su kanker biomedisch bekeken bw DEF.indb

Deel 1 Wat is kanker?

42

DEEL 1 WAT IS KANKER?

Hoofdstuk 1

Wat is kanker?



Karin Vanderkerken, Hendrik De Raeve, Peter Vandenberghe

1 Celdeling als motor van ontwikkeling, groei en weefselhomeostase Celdeling is de motor van de ontwikkeling, groei en weefselhomeostase van multicellulaire organismen. In een normaal weefsel interageren de cellen zoals in een ecosysteem met cellen als individuen. Er zijn, net zoals in een samenleving, regels en wetten i.v.m. geboorte, sterfte, habitat, territoriale beperkingen (vooral de beperking van grootte van een bepaalde populatie). Om deze homeostase te kunnen handhaven werken de cellen nauw samen via een complexe signalisatie die de cellen onderwerpt aan strikte groeiregulerende mechanismen: ze zorgen ervoor dat bij groei en ontwikkeling individuele organen tot hun normale afmetingen groeien. Zodra die bereikt zijn, blijft er in de meeste weefsels een zekere activiteit aan celdeling bestaan: die staat in voor vervanging van afstervende cellen en verzekert dus het behoud van de weefselhomeostase. Het dunnedarmepitheel en het hematopoëtische systeem worden gekenmerkt door een extreem snelle turnover, terwijl de celturnover in andere weefsels, zoals de nieren, de endocriene organen en het endotheel, veel lager is. Zeer sterk gedifferentieerde weefsels, zoals spiercellen of neuronen, verliezen zelfs het vermogen om te delen. Bij een volgroeid organisme is er blijvende nood aan aanpassing aan wisselende situaties, zoals weefselschade. Spierweefsel dat zijn delingscapaciteit verloren heeft, reageert op een verhoogde belasting met hypertrofie. Dit betekent een toename van het volume van de individuele spiercellen, bv. hartspierhypertrofie en skeletspierhypertrofie door toegenomen fysieke inspanningen bij atleten of hartspierhypertrofie bij hypertensiepatiënten. Hyperplasie, een toename van het aantal cellen in het betreffende orgaan, is een andere manier om aan gewijzigde behoeften tegemoet te komen, bv. de neutrofiele leukocytose die optreedt bij infecties, vooral van bacteriële oorsprong. Als de beschadiging hersteld is of het uitlokkende fenomeen verdwenen is, komen deze adaptieve mechanismen opnieuw tot rust: hieruit blijken de adaptiviteit en de reversibiliteit van zo'n proces. Weefsels bezitten dus het vermogen zich op een flexibele en dynamische manier aan te passen aan wisselende omstandigheden: dit berust op een delicate balans van groeistimulerende en groei-inhiberende signalen die vanuit het extracellulaire milieu op de individuele cellen inwerken.

2 Neoplastische groei Kankercellen en hun nakomelingen reproduceren zich zonder de beperkingen van normaal weefsel. Ze groeien onafhankelijk van de normale verankering ('anchorage-independent') en zijn ongevoelig voor beperkingen van populatiedensiteit. Men spreekt in dit geval van een neoplasie. Neoplasieën ontstaan dus als het aantal cellen in een weefsel op een onaangepaste manier toeneemt: d.w.z. zonder dat dit tegemoetkomt aan een fysiologische stimulus, zoals ontwikkeling, necrose, groei, infectie of belasting. In tegenstelling tot hyperplasie of hypertrofie is een neoplastisch proces in principe irreversibel: het is geen antwoord op, en dus niet afhankelijk van, een uitlokkende stimulus, maar berust daarentegen op verworven storingen in de groeistimulerende of groeiremmende processen en de daarmee verbonden cascades (zie ook hoofdstuk 3-6). Figuur 1.1 illustreert hoe fouten in de regulatie van de celdeling vanaf een stamcel aanleiding kunnen geven tot tumoren. Figuur 1.2 illustreert hoe verstoring in de celdeling in de basale laag van huidepitheel aanleiding kan geven tot huidkanker.

A Figuur 1.1

B

C

Normale en verstoorde controle van cellen vanuit stamcellen A Normale strategie voor het produceren van nieuw gedifferentieerde stamcellen B Stamcellen falen bij het produceren van één niet-stamceldochter en vormen een ongedifferentieerde tumor. C De dochterstamcellen slagen er niet in om normaal te differentiëren. Ze blijven prolifereren en vormen een tumor.

