptidsequenzen mit den folgenden Aminosäurenanzahlen ergeben: um M87 12 Aminosäuren, für M123 19 Aminosäuren, für M298 27 Aminosäuren, für M329 13 Aminosäuren, für M446 21 Aminosäuren und für M548 12 Aminosäurenreste. Da das tryptische Fragment um M298 ein Proteinteilstück aus 27 Aminosäuren (S287-K313) liefert,

Serumproteine

177

könnte die Länge des Peptids der Grund dafür sein, dass der Rest massenspektrometrisch nicht detektiert werden kann und keine ausreichende Fragmentierung ergeben würde. Neben den oben diskutierten Bindungsstellen (C34, Y148, Y150, M329 und M548) kann durch die Identifizierung mehrerer koordinierter Peptidsequenzen aus Serumalbumin auch eine Carboxylatgruppe (D375/E376) als Koordinationsstelle charakterisiert werden. Die untere Abbildung zeigt die Proteinstruktur des Serumalbumins mit den CisplatinBindungsstellen.

III B

III A

II B

II A

IB

IA

Abb.6.38: Struktur des Serumalbumins mit den identifizierten Koordinationsstellen

Die Verteilung der identifizierten Bindungsstellen für Cisplatin im Protein wird aus der Darstellung deutlich. Die Lokalisierung der Aminosäurenseitenketten von M329, D375 und M548 an der Oberfläche einzelner α-Helices [145] indiziert ihre Bereitschaft zur Bindung. Dagegen liegen die Seitenketten von C34 und Y150 in flexiblen Schleifen von Bindungstaschen der Subdomäne IA (für C34) und IA/IIA (für Y150). Die folgende Tabelle gibt die gesamte Sequenz für Serumalbumin mit allen 609 Aminosäuren. Dabei ist zu beachten, dass die Nummerierung der Aminosäuren entsprechend der tatsächlichen Proteinkette erfolgt. Für Serumalbumin sind es die Aminosäuren D25-L609. Die mittels MudPIT-Technologie identifizierten Bereiche im Serumalbumin aus der ersten Blutserumprobe-Analyse werden grün markiert. Dabei wurden die folgenden Kriterien

Serumproteine

178

verwendet: XCorr-Werte für einfach XCorr ≥ 1,8, für zweifach XCorr ≥ 2,5 und für dreifach geladene Moleküle XCorr ≥ 3,5; Sp-Werte ≥ 500; Ionenzuordnung ≥ 30% und die erste (mit dem höchsten XCorr-Wert) einbezogene Peptidsequenz zu einer bestimmten Masse. Diese Einstellungen gehören zu den häufig verwendeten in der Proteomik [z. B. 96,146].

Tab.6.33: Die gesamte Proteinsequenz des Serumalbumins mit den massenspektrometrisch detektierten Sequenzen in grün MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQ CPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMAD CCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCA SLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDR ADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDV CKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVN RRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

In der Sequenz wurden alle detektierten Peptidsequenzen grün gekennzeichnet. Daraus ist erkennbar, dass etwa 54% der Aminosäuren aus einem der detektierten Fragmente identifiziert werden konnten. Die oben genannten sechs Methioninstellen sind eingerahmt und es wird deutlich, dass drei Stellen (rot unterlegt) M87, M298 und M446 in keiner der Analysen gefunden wurde. Die fünf detektierten Cisplatinbindungsstellen sind eingerahmt und gelb gefärbt. Ähnliche „coverage“-Werte wurden für die zweite Blutserumprobe sowie für die Einzelanalysen von Serumalbumin erhalten. Den Tabellen 6.12, 6.15, 6.17 und 6.19 können die aus allen Analysen identifizierten Bindungsstellen des Cisplatins im Serotransferrin entnommen werden. Unter den Koordinationsstellen findet sich die Seitenkette des Tyrosins 314. Bei den Untersuchungen des Serotranferrin/Cisplatin-Systems konnten etwas höhere SEQUEST-Parameter für die alternative Koordination an M313 beobachtet werden (Tab. 6.16). Auf Grund einer fraglichen Zuordnung des b+-Ions (z. B. Abb. 6.17), kann jedoch nicht zwischen M313 und Y314 als Bindungsstelle für Cisplatin entschieden werden. Eine Zuordnung zu Y314 wird durch die Beobachtung begründet, dass zusätzlich zu dieser Peptidsequenz [MY§LGYEYVTAIR]2+ mit

Serumproteine

179

der Koordination des [Pt]2+-Fragments auch koordinierte Sequenzen beobachtet wurden, in denen das Methionin fehlt (siehe Tab. 6.19). Aus [1H,

13

C] und [1H,

15

N]-HSQC-NMR

Studien von SADLER konnten außerdem keine Hinweise darauf erhalten, dass M313 an der Koordination des Cisplatins beteiligt ist [58]. In Serotransferrin sind neun Methioninstellen enthalten: M26, M109, M256, M309, M313, M382, M389, M464 und M499 mit den jeweiligen tryptisch gespaltenen Peptidsequenzen der Längen von 9, 10, 5, 4, 12, 21, 21, 14 und 15 Aminosäureresten. Auch hier erfolgt die Nummerierung entsprechend der tatsächlichen Proteinkette (V20-P698). Zur Verdeutlichung der

Lokalisierung

dieser

Aminosäuren

dient

die

folgende

Auflistung

der

Serotransferrinsequenz.

Tab.6.34: Die gesamte Proteinsequenz des Serotransferrins mit den massenspektrometrisch detektierten Sequenzen in grün MRLAVGALLVCAVLGLCLAVPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSV ACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQT FYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKA VANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFV KHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKED LIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGY EYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETT EDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAVA VVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAP GSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQN TGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEAC VHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGE EYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP

In der oberhalb dargestellten Proteinsequenz des Serotransferrins sind wiederum die in einer der Blutserumproben identifizierten Abschnitte grün markiert. Zur Verdeutlichung der Verteilung der Bindungsstellen für Cisplatin aus den Analysen sind auch die modifizierten Bereiche der reinen Protein:Metallkomplex-Gemische eingeteilt. Unter Berücksichtigung der oben genannten Kriterien (XCorr-Werte für einfach XCorr ≥ 1,8, für zweifach XCorr ≥ 2,5 und für dreifach geladene Moleküle XCorr ≥ 3,5; Sp-Werte ≥ 500; Ionenzuordnung ≥ 30%

Serumproteine

180

und die erste (mit dem höchsten XCorr-Wert) einbezogene Peptidsequenz zu einer bestimmten Masse) konnten aus Serotransferrin etwa 51% der Aminosäuren identifiziert werden. Von den oben genannten neun Methioninen konnten drei in keiner der durchgeführten Analysen detektiert werden: M26, M309 und M499. Wie bereits erwähnt untersuchte SADLER die Cisplatinbindungsstellen in humanem Transferrin mittels NMRSpektroskopie [58]. Wie in der folgenden Abbildung aus diesen Studien gezeigt, konnte eine Koordination an M256 und M499 beobachtet werden.

Abb.6.39: 2D [ 1H, 13C] HSQC : A Transferrin; B Transferrin nach Inkubation 24h/37°C aus [58] In der Darstellung sind E und E´ Pt-S13CH3-Gruppen und auf Grund abnehmender Intensitäten der Resonanzen während der Reaktion den Seitenketten von M256 und M499 zugeordnet. Wie aus Tabelle 6.19 ersichtlich, konnte im Rahmen der eigenen Studien die Modifizierung des M256 bei einem fünffachen Cisplatinüberschuss nach einer Inkubation von 168h/37°C beobachtet werden. Da M499 nicht zu den massenspektrometrisch beobachteten Aminosäuren gehört, kann keine Aussage getroffen werden, ob dieser Methioninrest eine Bindungsstelle darstellt. Aus beiden Analysen aus dem Protein und dem ebenfalls fünffachen Überschuss an Cisplatin (3h und 168h Inkubation bei 37°C) konnte T457 als Bindungsstelle des Metallkomplexes identifiziert werden (s. Tab. 6.17, 6.19). Diese Koordination konnte wie bereits erwähnt DYSON in seinen LC/MS/MS-Studien feststellen [137]. Dabei wurde ein Protein:CisplatinVerhältnis von 1:10 und Inkubationszeiten von 15 und 30 min bei 37°C verwendet.

Serumproteine

181

Zur Veranschaulichung der Lokalisierung der von einem Cisplatinfragment koordinierten Seitenketten im Serotransferrin findet sich in der folgenden Darstellung die Gesamtstruktur. E385 M256

T457

Y314

E265 Abb.6.40: Proteinstruktur des Serotransferrins mit bevorzugten Cisplatinbindungsstellen

In der Abbildung sind die aus den einzelnen Analysen erhaltenen Bindungsstellen des Cisplatins in Serotransferrin hervorgehoben. Daraus ersichtlich ist Verteilung der Aminosäuren in den beiden Bereichen des Serumproteins. Aus dem N-lobe (V1-T336) wurden M256, E265 und Y314 und die restlichen zwei Seitenketten (E385, T457) aus dem Clobe (N337-P679) identifiziert. Von den fünf Koordinationen sind vier kinetisch bevorzugte Stellen (E265, Y314, E385 und T457), was mit den Befunden aus den Analysen mit dem Serumalbumin (z. B. Y150, D375) übereinstimmt. Wie schon DYSON [59] mittels UV/Visspektroskopischer Arbeiten zeigen konnte, konkurriert Cisplatin mit Fe(III) um Bindungen im Serotransferrin. Die hier ermittelten Bindungsstellen bestätigen diese Annahmen, wie die nachstehende Abbildung zeigt.

