Undersökning av en möjlig FNR-beroende promotor

Undersökning av en möjlig FNR-beroende promotor uppströms genen för kloritdismutas i Ideonella dechloratans

Examination of a possible FNR-dependent promoter upstream the gene for chlorite dismutase in Ideonella dechloratans Shady Blomqvist

Fakulteten för hälsa, natur- och teknikvetenskap Civilingenjörsprogrammet i kemiteknik Examensarbete Civilingenjör 30 HP Handledare: Maria Rova Examinator: Lars Järnström Datum Löpnummer

Sammanfattning Ideonella dechloratans är en fakultativ anaerob som innehåller generna för kloratreduktas och kloritdismutas nödvändiga för respiration av klorat. Man har tidigare visat att kloritdismutas induceras under anaeroba förhållanden och anses regleras på transkriptionsnivå. Inom sekvensen uppströms genen har ett möjligt FNR-säte lokaliserats, en konsensus-sekvens dit transkriptionsfaktorn FNR kan binda in. FNR är ett regleringsprotein som tillåter anpassning av fakultativa anaerober som Ideonella dechloratans till syrefattiga miljöer. I det här arbete undersöks sekvensen uppströms genen för kloritdismutas efter en möjlig FNR-beroende promotor. Genom tillverkning av två fragment 189 bp respektive 172 bp långt av sekvensen, innehållande en möjlig promotor med och utan -10 elementet och via en plasmidvektor med en -galaktosidas reportergen transformera in dessa i Escherichia coli och mäta uttrycken med -galatosidas mätning under aeroba och anaeroba förhållanden. Det 189 bp fragmentet gav upphov till basaluttryck och anaerob induktion på 3.3 x basaluttryck medans 172 bp fragmentet inte gav upphov till något uttryck överhuvudtaget. fragmenten kotransformerades också in i en FNR-negativ stam tillsammans med en möjlig FNR-gen ifrån Ideonella dechloratans som visade sig ha förmåga att inducera uttrycket av kloritdismutas under anaeroba förhållanden med 2.8 x basaluttrycket. Detta visar att -10 elementet är viktigt för både aerobt och anaerobt utrryck vilket föreslår att det finns en promotor inom 189 bp fragmentet som både står för ett basaluttryck och ett anaerobt uttryck. Resultaten visar också att att den regleras utav FNR och att FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans kan utföra den anaeroba induktionen.

2

Innehållsförteckning Sammanfattning....................................................................................................................................2 Övergripande Sammanfattning.............................................................................................................7 Bakgrund..........................................................................................................................................7 Transkription och promotor regioner i prokaryoter.........................................................................8 Tidigare resultat och avsikten med arbetet......................................................................................9 Metodiken kortfattat......................................................................................................................10 Sammanfattning av resultaten........................................................................................................11 De viktigaste slutsatserna...............................................................................................................12 Executive Summary............................................................................................................................13 Background....................................................................................................................................13 Transcripiton and promoter regions in prokaryotes.......................................................................14 Earlier results and the purpose of this thesis..................................................................................15 Methods.........................................................................................................................................17 A summary of the results...............................................................................................................18 Conclusion.....................................................................................................................................19 Förkortningar......................................................................................................................................20 Introduktion........................................................................................................................................21 Problemformulering.......................................................................................................................21 Syfte...............................................................................................................................................21 Klorat och perklorat: Egenskaper och miljöproblem.....................................................................22 Enzymer för kloratmetabolism......................................................................................................23 Transkription och promotor regioner i prokaryoter.......................................................................24 Möjliga promotorer för cld-genen i I. dechloratans och FNR-reglering.......................................26

3

Metodiker.......................................................................................................................................29 Uppnådda resultat..........................................................................................................................31 Viktigaste slutsatserna....................................................................................................................31 Material och metoder..........................................................................................................................32 Bakteriestammar, plasmider och odlingsförhållanden...................................................................32 Analys av promotorsekvens...........................................................................................................32 Plasmidpreparation........................................................................................................................32 Klyvning av plasmid......................................................................................................................33 PCR: Tillverkning av insert...........................................................................................................34 Klyvning av fragment....................................................................................................................35 Ligering..........................................................................................................................................35 Transformering..............................................................................................................................35 Verifiering av kolonierna med 189 bp och 172 bp transformanter................................................35 - galaktosidas Assay....................................................................................................................36 Elektrokompetenta celler...............................................................................................................36 Elektroporering..............................................................................................................................36 Resultat: Del I.....................................................................................................................................37 Analys av promotorsekvens...........................................................................................................37 Primers...........................................................................................................................................38 Plasmidpreparation........................................................................................................................40 Restriktionsklyvning......................................................................................................................41 PCR................................................................................................................................................44 Rening av PCR produkterna..........................................................................................................45 Transformering..............................................................................................................................46 Verifiering......................................................................................................................................47

4

Celltillväxt XL1-BLUE.................................................................................................................48 -galaktosidas assay.....................................................................................................................49 Resultat: Del II...................................................................................................................................52 Plasmidpreparation........................................................................................................................52 Restriktionsklyvning......................................................................................................................53 Rening av kluven plasmid .............................................................................................................54 PCR................................................................................................................................................55 Transformering II...........................................................................................................................56 Verifiering II..................................................................................................................................57 Transformering III.........................................................................................................................58 galaktosidas assay II...............................................................................................................61 Celltillväxt RM 101.......................................................................................................................66 Diskussion .........................................................................................................................................67 Val av plasmider.............................................................................................................................67 Val av primrar för test om hypotes.................................................................................................68 Fragmenten för test om hypotes.....................................................................................................69 Den FNR-beroende promotorn......................................................................................................70 FNR´s roll i I. dechloratans............................................................................................................72 Celltillväxt.....................................................................................................................................73 Klyvning av plasmid......................................................................................................................74 PCR................................................................................................................................................74 Felsökning assayer.........................................................................................................................75 Slutsats................................................................................................................................................76 Tackord...............................................................................................................................................77 Referenser...........................................................................................................................................78

5

Appendix............................................................................................................................................82