1

Kenmerk

Benigne tumor

Maligne tumor

begrenzing

scherp

onregelmatig

frequent

zelden

niet-invasief

invasief

laag

hoog

necrose

zelden

frequent

differentiatie

goed

slecht

mitotische activiteit

laag

hoog

metastasering

niet

wel

kapsel groeiwijze groeisnelheid

Tabel 1.1 Figuur 1.2 Normale en maligne groei van huidepitheel Bij normale epitheliale groei (links) is er proliferatie in de basale laag van het epitheel. Naarmate de onderste lagen van de endotheelcellen opschuiven, veranderen de cellen van vorm en verliezen ze de capaciteit om te delen. Bij tumorgroei (rechts) is dit proces verstoord en behouden sommige cellen hun delingscapaciteit. De celdeling is niet in evenwicht met de celdifferentiatie waardoor er een progressieve stijging is van het aantal delende cellen.

3 Invasief en metastatisch gedrag Het is de combinatie van twee belangrijke eigenschappen, nl. onbeperkte groei en irreversibiliteit, die kankercellen zo gevaarlijk maakt. Als de proliferatie niet meer gecontroleerd is, wordt een tumor gevormd en spreekt men van een neoplasma. Goedaardige tumoren vertonen geen invasief gedrag, in tegenstelling tot maligne tumoren. Een chirurgische ingreep kan in dit stadium voor een volledige verwijdering van de tumor zorgen. Als de cellen het omliggende weefsel echter invaderen, spreekt men van een kwaadaardig of maligne letsel (zie tabel 1.1).

Wat is kanker?

Onderscheid tussen benigne en maligne tumoren

Gewoonlijk impliceert metastase ook dat de cellen loskomen van de initiële tumor; ze groeien door de basale membraan of het orgaankapsel heen om andere weefsels te invaderen. Ze zaaien via het lymfestelsel of de bloedbaan uit naar andere weefsels waar ze nieuwe gezwellen vormen en nieuwe symptomen kunnen veroorzaken. Metastaserende kankercellen verspreiden zich over het hele lichaam en zijn hierdoor moeilijk te verwijderen. Metastase is een multistappenproces dat verschillende moleculaire interacties vereist (zie figuur 1.3). Longen, lever en bot zijn frequente sites voor metastatische letsels, terwijl metastasen in spierweefsel en miltweefsel zeldzaam zijn. Goedaardige gezwellen zijn goed omkapseld: ze invaderen de omliggende weefsels niet en zaaien niet uit naar weefsels op afstand. Dit aspect zal verder behandeld worden in hoofdstuk 9.

Benigne tumoren kunnen onderscheiden worden van maligne tumoren op basis van een aantal verschillen (zie ook tabel 1.1). De meeste van deze verschillen zijn relatief, afhankelijk van het weefseltype, en soms is het moeilijk te differentiëren tussen benigne en maligne groei. Figuur 1.3 Metastaseproces Slechts een klein percentage van de kankercellen kan de verschillende stadia van het metastaseproces succesvol doorlopen.

43

44

DEEL 1 WAT IS KANKeR?

De mogelijkheid van kankercellen om zich te verspreiden is gebaseerd op twee verschillende mechanismen: invasie en metastasering. Invasie is de directe migratie en penetratie van kankercellen in naburige weefsels, terwijl metastase de mogelijkheid is van kankercellen om in de bloedstroom te geraken, naar ver gelegen weefsels te migreren en daar metastasen te vormen die fysisch niet verbonden zijn met de primaire tumor (figuur 1.3). Paget (figuur 1.4) was de eerste om aan te tonen dat tumorcellen niet random metastaseren, maar naar zeer specifieke sites. Bij invasie hebben verschillende mechanismen een belangrijke rol: de cel-celinteractie tussen de kankercellen vermindert. Een cruciale molecule hiervoor is Ecadherine (sterk invasieve kankers hebben gewoonlijk minder E-cadherine dan normale cellen). Bovendien moet er een verhoogde gerichte motiliteit van de cellen zijn. Chemoattractanten zijn belangrijke moleculen die de kankercellen kunnen aantrekken. De kankercellen zullen ook proteasen aanmaken die extracellulaire matrix kunnen afbreken. Een kritische barrière waar de tumorcellen meestal door moeten, is de lamina basalis, die de epitheliale lagen scheidt van andere, onderliggende weefsels (zie ook hoofdstuk 9).

4 Selectie van de tumorcellen

Figuur 1.4 Paget (The Lancet, 1889) was de eerste om aan te tonen dat kankercellen niet random metastaseren, maar naar preferentiële sites gaan. Hij noemde dit de ‘seed and soil’ hypothese (zie ook hoofdstuk 9).