Serumproteine

182 E385

Y314

Y95

H249

Y188 D63 Abb.6.41: Ausschnitt aus der Proteinstruktur des Serotransferrins mit vier Fe(III)Bindungsstellen

Aus der Abbildung wird die räumliche Nähe der Seitenketten besonders deutlich. Zur besseren Unterscheidung der Aminosäuren wurden die Fe(III)-Bindungsstellen lilafarben und die zwei Cisplatinbindungsstellen gelb dargestellt. Vergleichbare Nähe liegt bei den Fe(III) Bindungsstellen des C-lobes und einer weiteren Koordinationsstelle für Cisplatin T457. Diese Aminosäure ist als Bicarbonat-Bindungsstelle bekannt [147].

Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin

183

7. Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin In einer weiteren Teilstudie wurden im Rahmen dieser Arbeit die Bindungseigenschaften des Zytostatikums Cisplatin mit Thioredoxin untersucht. Thioredoxine gehören allgemein zur Familie kleiner Enzymproteine und wirken als Redoxintermediate bei der Umwandlung von Ribose zur Desoxyribose zur DNA-Synthese [152]. Das aktive Zentrum des Proteins besteht häufig aus der Sequenz Cys-Gly-Pro-Cys. Die zum Thioredoxin-System (siehe Abbildung 7.1) gehörende Reduktase ist in vielen physiologischen Prozessen im Organismus und dementsprechend auch im Zellwachstum (auch von Tumorzellen) involviert. Zu dem Enzym wurden aus mehreren Studien Hinweise darauf erhalten, dass antitumorwirksame Gold (I)und Gold (III)-Komplexe die Reduktase hemmen [153, 154].

TR

Trx-(SH)2 + XS2

TR

Trx-S2 + NADPH

Trx-S2 + X(SH)2 Trx-(SH)2 + NADP+

Abb.7.1: Intrazelluläres Disulfid-Reduktionssystem [152]

Thioredoxin wird in vielen menschlichen Tumorzellen überexprimiert. Die Redoxaktivität des Proteins ist entscheidend für die proliferationssteigernde Wirkung. Des Weiteren werden die apoptosehemmende Wirkung und die mögliche Beteiligung an einer Resistenzentwicklung der Zellen gegenüber einigen Antitumormittel [155, 161] im Zusammenhang mit Thioredoxin diskutiert. Dabei konnte eine Cisplatin-Resistenz bei humanen Thioredoxin nicht jedoch bei Thioredoxin aus E. coli beobachtet werden [126, 127].

Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin

184

Bei der Analyse mit dem Darmbakterium E. coli konnte die Koordination eines Cisplatinfragmentes an eine Peptidsequenz des Thioredoxins identifiziert werden. Es wurde hierbei eindeutig die Seitenkette des Histidins 7 modifiziert. Wie in Kapitel 3 diskutiert, diente das Bakterium bei den Umsetzungen als Modellsystem für Vorgänge in anderen Organismen. So stellte sich bei dieser Beobachtung die Frage, ob das humane Thioredoxin Ähnlichkeiten im Reaktionsverhalten gegenüber Cisplatin aufweist. Für den direkten Vergleich sind im Folgenden die Proteinsequenzen des humanen und des aus E. coli stammenden Thioredoxins dargestellt.

Tab.7.1: Aminosäure-Sequenzen der Thioredoxine /E. coli und human Thioredoxin aus E. coli (109 Aminosäuren) MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVA KLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA

Humanes Thioredoxin (105 Aminosäuren) MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLEV DVDDCQDVASECEVKCMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELV

Die Tabelle 7.1 enthält die Proteinsequenzen der beiden Thioredoxine. Das oben erwähnte aktive Zentrum des jeweiligen Proteins ist rot unterlegt. Beim Thioredoxin aus E. coli sind es die Aminosäuren C33-C36 und beim humanen Thioredoxin C32-C35. Des Weiteren wurden in den beiden Sequenzen die einzigen Histidinstellen eingerahmt bzw. bei E. coli, da das H7 die Bindungsstelle für Cisplatin darstellt, grün gekennzeichnet. Es fällt auch, dass humanes Thioredoxin kein Histidin in der Nähe des N-terminalen Methionins enthält. Aus dem Vergleich der oben dargestellten Proteinsequenzen ist ersichtlich, dass in dem humanen Thioredoxin neben den Cysteinen im katalytischen Zentrum (C32 und C35) noch drei weitere Cysteine enthalten sind (C62, C69, C73), die im bakteriellen Thioredoxin fehlen. Für weitere Vergleiche wurden mit beiden Proteinen jeweils folgende Umsetzungen durchgeführt: äquimolare Ansätze aus Thioredoxin und Cisplatin mit 3h Inkubation bei 37°C, sowie Ansätze im 1:5-Verhältnis jeweils nach 3h und nach 168h bei 37°C. Die bei pH = 7,8 (NH4HCO3-Puffer)

inkubierten

Protein-Metallkomplex-Gemische

wurden

nach

dem

Entfernen nicht umgesetzter Cisplatinreste (3kDa cut-off-Filter) mit Trypsin in Peptide

Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin

185

gespalten. Die eingeengte Lösung wurde auf eine RP-C18-Säule geladen und über LC/ESIMS/MS analysiert.

7.1. Proteintargets in humanem Thioredoxin Eine Auflistung der koordinierten Peptidsequenzen im humanen Thioredoxin ist in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Für die Bindungsstellen wurden in allen folgenden Tabellen die zum Teil zusätzlich zur bevorzugten Koordinationsstelle Aminosäuren angegeben, deren theoretische MS/MS-Spektren ebenfalls gute Übereinstimmungen mit den experimentellen Spektren ergeben (Differenzen bei den ∆Cn-Werten < 0,1, Sp > 500, RSp 9 im Spektrum vorhanden sind. Die folgende Tabelle zeigt weitere mögliche Peptidsequenzen des E. coli Thioredoxins mit möglichen Cisplatinkoordinationen und der Masse m/z = 2017 (mit ∆m ± 2,5).

Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin

192

Tab.7.7: SEQUEST-Parameter von [MIAPILD$EIADEYQGK]3+ und einer weiteren Peptidsequenz aus dem 1:5-Ansatz von Thioredoxin E. coli:Cisplatin nach 3h Inkuabtion bei 37°C Sequenz XCorr K.MIAPILD$EIADEYQGK.L 5,745 K.M$IAPILDEIADEYQGK.L 5,605 K.MIAPILDE$IADEYQGK.L 5,165 K.MIAPILDEIAD$EYQGK.L 2,656 K.MIAPILDEIADE$YQGK.L 2,473 K.MIAPILDEIADEY$QGK.L 1,902 K.AD$GAILVDFWAEWC$.G 1,798 K.AD$GAILVDFWAE$WC.G 1,516 K.ADGAILVD$FWAEWC$.G 1,508 K.MIAPILDEIADEYQGK$.L 1,452

∆Cn 0 0,024 0,101 0,538 0,57 0,669 0,687 0,736 0,738 0,747

Sp 2020,6 2750,3 1540,7 403,1 341,7 264 141,5 127,3 79,6 175,1

RSp 2 1 3 4 5 6 8 9 11 7

Ionen 32/60 35/60 29/60 20/60 19/60 18/60 13/52 12/52 10/52 15/60

Protein THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI THIO_ECOLI

Aus der Auflistung werden die ersten drei Peptidsequenzen mit den potentiellen Bindungsstellen D44, M38 und E45 betrachtet. Die Sp- und ∆Cn- Werte aller restlichen Sequenzen erfüllen die Kriterien nicht (Sp < 500, ∆Cn > 0,1) und können als koordinierte Sequenzen ausgeschlossen werden. Für die Bindung des Cisplatinfragmentes an D44 oder M38 kann allein aus den SEQUEST-Parametern keine Entscheidung zu Gunsten einer dieser Stellen gefällt werden (für beide gilt ∆Cn < 0,1). Die im MS/MS-Spektrum in Abbildung 7.4 dargestellten Massenpeaks der Ionen b3+ und b5+ wurden mit geringen Intensitäten detektiert und können deswegen nur unzureichend auf eine mögliche Platinverteilung geprüft werden. Bei einer M38-Koordination wären diese b+-Ionen nicht zu beobachten. Die vergrößerte Darstellung des Ausschnittes aus der Proteinstruktur ist in Abbildung 7.5 zu sehen.