6

Övergripande Sammanfattning Bakgrund Under en längre tid har nu industriella processer som använder sig utav klorat och perklorat sökt en lösning på hur man skulle kunna förhindra vidare utsläpp av dessa ämnen ut naturen. Ämnena är viktiga komponenter i många av processerna och där klorat t. ex. används som blek och deligninfieringsmedel inom pappersindustrin [3,4,17] och perklorat som komponenter i olika raket[5, 17, 18], och missilbränslen eller som gödningsprodukter [18]. Samtidigt besitter klorat och perklorat egenskaper som gör dem extremt tåliga och mobila [17, 18] som medför att de väldigt lätt kan röra sig långa avstånd ifrån källan ut i naturen. Dessutom är båda kompunden hälsoskadliga både för människor, djur och växter. Klorat är framförallt skadligt för vattenväxter, främst brunalger [1, 4, 17] där föreningen tros inhibera och stänga av ett nitratreducerande system som medför att många av dessa växter dör [3, 17]. Perklorat har visat sig vara mer skadlig för människor och djur där intag leder till försämrat jodupptag som i sin tur kan leda till växt och utvecklingsproblem hos individen [2, 10, 16, 18]. Som lösning på problemet anses mikroorganismer som anaerobt kan respirera dessa ämnen och på så sätt bryta ned dem till ofarliga grundämnen. Dessa bakterier återfinns på platser där klorat och perklorat naturligt uppkommer. Det är vanligtvis i minneralfyndigheter lokaliserade i öknar värden över som t. ex. i Chile och Kanada eller i förhistoriska vattenansamlingar i runt om i USA [1, 5]. Mikroorganismerna finns i två typer, perkloratreducernade bakterier som både kan reducera perklorat och klorat, och kloratreducernade bakterier som bara kan reducera klorat [4, 11, 17]. Enzymen som gör det möjligt att under anaeroba förhållanden respirera dessa ämnen är perklorat reduktas, klorat reduktas och kloritdismutas. Endast perkloratreducerande bakterier bär på perklorat reduktas som både kan reducera perklorat och klorat vidare till klorit, likaledes gäller kloratreduktas som bara finns kloratreducernade bakterier och bara reducerar klorat till klorit men klarar inte av perklorat. Kloritdismutas är gemensamt för de båda huvudtyperna och omvandlar klorit till syre och kloridjoner [4,10]. Reaktionsvägen för nedbrytning av perklorat och klorat visas i Figur S1.

Figur S1. Visar reaktionsvägen för reduktionen av klorat och perklorat.

7

Transkription och promotor regioner i prokaryoter För att en gen i en mikroorganism ska uttryckas till ett funktionellt protein måste först ett RNApolymeras binda in till en sekvens strax uppströms genen. Den sekvensen kallas en promotor och tillåter initiering utav en transkriptionsprocess. Det innebär att RNA polymeraset skriver om genen som en kopia i form av ett ”messenger RNA” som senare översätts till ett funktionellt protein in annan process som kallas translation. Promotorregionen är mycket viktig för uttrycket och bestämmer i vilken grad det sker. Den har karakteristika drag som identifieras av en s-faktor, ett protein associerar med RNA polymeraset och leder polymeraset dit strax innan transkription. Beroende på om de karakteristiska dragen är mer eller mindre konserverade avgör de hur aktiv promotorn är och därmed om uttrycket är högt eller lågt. Dessa drag identifieras som ett transkriptionsstart som är nukleotiden A eller G och två element som benämns -10 och -35. Elementen är ungefärligt positionerade -10 och -35 nukleotider från transkriptionsstart och har konsensussekvenserna TATAAT respektive TTGACA (Figur S2). Ett avvikande ifrån sekvenserna är vanligt i promotorer där normalt 3/6 eller fler av nukleotiderna är bevarade [8, 9]. Det finns också en större preferens för vissa nukleotider på bestämda positioner inom -10 elementet som anses ha en större betydelse inom för identifiering av promotorn och inledning av transkription. Dessa är det första T:t inom – 10 elementet, närmast transkriptionsstart och benämns ha position -7, och A på position -11 räknat uppströms från -7 positionen. De tar direktkontakt med RNA-polymeraset [24]. -10 elementet i sig själv är oftast mest bevarat, speciellt i de fall där -35 området avviker ibland uppkommer en TG determinant positionerat en nukleotid uppströms -10 hexameren (Figur S2) som ytterligare styrker promotorn identifieringen [9, 12]. Elementet benämns då ”exteneded – 10” och har konsensus-sekvensen TGNTATAAT. Även optimala avstånd mellan elementen och TSS utgör en effekt på promotoraktiviteten, för störst aktivitet är avstånden sjutton nukleotider mellan -10 och -35 elementet [12, 24] och sju nukleotider mellan -10 elementet och transkriptionsstart. Små proteiner som kallas utav transkriptionsfaktorer kan ibland binda in till promotorn och underlätta eller motverka inbindning av ett RNA-polymeras och därmed öka eller sänka uttrycket av genprodukten. En sådan transkriptionsfaktor är FNR som kontrollerar övergången mellan aerob och anaerob metabolism via reglering på transkriptionsnivå [6, 14, 23]. FNR är en monomer som aktiveras i syrefria miljöer och får då ett [4Fe–4S]2+ kluster som tillåter dimerisering [23]. Det leder till att proteinet sekvensspecifikt kan binda in till en egen konsensus-sekvens som är placerade på promotorer och reglera uttrycket.

Figur S2. Visar den typiska arkitekturen för en bakteriell promotor och konsensus-sekvenserna för faktorn hos E.coli [19].

8

Tidigare resultat och avsikten med arbetet Problemet med mikroorganismerna är att många av dem är fakultativa anaerober som innebär att de lever under aeroba förhållanden men har förmågan att utnyttja anaeroba respiration i frånvaro av syre. Det betyder att man måste avlägsna syret i miljön runt omkring för att få bakterierna att gå över till en anaerob respiration för att de t. ex. ska kunna reducera klorat och perklorat. Ideonella dechloratans tillhör kloratreducerande bakterier där studier kring den anaeroba uppregleringen utav kloritdismutas främst stått i fokus. Målet är att förstå vad som orsakar den så att man potentiellt skulle kunna styra över den oberoende av hur miljön runt omkring ser ut. Hittills har ett möjligt transkriptionsstart identifierats [21] och en möjlig FNR-box [20] (Figur S3) inom sekvensen uppströms kloritdismutas-genen. Man har visat att mutationer på FNR-boxen inte bara stänger ned den anaeroba induktionen men också leder till att basaluttrycket under aeroba nästan försvinner helt [15]. Genom att istället bevara FNR-boxen och föra över promotorregionen till en bakteriestam som inte har förmåga att uttrycka ett FNR har det visat att ett basalt uttryck ändå förmedlats [15]. Detta gav upphov till en hypotes om att en FNR-beroende promotor längre nedströms finns som leder den anaeroba induktionen eftersom med FNR-sätets position i förhållande till transkriptionsstart (Figur S3) ser ut att ha en undertryckande roll utav genen.