Zoals hierboven vermeld, begint een tumor met één cel. Deze cel heeft verschillende ronden van mutaties en natuurlijke selectie ondergaan en resulteert vervolgens in een cel met verschillende fysiologische behoeften van een normale cel, zoals groeimogelijkheden in hypoxische omstandigheden (zie ook hoofdstuk 9) met weinig nutriënten en de mogelijkheid om de natuurlijke barrières van een normaal weefsel te doorbreken. Zo ontstaat een dominante kloon (figuur 1.5). De snelheid van evolutie van een populatie hangt van verschillende factoren af: de mutatiesnelheid (de probabiliteit per gen en per tijdseenheid om een genetische verandering te ondergaan), het aantal individuen in de populatie, de snelheid van reproductie (het aantal generaties nakomelingen per tijdseenheid), het selectieve voordeel van de mutanten (de ratio van het aantal overlevende fertiele nakomelingen van de mutanten op het aantal overlevende fertiele nakomelingen van de non-mutanten). Deze kritische factoren tellen zowel voor de evolutie van kankercellen in een multicellulair organisme als voor alle levende organismen op aarde. De meerderheid van de humane kankers heeft een verhoogde mutatiesnelheid (zie ook hoofdstuk 3, 4 en 7). Deze instabiliteit kan verschillende vormen aannemen: sommige kankercellen kunnen hun lokale DNA-schade of hun replicatiefouten niet herstellen. Deze cellen accu-

1

muleren meer puntmutaties en kleine veranderingen in DNA-sequenties dan normale cellen. Andere kankercellen hebben problemen met de integriteit van hun chromosomen en vertonen dan ook grote karyotypische abnormaliteiten. Hoe groter de initiële kloon van gemuteerde cellen is, hoe meer kans er is dat een bijkomende mutatie voor een meer aggressieve variant zal zorgen.

Wat is kanker?

De zes verworven eigenschappen die een cel tot een kankercel transformeren, zijn: 1 De cellen negeren de externe en interne signalen die celproliferatie reguleren. 2 De cellen vermijden apoptotische celdood. 3 De cellen omzeilen geprogrammeerde beperkingen van proliferatie en differentiatie. 4 De cellen zijn genetisch instabiel. 5 De cellen ontsnappen uit hun initiële weefsel (ze zijn invasief). 6 De cellen overleven en delen in vreemde weefsels (ze metastaseren).

5 Hoe manifesteert kanker zich in een patiënt? A Normale cellen B Cellen met een optimale genetische instabiliteit C Cellen met te veel genetische instabiliteit Figuur 1.5 Genetische instabiliteit en tumorprogressie Cellen met een optimaal niveau van genetische stabiliteit zijn het meest succesvol om een tumor te vormen. A In normale cellen is de intrinsieke genetische instabiliteit laag. Als deze cellen een selectiebarrière tegenkomen, zoals lage zuurstofconcentraties, is hun mutatieniveau te laag om een cel te produceren die deze selectiebarrières kan overleven en verder prolifereert. B In tumorcelprecursoren zorgt een verhoogd niveau van genetische instabiliteit voor een verhoogde kans dat er cellen ontstaan die de nodige genetische veranderingen ondergaan om de twee selectiebarrières te overleven. Deze genetische instabiliteit blijft bewaard in de tumor. C Bij een teveel aan genetische instabiliteit prolifereren de cellen niet voldoende of worden ze veel gevoeliger voor celdood. Deze verhoogde mutatiesnelheid kan dus leiden tot het verdwijnen van deze populatie cellen.

Mutaties kunnen een invloed hebben op het aantal cellen. In normale weefsels is er een evenwicht tussen celdeling en celdood (en dit laatste vooral door apoptose). Veranderingen die de normale maturatie van cellen naar een niet-delende, terminaal gediffentieerde staat blokkeren of die een normale, geprogrammeerde celdood inhiberen, spelen een belangrijke rol bij heel wat kankers (zie ook figuur 1.1 en hoofdstuk 6). Normale cellen prolifereren onder invloed van groeifactoren. Kankercellen worden dikwijls onafhankelijk van deze groeifactoren door defecten in de signaaltransductie waardoor er constante signalen zijn die de celdeling stimuleren. Verstoringen in de controle van de celcyclus dragen ook bij tot een ongelimiteerde proliferatie van de kankercellen (zie ook hoofdstuk 3).