M38

D44

Abb.7.5: Ausschnitt aus der Proteinstruktur von Thioredoxin E. coli mit M38 und D44

Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin

193

Aus der oberen Darstellung kann kein eindeutiger Hinweis dafür erhalten werden, welche Seitenkette für eine Koordination begünstigt wäre, so dass beide Stellen M38 und D44 als mögliche Bindungsstellen für Cisplatin in Frage kommen. Allerdings wird M38 in allen Analysen als Koordinationsstelle mehrfach identifiziert. Aus den drei Analysen des einzelnen Proteins mit Cisplatin und der MudPIT-Analyse der E. coli-Zellen mit dem Zytostatikum konnten somit einige möglicherweise spezifische Bindungsstellen ermittelt werden. Dabei handelt es sich um H7, D16 (T15), M38 (C36, K37), D44 und E45. Die Lokalisierung der Aminosäuren im Protein ist in der folgenden Abbildung gekennzeichnet. C33 C36

M38 H7

D16

D44

Abb.7.6: Gesamtstruktur des Thioredoxins (E. coli) mit H7, D16, K37, M38 und D44

In der oberen Darstellung wurden neben den genannten Cisplatinbindungsstellen die Seitenketten der Cysteine des aktiven Zentrums des Proteins C33 und C36 gekennzeichnet. Wie aus den Tabellen 7.4-7.6 zu entnehmen, ist eine Koordination des Cisplatins an C33 nicht beobachtet

und

ist

an

C36

unwahrscheinlich.

Insgesamt

konnte

bei

den

massenspektrometrischen Analysen etwa 50% der Peptidsequenzen detektiert werden und C36 in nicht koordinierten Proteintargets beobachtet werden.

Proteintargets in humanem und bakteriellem Thioredoxin

194

7.3. Vergleich von humanem und E. coli Thioredoxin Wie oben bereits erwähnt, wird das Thioredoxin durch einige Metallkomplexe in seiner Wirkung gehemmt. Eine Bindung an das C32 und das benachbarte D26 wird für die hemmende Wirkung einer Cadmiumverbindung verantwortlich gemacht [156]. MALDI-ToF MS-Studien („top-down“-Methode) mit Thioredoxin aus Thermus thermophilus HB8 haben gezeigt, dass das [Pt(bpy)]2+-Fragment mit den Cysteinseitenketten C31 und C34 des aktiven Zentrums in dem Protein eine Chelatbildung eingeht. Aus dieser Blockierung des aktiven Zentrums wird die Cisplatinresistenz in den Zellen, die Thioredoxin überexprimieren (z. B. Kolonkarzinome [157]), vermutet. Ein Vergleich der oben beschriebenen Analysen (Tab 7.2 und 7.4-7.6) des humanen Thioredoxins und aus E. coli mit Cisplatin zeigt, dass obwohl die Proteinsequenz des humanen Thioredoxins Histidin enthält, keine Hinweise auf eine Cisplatinbindung an H43 erhalten werden konnten. Obwohl in beiden Proteinen das Cystein C32 (bei E. coli)/C33 (human) in der Schleife vor der Helix enthalten, wurde es nur im humanen Thioredoxin als mögliche Cisplatinbindungsstelle ermittelt. Des Weiteren konnte im Gegensatz zum E. coli Thioredoxin keine M38-Koordination im humanen Thioredoxin beobachtet werden. Zu erwähnen ist in dieser Hinsicht, dass diese Aminosäure trotz einer coverage-Rate von etwa 93% nur nicht koordiniert detektiert werden konnte. Diese Beobachtungen könnten die Befunde zum Reaktionsverhalten des humanen bzw. E. coli Thioredoxins mit Cisplatin bestätigen, welche von einer Inaktivierung des humanen Proteins durch eine Platinbindung an eines oder durch Chelate an beide Cysteine ausgehen.

Proteintargets in Cyclooxygenase-2

195

8. Proteintargets in Cyclooxygenase-2 Cyclooxygenasen (COX) sind die wesentlichen Enzyme in der Prostaglandinsynthese und im Inneren des endoplasmatischen Retikulums, innerhalb der Kernhülle und im Golgiapparat lokalisiert. COX-2 kommt wird einer Reihe von Tumorzellen überexprimiert vor. Das durch die COX-2 gebildete Prostaglandin-H2 stimuliert Entzündungsreaktionen und regt die Bildung der Wachstumsfaktoren an, weswegen vermutet wird, dass COX-2 eine Rolle für das Tumorwachstum spielen könnte [158]. Daher wird derzeit die präventive oder therapeutische Wirkung von COX-2 Inhibitoren in der Krebsbehandlung insbesondere von Tumoren des Magen-Darm-Traktes untersucht. Zum Wirkmechanismus der nicht modifizierten Acetylsalicylsäure (ASS oder Aspirin®) ist bekannt, dass die von ihr ausgehende Hemmung der Cyclooxygenasen (COX-1 und COX-2) über eine Acetylierung des Serins 529 (bei COX-1) und des Serins 516 (bei COX-2) stattfindet

[159].

In

einer

separaten

Umsetzung

des

reinen

Proteins

mit

dem

schmerzhemmenden Wirkstoff konnte die Acetylierung dieser Stelle nachgewiesen werden. Diese Modifikation der COX-2 nach der Reaktion mit dem in der folgenden Abbildung gezeigten Komplex ist in Tabelle 8.1 aufgeführt.

O O

Co2(CO)6

O O Abb.8.1: Struktur des Komplexes Co-ASS

Wie in der Einleitung bereits erwähnt, zeigt die Modifikation der ASS zu einem metallorganischen Derivat zusätzlich zu den bekannten Eigenschaften der ASS (wie Reduktion der zellulären PGH2-Bildung durch die irreversible COX-1 und COX-2 Hemmung) zytotoxische Wirkung. Bisher ist jedoch noch weitestgehend ungeklärt geblieben, wie dieser Effekt des Co-ASS-Komplexes begründet ist. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels LCESI

MS/MS

mögliche

Bindungsstellen

des

(Hexacarbonyl[2-propyn-1-ylacetylsalicylat]dicobalt)

potentiellen (Co-ASS)

Antitumorkomplexes

untersucht,

um daraus

mögliche Hinweise auf eine Wechselwirkung zu erhalten. Dazu wurden die tryptisch verdauten Reaktionslösungen ohne vorherige SCX-Extraktion über eine RP-C18-Säule

Proteintargets in Cyclooxygenase-2

196

getrennt und direkt ins gekoppelte Massenspektrometer injiziert. Die Datenbanksuche beinhaltete die mögliche Acetylierung (Ac entspricht -CO-CH3) der Aminosäuren C, D, E, H, K, M, R, S, T und Y mit der Masse m/z = 42, nach Abzug eines Protons für den Ladungsausgleich. Außerdem wurde die mögliche Metallierung mit Cobaltionen sowie eine ASS-Kopplung an den entsprechenden Seitenketten überprüft. Die folgende Tabelle listet die Peptidsequenzen des Proteins auf, welche mit der Acetylierung einer Aminosäurenseitenkette aus beiden Analysen (1:1 Ansatz mit ASS und mit Co-ASS) identifiziert werden konnten.

Tab.8.1: Acetylierte Peptidsequenzen der COX-2 nach 3h Inkubation bei 37°C jeweils mit ASS und mit Co-ASS Peptid Bindungsstelle MH+ z XCorr ∆Cn Sp RSp Ionen Acetylsalicylsäure K.PRPDAIFGETMVEVGAPFS^LK.G S516 2304,61 3 4,75 0,73 1275,9 1 32/80 Co-ASS-Komplex K.QLPDSNEIVEK^LLLR.R K166 1810,05 2 4,80 0,79 1284,7 1 21/28 L.PDSNEIVEK^LLLR.R K166 1568,76 2 3,13 0.75 1253.7 1 17/24 K.LK^FDPELLFNK.Q K346 1406,61 2 3,80 0,65 658,2 1 15/20 V.PPAVQK^VSQASIDQSR.Q K432 1753,9 2 3,13 0,72 771,6 1 17/30 R.SGLDDINPTVLLK^ER.S K598 1712,89 2 4,27 0,70 822,7 2 18/28 ^ = Ac

COX-2 wurde für jeweils 3h bei 37°c mit ASS und Co-ASS inkubiert. Aus der Umsetzung mit ASS konnte die Acetylierung der Serinseitenkette von S516 eindeutig bestätigt werden. Daneben konnte keine weitere Acetylierungsstelle der ASS in der Cyclooxygenase-2 mit ∆m ± 2,5, XCorr ≥ 3,75 für dreifach, XCorr ≥ 2,5 für zweifach und einfach geladene Moleküle, Sp ≥ 500, RSp ≤ 5, mindestens 30% Ionenzuordnung und ∆Cn < 0,1 beobachtet werden. Die Analyse der Reaktion der COX-2 mit dem Metallkomplex Co-ASS ergab das Resultat, dass Acetylierungen mehrerer Lysinseitenketten stattfinden. Wie in der Tabelle 8.1 dargestellt, wurden K166 (aus zwei unterschiedlichen Peptidsequenzen), K346, K432 und K598 mit dem Acetylrest modifiziert. Eine Acetylierung von S516 wurde nach den obigen SEQUEST-Kriterien nicht beobachtet, ebenso eine Metallierung oder Modifikation mit ASS. Als Beispiel ist in der folgenden Abbildung das MS/MS-Spektrum der acetylierten Peptidsequenz [156QLPDSNEIVEK^LLLR170]2+ gezeigt.