Figur S3. Visar var en möjlig promotor skulle kunna vara belägen för kloritdismustas-genen i Ideonella dechloratans. De lätt understrukna nukleotiderna i -10 och -35 elementen stämmer överens med konsensus-sekvenserna i Escherichia coli [15]. Den grövre understrukna sekvensen är ett möjligt FNR-säte position.

Därför gjorde jag en teoretisk analys av sekvensen uppströms kloritdismutas-genen i förhållande till FNR-pallindromet med i hopp om att finna en möjlig FNR-beroende promotor (Figur S4). Av den gjorde jag sedan två fragment, ett 189 bp långt som bevarar hela den möjliga promotorn och ett 172 bp långt där det möjliga -10 elementet avlägsnats. De ligerades in i reportervektorer och transformerades in i två olika Escherichia coli stammar med (XL1-BLUE) och utan (RM 101) förmåga att producera ett FNR. En del av celler som saknade FNR transformerades också med en gen ifrån Ideonella dechloratans som möjligen kodar för ett FNR. Genom att mäta uttrycken under aeroba och anaeroba förhållanden kunde resultatet av mätningarna relateras till frågeställningen om hur vida det finns en FNR-beroende promotor uppströms kloritdismutas-genen och om den regleras utav ett FNR-protein.

9

Figur S4. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn för kloritdismutas genen i Ideonella dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en klass II promotor som allmänt har ett transkriptionsstart 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet. Det optimala avståndet på sju nukleotider uppströms transkriptionsstart gav ett möjligt extended -10 element markerat i fet stil med understrukna nukleotider som överensstämmer med Escherichia coli konsensus-sekvens TATAAT. -35 elementet bestämdes sjutton nukleotider uppströms första nukleotiden i -10 hexameren, elementet är markerat med fet stil och överensstämmande nukleotider understrukna.

Metodiken kortfattat Tillverkningen av sekvenserna innehållande den möjliga FNR-beroende promotorn med och utan -10 elementet gjordes med Polymerase Chain Raction eller PCR. Tekniken går ut på att man amplifierar en önskad sekvens ifrån t. ex. en större DNA molekyl. För att utföra reaktionen behövs två primrar som är komplementära till en del utav sekvensen som ska amplifieras, ett polymeras, nukleotider, MgCl och templat DNA. Reaktionen delas därefter in i tre steg efter varandra denaturereing annealing och extension. Stegen utförs sedan i ordning med bestämda temperaturer och tider sådant att primrarna binder in till sekvensen som ska amplifieras och polymeraset kan förlänga primrarna. Stegen utförs flera gånger som ger upphov till att ett stort antal produkter bildas. För att mäta om fragmenten av den möjliga FNR-beroende promotorn kunde ge upphov till transkription och därmed uttryck ligerades de in framför en promotorlös gen som kodar för enzymet galaktosidas i plasmiderna pBBR1MCS-4-LacZ och pBBR1MCS-2-LacZ. Plasmiden som är en cirkulär DNA sekvens och klövs upp så att den blev linjär och efter det sammanfogades med den amplifierade promotorsekvensen och återförslöts igen. Klyvningen görs med restriktionsenzymer som identifierar en specifik DNA sekvens som benämns ett restriktionssäte bestående av ett par nukleotider och klyver av DNA:t där. Plasmiden innehåller många sådana säten från början medans ett specifikt säte som också fanns i plasmiden adderades på promotorsekvensen under amplifieringen. Både plasmid och promtorsekvens kan då klyvas med samma restriktionsenzym som gör att komplementära ändar hos plasmid och promotorsekvens som kan binda till varandra via vätebindningar. Sammanfogningen slutförs sedan i ett ligeringssteg där enzymet DNA ligas syntetiserar ihop DNA strängarna kovalent med fosfodiesterbindningar som återförsluter promotorsekvensen med plasmiden som återgår till cirkulär form, nu innehållande promotorsekvensen framför galaktosidas-genen. För att introducera in plasmiden innehållande den möjliga FNR-beroend promotrsekvensen in i en bakterie användes transformering. Två olika transformeringsmetoder användes. En mer generell metod som involverar att man utsatte cellerna för ett elektriskt fällt en kort tid som ger upphov till att porer bildas i cellväggen och medför att DNA molekyler ifrån omgivningen kan tränga in. Den andra metoden var mer specifik och där tillgjorda celler som mycket lätt tar upp DNA beställdes ifrån ett företag och där igenom följa ett protokoll som beskriver hur man ska gå till väga för att introducera DNA utifrån in i cellen.

10

Cellerna odlas därefter upp under aeroba och anaeroba förhållanden i lämpligt odlingsmedium med antibiotika. Det skördas under exponentiell fas och toulen tillsattes som permeabiliserar cellerna så att det färglösa substratet o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG), när tillsatt, kan diffundera in i cellen och konverteras av galaktosidas till två produkter varav en är färgad. Mängden gul produkt kan då mätas via absorbans vid våglängden 420 nm som är, proportionellt mot, om substratet tillsätts i överflöd, mängden enzym som bildats och reaktionstiden [22].

Sammanfattning av resultaten Den 189 bp långa sekvensen med den fullständigt bevarade möjliga FNR-beroende promotorn gav upphov till basaluttryck och anaerob induktion. Induktionen bestämdes till 3.3 ggr basaluttrycket i XL1-BLUE och till 2.8 i RM 101 som också kontransformerats med den möjliga FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans. Den kortare 172 bp sekvensen där -10 elementet avlägsnats gav inget uttryck i XL1-BLUE till väldigt låga uttryck i RM 101 utan tydlig anaerob induktion (Figur S5 och S6).