Niet alle kwaadaardige aandoeningen groeien als ‘gezwellen’: bij leukemie worden de leukemische cellen in het beenmerg gevormd en als individuele cellen in de bloedbaan losgelaten, net zoals bij normale bloedcellen. Zeldzaam kunnen leukemische cellen evenwel ook als een solide weefselmassa groeien (‘chloromen’ bij chronische of acute myeloïde leukemie). Lymfomen, tumoren van het lymfoïde systeem, kunnen zich voordoen als kliergezwellen of als leukemisch uitgezaaide aandoeningen. De klinische manifestaties van een gezwel op zich kunnen multipel zijn, afhankelijk van het orgaan/de organen en/of de locatie(s) waar ze zich voordoen. Al te vaak blijven tumoren een lange tijd onopgemerkt aanwezig (zie hoofdstuk 2 en 12). Een van de grote uitdagingen voor de preventieve geneeskunde bestaat erin deze asymptomatische gezwellen tijdig op te sporen zodat ze nog met curatieve doeleinden behandeld kunnen worden. Gezwellen van de huid en van onderhuidse weefsels kunnen palpabel zijn (bv. het mammacarcinoom). Groei van een gezwel in een niet-expandeerbare ruimte, bv. de schedelholte of het spinale kanaal, kan leiden tot overdruk (intracraniële overdruk: hoofdpijn, nausea, papiloedeem, eventuele neurologische uitval) en compressiesymptomen (uitval van perifere en centrale zenuwbanen met neurologische uitval). Tumoren in holle organen (respiratoire tractus, gastro-intestinale tractus, biliaire tractus, urogenitale tractus …) kunnen de oorzaak zijn van abnormaal bloedverlies of diverse obstructiefenomen. Ook kan door de aanwezigheid van een gezwel of maligniteit de functie van een orgaan in het gedrang komen (bv. botpijnen of pathologische fractuur bij skeletale aandoeningen; pancytopenie met hypoxie, vatbaarheid voor infecties, bloedingen bij acute leukemie; malabsorptie bij darmlymfomen; hypoxie bij longtumor; karakterstoornissen bij intracraniële tumoren).

45

46

DEEL 1 WAT IS KANKER?

Benigne neoplasieën lijken in principe goed op het weefsel waaruit ze ontstaan zijn: ze zijn goed gedifferentieerd. Maligne neoplasieën kunnen een breed spectrum bestrijken van veeleer goed gedifferentieerd naar matig gedifferentieerd tot ongedifferentieerd. In de overgangszone tussen goed- en kwaadaardig bevinden zich de ‘dysplastische’ letsels. Het bestaan van dysplasie in een weefsel is een uiting van bestaande weefselbeschadiging, die weliswaar nog niet geleid heeft tot tumorale transformatie, maar vaak ‘premaligne’ of ‘precancereus’ is: de kans dat zich uit een dergelijk letsel een maligne aandoening ontwikkelt, is duidelijk verhoogd (bv. actinische keratose van de huid, dysplasie van bronchusepitheel, barrettmetaplasie van de slokdarm). Soms is het door verregaande dedifferentiatie zelfs niet mogelijk uit een metastatisch letsel de histologische aard van de primaire tumor te achterhalen. Niet-gedifferentieerde tumoren gedragen zich meestal agressiever dan beter gedifferentieerde. De differentiatiegraad van een weefsel wordt beoordeeld op grond van een aantal cytologische parameters: de verhouding tussen de grootte van nucleus en cytoplasma, de zichtbaarheid van de nucleoli, de densiteit van de nucleus, de mitosefiguren, de basofilie van het cytoplasma, de aanwezigheid van weefselspecifieke granules, de variabiliteit van de celgrootte. Er is een biologisch spectrum tussen goed- en kwaadaardig en het is niet altijd eenvoudig de aard van een staal exact te typeren. Dit kan geïllustreerd worden aan de hand van het volgende voorbeeld. Bij de beoordeling van uitstrijkjes van de baarmoederhals (screening naar baarmoederhalskanker) (figuur 1.6) gebruikt men het Bethesdasysteem (2001). Men onderscheidt hierin enerzijds ‘negatief voor epitheliale laesies of maligniteiten’ en anderzijds ‘epitheelcelafwijkingen’. Hierin zijn er squameuze epitheliale afwijkingen en glandulaire epitheliale afwijkingen (zie ook hoofdstuk 12). Bij de squameuze epitheliale afwijkingen onderscheidt men: • atypische squameuze cellen van onbekende betekenis (ASC-US: ‘atypical squamous cells of undetermined significance’); • atypische squameuze cellen waarbij een hooggradige squameuze intra-epitheliale laesie niet uitgesloten kan worden (ASC-H); • laaggradige squameuze intra-epitheliale laesie (LSIL); • hooggradige squameuze intra-epitheliale laesie (HSIL); • plaveiselcelcarcinoom. Bij de glandulaire afwijkingen onderscheidt men: • atypische endocervicale cellen niet anders gespecificeerd (NOS, ‘not otherwise specified’); • atypische endometriale cellen NOS;