Proteintargets in Cyclooxygenase-2

197

Abb.8.2: MS/MS-Spektrum von [156QLPDSNEIVEK^LLLR170]2+ aus dem 1:1-Ansatz COX-2 mit Co-ASS nach 3h Inkubation bei 37°C In dem obigen MS/MS-Spektrum konnten 18 von 28 möglichen b+- und y+-Ionen (21 von SEQUEST eingeteilt) zugeordnet werden. Die Tabelle 8.2 zeigt Peptidsequenzen des Proteins, welche ebenfalls acetyliert mit der Masse m/z = 1810 (∆m ± 2,5) vorkommen könnten. Tab.8.2: SEQUEST-Parameter von [156QLPDSNEIVEK^LLLR170]2+ und einer weiteren Peptidsequenz aus dem 1:1-Ansatz COX-2 mit Co-ASS nach 3h Inkubation bei 37°C Sequenz K.QLPDSNEIVEK^LLLR.R K.QLPDSNEIVE^KLLLR.R K.QLPDSNE^IVEKLLLR.R K.QLPDSNEIVEKLLLR^.R K.QLPDS^NEIVEKLLLR.R K.QLPD^SNEIVEKLLLR.R K.QLP^DSNEIVEKLLLR.R K.EMSAE^LEALY^GDIDAV.E K.EMSAELE^ALY^GDIDAV.E

XCorr 4,797 4,612 3,591 3,006 2,623 2,262 1,999 0,995 0,901

∆Cn 0 0,038 0,251 0,373 0,453 0,528 0,583 0,793 0,812

Sp 1284,7 1093,4 371 546 213 166,4 135,9 37,3 51,2

RSp 1 2 4 3 5 6 7 23 14

Ionen 21/28 20/28 15/28 14/28 12/28 11/28 10/28 6/30 7/30

Proteintargets in Cyclooxygenase-2

198

Von den neun in Tabelle 8.2 aufgeführten Peptidsequenzen würden nur die ersten beiden möglichen Modifikationen die oben genannten Kriterien erfüllen. Für die restlichen Peptide gilt Sp < 500 und/oder ∆Cn > 0,1. Die Zuordnung von y5+ spricht eindeutig für K166 las Acetylierungsstelle. Nach einer Inspektion der in Tabelle aufgeführten Acetylierungen des Proteins COX-2 können die vier Lysinseitenketten bezüglich ihrer Lokalisierung im Protein betrachtet werden. Die Proteinstruktur mit den möglichen acetylierten Lysinstellen ist in der nachstehenden Abbildung gezeigt. K346

K598

S516

K166 Y371 K432

Abb.8.3: Proteinstruktur der Cyclooxygenase-2 mit K166, K346, K432 und K598 sowie Y371 und S516 (PDBID:1VOX [160])

In der Struktur sind die acetylierten Seitenketten von K166, K346, K432 und K598 sowie das Aktive Zentrum (Y371) und die von ASS acetylierte Aminosäure S516 hervorgehoben. Die Vermutung,

dass

der

Co-ASS-Komplex

Acetylierungen

der

Seitenketten

in

der

Cyclooxygenase-2 verursacht, konnte bekräftigt werden, indem eine LC-ESI-MS/MS-Analyse

Proteintargets in Cyclooxygenase-2

199

des reinen Proteins durchgeführt wurde. Die Prüfung der gespaltenen Peptidsequenzen auf eine mögliche Acetylierung ergab keine Ergebnisse, welche die Sp-, ∆Cn-, XCorr, RSp-, Ionenzuordnung oder ∆m-Kriterien erfüllen würde. Aus den erhaltenen möglichen Acetylierungen der Cyclooxygenase-2 nimmt K346 eine besonders interessante Rolle ein. Diese Aminosäure ist nämlich in der Umgebung des aktiven Zentrums des Enzyms, welches bei Y371 liegt, positioniert. Aus den bekannten Befunden bezüglich der Wirkwiese der Acetylsalicylsäure, dass die Acetylierung der Seitenkette S516 für die Wirkung verantwortlich ist, kann vermutet werden, dass die von Co-ASS ausgehende Acetylierung der Lysinseitenketten ebenfalls einen Effekt auf die Enzymfunktionen auslösen kann. Die beobachten zytotoxischen Eigenschaften des Co-ASS-Komplexes gegenüber den Zelllinien MCF-7 und HCT-29 [31-33], die nicht von ASS ausgelöst werden, lassen vermuten, dass die Modifikation der Acetylsalicylsäure mit dem organometallischen Rest eine wichtige Rolle beim Wirkmechanismus spielt.

Zusammenfassung

200

9. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden komplexe Proteingemische mittels kombinierter flüssigchromatographischer und ESI-MS/MS Methoden auf mögliche Bindungsstellen von Übergangsmetallkomplexen untersucht. Für die Bestimmung von Proteintargets in lebenden Escherichia coli-Zellen und in humanen Blutserumproben wurde die MudPIT-Technologie (Multidimensional Protein Identification Technology) eingesetzt. Dabei wurden folgende Verbindungen

untersucht:

[(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)],

[Pt(dien)(H2O)](NO3)2

und

Cisplatin (cis-[(NH3)2PtCl2]). Aus den durchgeführten Voruntersuchungen mit Modellpeptiden und dem jeweiligen Metallkomplex konnten sowohl an die chromatographisch als auch massenspektrometrisch zu untersuchenden Systeme eine Reihe von Anforderungen gestellt werden, damit eine MudPITAnalyse des Gemisches erfolgreich verlaufen kann. Die gebildeten Protein- und Peptidaddukte müssen eine hohe kinetische Stabilität über einen weiten pH-Bereich aufweisen. Dabei liegt während des enzymatischen Verdaus ein leicht alkalisches Milieu bei pH ≈ 7,8 vor, während der SCX-/RP-Trennung, welche bei pH ≈ 2,3 durchgeführt wird, ein relativ niedriger pH-Wert vorkommt. Die Peptid-Metall-Bindung muss während des Fragmentierungsvorgangs soweit intakt bleiben, dass eine zufrieden stellende Anzahl an Fragmentionen (z. B. b+- und y+-Ionen) entstehen kann, die eine Identifizierung der Peptidsequenz durch den Vergleich mit theoretischen MS/MS-Spektren ermöglicht. Dies sollten im Allgemeinen mindestens 30% Ionenzuordung sein, auch im Beisein von neutral loss Fragmentierungen der weiteren Liganden, z. B. Amminliganden bei cis-[(NH3)2PtCl2]. Ein charakteristisches Pattern des eingesetzten Metallzentrums kann bei der Zuordnung der Ionen eine Hilfestellung bieten, was bei Ruthenium und Platin mit deren Isotopenverteilungen gewährleistet ist. Vergleichsuntersuchungen an den vorhandenen Finnigan LCQ und LTQ Massenspektrometern belegten, dass die höhere Scanzahl (ein MS/MS-Spektrum in zwei Sekunden vs. drei MS/MS-Spektren pro Sekunde) des LTQs für eine effiziente Adduktcharakterisierung essentiell ist. Die Analyse der Produkte nach 3h Inkubation des Komplexes [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] mit dem Bakterium Escherichia coli (E. coli) bei 37°C ergab eine Liste von acht Proteinen, welche rutheniert identifiziert werden konnten. Dabei handelt es sich um vier stressregulierende Proteine ppiD, osmY, cspC und sucC, eine damage inducible Helikase dinG und weitere drei Helikasen traI1, dbpA und hrpA. Die bevorzugten Bindungspositionen

Zusammenfassung

201

stellen dabei die Carboxylatgruppen der Aspartate, die Hydroxygruppen der Serin- und Threoninreste sowie Aminostickstoffe aus Lysinseitenketten.

Abb.9.1: Proteinstruktur des cold shock Proteins cspA

Die beobachtete K26/D27-Koordination des cspC-Proteins ist besonders interessant, da durch dieses cold shock Protein das gesamte SOS-System der Zelle beeinflusst wird. Zusätzlich könnte die beobachtete Koordination der DNA-damage-inducible Helikase dinG einen Eingriff in das Replikations- und Reparatursystem der Zelle bedeuten. Die Koordination weiterer drei Helikasen traI1, dbpA und hrpA lässt die Vermutung zu, dass die Interaktion von (η6-p-Cymol)Ru(II)-Komplexen mit den Helikasen für die antiproliferative Aktivität der Verbindungen von Bedeutung ist. Aus der Umsetzung der Modellverbindung [Pt(dien)(H2O)](NO3)2 mit dem Darmbakterium E. coli nach 30 min Inkubation bei 37°C konnten sieben platinierte Peptidsequenzen mittels MudPIT identifiziert werden. Es wurden die Proteine rl7, eftU, aldB, dnaK, ssb, rbsA und yicC mit jeweils einer koordinierten Peptidsequenz gefunden. Die Bevorzugung der Koordination von kinetisch begünstigten Seitenketten konnte auch hier beobachtet werden. Die Carboxylatseitenketten der Glutamin- und Asparaginsäure stellen den Hauptteil der koordinierten Aminosäuren dar. Es konnten allerdings auch zwei Koordinationen an das weichere Schwefelatom in Methionin beobachtet werden.

