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RAPPORT DE STAGE DE BACTERIOLOGIE ET DE PARASITOLOGIE

Effectué au Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie E.S.S.Agro.

Du 03 Août 2014 au 31 Octobre 2014

Présenté par : RAZAFINDRABE Tsiriniaina Jean Luco Doctorant à l’A2E E.S.S.Agro.

i REMERCIEMENTS Nous tenons à remercier : -

Le Programme des Nations Unies pour le Developpement (PNUD), l’Organisme des Nations Unies pour l’Education, la Science et la Culture (UNESCO) et du Comité Scientifique (CS) ;

-

L’Université d’Antananarivo à travers toute l’équipe G/DHD dirigée par Monsieur le Vice Président de la Formation et de la Recherche ;

-

Tout le personnel du Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSAgro.

Nous adressons, particulièrement, nos vifs remerciements et toutes nos chaleureuses gratitudes à Monsieur le Professeur RAKOTOZANDRINDRAINY Raphaël, Chef de Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSAgro. et aussi notre encadreur. C’est avec un grand plaisir que nous réservons ces lignes en signe de gratitude et de reconnaissance à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin pour la réalisation de ce stage.

SOMMAIRE Pages REMERCIEMENTS ................................................................................................................... i INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1 CONTEXTE ................................................................................................................................ 1 HISTORIQUE ET ACTIVITES DU SITE D’ACCUEIL....................................................... 2 METHODOLOGIE .................................................................................................................... 3 I.COLLECTE DE FECES DE BOVIN .............................................................................................. 3 I.1.

Nature et condition de prélèvement ..................................................................................... 3

I.2.

Lieu et modalité de prélèvement .......................................................................................... 3

I.3.

Etiquetage............................................................................................................................... 3

I.4.

Acheminement et transport .................................................................................................. 3

I.5.

Réception au laboratoire....................................................................................................... 3

II.

EXAMEN BACTERIOLOGIQUE DES SELLES (COPROCULTURE)............................ 3

II.1.

Examen macroscopique des prelevements ...................................................................... 3

II.2.

Culture : ensemencement et isolement ............................................................................ 4

II.2.1.

Milieu de culture ............................................................................................................ 4

II.2.2.

Technique de culture et isolement................................................................................ 5

II.3. II.3.1.

Aspect des colonies ........................................................................................................ 5

II.3.2.

Examen microscopique direct ...................................................................................... 5

II.3.3.

Tests metaboliques (glucidiques, protéiques, lipidiques) ........................................... 7

II.3.4.

Autres tests d’identification .......................................................................................... 7

II.4.

III.

Identification ...................................................................................................................... 5

Antibiogramme .................................................................................................................. 8

II.4.1.

Technique et réalisation sur gélose Mueller Hinton ................................................... 8

II.4.2.

Lecture et interprétation............................................................................................... 8

EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES .................................................................. 9

III.1.

Technique de sédimentation ............................................................................................. 9

III.2.

Différents types d’œuf d’helminthes des bovins observés .............................................. 9

RESULTATS ............................................................................................................................ 10 CONCLUSION ET PERSPECTIVES.................................................................................... 11 ANNEXES ................................................................................................................................. 12 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................... 15

1 INTRODUCTION Dans le cadre de la préparation du doctorat en santé animale au sein de l’Ecole doctorale A2E ESSAgro de l’Université d’Antananarivo, le Programme des Nations Unies pour le Developpement (PNUD), l’Organisme des Ntions Unies pour l’Education, la Science et la Culture (UNESCO) en coopération avec l’ Université d’Antananarivo à travers la Gouvernance et Développement Humain Durable (G/DHD) nous a offert un stage académique 3 mois au sein du Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSA-Université d’Antananarivo. Notre thème concerne « la diarrhéé bovine : causes microbienne et parasitaire dans les régions d’Amoron’i Mania et Vakinankaratra ». C’est pourquoi l’objectif de notre stage focalisé sur le savoir-faire des analyses bactériologiques et parasitologiques relatifs à la connaissance des causes de la diarrhée bovine. CONTEXTE A Madagascar, l’elevage bovin occupe une place très importante dans le cadre du développement en intervenant dans plusieurs domaines économiques, sociologiques et culturels (1). Comme toute spéculation, il rencontre des problèmes de maladies telles que la diarrhée banale, le météorisme, les helminthoses (2). La diarrhée entraine des pertes économiques pour les éleveurs alors que sa cause exacte reste encore méconnue.