• atypische glandulaire cellen NOS; • atypische endocervicale cellen met voorkeur voor maligniteit; • atypische glandulaire cellen met voorkeur voor maligniteit; • endocervicaal adenocarcinoom in situ; • endocervicaal adenocarcinoom; • endometriaal adenocarcinoom; • extra-uterien adenocarcinoom; • adenocarcinoom NOS.

Figuur 1.6

Uitstrijkjes van baarmoederhals: links een normale cytologie en rechts een zwaar afwijkende cytologie (Met dank aan de dienst Pathologische ontleedkunde Onze-LieveVrouwziekenhuis Aalst.)

De meeste kankercellen zijn afkomstig van één abnormale cel; zelfs als de kankercellen gemetastaseerd zijn, blijken ze afkomstig van één tumor en zelfs van één cel. Om na te gaan of verschillende kankercellen van één tumor afkomstig zijn, kan men chromosomale afwijkingen gaan opsporen. Zo kan men bijvoorbeeld bij patiënten met chronische myeloïde leukemie kwaadaardige lymfocyten van goedaardige onderscheiden door een specifieke chromosomale afwijking, nl. het philadelphiachromosoom, waarbij er een translocatie is van chromosoom 9 → 22. (figuur 1.7).

Figuur 1.7 De translocatie tussen chromosoom 9 en 22 is verantwoordelijk voor chronische myeloïde leukemie. Het kleinste abnormale chromosoom dat hier ontstaat, wordt philadelphiachromosoom genoemd naar de stad waar deze abnormaliteit voor het eerst beschreven is.

1

6 Tumorclassificatie Een correcte en bruikbare classificatie van tumoren is van het allergrootste belang omdat op die manier de aard van een ziekte benoemd wordt en op grond hiervan ook de correcte behandeling gepland kan worden. De syntaxis van de tumornomenclatuur codeert het oorspronkelijke weefseltype (mesenchymaal, epitheliaal, reticulo-endotheliaal), het karakter van de tumor (benigne of maligne), het orgaan van oorsprong, soms aangevuld met het groeipatroon. Goedaardige tumoren van plaveiselepithelen zijn papillomen, van klierepithelen adenomen. Kwaadaardige tumoren van epithelen zijn carcinomen: plaveiselcelcarcinomen, basaalcelcarcinomen, adenocarcinomen (als het oorspronkelijke weefsel een exocriene klier of een slijmnapepitheel is). Tumoren van mesenchymale oorsprong worden benoemd naar het oorspronkelijke weefseltype gevolgd door ‘-oom’ voor goedaardige aandoeningen, ‘-sarcoom’ voor kwaadaardige aandoeningen. In het zenuwstelsel kunnen eveneens goedaardige en kwaadaardige tumoren voorkomen. Tumoren van neuronen doen zich alleen bij het embryo of het jonge kind voor (als neuroblastomen of retinoblastomen). Alle andere tumoren van het zenuwstelsel ontstaan uit niet-neuronale steunweefsels van het hersenparenchym of de perifere zenuwen. Dit impliceert dat bij volwassen patiënten hersentumoren in principe uitgaan van steunweefsels (bv. acusticusneurinomen, glioblastomen) en niet van neuraal weefsel stricto sensu. Op jonge leeftijd blijven in zenuwweefsel of spierweefsel nog stamcellen bestaan, die dus bij kinderen de oorsprong kunnen zijn van tumo-

Wat is kanker?