Zusammenfassung

202

In einer weiteren Untersuchung wurde E. coli mit Cisplatin für 3h bei 37°C inkubiert und durch eine MudPIT-Analyse auf koordinierte Peptidsequenzen geprüft. Es konnten insgesamt 31 Proteintargets ermittelt werden. Auch in dieser Analyse überwiegen die Koordinationen der kinetisch attraktiven Carboxylatsauerstoffatome oder Hydroxygruppen. Außerdem konnten neun Proteintargets mit Methionin-Bindungsstellen sowie drei thermodynamisch bevorzugte Koordinationen an C- und H- Reste beobachtet werden. Die aus dieser Analyse hervorgehende Identifizierung der DNA-bindenden Proteine mutS (mismatch repair protein), uvrD (DNA-Helikase II) und top1 (Topoisomerase 1) weist auf eine mögliche Beeinträchtigung des DNA-Reparatur-Systems unter Einfluss von Pt(II)Koordinationen hin. Die Ermittlung einer Vielzahl an diesen und anderen, wenig abundanten Proteine in den Zellen (~ 102-103 Kopien pro Zelle) als spezifische Proteintargets für Cisplatin in E. coli bedeutet bei einer Nachweisgrenze von etwa 10 fmol, dass etwa 10% oder mehr der Kopien dieser Proteine von Cisplatin koordiniert vorliegen müssen. Im abundanten Redoxprotein Thioredoxin (103-104 Kopien pro Zelle), einem in vielen Krebszellen überexprimierten Protein, konnte die Koordinationsstelle H7 aus der Analyse des Bakteriums sowie in Einzeluntersuchungen des Proteins mit Cisplatin als spezifische Bindungsstelle eindeutig bestätigt werden. Im Gegensatz zum humanen Thioredoxin wird auch der Methioninrest M38 in E. coli Thioredoxin, jedoch nicht wie bei der humanen Version eine der benachbarten Cysteinstellen (C33/C36) des aktiven Zentrums als Koordinationsstelle identifiziert.

C33

C32 M38

H7

M38

E13

Abb.9.2: Proteinstrukturen des humanen (links) und des E. coli (rechts) Thioredoxins mit bevorzugten Cisplatinbindungsstellen

Zusammenfassung

203

Auch aus den Analysen der Blutserumproben und der Untersuchungen mit einzelnen Serumproteinen und Cisplatin wird die Bevorzugung der Koordination der häufiger vorkommenden Sauerstoff-Donoratome bei dem verwendeten pH ≈ 7 bekräftigt. Diese Befunde decken sich mit aus den E. coli-Analysen erhaltenen Ergebnissen. Aus früheren Studien waren für Serumalbumin C34, sowie 2-4 Methioninreste als Cisplatinbindungsstellen ermittelt worden. C34 sowie M329 und M548 konnten in den hier beschriebenen Analysen der Blutserumproben und des Serumalbumins neben Y148/Y150 und D375/E376 ermittelt werden. Die kinetisch bevorzugte Koordination durch O-Donorseitenketten könnte wegen ihrer hohen Bildungsgeschwindigkeit für die Transportfunktion von pharmakologisch relevanten Metallkomplexen des Proteins zu Tumorzellen eine bedeutende Rolle spielen. κOkoordinierte Cisplatinfragmente können anschließend wegen der schwächeren Pt-OBindungen zu thermodynamisch bevorzugten weicheren Bindungsstellen, wie den Nukleobasen der DNA, wandern. Im Gegenteil dazu verhindert die langsame Bildung von κ2S,N-Chelaten (wie bei der C34 bzw. M329 oder M548 Koordination) die Migration der Metallkomplexe.

Abb.9.3: Proteinstruktur des Serumalbumins und die ermittelten Cisplatinbindungsstellen

Zusammenfassung

204

Auch die charakteristischen κO-Bindungsstellen des Cisplatins im Serotransferrin (Y314, E385 und T457) können neben M256 beim Transport des Antitumormittels direkt nach der Verabreichung eine wichtige Rolle spielen. Zur Veranschaulichung ist untenstehend die Proteinstruktur

des

abundanten

Serumproteins

Serotransferrin

mit

den

Cisplatinbindungsstellen gezeigt. E385

M256

T457

Y314

E265 Abb.9.4: Struktur des Serotransferrins mit den ermittelten Cisplatinbindungsstellen

Der Befund, dass nur wenige Histidinreste von Cisplatin sowohl im E. coli-Bakterium als auch im Blutserum koordiniert wurden, bestätigt einerseits die von SADLER durchgeführten NMR-Studien [15, 17], in denen Histidin-Addukte als Bindungsstelle nicht bei Serumproteinen Albumin und Serotransferrin nachgewiesen werden konnte. Andererseits ist es jedoch auch möglich, dass Histidin keine adäquate Anzahl an b+- und y+-Fragmentionen liefern und die koordinierten Peptidsequenzen entsprechend nur niedrige SEQUESTParameter zugeteilt bekommen. Wie jedoch die Identifizierung der H7-Koordinationsstelle im Thioredoxin des E. coli Baktriums zeigt, ist im Allgemeinen eine Histidinzuordnung auch aus einer MudPIT-Analyse möglich. Anhand der vorliegenden Untersuchungen lässt sich feststellen, dass die in dieser Arbeit entwickelte LC2/ESI-MS2-Methode erstmals die Möglichkeit eröffnet, sowohl Proteintargets

Zusammenfassung

205

als auch die Bindungsstellen in diesen Targets komplexer Proteingemische zu bestimmen. Hierbei muss allerdings immer der Anteil der durch ESI-MS/MS zu detektierenden Sequenzen (coverage) berücksichtigt werden. Typische Werte liegen bei etwa 30-55%. In Einzelfällen sind wesentlich höhere Werte möglich (z. B. bei humanem Thioredoxin 93%). Die Identifizierung der gleichen Bindungsstellen aus unabhängigen Blutserumproben bzw. bei Messwiederholungen für Protein:Cisplatin-Reaktionsgemische belegt die Reproduzierbarkeit und somit die Zuverlässigkeit dieser Technik.

Experimenteller Teil

206

10. Experimenteller Teil 10.1. Ausgangssubstanzen Peptide Die Peptide FKVSGFLG, FKVGHFLG, GALTNVSMAK und IVDAQGNDVLIPG wurden von der Firma PSL (Heidelberg), VSEHEAT von Genscript Corporation (USA) und AcSG, AcM sowie AcH von BACHEM (Weil am Rhein) erworben. Cisplatin wurde bei ChemPUR (Karlsruhe) erworben und wie erhalten eingesetzt.

Proteine/Protease Die

Proteine

Alpha-1-Antitrypsin,

Alpha-2-Macroglobulin,

Cyclooxygenase-2,

Apolipoprotein A1, Serumalbumin, Thioredoxin (human), Thioredoxin (E. coli) und Transferrin wurden bei Sigma (Heidelberg) erworben. Trypsin wurde bei Promega (Mannheim) gekauft.

Metallkomplexe 1. [PtI(dien)]I wurde wie in der Literatur beschrieben [162] hergestellt. 1) Darstellung von PtI2·H2O: Es werden 2,5 g (6,02 mmol) K2[PtCl4] in 40 ml H2O unter Rühren gelöst und bei 90°C werden 3,0g (18mmol) KI zugegeben. Nach 3,5h wird über eine D3-Glasfritte der gebildete schwarze Niderschlag abfiltriert, mehrmals mit H2O gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute: 2,2 g = 4,7 mmol (78%). 2) Darstellung von [PtI(dien)]I: 2,0 g (4,3 mmol) PtI2·H2O werden mit etwa 1 ml H2O zu einer Suspension verrieben und dazu werden innerhalb von 1,5h 0,5 ml (4 mmol) Diethylentriamin in 1 ml H2O hinzugetropft. Die Suspension wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand mit 90°C heißem H2O extrahiert. Nach dem Abfiltrieren wird die gelbe Lösung im Eisbad gekühlt und die entstandenen gelben Kristalle abgetrennt. Die mit eiskaltem H2O gewaschenen Kristalle können an der Luft getrocknet werden. Ausbeute: 1,6 g = 2,9 mmol (67%). Die Reinheit wurde mittels IRSpektroskopie überprüft. 3) [Pt(dien)(H2O)](NO3)2 wurde aus [PtI(dien)]I durch Zugabe von zwei Äquivalenten AgNO3 und 24 h im Dunkeln Rühren nach anschließender Zentrifugation (gebildetes AgI bei 6°C) erhalten. 2. [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] wurde nach den Vorschriften [163, 164] dargestellt.