Beta – galaktosidas [Miller Units]

Beta - galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler med 189 bp och 172 bp fragmenten under aeroba och anaeroba förhållanden 300 250

Aerobt (189 bp fragment)

200

Anaerobt (189 bp fragment)

150

Aerobt (172 bp fragment)

100

Anaerobt (172 bp fragment)

50 0 -50

Figur S5. Visar galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ med 189 bp fragmentet mot celler med 172 bp fragmentet efter tillväxt under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 22 st för 189 bp aerobt, 12 st för 189 bp anaerobt, 24 st för 172 bp aerobt och 18 st för 172 bp anaerobt.

11

Beta - galaktosidas [Miller Units]

Beta - galaktosidas aktivitet i RM 101 med FNR av 189 bp och 172 bp fragmenten aerobt och anaerobt 100 80

Aerob 189 bp fragment med FNR utan bakgrund

60

Anaerob 189 bp fragment med FNR utan bakgrund

40

Aerob 172 bp fragment med FNR utan bakgrund

20 0

Anaerob 172 bp fragment med FNR utan bakgrund

Figur S6. Visar Galaktosidas aktiviteten i RM 101 celler med I. dechloratans FNR innehållande fragmenten 189 bp och 172 bp under aeroba och anaeroba förhållanden. Det bidragande uttrycket förmedlat i celler med bakgrundsplasmiderna innehållande FNR har subtraherats bort ifrån alla mätningar. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 3 för alla aeroba prov och 4 st för de anaeroba.

Det verifierades genom att jämföra uttrycken aerobt och anaerobt för 172 bp fragmentet mot uttryck i celler som enbart bar på reportervektorn utan inligerat fragment. Resultaten visade också att RM 101 som endast transformerats FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans överlevde under anaeroba förhållanden med NaNO3-respiration till skillnad från RM 101 utan någon FNR-gen.

De viktigaste slutsatserna Resultaten visar tydligt att utan det föreslagna -10 elementet sänks uttrycket under både aeroba och anaerob förhållanden till nära noll och måste bevaras för fullt uttryck utav kloritdismutas. Av det dras slutsatsen att transkription under aeroba och anaeroba förhållanden startar ifrån den FNRberoende promotorn. En annan slutsats är att den möjliga FNR-genen Ideonella dechloratans kodar för ett protein som kan inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Proteinet har också förmågan att ersätta Escherichia coli 's FNR-proteins i roll under NaNO3-respiration.

12

Executive Summary Background Under a longer peridod of time industriall processes that makes use of chlorate and perchlorate has been seekeing a solution on how to stop the effluent of these compounds reaching the environment. Both chlorate and perchlorate are important componenents in many of the processes and are specifically used as bleech and delignifying agents in the paper and pulp indusrty [3,4,17], respektive as components in combustionaccelerants such as rocket [5, 17,18], and missilfuels, and fertilizeragents in agriculture [18]. At the same time chorate and perchlorate are extremly mobile and inert [17, 18] which makes it easy for them, once they escape an industriell area, to travel long distances from the source and widley contaminate the environment. Further, the compounds are considered hazardous for both animal and plants. Chlorate does most damage to waterplants such as algea, where it inhibits a nitratereducing pathway causing it to fail [3, 17] which has resultet in that many of these plants have dissapeard, in particular brown algea [1, 4, 17]. Perchlorate has shown to be more hazardous toward animals and humans where it interferes with the iodine uptake causeing growth and developmental problems to the individual [2, 10, 16, 18]. A possible solution to this problem might be to use of naturally found microorganisms with the ability to anaerobically respire on these compunds, reducing them into the their corresponding elements, rendering them harmless. These creatures are found all around the world in places where know sources of natural chlorate and perchorate has been found. This is usually mineralldeposits found in desserts like in Chile and Canada or in prehistoric aquifers around the USA [1, 5]. The microorganisms are present in two types, perchlorate-respiring bacteria and chlorate-respiring bacteria. Perchlorate-respiring bacteria can reduce both perchlorate and chlorate while chlorate-respiring bacteria can only reduce chlorate [4,11, 17]. The enzymes which makes this possible is perchlorate reductase, chlorate reductase and chlorite dismutase. Perchlorate reductase has the ability to reduce both perchlorate and chlorate to chlorite and is only present in perchlorate-respiring bacteria. Chlorate reductase can reduce chlorate to chlorite but not perchlorate, and is present in chlorate-respiring bacteria. The enzyme chlorite dismutase turns chlorite into molecular oxygen and chloride ions [4,10], and are present in both perchlorate-respiring bacteria and chlorate-respiring bacteria. The reaction pathway for the degradation of chlorate and perchlorate is shown in Figure SI.

Figur SI. Shows the reaction pathway for the reduction of chlorate och perchlorate.

13

Transcripiton and promoter regions in prokaryotes In order for a functional protein to be expressed from a gene an enzyme called RNA-polymerase must attach itself to small region just upstream the gene. This sequens is termed a promoter and allows for the initation of a process called transcription. The meaning of transcription is when the RNA-polymerase rewrites a copy of the gene in the form of a ”messenger RNA”, the mRNA is later transalted into a functional protein in another process called translation. The promoter is essentiell for the expression of the gene and decides to what extent it is done. It has some characteristic features that can be identifiead by another protein, the s-factor, which associates it self with the RNA-polymerase and leads the polymerase to the promoter in time for transcription. Depending on how well conserved these characteristic features are helps decide how active the promoter is and by that if the gene expression is high or low. The features are a transcription start site which is an A or a G nucleotide and beyond that two elements termed -10 and -35. The elements have the consensus sequenses of TATAAT respektive TTGACA and are approxemalty possitioned -10 respektive -35 nucleotides uppstream the transcription start site (Figure SII). Usually the elements are not compleatly conserved and a match of 3/6 nucleotieds per element or more is to be expected [8, 9]. It has also been shown that there is a preference for some nucleotides at certain positions within the -10 element. These are the first T within the -10 element closest to the transcription start site referred to as the -7 position, and A on position -11 counting uppstream from the -7 position. Because of the higher preference of the nucleotides -7T and -11A, it has predicted that they have more of an importans than the other nucleotides in the -10 element in the process of identyfiying the promoter. Later is has been shown that they make direct contact with the RNA-polymerase under the initiation of transcription process [24]. The -10 element is the more conserved element between the two especially when the – 35 element is not. Then the appearance of a TG determinant might happen, possitioned on nucleotde upstream the -10 element (Figure SII), that can further strengthens the promotor identification and activity [9, 12]. The combination of this TG determinant with the -10 element is called an ”extended -10 element” and has the consensus sequence TGNTATAAT. Even the distances between these elements and in relationship to the transcription start site has an impact on the promotor strength. The most common distances between the -10 and -35 elements are 17 nt [12, 24] and 7 nt between the -10 region and the transcription start site, this is also considered to be the most optimal distances that contributes most to the promotor activity. The expression of a gene can also be regulated by the binding of small proteins referred to as transcriptionfactors to the promotor, facillitating or counteracting the transcription process and thereby increase or repress the exprsseion. FNR is an example of such a transcriptionfactor, that regulates the transition between aerobic and anaerobic respiration on the trancriptional level [6, 14, 23]. The protein consists of a monomer that activates under oxygen starvation and is then presented with a [4Fe–4S]2+ cluster allowing it to dimerize [23] and successfully bind to a consensus sequence of its own located somwhere on the promoter region of genes whom are regulated by FNR.