ren van het spierstelsel (rhabdomyosarcomen) of het zenuwstelsel (medulloblastomen, neuroblastomen, retinoblastomen). De classificatie van de tumoren van het hematopoëtische en lymfoïde systeem is uitermate gecompliceerd en is onlangs herzien (WHO-classificatie 2008). Het hematopoëtische en vooral het lymfoïde systeem bevatten cellen in diverse stadia van rijping, en aan veel van deze rijpingsstadia beantwoordt een maligne tegenhanger, met een specifiek biologisch gedrag en dus een specifieke naam. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen myeloïde neoplasmen (met acute en chronische leukemieën als voornaamste groepen) en lymfoïde neoplasmen. Deze laatste kan men onderverdelen volgens de cel van origine (T/B/NK) en volgens het rijpingsstadium waaruit de aandoening ontstaan is (precursor B- en T-neoplasmen (uit voorlopercellen) versus mature B- en T-neoplasmen (uit mature cellen)). Sommige van deze aandoeningen situeren zich in het beenmerg om leukemisch uit te zaaien (‘leukemieën’), sommige ontstaan in de perifere lymfoïde organen en geven dan aanleiding tot klierzwellingen (‘lymfomen’), weer andere vertonen beide groeipatronen. Omdat de huidige WHO-classificatie vooral de nadruk op genetische of biologische entiteiten wil leggen, wordt nu minder de nadruk gelegd op het onderscheid tussen lymfoom en leukemie. Tumoren van het hematopoëtische stelsel zijn in principe altijd uitgezaaid en worden daarom onder de maligne neoplasmen gerangschikt. Er bestaat echter een breed spectrum van indolente (traag evoluerende) tot zeer agressieve aandoeningen (tabel 1.2).

47

48

DEEL 1 WAT IS KANKER?

Oorspronkelijk weefsel

Oorspronkelijke cel

Benigne tumor

Maligne tumor

plaveiselcelpapilloom

plaveiscelcarcinoom

Epitheel plaveiselepitheel Huid

Mond, tong, slokdarm Maag, dunne darm, dikke darm

basale cellen

basaalcelcarcinoom

melanocyt

naevus

maligne melanoom

plaveiselepitheel

papilloom

(plaveiselcel)carcinoom

papillair adenoom

(adeno)carcinoom

adenoom

(adeno)carcinoom

bindweefsel

fibroom

fibrosarcoom

vetweefsel

lipoom

liposarcoom

bot

osteoom

osteosarcoom

kraakbeen

chondroom

chondrosarcoom

gladde spier

leiomyoom

leiomyosarcoom

gestreepte spier

rhabdomyoom

rhabdomyosarcoom

bloedvatendotheel

hemangioom

hemangiosarcoom

slijmnapepitheel (in maag) slijmbekercellen in dunne en dikke darm

Lever, nier, prostaat, schildklier, pancreas Mesenchym

Zenuwstelsel neuronen

neuroblastoom retinoblastoom

meningen*

meningeoom

zenuwschede*

neurofibroom

glia*

neurofibrosarcoom glioblastoom

Hematopoëtisch stelsel acute myeloïde leukemie Myeloïd chronische myeloïde leukemie • B-lymfoblastische leukemie/ lymfoom Lymfoïd

• T-lymfoblastische leukemie/ lymfoom mature B-celneoplasmen mature T-/NK-neoplasmen

* Qua oorsprong zijn dit mesenchymale weefsels. Tabel 1.2

Nomenclatuur van enkele tumoren

1

Experimenteel luik Het onderzoek naar de mechanismen die aan de basis liggen van de pathofysiologie van kanker eist cellulair materiaal, zowel om genetische analyses te doen als functionele experimenten met de kankercellen al dan niet in cocultuur met andere cellen. Het grote voordeel van deze in-vitro-experimenten is dat de omgeving (en vooral de fysicochemische eigenschappen) goed gecontroleerd zijn. Bovendien is er ook geen invloed meer van andere lichaamscellen en wordt de studie van de celfunctie, het metabolisme of het differentiatieproces vereenvoudigd. In deze context wordt het ook eenvoudiger om de interactie tussen een bepaalde cel en een agens (bv. een nieuw geneesmiddel) te bestuderen. Gezien de kleine volumes heeft men minder reagentia nodig dan bij in-vivoexperimenten. In vivo gaat er immers meer dan 90 % van de toegediende stoffen verloren door distributie over de weefsels en door secretie. Nadelen van in-vitroculturen zijn dan dat men steriele kweekomstandigheden nodig heeft (met uiteraard ook de nodige infrastructuur) met complexe media. Finaal heeft men ook de extrapolatie van in vitro naar in vivo. De cellen zijn immers van een driedimensionaal in-vivosysteem naar een tweedimensionaal in-vitrosysteem gebracht. Hierbij zijn verschillende celinteracties en micro-omgevingen verloren gegaan (en zijn er ook geen neuro- of endocriene regulaties in vitro). In dit deel zal vooral aandacht gegeven worden aan de methodes van isolatie en zuivering van cellen. Zodra deze cellen in cultuur gebracht zijn, kunnen verdere experimenten uitgevoerd worden om proliferatie (hoofdstuk 4), apoptotische (hoofdstuk 6) en genetische eigenschappen (hoofdstuk 3 en 7), en de interacties met de microomgeving, zoals inductie van botziekte en angiogenese (hoofdstuk 9), te bestuderen. Gevoeligheden voor therapieën, zoals radiotherapie en chemotherapie, worden ook in een later hoofdstuk besproken (hoofdstuk 13). In een tweede deel zal kort aangehaald worden welke transplantatiemodellen beschikbaar zijn. Transgene modellen worden later behandeld (hoofdstuk 3).