Experimenteller Teil

207

1) Darstellung von [(η6-p-Cymol)RuCl2]2: 2 g (7,3 mmol) RuCl3·H2O (bei Chempur erworben) wurden in 100 ml Ethanol gelöst und mit 13,6 g (0,1 mol) α-Phellandren versetzt und 4h bei 80°C refluxiert. Nach dem Abfiltrieren und Waschen mit wenig kalten Ethanol wurde [(η6-p-Cymol)RuCl2]2 erhalten. Ausbeute: 1,7 g = 2,8 mmol (76%) 2) Darstellung von [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)]: 80 mg (0,13 mmol) [(η6-pCymol)RuCl2]2 wurden mit zwei Äquivalenten (20,5 mg; 0,2 mmol) DMSO in einer 1:1 Methanol/Methylendichlorid-Lösung über 4h bei 60°C refluxiert. Nach dem Einengen und Abfiltrieren der rotbraun gefärbten Lösung wurden bräunliche Kristalle erhalten.

Ausbeute:

70

mg

=

0,2

mmol

(70%).

Die

Reinheit

wurde

röntgenkristallographisch bestimmt [165]. 3. Cisplatin wurde bei Chempur erworben und wie erhalten eingesetzt. 4. Hexacarbonyl[2-propyn-1-ylacetylsalicylat]dicobalt (Co-ASS) wurde von Dr. Ingo Ott (FU Berlin) zur Verfügung gestellt und wie erhalten eingesetzt.

Lösungsmittel/Chemikalien HPLC-grade

Methanol

wurde

bei

Baker,

Acetonitril,

Ammoniumacetat

und

Ammoniuhydrogencarbonat wurden bei Merck gekauft. Pentafluorpropionsäure (PFP) wurde von ACROS erworben. Das bidestillierte Wasser wurde aus dem VE-Wasser der RuhrUniversität Bochum mit einer Anlage der Firma Büchi hergestellt.

10.2. Biologische Proben Escherichia coli 50 µl von der E. coli BL21-Stamm Suspension (vom Lehrstuhl für Biochemie, Ruhr Universität Bochum zur Verfügung gestellt) wurden mit 2,5 ml LB-Medium (lysogeny broth) und 50 µl Chloramphenicol für 2-3h bei 37°C geschüttelt. Danach wurden weitere 48 ml des LB-Mediums hinzugefügt und für weitere 12h bei 37°C geschüttelt. Nach dem Zentrifungieren wurde ein Zellpellet erhalten, welches für die Umsetzungen mit den Metallkomplexen verwendet wurde. Dabei besteht das LB-Medium aus bacto-Trypton, bactoHefeextrakt, NaCl und H2O (pH ≈ 7).

Experimenteller Teil

208

Blutserum Humanes Blutserum wurde von zwei unterschiedlichen Personen nach einer Blutabnahme durch Abtrennen (Zentrufugieren) von den festen Bestandteilen des Blutplasmas erhalten (vom Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmansheil GmbH Bochum mit Einwilligung der Personen zur Verfügung gestellt).

10.3. Massenspektrometrische Untersuchungen 10.3.1. ESI-MS und ESI-MS/MS Messungen an Modellpeptiden/Metallkomplex Reaktionssystemen Alle Modellpeptid:Metallkomplexansätze wurden in wässrigen Lösungen (50µM) im Verhältnis 1:1 für 24h bei 37°C inkubiert und direkt massenspektrometrisch analysiert. Die

ESI-MS

und

MS/MS

Untersuchungen

wurden

an

einem

Finnigan

LCQ

Massenspektrometer (Thermo Electron Corp., San Jose, CA, USA) durchgeführt. Dieses wurde stets im positiven Modus bei einer Kapillartemperatur von 200°C, bei einer CIDEnergie zwischen 35-40% und einer Sprayspannung von 1,8 kV bedient. Die Flussraten wurden zwischen 0,5-1,0 µl·min-1 variiert.

10.3.2. LC-ESI-MS/MS Messungen an Protein/Cisplatin Reaktionslösungen Alle Protein:Cisplatin Ansätze wurden in NH4HCO3-Puffer (10mM, pH = 7,8) in 1:1, 1:3 oder 1:5 Verhältnissen (1-5 µM) für 3h (1:1, 1:3, 1:5) oder 168h (1:5) bei 37°C inkubiert. Metallkomplexüberschüsse wurden durch Verwendung eines 3 kDa Ausschlussfilters (Microcon, YM-3, Millipore) nach Herstellerangaben entfernt. Durch Zugabe von Trypsin (1:50 w/w) erfolgte der enzymatische Verdau der jeweiligen Proben für 12h bei 37°C. Durch Zugabe von 98% Ameisensäure wurde der Verdau abgestoppt (pH ≈ 2,3). Unverdaute Proteine wurden durch Verwendung eines 10 kDa (Microcon, YM-10, Millipore) Ausschlussfilters entfernt.

Eindimensionale LC-ESI Für alle LC-ESI-Analysen wurden zwei Pufferlösungen verwendet: Puffer A (2% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure) und Puffer B (80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure). Die nanoLC-ESIAnalysen

der

Peptid:Metallkomplex-Gemische

wurden

an

einem

Finnigan

LTQ

Massenspektrometer (Thermo Electron Corp., San Jose, CA, USA) durchgeführt. Zur eindimensionalen Peptidtrennung wurde eine Kapillarsäule mit einem Innendurchmesser von 75 µm, gefüllt mit 10 cm RP-C18 Material (Eclipse XDB, Hewlett Packard), verwendet. Die

Experimenteller Teil

209

Peptidmischungen wurden unter Hochdruck auf die Kapillarsäule geladen und 5 min mit Puffer A gespült. Die Elution erfolgte durch einen linearen Gradienten von 0 bis 55 % Puffer B über 120 min und einen folgenden linearen Gradienten bis 100% Puffer B über 20 min. Die angelegte Ionisierungsspannung betrug 1,8 kV bei einer Flussrate von 0,12 µl / min. Die Kapillartemperatur betrug 200°C und die CID-Energie wurde zwischen 35-40% variiert. Die MS/MS Spektren wurden unter Verwendung der Xcalibur-Software aufgenommen.

10.3.3. Multidimensionale-Protein-Identifizierungs-Technologie (MudPIT) 10.3.3.1 MudPIT E. coli Das nach dem Zentrifugieren erhaltene Zellpellet konnte für eine Umsetzung mit dem jeweiligen Metallkomplex verwendet werden. 500 µg des Zellpellets wurden mit 2mM cis[PtCl2(NH3)2] bzw. 10mM [Pt(dien)(H2O)](NO3)2 oder [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] in 500 µl destilliertem Wasser 3h (30 min bei [Pt(dien)(H2O)](NO3)2) bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde mehrmals mit 10 mM NH4HCO3-Puffer gewaschen, um ungelöste Reste abzutrennen. Mit Hilfe eines Douncers wurden die Zellen durch das Zerstören der Zellwände geöffnet. Vor dem Verdau mit der Protease Trypsin wurde die Proteinkonzentration mit Hilfe des Bradford-Assays bestimmt und die Lösung filtriert. Dafür wurde ein 3kDa Ausschlussfilter (cut-off, Microcon, YM-3, Millipore) zum Abtrennen nicht gebundener Metallkomplexe verwendet. Durch Zugabe von Trypsin (1:50 w/w, 2,4 µg) erfolgte der enzymatische Verdau der jeweiligen Proben für 12h bei 37°C. Das Abstoppen des Verdaus erfolgte durch Zugabe von 98% Ameisensäure (2-4µl, pH ≈ 2,3). Anschließend wurden mit einem 10 kDa (Microcon, YM-10, Millipore) Ausschlussfilter nicht verdaute Proteine von der Messlösung abgetrennt und die Lösung auf etwa 20 µl eingeengt. Die auf die Säule geladene Protein-Metallkomplex-Mischung wurde unter Verwendung von 12 chromatographischen Salzgradientenstufen massenspektrometrisch detektiert.

10.3.3.2. MudPIT Blutserum Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bardford-Assays bestimmt und betrug jeweils etwa 70µg/µl Serum. Jeweils 1µl des Blutserums wurde mit einem zehnfachen Überschuss an Cisplatin (20µM) in 500 µl NH4HCO3-Puffer (10mM, pH = 7,8) für 3h bei 37°C inkubiert. Nicht umgesetztes Cisplatin wurde vor dem Verdau aus der Mischung mit einem

3kDa

(Microcon,

YM-3,

Millipore)

Ausschlussfilterfilter

abgetrennt.

Das

Protein:Cisplatin-Gemisch wurde für 12h bei 37°C mit der Protease Trypsin (1,4µg) verdaut. Mit der Zugabe von 3µl 98%-iger Ameisensäure wurde der pH-Wert auf etwa 2,3 eingestellt.