Figur SII. Shows the typical architecture of a bacterial promoter and consensus sequence of the - factor of E.coli [19].

14

Earlier results and the purpose of this thesis Many of the microorganisms are facultative anaerobs which means that gathers energy through aerobic respiration if oxygen is present but has the ability to switch to anaerobic respiration or fermentation if oxygen i abscent. This presents qiute of a problem in that the effluent from an industriell process must be deprivied of oxygen in order for the bactereia to enter anaerobic respiration and reduce chlorate and perchlorate. Ideonella dechloratans is a chlorate respiring bacteria in which studies connected to the uppregulation of the chlorite dismutase gene has been of main focus. The goal is to get an understanding of what's causing this increase so that one would be able to controll it without having to deprive the effluent of oxygen. So far a possible transcritionstart site [21] and a FNR-box [20] (Figure SIII) within the sequence upstream the chlorite dismutase gene. It has been shown that mutating the FNR-box inside the promoter region leads to almost total loss of expression under both aerobic and anaerobic conditions. By insted preserving the FNR-box and cloning the entire possible promoter region into the FNR negative Escherichia coli type RM 101 has shown that the promoter still supports basal expression under aerobic condition [15]. This gave to the hypothosis of that there might be a FNR-dependent promoter further downstrem the FNR-box which is responsible for the upregulation since the postion of the FNR-box in relationship to the possible transcription start site (Figure SIII) is mostly seen in cases when FNR acts as a repressor.

Figur SIII. Shows where a possible promotor could be positioned relative to the chlorite dismutase gene in Ideonella dechloratans. The thin underlined nucleotides inside the -10 and -35 elements match the consensus sequence in Escherichia coli. The coarser underlined sequence is a possible FNR-site [15].

15

Therefor I made a theoretical analysis of the sequence upstream the chlorite dismutase gene with respect to the position of the FNR-box in hope of finding a possible FNR-dependent promotor (Figure SIV). I then made two constructs of the result i found, one 189 bp long sequence containing the entire possible FNR-dependent promoter and one 172 bp long sequence where the -10 element had been removed. The sequences where ligetad in reprtervectors and transformed into to types of Escherichia coli types with (XL1-BLUE) and without (RM 101) the ability to produce FNR. Into some of the cells lacking the ability to produce FNR, a gene that might code for a FNR-protein in Ideonella dechloratans was also transformed indroduced into them. By conducting chemicall assays I was able to measure the expression each construct provided under aerobic and anaerobic conditions and by doing so it was possible to relate them to issue if there exists a FNR dependen promoter upstream the chlorite dismutase gene and if it is regulated by FNR.

Figur SIV. Shows where the possbile FNR-dependent promtoter for the chlorate dismutase gene in Ideonella dechloratans is located. The sequence was assumed to be a class II type FNR promoter which has a transcription start site 41.5 nucleotides downstream the centre of the FNR-site. The optimal distance of seven nucleotides upstream the transcription start introduced a possible extended -10 element marked in bold type with underlined matching nucleotides to the Escherichia coli consensus sequence TATAAT. The -35 element was found seventeen nucletides upstream the fisrt nucleotide in the -10 hexamer, the element is also marked in bold type with underlined matching nucleotides.

16

Methods The production of the constructs containing the possible FNR-dependent promoter with and without the -10 element was made by the use of a technique called Polymerase Chain Raction or PCR. It makes it possible to amplify a short fragment of DNA from a known sequence. In order to conduct this method two primers are needed whom are short oligonucleotied complementary to a short strech flanking part of the sequnce intended for amplification. Also needed are nucletiodes, a polymerase, some MgCl and a DNA template. The reaction which produces the products is devided into three stages, denaturation, annealing and extension and are conducted in that order with set times and temperatures. This makes it possible for the primers to bind to the sequence of intresst and for the polymerase to extended the primers and thereby make a copy of the fragment. This is performed multiple times through the process resulting in a large number of products. In order to estimate if the constructs were able to give rise to expression they had been ligated infront off the b-galactosidase gene in the reportervector pBBR1MCS-4-LacZ and pBBR1MCS-2LacZ. The reportervector which has a circular shape was cut open to give a linear shape and thereafter a construct were joined together with the reportervector and ligated into circular form again. The digestion was done by using restrictionnezymes which identifies a specific DNA sequance called a restriction site consisting of a short strech of nucleotides. The restricitionenzymes cuts the DNA at this loaction. The vector contains alot of these sequances corresponding to multiple restrictionenzymes. One of these restriction sites is added to the constructs during the PCR amplification so that both the vector and the constructs can be digested with the same restrictionenzyme. This leads to that complementary ends are formed on the vector and constructs which can then bind to each other through hydrgenbonding. By addning DNA ligase, new phosphodiesterbonds are formed between the vector and the construct which returns the vector to its circular shape now containing the possible FNR-dependent promoter sequence infront off the galactosidas-gene. To introduce the reportervector carrying the variations of the possible FNR-dependend promoter into bacteria the method of transformation was used. Transformation can be conducted in many ways where as in this work two methods were used. One was a more common method which involve exposing the cells to an electric pulse under a short period of time which promotes the formation of pores in the cell wall therby making it possible for DNA molecules in the surrounding solution to enter. The cells were thereafter cultivated under aerobic and anaerobic conditions in a propper cultivation medium and an antibiotic. They were then harvested under exponentiall growth and was treated with toluene directly afterwards. This shatters the cell making entry of small molecules such as the substrate o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG) into the cell possible. ONPG is collorless which is converted into two products, one of which is yellow, in the presence of b-galactosidase. The amount of yellow product can be measured with absorbance at 420 nm, and if ONGP was added in excess, the amount of product is proportional to the amount of enzyme present and the reaction time between the enzyme and ONPG [22].