Celisolatie De celbiologische studie van de kankercel vereist de isolatie en zuivering van die kankercel. Kankercellen kunnen uit een patiëntenstaal of uit een proefdiermodel geïsoleerd worden. Naargelang van de opbouw kan men drie types weefsel onderscheiden: 1 Weefsels waarin de cellen al loszitten, zoals bloed. Dat is eigenlijk al een ‘single cell’ suspensie. Uit bloed kan men met sedimentatie en gradiëntcentrifugatie de verschillende celtypes isoleren.

Wat is kanker?

2 Cellen die georganiseerd zijn in een weefsel, zoals in de lever, de pancreas en de nier. Deze isolatiemethodes zijn uiteraard ingewikkelder. 3 Cellen die min of meer vastzitten, zoals longmacrofagen, peritoneale macrofagen, beenmerg- en miltcellen, die met gewoon uitwassen met een isotone oplossing vrijkomen. Gezien de sterk verschillende architectuur en samenstelling van de verschillende organen is het niet mogelijk om een standaardprocedure te ontwikkelen. Afhankelijk van de cel-celinteracties en de interacties met de extracellulaire matrix, zoals collageen, kan men verschillende isolatiemethoden ontwikkelen. Algemeen kan men stellen dat de eerste stap het afbreken is van de extracellulaire matrix die de cellen bijeenhoudt. Hiervoor moeten de nodige enzymen in voldoende hoeveelheden ter beschikking zijn. Voor een goede digestie moet het enzym in het orgaan kunnen binnendringen. Men kan het orgaan hiervoor in zo klein mogelijke stukken (1 tot 2 mm) verdelen voor men het met de enzymen incubeert. Een beter alternatief is het enzym, indien mogelijk, in het orgaan te brengen via de bloedbaan, dus door perfusie. Na de enzymatische digestie wordt het weefsel verder gedissocieerd: ofwel mechanisch (homogeniseren, schudden, vortexen, herhaaldelijk opzuigen en uitblazen met een pasteurpipet of fijne naald), ofwel chemisch (door het weglaten van divalente kationen (Ca2+, Mg2+) uit de oplossing, eventueel zelfs door het toevoegen van chelatoren, zoals ethyleendiaminotetra-acetaat (EDTA), die het vrije Ca2+ binden (of cheleren)), ofwel enzymatisch (hierbij wordt de extracellulaire matrix verteerd door enzymen, zoals collagenase, pronase, trypsine (werd het eerst gebruikt), hyaluronidase, papaïne en DNase). Gewoonlijk bestaat een celisolatieprocedure van een vast weefsel uit: 1 het verwijderen van vet en necrotisch weefsel; 2 het in kleine stukjes knippen van het weefsel (of een perfusiedigestie) en de incubatie met enzymen of een combinatie van een enzymatische of chemische behandeling om de intercellulaire verbindingen te verzwakken gevolgd door een mechanische behandeling om de cellen los te maken uit de verzwakte matrix. De enzymen worden dan verwijderd door de cellen te centrifugeren en het bovenstaande medium te verwijderen (‘wassen’). Na de isolatie moeten vrij complexe media gebruikt worden die de samenstelling van bloedplasma nabootsen.

Celscheiding Na isolatie moeten de cellen gescheiden worden. Afhankelijk van de eigenschappen van de cellen die je wilt isoleren en van de omliggende cellen kunnen verschillende

49

50

DEEL 1 WAT IS KANKER?

technieken gebruikt worden om cellen te scheiden. Dat kan op basis van fysische, chemische (immunologische) of morfologische eigenschappen.