Experimenteller Teil

210

Es folgte ein Abfiltrieren der nicht verdauten Proteine (10 kDa cut off Filter, Microcon, YM10, Millipore) und Einengen der Mischung auf etwa 20 µl. Für die MudPIT-Analyse wurden die Mischungen auf die Säule geladen und unter Verwendung von 12 chromatographischen Salzgradientenstufen massenspektrometrisch detektiert. 10.3.3.3. LC2/ESI-MS2 Messungen Vier Pufferlösungen wurden bei allen Analysen verwendet: Puffer A (2% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure), Puffer B (80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure), Puffer C (250 mM Ammoniumacetat, 0.1% Ameisensäure, Acetonitril) und Puffer D (1,5 M Ammoniumacetat, 0.1% Ameisensäure, Acetonitril). Die Analysen der Proteingemische erfolgten durch Verwendung eines HPLC-Systems bestehend aus einer Pumpe (Dual Gradient System, Dionex), einem automatischen Probenapplikator (Famos) und einer Säulenschalteinheit (Switchos), die direkt mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer Finnigan LTQ (Thermo Electron Corp., San Jose, CA, USA) verbunden war. Die Peptidmischung wurde zunächst auf eine dreiphasige Kapillarsäule (100 µm C18-RP-Materials (Eclipse XDB, Innendurchmesser) geladen, bestehend aus 12 cm eines C18 Hewlett Packard), 4 cm eines starken Kationen-Austauschmaterials (SCX, Whatman) und abschließend 4 cm des C18-RP-Materials. Die Äquilibrierung der Säule erfolgte durch Spülen mit Puffer A. Einer 30 min Waschstufe mit Puffer A folgte zur Entfernung nicht an SCX gebundener Peptide der lineare Gradient über 180 min bis 100% Puffer B. Die schrittweise Elution der Peptide von der SCX-Säule erfolgte durch Erhöhen des Puffer C-Gehaltes in 10%Schritten und Puffer D mit 33, 50 und 75% für 2 min zwecks Ionenaustausch. Jeder Salzstufe folgte eine 7 min Waschstufe mit Puffer A und über 70 min ein Gradient zuerst bis 50% Puffer B, danach bis 100% über weitere 20 min. Nach einer 5min Stufe mit 100% Puffer B schloss sich eine 20 min Stufe mit 100% Puffer D an. Die angelegte Ionisierungsspannung für die ESI-MS/MS Messungen betrug 1,8 kV, die CID-Energie lag bei 35-40% und die Flussraten zwischen 0,15-0,25 µl·min-1. Das LTQ wurde mittels der Xcalibur-Software gesteuert, wobei MS-Spektren in einem Massenfenster von 350 – 2000 m/z aufgenommen wurden und die drei intensivsten Peptid-Ionen sequenziell isoliert und in der Ionenfalle fragmentiert wurden.

Experimenteller Teil

211

10.3.3.4. Auswertung der MS/MS Daten mit dem SEQUEST Algorithmus Die Interpretation der MS/MS Spektren erfolgte mit Hilfe des SEQUEST Algorithmus. Die generierten MS/MS Daten wurden zunächst in einem spezifischen Datenformat (BioworksProgramm) abgelesen und in Excel-Format überführt. Als mögliche Modifikationen wurden die Oxidation von Methioninen (+16 Da) und die jeweiligen Metallierungen verwendet. Es wurde die Protease Trypsin in der SEQUEST Suchmaske mit der zusätzlichen Option auch halbtryptisch oder nicht tryptisch gespaltene Peptide zu berücksichtigen angegeben. Als Filterkriterien wurden folgende Faktoren verwendet: 1) XCorr (cross correlation) ist eine Funktion für die Kalkulation der Korrelation zwischen zwei Signalserien mit Cτ = Σnj=1 IRj ITj+τ (τ ist die relative Verschiebung zwischen dem theoretischen und dem experimentellen MS/MS-Spektrum im Bereich -k < τ < k; R und T sind Fourier transformiert; IRj ist die gesamte Intensität im Intervall j des experimentellen Spektrums; n ist die Anzahl der entsprechenden Peaks). Die Verwendung eines Bereiches -k < τ < k ermöglicht eine bessere Diskriminierung zwischen vergleichbaren Spektren. Die resultierenden XCorr-Werte werden weniger durch Verunreinigungen beeinflusst. 2) Sp (preliminary scoring) verwendet die Stetigkeit der b+- und y+-Ionen mit Sp = (Σnj=1)n (1+Cβ)IM/ητ (C ist die Anzahl der Peaks, die zusätzlich zum passenden Peak auch den vorhergehenden Peak zugeordnet bekommen haben, wobei der Faktor 1+ Cβ das mit β = 0,075 berücksichtigt; ητ ist die Gesamtzahl der zu erwartenden Peaks). IM berücksichtigt die Aminosäurereste, die Immonium-Ionen liefern können. 3) RSp (rank preliminary scoring) gibt den Rang der Sp-Werte an. 4) ∆Cn (delta correlation value) bezieht sich auf normalisierte XCorr-Werte, so dass der höchste XCorr-Wert gleich 1 gesetzt wird. Bei ∆Cn wird der normalisierte XCorrWert für eine Sequenz von dem höchsten normalisierten XCorr-Wert abgezogen. 5) Ionen bezeichnen die Anzahl der zugeordneten Fragmentionen im Verhältnis zur Anzahl der möglichen Fragmentionen. 6) ∆m ist die Differenz zwischen der experimentellen Vorläuferion-Masse und der theoretischen Masse für eine Peptidsequenz. Für die eingesetzten Metallkomplexe wurde jeweils ein ∆m ± 2,5 verwendet, um auch die Isotopenverteilung der Metallatome zu berücksichtigen.

Experimenteller Teil

212

10.4. Chromatographische Untersuchungen Für die chromatographischen Untersuchungen wurde die Umkehrphasen-IonenpaarHochdruck-Flüssigkeitschromatographie (IPRP-HPLC) eingesetzt. Als stationäre Phase kam eine silicagelbasierte C18-Phase von der Firma Macherey-Nagel mit einer durchschnittlichen Porengröße von 10nm und einer Korngröße von 5µm für die analytischen Trennungen zum Einsatz. Die mit der NUCLEODUR-Pyramid-Phase gefüllte Säule weist, bezogen auf die aggressiven Trennbedingungen (z. B. pH-Wert ≈ 2) eine gute Langzeitstabilität auf. Die chromatographischen Säulen waren 25 cm lang bei einem Innendurchmesser von 4mm. Für das untersuchte chromatographische System wurde ein Stufengradient verwendet, bei dem einem Gemisch aus 4% Methanol und 96% Wasser nach 25 min ein Eluentengemisch mit 12% Methanol und 88% Wasser mit jeweils 0,1% Pentafluorpropionsäure (PFP) als Ionenpaarreagenz folgte. Die Wellenlänge betrug bei allen Messungen 220nm. Die Temperatur war bei 25°C eingestellt und die Flussrate bei 0,8 ml·min-1. Der Chromatograph für die analytischen Lösungen bestand aus einer LaChrom Anlage der Firma Merck und setzte sich aus einer HPLC Gradientenpumpe L-6200A, einem UVDetektor L-4250 und einem Säulenthermostat L-7360 zusammen. Zur Injektion diente ein 6Wege-Ventil 7125 von Rheodyne mit einer 20µl Probenschleife. Die Aufnahme der chromatographischen Daten wurde mit einem 20 Bit A/D-Wandler der Firma Knaur bei einer Datensammelrate von 1Hz mit dem Eurochrom Integration Package V.1.5 durchgeführt.

Für die kinetische Untersuchung wurden je 0,8 µmol Cisplatin und Peptid eingewogen und in 10ml Wasser gelöst. Die Einstellung des pH-Wertes erfolgte über die Zugabe von 0,1 M NaOH oder HNO3. Die Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer bei 37°C inkubiert. Bei den durchgeführten Konkurrenzuntersuchungen wurde wiederum je 0,8 µmol Peptid hinzugefügt und die Lösung weiter bei 37°C inkubiert.

10.5. Kernresonanzspektroskopie Die Aufnahme der NMR-Spektren erfolgte in der SC-Abteilung der Ruhr-Universität Bochum an dem FT-NMR-Spektrometer DRX200 der Firma Bruker bei ν = 200,13 MHz. Als Lösungsmittel diente in allen Fällen D2O und als Frequenzsstandard in D2O gelöstes Natrium3-(Trimethylsilylpropionat)-D4. Es wurden 5mm Probenröhrchen verwendet. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit dem Programm MestRe-C2.3a der Universidade de Santiago de Compostela.

Experimenteller Teil

213

Die Reaktionslösungen für die zeitabhängigen 1H-NMR-Untersuchungen wurden durch Einwaage von je 0,8 mmol Cisplatin und Peptid hergestellt, die in 1ml D2O gelöst werden. Die Einstellung des pH*-Wertes erfolgt über Zugabe verdünnter NaOD und DNO3. Die Angaben der pH*-Werte sind für den Isotopeneffekt des Deuteriums unkorrigiert (pH = pH*).