17

A summary of the results

Beta – galactosidase [Miller Units]

The 189 bp construct containg the entire possible FNR-dependent promoter was shown to support both basal expression and was upregulated under anaerobic conditions. The anaerobic induction was determined to be 3.3 times the basal expression in XL1-BLUE, and 2.8 in RM 101 containing the the possible FNR gene from Ideonella dechloratans. The shorter cosntruct with the -10 element removed didn't give rise to any expression at all in XL1-BLUE and a very low expression in RM 101 (Figure SV and SVI).

Beta - galactosidase activity in XL1-BLUE cells containing 189 bp and 172 bp fragments under aerobic and anaerobic conditions 300 250 200

Aerobic (189 bp fragment) Anaerobic (189 bp fragment)

150

Aerobic (172 bp fragment)

100

Anaerobic (172 bp fragment)

50 0 -50

Figur SV. Shows the galactosidase activity in XL1-BLUE cells containing the vector pBBR1-MCS4-LacZ with the 189 bp fragment vs cells with the 172 bp fragment after growth under aerobic and anaerobic conditions. The errorbars represent a 95 % confidnece interval for the mean value. The number of observations for each mean value are 22 and 12 for the 189 bp under aerobic and anaerobic conditions respecively. For the 172 bp fragment the number of observations were 24 under aerobic and 18 under anarobic conditions.

Beta - galactosidase [Miller Units]

Beta - galactosidase activity in RM 101 with FNR and 189 bp and 172 bp fragments under aerobic and anaerobic conditions 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Aerobic 189 bp fragment with FNR minus backbone vectors with FNR Anaerobic 189 bp fragment med FNR minus backbone vectors with FNR Aerobic 172 bp fragment med FNR minus backbone vectors with FNR Anaerobic 172 bp fragment med FNR minus backbone vectors with FNR

Figur SVI. Shows the galactosidase activity in RM 101 cells with Ideonella. dechloratans FNR-gene and the vector pBBR1MCS2-LacZ containing the fragments 189 bp och 172 bp under aerobic and anaerobic conditions. The expression mediated by the backbone vectors alone containing the FNR-gene has been subtracted from all measurements. The errorbars represent a 95 % confidnece interval for the mean value. The number of observations were 3 under aerobic and 4 under anarobic conditions.

18

This was verified by comparing the expressions under both aerobic and anaerbic conditions between the 172 bp construct and the expression mediated by the reportervector alone. The results also showed that RM 101 containing the FNR-gene from Ideonella dechloratans but not any of the constructs was able to survive under anaerobic conditions during NaNO3 respiration.

Conclusion Regarding the -10 element, it has been shown that it is important for full expression and without it there is no expression, under both aerobic and anerobic condition. The conclusion that this is the one and only promoter from whom which both aerobic and anaerobic transcription is initiated at is drawn. Another colusion is that the possible FNR-gene in Ideonella dechloratans encodes such a protein with the ability to induce the expression of the chlorite dismutase gene and also has the abillity to replace Escherichia coli 's FNR under anaerobic respiration with NaNO3.

19

Förkortningar PRB

Perkloratreducerande bakterier

CRB

Kloratreducerande bakterier

FNR

fumarate and nitrate reduction regulatory protein

PCR

Polymerase chain reaction

MCS

Multiple cloning site

Ö. N

Över natt

bp

Baspar

SD

Site Directed

ONPG

o-nitrofenyl-b -D-galaktosid

sRNAP

Sigma factor bundet RNA polymeras

TAE

Tris-Acetat-EDTA Buffert

TBE

Tris-Borat-EDTA Buffert

Cld

Kloritdismutas

Clr

Kloratreduktas

LB

Luria Bertani Broth

OD

Optisk densitet

nt

Nukleotider

20

Introduktion Problemformulering I dag hanterar många industriella processer ämnen som potentiellt kan vara skadligt för vår miljö, sådana ämnen är perklorat ClO4- och klorat ClO3-. De är båda inerta och stabila nog att under flera decennier kvarstå i naturen. Eftersom de är hälsoskadliga för både djur och växter vill man finna ett sätt att ofarliggöra dem. Bakterier som kan livnära sig på klorat och perklorat via anaerob respiration finns i naturen, främst på platser där dessa ämnen förkommer naturligt. Dessa bakterier anses kunna vara en potentiell lösning till problemet med den ökande mängden klorat och perklorat i naturen som resultat av användning i industriella processer. För rening av förorenade områden behöver man veta hur regleringen av generna för de enzymer som deltar i nedbrytningen perklorat och klorat fungerar eftersom de endast aktiveras under anaeroba förhållanden och den kunskapen finns inte idag. Ideonella dechloratans är en kloratreducerande bakterie som med gener för enzymerna kloratreduktas och kloritdismutas kan bryta ner klorat till de ofarliga produkterna kloridjoner och syrgas. Det som hitintills är känt om bakterien är att genuttrycken ökar under anaeroba förhållanden. På sekvensen uppströms kloritdismutas-genen (cld) har ett transkriptionsstart identifierats och en sekvens med stor likhet till en känd bindningssekvens för transkriptionsfaktorn FNR. Det är ett protein som tillåter anpassning av bakterier till syrefattiga miljöer genom på transkriptionsnivå nedreglera enzymer som är nödvändiga för aerob respiration och uppreglera uttrycket av enzymer som är viktiga för anaerob respiration. Detta sker genom att transkriptionsfaktorn binder in till en specifik DNA sekvens som ligger inom en promotorregion uppströms genen ifråga och därmed underlättar eller undertrycker transkription. Det finns två typer av promotorer som regleras utav FNR, dessa typer delas in klass I och II promotorer beroende på FNR-sätets position i förhållande till transkriptionsstart. En klass II promotor har ett transkriptionsstart (TSS) centrerat 41,5 nt nedströms FNR-sätet och klass I promotorer har ett TSS längre nedströms. Detta arbete delas upp i två delar, del I och del II som kretsar kring huruvida FNR reglerar uttrycket utav cld.

