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BIOTECHNOLOGIE Clonage par recombinaison BIOTECHNOLOGIE INDUSTRIELLE

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CLONAGE PAR RECOMBINAISON Le microbe Escherichia coli (E. coli) est probablement l’organisme le plus étudié et le plus compris de la planète. La plupart de ses gènes et de ses mécanismes biochimiques ayant été identifiés par les scientifiques, il nous est ainsi plus facile de le manipuler afin de pouvoir en profiter pleinement. Bien que cette bactérie ait toujours eu mauvaise presse, son utilité dans le domaine de la biotechnologie ne fait aucun doute. Les bactéries emmagasinent la plupart de leurs gènes (parties d’ADN qui servent à encoder les protéines) dans une seule molécule d’ADN, mais elles comprennent également des fragments mobiles d’ADN; ce sont les plasmides (voir la Figure 1). Les bactéries contiennent souvent Figure 1 : ADN bactérien et plasmides. des plasmides dans leurs cellules et les utilisent en 1 : ADN bactérien, 2 : Plasmides cas « d’urgence »; par exemple, les plasmides Source de l’image : renferment généralement des gènes qui favorisent la http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Plasmid_%28numbers %29.svg?uselang=frc Wikimedia Commons. résistance aux antibiotiques. Ce sont des gènes qui ne seraient pas nécessaires dans des conditions normales, mais qui sont très utiles en présence d’un antibiotique (la pénicilline, l’ampicilline, l’érythromycine, etc.) qui normalement détruirait la cellule. Ces mêmes plasmides (aussi appelés vecteurs) sont le moyen utilisé par les scientifiques pour insérer des « gènes d’intérêt » dans les bactéries. Un « gène d’intérêt » est un gène qu’un scientifique peut vouloir étudier afin d’en apprendre davantage sur sa fonction (son action), sa structure (son apparence) ou sa séquence (le codage de l’ADN). Le processus qui consiste à insérer des gènes dans un vecteur pour former une nouvelle molécule d’ADN qui pourra se répliquer en cellule hôte est appelé clonage par recombinaison (aussi connu sous le nom de clonage moléculaire). Ici, « recombinaison » signifie que deux différents brins d’ADN qui ne coexisteraient pas normalement sont combinés; le « clonage » consiste à créer de multiples copies d’organismes génétiquement identiques (clones). Le processus de clonage bactérien par recombinaison est constitué de quatre étapes fondamentales. Ces étapes sont : 1. Réactions de ligature 2. Transformation 3. Sélection et propagation 4. Isolement Examinons de plus près chacune de ces étapes.

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1. Réactions de ligature La première étape de ce processus consiste à transférer le « gène d’intérêt » dans le plasmide qui sera absorbé par la bactérie E. coli. Mais comment les scientifiques s’y prennent-ils au juste pour introduire le gène dans le plasmide? Premièrement, ils utilisent des protéines spéciales appelées enzymes de restriction afin de couper le gène et le plasmide à des endroits précis qui sont complémentaires. Les deux parties d’ADN libres se rencontrent avec l’aide d’une autre enzyme appelée l’ADN ligase et se combinent (ligature) pour former un plasmide modifié (voir la Figure 2).

2. Transformation

Figure 2 : Les brins d’ADN sont coupés et se réassocient avec l’ADN ligase. Source de l’image : Parlons sciences.

Nous sommes maintenant en présence d’un plasmide contenant le « gène d’intérêt ». Cependant, un plasmide ne peut pas cloner un gène par lui-même; il a besoin d’un système hôte pour faire des copies du plasmide (et ainsi, faire des copies du « gène d’intérêt »). Le système hôte le plus efficace est une bactérie, en particulier les bactéries E. coli puisque celles-ci se divisent et croissent rapidement. Une seule cellule E. coli peut se croître et se diviser en milliards de cellules en seulement 24 heures! Si une bactérie E. coli est porteuse d’un plasmide renfermant le « gène d’intérêt », le plasmide sera dupliqué chaque fois que la bactérie se dupliquera. Par conséquent, au cours d’un cycle de croissance d’une durée de 24 h, des milliards de copies (clones) du gène pourraient être produites! Maintenant, comment pouvons-nous convaincre les bactéries de devenir des hôtes pour nos plasmides? Dans un premier temps, de nombreux types de bactéries absorberont Figure 3 : Des bactéries sont amenées à absorber naturellement les molécules d’ADN dans leur environnement, des plasmides. Source de l’image : Parlons sciences. mais pour maximiser l’assimilation, il est possible de traiter les bactéries E. coli avec des produits chimiques afin qu’il soit plus facile pour elles d’absorber l’ADN plasmidique. Un des moyens d’y parvenir est de faire croître la bactérie E. coli avec un mélange contenant les plasmides et du sel. La pression osmotique (c.-à-d. une concentration élevée de sel à l’extérieur des cellules et une faible concentration de sel à l’intérieur des cellules) et la présence des plasmides provoqueront l’introduction des plasmides dans les cellules E. coli (voir la Figure 3). www.explorecuriocite.org © Parlons sciences 2014