Anhang

214

11. Anhang MudPIT-MS/MS-Spektren der Proteintargets aus E. coli (nicht in Kapitel 5 diskutiert) 1.Proteintargets von [(η6-p-Cymol)RuCl2(DMSO)] in E. coli (Tab. 5.1)

PPID_ECOLI V.SD*AASNDTESLAGAEQAAGVK.A

DBPA_ECOLI L.T*LCGGQPFGMoxQR.D

OSMY_ECOLI (a) V.VT*LSGFVESQAQAEEAVK.V

OSMY_ECOLI (b) V.VT*LSGFVESQAQAEEAVK.V

HRPA_ECOLI A.QGAVMAT*EK.V

Anhang

215

2. Proteintargets von Pt(dien)]2+ in E. coli (Tab. 5.6)

ALDB_ECOLI [email protected]

RBSA_ECOLI [email protected]

YICC_ECOLI [email protected]

DNAK_ECOLI [email protected]

Anhang

216

3. Proteintargets von cis-[PtCl2(NH3)2] in E. coli (Tab. 5.10)

FINQ_ECOLI K.MoxECID~NEVVVTVNEKLK.D

REP5_ECOLI S.FISDILYADIE~SK.A

INTD_ECOLI V.PNMS~HSEIMoxEDIKKA

DBPA_ECOLI K.MoxRPGD~VLGALTGDIGL.D

DBPA_ECOLI K.MoxRPGD#VLGALTGDIGLDGADIG.K

RS6_ECOLI R.HYEIVFM§VHPDQSEQVPGMIER.Y

Anhang

CH60_ECOLI A.M#LQDIATLTGGTVISEEIGMELEK.A

ACRD_ECOLI R.KAQALGVAID#DINDTLQ.T

FIMA1_ECOLI A.LSLS#STAALAAATTVNGGTVHFK.G

217

RPOA_ECOLI .M§QGSVTEFLKPR.L

MDTA_ECOLI R.QE§LDAQQALVSETEGTIKADEASV.A

CEAN_ECOLI K.LIDAESIK#GTEVYTF.H

Anhang

218

ARTI_ECOLI K.FIM§DKHPEITTVPYDSYQNAK.L

PTHP_ECOLI .M§FQQEVTITAPNGLHTR.P

DCEA_ECOLI F.EMDFAELLLEDY#K.A

MDH_ECOLI K.SIGTLSAFEQNALEGMLDT~.L

G3P1_ECOLI K.RSD§IEIVAINDLLDADYMAYMLK.Y

EBGC_ECOLI V.HE§GQIVICDIHEAYR.F

Anhang

TDCE_ECOLI K.T§APLMoxDDVLDYDKVMDSL.D

SPEA_ECOLI R.MoxADKMYVNFS$LFQSMPD.A

219

HIS2_ECOLI H.AVSGEVLMLGYM$NPEALDK.T

MUKE_ECOLI R.STT#LIPRSVLSELDMMVG.K

Literaturverzeichnis

220

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Danksagung

Meinem Mann danke ich einfach für alles. Meiner Familie danke ich ebenfalls für jegliche mir gewährte Unterstützung.

Bei allen aktiven und ehemaligen Mitarbeitern der Arbeitskreise Sheldrick und Iris Oppel möchte ich mich sowohl für die fachliche, als auch für die freundschaftliche Hilfe und ihre aufbauenden Worte bedanken. Dr. Oliver Hohage danke ich für seine beruhigende und immer wieder aufmunternde Art und natürlich für die fachlichen Tipps. Dr. Kirsten Föcker, Me Harlos, Anna Kromm, Yvonne Geldmacher, Ruth Bieda und Dr. Michael Scharwitz danke ich für die netten Stunden vor allem außerhalb des MS-Bunkers. Den aktiven und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Dr. Dirk Wolters (besonders Dr. Dirk Wolters, Sabine Bendix und Dr. Andreas Kyas) danke ich für die Möglichkeit der Mitbenutzung der Geräte und die vielen praktischen Tipps. Jan-Amadé Bangert, Gerd Kock und Dr. Carsten Berghaus danke ich nicht nur für die computer-technische Unterstützung, sondern auch für die unterhaltsame Zeit. Der Arbeitsgruppe von Prof. Gust (FU Berlin), besonders Dr. Ingo Ott sowie den weiteren Mitgliedern der Forscherguppe, danke ich für die gute Zusammenarbeit und die nette Atmosphäre bei allen FOR 630-Treffen. Bei allen, die zum Gelingen der Arbeit in irgendeiner Weise beigetragen haben, aber nicht namentlich genannt sind, möchte ich mich dafür entschuldigen. Mein Dank gilt natürlich auch Euch.

Lebenslauf

Name: Geburtsdatum: Geburtsort: Familienstand: Nationalität:

Joanna Maria Will, geb. Sajonz 23.08.1977 Oppeln verheiratet deutsch

Schulbildung Sept. 1984 – Dez. 1990 Jan. 1991 – Juni 1997 Juni 1997

Volksschule in Oderwinkel, Kreis Oppeln Ursulinengymnasium Werl Allgemeine Hochschulreife, Juni 1997

Berufsausbildung Aug. 1997 – Juli 1999 Aug. 1999 – Febr. 2000 März 2000

Pharmazeutisch-technische Lehranstalt in Castrop-Rauxel Berufspraktikum im Rahmen der Ausbildung zur pharmazeutisch-technischen Assistentin Abschluss als staatlich geprüfte pharmazeutisch-technische Assistentin

Studium April 2000 – Mai 2005 Oktober 2002 Nov. 2004 – Mai 2005

Studiengang Diplom-Chemie an der Ruhr-Universität Bochum Vordiplom der Chemie Anfertigung der Diplomarbeit am Lehrstuhl für Analytische Chemie bei Prof. W. S. Sheldrick, Thema der Arbeit: „Wechselwirkungen zytostatisch wirksamer Platinkomplexe mit 5´-GMP2- in Gegenwart schwefelhaltiger Substanzen“

Mai 2005

Diplom der Chemie

Juli 2005 – Mai 2008

Promotion am Lehrstuhl für Analytische Chemie bei Prof. W. S. Sheldrick, Thema der Arbeit: „Massenspektrometrische Ermittlung der Proteintargets von zytotoxischen Metallkomplexen in Blutserum und E. coli-Zellen“

Veröffentlichungen 1. Will J, Kyas A, Sheldrick WS, Wolters DA, Identification of (η6-arene)ruthenium(II) protein binding sites in E.coli cells by combined multidimensional liquid chromatography and ESI tandem mass spectrometry: specific binding of [(η6-p-cymene)RuCl2(DMSO)] to stress-regulated proteins and to helicases J. Biol. Inorg. Chem., 2007, 12, 883 DOI 10.1007/s00775-007-0242-x

2. Will J, Wolters DA, Sheldrick WS Multidimensional LC-ESI MS/MS analysis of protein targets for cisplatin and [(η6-p-cymene)RuCl2(DMSO)] in human serum and E. coli cells J. Biol. Inorg. Chem., 2007, 12 (Suppl 1), 50, P093

3. Will J, Sheldrick WS, Wolters DA Characterisation of cisplatin coordination sites in cellular E. coli DNA binding proteins by combined biphasic liquid chromatography and ESI tandem mass spectrometry J. Biol. Inorg. Chem., 2008, 13, 421 DOI 10.1007/s00775-007-0333-8

4. Will J, Wolters DA, Sheldrick WS Characterisation of Cisplatin Binding Sites in Human Serum Proteins using Hyphenated Multidimensional Liquid Chromatography and ESI Tandem Mass Spectrometry ChemMedChem, 2008, eingereicht

5. Ott I, Kircher B, Bagowski C, Vlecken DHW, Ott E, Will J, Sheldrick WS, Gust R Bioorganometallic Aspirin: A Hexacarbonyldicobalt Complex as NSAID like Anticancer Agent and Angiogenesis-Inhibitor Angewandte Chemie, 2008, eingereicht

Poster/Präsentation 1. Will J, Kyas A, Sheldrick WS, Wolters DA Shotgun identification of metal-protein complexes in whole cell systems by combined Multidimensional Liquid Chromatography ans ESI tandem mass spectrometry 3rd International Symposium on Bioorganometallic Chemistry, Mailand, 5.-8. Juli 2006, Poster

2. Will J, Wolters D, Sheldrick WS Identification of protein targets for cisplatin and [(η6-p-cymene)RuCl2 (DMSO)] in E.coli cells and human blood serum using multidimensional LC-ESI MS/MS analysis FOR 630-Treffen in Berlin, Eggersdorf, 30.Mai- 1.Juni 2007, Präsentation

3. Will J, Wolters D, Sheldrick WS Identification of protein targets in human serum using the multidimensional LC-ESI MS/MS Symposium on Medicinal Organometallic Chemistry, St. Martin in der Pfalz, 2.-5. April 2008, Poster