Syfte Syftet med arbetet var identifiera om cld uppreglerades utav FNR under anaeroba förhållanden och därmed om det möjligen fanns en klass II FNR-beroende promotor placerad 41,5 nt nedströms det möjliga FNR-sätet. Utöver det tog jag reda på för om en gen i I. decloratans som antogs koda för ett funktionellt FNR-protein gjorde det och om det kunde binda in till FNR-sätet och inducera uttrycket av cld.

21

Klorat och perklorat: Egenskaper och miljöproblem I dagens samhälle beror vår vardag till stor del av industriella processer som genom produktion av viktiga varor och tjänster underlättar livet. För att dessa viktiga uppgifter ska kunna utföras krävs ibland hantering av ämnen som potentiellt kan vara skadligt för djur och natur. Dessa ämnen efterlämnas ofta i processen, eller bildas som biprodukter och kontaminerar olika delar av naturen. Därför är det ett globalt mål att finna praktiska lösningar på dessa problem. Exempel på förorenande processer är sådana som använder sig av och släpper ut oxyanjonerna perklorat ClO4- och klorat ClO3-. Klorat förekommer ofta inom pappersindustrin där klorat främst används i tillverkning av klordioxid som sedan används för blekning av produkter, man får också tillbaka klorat då det återbildas efter blekningsprocessen. Det används också som delignifieringsmedel inom massa och pappersindustrin och inom jordbruk som herbicider och avlövningsmedel [3,4,17]. Perklorat kan också förekomma ifrån antropogen aktivitet, dvs i processer som utförs utav människor, ett exempel är tillverkning av ammoniumperkloratsalter som främst används i oxidationsmedel för fast raketbränsle, pyroteknik [5, 17, 18], bomber, färgproduktion, batterier och smörjmedel [5]. Det återfinns också i produkter som ammunition, missilbränsle och gödningsprodukter [18]. Dessa ämnen är starkt inerta och vattenlösliga och eftersom de inte adsorberas på partiklar så som jord och sediment är de extremt mobila och tåliga. Konsekvensen blir att de lätt följer med ut i naturen, kan spridas långt ifrån ursprungskällan och ansamlas på platser som i jord och vattenkällor under flera decennier [17, 18]. Det har visat sig att perklorat kan ge upphov till dysfunktionalitet av hormonproduktionen i sköldkörteln genom att binda till natrium-jod symportern i sköldkörteln och inhibera upptaget av jod. Det leder till endokrina sjukdomar och kan ge upphov till tillväxt- och utvecklingsproblem, framförallt hos foster och spädbarn [2, 10, 16, 18]. Klorat är framförallt giftigt för många typer av vattenväxter, där vissa typer av brunalger drabbas hårdast [1, 4, 17]. Det kan förklaras genom att klorat ClO3- är strukturellt likt nitrat NO3- och kompetetivt inhiberar enzymet nitratreduktas som finns i dessa vattenväxter. Man tror också att eftersom enzymet har svårt att skilja mellan nitrat och klorat kan det ibland förekomma en förväxling mellan dem som resulterar i att enzymet istället reducerar klorat till klorit eller hypoklorit som är två extremt reaktiva ämnen. Effekten av detta blir att det nitratreducerande systemet stängs av [3, 17]. Eftersom både perklorat och klorat har visat sig vara giftiga och därmed klassificerats som hälsoskadliga för både människor och djur försöker man nu hitta en lösning som oskadliggör dem. Dessa ämnen förkommer också i naturen på platser som inte påverkats av människan. Perklorat och klorat finns världen över och hittas på torra platser såsom i öknar och i förhistoriska vattenansamlingar [1, 5, 16]. Den största kända ackumuleringen av naturligt perklorat finns i nitratrika områden i Chiles Atacama öken, men har också funnits Death Valley och Mission Valley Eocene deposits i Kalifornien, Potash deposits of Saskatchewan i Kanada och förhistoriska vattenansamlingar i Texas och New Mexiko [5]. Naturliga förekomster av klorat har upptäckts först på senare tid och förekommer på liknande platser. Den naturliga produktionen av dessa ämnen är inte helt förstådd. Många system föreslås som t. ex. fotokemiskt i atmosfären, på kloridbelagda mineralytor, som slutprodukt av fotokemiska reaktioner av klorprekursorer som hypoklorit, klorit och klorat under ultraviolett strålning eller genom ozonoxidation av kloridjoner i dessa torra regioner och vattenansamlingar [5]. Senare forskning styrker hypotesen om en global och kontinuerlig produktion av perklorat och klorat i jordens atmosfär [1, 5, 11]. Man har hittat mikroorganismer som kan livnära sig på klorat och perklorat genom anaerob respiration spridda på många ställen i naturen men de första stammarna man isolerade var ifrån kontaminerade vatten, industriområden mm. Dessa mikroorganismer anses vara en potentiell lösning för de industriella processer som hanterar klorat och perklorat. 22

Där är tanken att mikroorganismerna skulle kunna reducera bort klorat och perklorat i utflödet och därmed stoppa fortsatt kontaminering av miljön. Mikroorganismerna som kan livnära sig på dessa ämnen är fakultativa anaerober, det betyder att de lever under aeroba förhållanden men har förmågan att utnyttja anaeroba respiration i frånvaro av syre. För att då få mikroorganismerna att reducera dessa ämnen måste de först gå över till anaerob respiration. Det medför att allt syre i miljön runt omkring t. ex. i utflödet måste avlägsnas, någonting som kostar mycket pengar och är opraktiskt. Därför studeras nu genregleringen som leder till den anaeroba respirationen på molekylär nivå i hopp om att förstå hur den fungerar. Målet är att det med tillräcklig kunskap ska vara möjligt att styra över vilken respiration som inleds och inte behöva anpassa miljön runt omkring.