2 HISTORIQUE ET ACTIVITES DU SITE D’ACCUEIL Le

Laboratoire

de

Microbiologie

et

de

Parasitologie

ESSA-Université

d’Antananarivo a été fondé en 1990 grâce au sutien financier de la Suisse sous la direction du Docteur TYBERAENC (vétérinaire). En 1996, la coopération française a contribué pour l’appui technique et financier. En 2007, l’Union Européenne a assuré la réhabilitation du laboratoire. Le Professeur RAKOTOZA NDRINDRAINY Raphaël a dirigé le laboratoire depuis mai 1993. Les activités de ce laboratoire se focalisent sur les examens parasitologiques et bactériologiques pour les stages et les travaux pratiques des étudiants ainsi que les travaux de recherches pour les mémoires de fin d’étude et les thèses de doctorat. Le personnel est composé du Chef de Laboratoire, de 2 Docteurs vétérinaires Doctorants et de 2 Techniciens de laboratoire et d’un Assistant Administratif.

3 METHODOLOGIE I. COLLECTE DE FECES DE BOVIN I.1. Nature et condition de prélèvement Les prélèvements sont des matières fécales fraichement émises provenant des bovins présentant de signes de diarrhée. I.2. Lieu et modalité de prélèvement Les prélèvements ont été pris dans les tueries d’Ampasika et chez quelques éleveurs situés dans les Fokontany Andraisoro et Ambatomaro. Pour le receuil du prélèvement, la fouille rectale a été pratiquée. I.3. Etiquetage Bien emballé dans un sachet, ces matières fécales sont étiquetées pour éviter toute confusion. I.4. Acheminement et transport Les prélèvements ont été transportés jusqu’au laboratoire d’analyse de l’ESSAgro. dans une glacière munie d’accumulateurs de froid pour bloquer la multiplication bactérienne et l’évolution des œufs de parasites (Annexe 1). I.5. Réception au laboratoire Arrivés au laboratoire, ces prélèvements sont mis dans un réfrigérateur (conservation maximale 8 heures à 4°C) jusqu’au moment du début de l’analyse. II. EXAMEN BACTERIOLOGIQUE DES SELLES (COPROCULTURE) L'examen bactériologique des selles se fait par coproculture, en ensemençant ces dernières sur des milieux de culture appropriés. Le but est de rechercher des bactéries réputées pathogènes. II.1. Examen macroscopique des prelevements Chaque prélèvement est observé pour noter son aspect et sa consistance : la présence de mucus, sa couleur noirâtres, son odeur (nauséabonde).