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3. Sélection et propagation

Figure 4 : Sélection antibiotique de bactéries contenant des plasmides. Source de l’image : Parlons sciences.

Malheureusement, comme tu peux le voir à la Figure 3, ce ne sont pas toutes les cellules qui intégreront les plasmides, alors les cellules doivent être sélectionnées afin d’identifier celles qui auront intégré les plasmides et celles qui ne l’auront pas fait. Comment savoir quelles bactéries ont intégré les plasmides et quelles ne l’ont pas fait? Le plasmide renferme un agent de sélection spécifique, qui est généralement un gène codant une résistance antibiotique (voir la Figure 4). Étant donné que les bactéries se développent en présence d’un antibiotique, les bactéries AVEC des plasmides seront viables et pourront se développer, alors que les bactéries SANS plasmides mourront (voir la Figure 4). C’est ce qu’on appelle la sélection antibiotique. Une fois qu’une colonie (groupe de bactéries) possède le plasmide (parce qu’elle a su résister aux antibiotiques), elle est isolée et peut se multiplier. Ainsi, un bon nombre de bactéries contiennent le « gène d’intérêt ».

4. Isolement L’étape finale consiste à prélever les plasmides (et donc le « gène d’intérêt ») des bactéries (voir la Figure 5). Pour ce faire, les bactéries sont lysées (la membrane cellulaire est brisée) (A) et les plasmides sont séparés de l’ADN bactérien à l’aide d’une solution acide (pH faible) à teneur élevée en sel (puisque l’ADN plasmidique peut résister à ces conditions, mais pas l’ADN normal) (B). Finalement, les plasmides sont séparés de toutes les autres parties de la cellule à l’aide du procédé de centrifugation (rotation à grande vitesse) (C). Le clonage par recombinaison est une méthode hautement contrôlée et efficace pour produire des composés comme la vitamine C, l’enzyme chymosine (présure) qui est utilisée dans la fabrication du fromage et du colorant indigo (l’indigo est le colorant qui donne aux jeans bleus leur couleur). Aujourd’hui, on retrouve l’ADN recombiné dans l’industrie, la production alimentaire, la médecine humaine et vétérinaire (voir l’encadré ci-dessous), l’agriculture et la bio-ingénierie.

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Figure 5 : Prélèvement de plasmides des bactéries. Source de l’image : Parlons sciences.

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ADN recombiné en médecine L’insuline humaine recombinée... a presque complètement remplacé l’insuline provenant de sources animales (p. ex., cochons et bétail) dans le traitement du diabète de type 1.

L’hormone de croissance humaine recombinée (HCH, somatotropine)... est utilisée auprès de patients dont la glande pituitaire ne produit pas assez de HCH pour assurer une croissance et un développement normaux. Avant que la HCH recombinée soit disponible, la HCH utilisée à des fins thérapeutiques était prélevée dans la glande pituitaire de cadavres (personnes décédées).

Le facteur VIII ou facteur anti-hémophilique A recombiné... est utilisé pour les patients souffrant de types d’hémophilies (trouble de saignement), qui ne sont pas en mesure de produire assez de facteurs VIII pour permettre une coagulation du sang normale.

Le vaccin de l’hépatite B recombiné... est un vaccin recombinant utilisé pour la prévention de l’hépatite, une infection du foie.

Trois tests courants pour le diagnostic de l’infection à VIH… comprennent tous l’utilisation de clonage par recombinaison ou de produits de clonage par recombinaison.

Merci aux rédacteurs bénévoles du Défi Parlons sciences qui ont contribué au contenu de cette fiche documentaire.

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