Fysische methodes Een van de parameters die gebruikt kan worden voor de scheiding van cellen is de ‘densiteit’. De meest gebruikte toepassing hiervan is centrifugatie, al dan niet op een gradiënt. Een gewone centrifugatie met lage g (of zelfs de gravitatiekracht (g = 1) ) kan op zich al cellen scheiden. Zo kan men bijvoorbeeld de zware leverparenchymcellen scheiden van de niet-parenchymale cellen door sedimentatie (g = 1). Meestal worden echter gradiënten gebruikt. De cellen sedimenteren in een densiteitsgradiënt tot een evenwichtspositie waarbij hun densiteit gelijk is aan die van de gradiënt. Bij een bepaalde centrifugale kracht en viscositeit van de gradiënt is de sedimentatiesnelheid dus evenredig met de grootte van de partikels en met het verschil in densiteit tussen die van het partikel en die van het omringende medium. De gebruikte gradiënten moeten fysiologisch (iso-osmolair, ionensterkte en pH), niettoxisch (dus niet doordringbaar door de celmembraan) en niet-visceus zijn bij hoge snelheden; verder moeten ze ook steriliseerbaar zijn en gemakkelijk verwijderbaar na de procedure. Er zijn twee types gradiëntcentrifugatie: 1 Isopycnische centrifugatie. De dichtheidsrange van de gradiënt bestrijkt hier het volledige gebied van dichtheden van de te scheiden deeltjes. Elk deeltje zal sedimenteren tot het in evenwicht is, dus tot de plaats waar de dichtheid van het deeltje gelijk is aan de dichtheid van het medium. 2 Zonale centrifugatie. Hier berust de scheiding op het verschil in afmetingen en dichtheden tussen de deeltjes. De dichtheidsgradiënt wordt zodanig gekozen dat de dichtheid van de deeltjes in elk punt van de oplossing groter is dan die van het medium. De centrifugatie wordt dan gestopt voor de verschillende zones de bodem bereiken.

Immunologische methodes Een belangrijke eigenschap die voor de zuivering van cellen gebruikt kan worden, is de expressie van bepaalde antigenen en de bindingseigenschappen van specifieke antilichamen aan deze antigenen. Verschillende technieken die deze antigenexpressie gebruiken, zijn panning, sefarosekolom en FACS. Bij panning wordt de cultuurbodem met een bepaald antilichaam gecoat. Alle cellen die het antigen (dat specifiek reageert met het antilichaam) uitdrukken, blijven hechten; de andere gaan eraf na het spoelen met een warm medium. Bij een sefarosekolom wordt een analoge methodologie gebruikt; hier worden sefarosekorrels gecoat

met het antilichaam en worden de niet-hechtende cellen uit de kolom geëlueerd. Bij ‘magnetic beads’ worden magnetische bolletjes gecoat met een antistof (figuur 1.8). Als de reageerbuis tegen de magneet gehouden wordt, migreren de cellen met het bolletje naar de kant van de magneet. De andere cellen worden weggewassen.

Figuur 1.8

Negatieve (links) en positieve (rechts) selectie via microbeads Bij negatieve selectie worden de niet-doelwitcellen gemerkt met een specifiek antilichaam gekoppeld aan microbeads. Die worden op de magneet tegengehouden en de doelwitcellen lopen door de kolom en worden opgevangen. Bij positieve selectie worden de doelwitcellen gemerkt met een specifiek antilichaam gekoppeld aan microbeads. Die blijven op de kolom achter terwijl de ongemerkte cellen door de kolom lopen. De kolom wordt vervolgens uit de magneet gehaald en de doelwitcellen worden in een aparte fractie opgevangen. (Naar brochure van Miltenyi.)

‘Fluorescence activated cell sorting’ (FACS) is een van de meer gesofistikeerde technieken van celscheiding die antilichamen gebruikt die gebonden zijn aan een fluorochroom. De gemerkte cellen kunnen dan van de niet-gemerkte cellen gescheiden worden met behulp van een elektronische ‘fluorescence activated cell sorter’, afgekort FACS. Flowcytometrie kan gedefinieerd worden als geautomatiseerde analyse van individuele cellen door belichting in een vloeistofstroom. De gesofistikeerde en multidisciplinaire apparatuur die hiervoor gebruikt wordt (de FACS), bestaat o.a. uit een of meer lasers en staat in voor de analyse van individuele cellen of partikels. Een lichtbundel met sterke focus belicht de cellen die op hun beurt in de vloeistofkolom gecentreerd worden. Simultaan worden verschillende fysicochemische eigenschappen van elke cel, zoals lichtverstrooiing, fluorescentie en celvolume, gemeten. Dat gebeurt met een zeer hoge