4 II.2. Culture : ensemencement et isolement II.2.1. Milieu de culture II.2.1.1. Types Plusieurs types de milieu de culture sont utilisés : o Gélose au sang et gélose au chocolat : gélose ordinaire favorable à la croissance et multiplication bactérienne et même ceux qui ont besoin d’un facteur de croissance. o Bouillon selenite o Gélose Salmonella-Shigella o Gélose Mac Conkey : c’est un milieu sélectif pour les bacilles Gram négatifs o Gélose Mueller-Hinton : milieu adapté pour l’antibiogramme o Autres milieux : bouillon au sélénite, Salmonella Shigella agar. II.2.1.2. Procédure de préparation Pour la gélose au sang et la gélose au chocolat, on a utilisé le « Columbia blood agar base CM0331 » qui se présente sous forme de poudre à dissoudre à raison de 39g/l d’eau distillée et stériliser pendant 15mn à 121°C à l’autoclave. Ce milieu est refroidit jusqu’à 50°C à la bain-mari pour la gélose au sang (70°C pour la gélose au chocolat) puis ajouter 5% de sang de mouton et repartition dans des boîtes de Pétri (20ml par boîte) et conserver dans un refrigerateur après solidification. Pour la gélose Mac Conkey (Mac Conkey agar CM0115), 51,5 gsont dissous dans un litre d’eau distillée et porter à ébullition jusqu’à ébullition complète. Stériliser 15mn à 121°C à l’autoclave, laisser refroidir puis repartir dans des boîtes de Pétri (20ml par boîte) puis conserver dans un réfrigérateur après solidification. La même opération est respectée pour la gélose Mueller-Hinton (Mueller-Hinton agar CM0337) avec dissolution de 38gdans un litre d’eau distillée (Annexe 2). Pour Sélénite broth base CM0395, la préparation se fait comme suit : dissoudre 4g de biselenite de sodium dans 1l d’eau distillée et ajouter 19g de milieu de base, chauffer jusqu’à dissolution complète puis bien melanger et repartir en tubes sur une hauteur de 5cm, steriliser au bain-marie bouillant pendant 10mn, ne pas autoclaver.

5 Pour S.S.Agar CM0099 : dissoudre 63g de poudre dans un litre d’eau distillée puis porter à l’ébullition en agitant fréquemment et maintenir un leger frénissement jusqu’à dissolution complète puis refroidir jusqu’à 50°C, mélanger et répartir. II.2.2. Technique de culture et isolement La culture permet d’obtenir des colonies bactériennes. Elle se fait en strie à l’aide d’une anse en platine sur le milieu de culture et renverser la boîte (milieu en haut) et incuber à 37°C pendant 18 à 24 heures. L'isolement est une technique qui permet de séparer les différentes bactéries d'un échantillon. L'isolement permet d'observer les colonies. Si les colonies sont isolées, on peut procéder à l’identification. II.3. Identification II.3.1. Aspect des colonies Cet examen apprécie :  La couleur de la colonie qui peut être jaune, blanche, blanchâtre, grise ou gris blanc.  La forme de la colonie : arrondie ou irrégulière  La taille de la colonie : petite , moyenne (1mm de diamètre) ou grande  L’aspect de la colonie : lisse ou rugueuse (Annexe 3)  Le pouvoir hémolytique : se voit sur gélose au sang avec différents types : o β-hémolytique o α-hémolytique II.3.2. Examen microscopique direct II.3.2.1. Examen direct a l’état frais a. Matériels • Lame et lamelle • Microscope optique

6 b. Principe Que ce soit leprélèvement (calque d’organe, pus, plaie) ou prise d’un échantillon de la colonie dans le milieu ensemencé, il faut respecter les étapes suivantes :  Prendre une lame bien stérile  Y déposer quelques gouttes d’eau distillée  Prendre un échantillon de la colonie du milieu ensemencé par un oese et mélanger avec les gouttes d’eau.  Recouvrir d’une lamelle et lecture au microscope avec objectif X 40. Résultat : cet examen direct permet d’observer :  La forme de la bactérie (cocci, bacille, coccobacille)  La mobilité de la bactérie :  Mobile pour le cas d’un bacille à ciliature péritriche comme Salmonella et Escherichia coli ;  Immobile pour les cocci comme les Staphylocoques et Streptocoques (mouvement brownien) (Annexe 4). II.3.2.2. Examen direct apres coloration de Gram a.

Matériels et colorants o Lame bien propre o Feu o Anse de platine avec boucle o Violet de Gentiane o Lugol o Ethanol o Safranine o Microscope

b. Principe o Utiliser une lame propre o Prélever les colonies o Etaler et fixer à la chaleur o Colorer au Violet de Gentiane pendant 1mn

7 o Rejeter le colorant o Verser le lugol pour fixer le colorant pendant 1 mn o Rejeter le lugol et verser l’alcool pour décolorer la préparation o Rejeter l’alcool et rincer avec l’eau o Verser l’encre de fuschine pendant 30 secondes et rejeter de nouveau o Rincer avec l’eau et sécher la lame o Verser de l’huile de Cèdre o Lecture au microscope avec objectif X100 c.

Résultats o Bactérie à Gram positif : préparation de couleur violet au microscope ; o Bactérie à Gram négatif : préparation de couleur rose (Annexe 5).

II.3.3. Tests metaboliques (glucidiques, protéiques, lipidiques) •

Métabolisme glucidique : fermentation des sucres comme le glucose, le lactose, le saccharose.

•

Métabolisme protéique : désamination, décarboxylation.

•

Métabolisme lipidique : présence de différente lipase.

Ces différents tests métaboliques peuvent être faits en plaquette comme la galerie API. II.3.4. Autres tests d’identification • Test d’oxydase Il existe plusieurs types de matériels pour vérifier le test de l’oxydase : disques, solution. Le contact des bactéries au disque entraîne le changement de la couleur de ce dernier en violet : oxydase positive. Si la bactérie a une oxydase négative, il n’y a pas de changement de couleur.

8 • Test de Catalase Les bactéries réduisent l’eau oxygénée (H 2 O 2 ) en eau avec dégagement d’O 2 . On met les colonies dans une goutte d’eau oxygénée. Les bactéries sont catalase positive s’il y a formation de bulles d’air .Si non, les bactéries sont catalase négative. • Galerie API Il existe de nombreux kit Api : API 20E pour les entérobactéries, Api 20NE pour les non entérobactéries, API NH pour les cocci gram- tels Neisseria et Haemophilus, API Staph pour les staphylocoques. Réalisation : - Préparer les souches : mettre des souches dans d’eau physiologique NaCl 0,9% de façon à avoir la turbidité d’un Mac Farland 0.5 ; - Remplir les cupules ; - Incuber à 37°C pendant 18 à 24 heures ; - Faire la lecture (Annexe 6).

II.4. Antibiogramme II.4.1. Technique et réalisation sur gélose Mueller Hinton o Préparer les souches : mettre des souches dans d’eau physiologique NaCl 0,9% de façon à avoir la turbidité d’un Mac Farland 0.5 ; o Ensemencer et étaler sur milieu gélose Mueller Hinton à l’aide d’un écouvillon ; o Placer les disques d’antibiotique ; o Incuber pendant 24 heures à 37°C. II.4.2. Lecture et interprétation L’efficacité de l’antibiotique est mesurée par le diamètre de la surface vide autour du disque correspondant à l’activité de l’antibiotique. La mesure du diamètre de la zone d’inhibition se fait avec une règle et exprimée en mm. L’interprétation des résultats suit la référence CLSI (Clinical Laboratory Standard International).

9

Penicilline (P 10): 6mm (R) Ampicilline (AMP 20): 6mm (R) Clindamicine (DA 2) : 6mm (R) Imipèneme (IPM 10) : 29mm (S) Ciprofloxacine (CIP 5) : 30mm (S) Tetracycline (TE 30) : 24mm (S) R : résistant

S : sensible

Antibiogramme d’Escherichia coli sur gélose Mueller Hinton III. EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES III.1. Technique de sédimentation Cinq grammes de matières fécales ont été pesés et déposés dans un becher de 100 ml contenant 50 ml d’eau, mélanger bien avant de la faire passer à travers le passoir puis laisser reposer durant une heure et rejeter le surnageant, 3 gouttes du sédiment sont examinées au microscope à l’objectif X10. Chaque examen doit être vérifié 3 fois à partir du même échantillon avant d’être classé négatif. Les fèces ont été gardés au froid pour éviter l’évolution de l’œuf (Annexe 6). III.2. Différents types d’œuf d’helminthes des bovins observés

Œuf de strongle

Œuf de Fasciola gigantica

10 Différents types d’œufs sont observés : - Toxocara vitulorum : arrrondi, taille moyenne, paroi épaisse ; - Strongles digestifs tels Oesophagostomum radiatum, Haemonchus contortus, Trichostrongylus axei : ovalaire ou ellipsoïde, paroi mince, contenant des blastomères ; - Fasciola gigantica : ovalaire, operculeux à l’un des pôles, grande taille, contenu granuleux, jaune doré ; - Trichuris globulosa : ovalaire, petite taille, deux pôles pourvus de bouchon polaire (3). RESULTATS Cette étude nous permet de savoir la cause de la diarrhée des bovins, d’ameliorer le contrôle de la présence de la maladie et d’orienter le programme de vermifugation et les soins des animaux. Ce qui reduit le taux de mortalité des animaux et augmente ses productivités. Il y aura donc un impact sur la vie des paysans et le developpement économique du pays. Parmi les bactéries pathogènes causant la diarrhéé bovine, on peut citer en premier lieu Escherichia coli entérotoxinogènes présent dans le tube digestif, y produisent des toxines et perturbent le bon fonctionnement des entérocytes (cellules de l'intestin). Il y a aussi les bactéries entéro-invasives qui dégradent les entérocytes comme Salmonella, Shigella et Campylobacter (4). Pour les parasites, on peut citer en premier lieu Fasciola gigantica dans la famille des trématodes, les strongles digestifs et Toxocara vitulorum pour les nématodes (5). Les causes de la diarrhée bovine peuvent être diverses comme le stress, la fatigue, l’insuffisance en alimentation, le changement climatique. A part ces causes possibles, la diarrhée peut être aussi d’origine virale, non seulement d’origine bactérienne ou parasitaire. L'étude bactériologique des selles est un examen techniquement délicat. Le prélèvement doit être fait et conservé dans de bonnes conditions. Les milieux de cultures doivent être de bonne qualité, et de préparation récente. Le non-respect des conditions opératoires peut conduire à des résultats faussement négatifs. Elle nécessite un laboratoire de bactériologie bien équipé, disposant de tout le matériel pour réaliser des cultures et d'un personnel entraîné.

11 CONCLUSION ET PERSPECTIVES Ce stage nous a rapporté beaucoup de connaissance concernant le monde du laboratoire, sa structure, son fonctionnement et surtout son activité. Le laboratoire est un pilier pour une meilleure prise en charge des maladies. Les analyses effectuées permettent la prise en charge thérapeutique. Il est très important de bien maîtriser les étapes des examens bactériologique et parasitologique à partir d’un prélèvement. Les objectifs sont atteints et nous espérons une continuité de l’accord de coopération cadre entre les divers acteurs pour mieux approfondir d’avantage sur les autres analyses de laboratoire concernant la serologie (test ELISA) et la biologie moleculaire (PCR) et l’implication de la zootechnie pour ameliorer la production.

12 ANNEXES Annexe 1 : Prélèvement et condition de transport

Bovin présentant une diarrhée

Glaciaire remplie de prélèvements

Annexe 2 : Préparation de la gélose

Gélose au sang Annexe 3 : Résultat de la culture

Sur gélose au sang : colonies rondes, lisses, de taille moyenne, de couleur blanchâtre et non hémolytique

Colonies sur gélose au sang

13 Annexe 3 : Identification

Préparation pour examen direct

Annexe 4 : Identification

Lames pour coloration de Gram Annexe 5 : Api 20 E

API 20E après 24 heures d’incubation

14 Annexe 6 : Technique de sédimentation

Préparation sédiment

15 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1- Claire G. La combinaison des analyses quantitatives et qualitatives pour une étude des dynamiques de pauvreté en milieu rural Malgaches. Thèse pour Doctorat es Sciences Economiques : Université Montesquieu Bordeaux IV ; Droit Sciences sociales et politique.2006 ; 368. 2- SEDES. Recensement et caractéristiques du cheptel. 1988 ; 2 :148-176 3- Frederic B. Atlas de coproscopie. 2001. 4- Pilet C et al. Bactériologie médicale et vétérinaire. Doin Editeurs, 2ème édition. 1979 : 437p. 5- Rousset J.J., Copro-parasitologie pratique. Edition ESTEM.1993 :251p