Enzymer för kloratmetabolism Det finns två typer av bakterier med förmågan att reducera dessa ämnen, perkloratreducerande bakterier (PRB) och kloratreducerande bakterier (CRB). Bakterier tillhörande (PRB) kan reducera båda perklorat och klorat medans (CRB) kan reducera klorat men inte perklorat [4, 11, 17]. Enzymerna som står för den anaeroba respirationen av klorat och perklorat är perkloratreduktas (Pcr) som reducerar perklorat till klorit via klorat. Det finns enbart hos perkloratreducerande bakterier. Kloratreduktas (Clr) reducerar klorat till klorit men har inte förmågan att reducera perklorat och finns i kloratreducerande bakterier. Kloritdismutas (Cld) är gemensamt för båda bakterietyperna och omvandlar klorit till syre och kloridjoner [4,10]. Reaktionsvägen för nedbrytning av perklorat och klorat visas i Figur 1. (PRB)

(PRB)/(CRB)

2e-

2e-

(PRB)/(CRB)

ClO4- ----------------------> ClO3- --------------------> ClO2- -----------------------> Cl- + Pcr

Pcr/Clr

O2

Cld

Figur 1. Visar reaktionsvägen för reduktionen av klorat och perklorat.

23

Transkription och promotor regioner i prokaryoter Vägen ifrån en gen till ett funktionellt protein är kräver två processer, transkription och translation. Transkription är då en gen avskrivs som en kopia i form av ett ”meddelar RNA” (mRNA). Enzymet som initierar och utför transkriptionen är RNA polymeras. Därefter kommer translation där ribosomer binder in till mRNA:t och avläser den information som genen kodar och syntetiserar det korresponderande proteinet. Transkriptionen skiljer sig i detalj men är i huvuddragen samma mellan olika celltyper såsom djurceller och bakterieceller. För att transkription i bakterier ska kunna inledas behöver RNA polymeraset associera sig med en faktor, ett protein som leder polymeraset till en region strax uppströms genen. Detta område kallas för en promotor och sträcker sig mellan -60bp till + 20bp relativt till transkriptionsstart som utgör +1 positionen [12, 13]. Varje promotor har karakteristiska drag som bestämmer hur hög affiniteten mellan RNA polymeraset och DNA sekvensen är. En del drag är samma för alla promotorer medans andra beror på vilken faktor som är bundet till RNA polymeraset. Ett tydligt mönster för bakteriella promotorer är att det innehåller en lägre halt av nukleotiderna G och C i förhållande till det genomiska medelvärdet. Istället är nukleotiderna A och T mer frekventa som har en lägre stabilitet och smälttemperatur [25]. Detta uppkommer p.g.a. DNA är dubbelsträngat och består utav två komplementära enkelsträngade molekyler som sammanfogas genom vätebindningar och måste separeras för att RNA polymeraset ska kunna inleda transkription där en utav strängarna används som mall. Det finns också två viktiga regioner positionerade ca -10 och -35 nt uppströms relativt till transkriptionsstart och kan identifieras av faktorn som binder RNA polymeraset dit. Utan faktorn bundet besitter fortfarande RNA polymeraset den katalytiska förmågan men kan inte identifiera promotorn [12]. De två -10 och -35 elementen identifierar också själva promotorn och finns i alla bakterier. De består av karakteristiska sekvenser som faktorerna känner igen och är specifika beroende på vilken faktor som är bundet till RNA polymeraset. Sekvenserna skiljer sig också mellan bakterier där en ideél karakteristisk sekvensen i en bakterie inte är det i en annan. En av de mest förekommande bakteriella faktorerna är de som tillhör  – familjen och de flesta gener transkriberas med dem , 8]. Andra faktorer förekommer också och uttrycker specifika gener under normala eller mer stressrelaterade förhållanden. Konsensus-sekvenserna består av sex nukleotider var och är för faktorn TATAAT vid -10 regionen och TTGACA vid -35 regionen för Escherichia coli (Figur 2). Det är väldigt sällan konsensus sekvenserna är helt konserverade i en promotor utan en kvot på 8/12 matchande nukleotider förekommer för en typisk promotor men är sällan lägre än en kvot på 6/12 [8, 9]. Det har även visat sig att regionerna är olika viktiga för promotoraktiviteten där -10 regionen har en större betydelse eftersom den oftare är mer konserverad än -35 regionen och därför kan kompensera för en mindre välbevarad sådan. De olika nukleotiderna i konsensus-sekvensen har också olika stor betydelse för promotoraktiviteten och man har visat att vissa av dem förekommer oftare än andra på specifika positioner inom elementen, speciellt när de är mindre konserverade [9, 24]. I -10 hexameren är nukleotiderna -7T, -11A och ibland -12T mest konserverade, vilket indikerar att de har en större betydelse än resterande nukleotiderna i -10 sekvensen. Positionerna inom – 10 elementet numreras från nukleotiden närmast TSS som -7 till -12 som är nukleotiden längst ifrån TSS enligt: -12T-11A-10T-9A-8A-7T-----TSS. I de initiala stegen för initiering av transkription och därmed separation av de dubbelbundna DNA strängarna flippas baserna -11 A och -7T ut ur stackning konformationen i DNA-helixen och associerar med RNA polymeraset som bär på specifika fickor för dessa två baser [24]. Undersökningar om hur smältningskinetiken beror av förändringar i -10 sekvenserna visar att A vid -11 och T vid -7 positionen har betydelse för snabb smältning av promotorn. Det är -11A som främst är viktig för snabb smältning medans -7T som är den mest konserverade nukleotiden är viktig för initiering av transkriptionsprocessen i sig själv [24]. -10 elementet kan ibland förekomma som en förlängd version ”extended -10 region” på promotorer, oftast då -10 och -35 regionerna är mindre 24

välbevarade eller då de inte finns något -35 element alls [9, 12]. Regionen som utgör ”extended” delen utav -10 elementet är att det en nukleotid uppströms hexameren sitter ett TG baspar. Konsensus-sekvensen lyder då TGNTATAAT där N är någon nukleotid A,T,C, eller G (Figur 2). En mutation på TG determinanten sänker i dessa avseenden aktiviteten drastiskt och därför andningen till att den anses kompensera för mindre välbevarade -10 och -35 element. Positionen mellan -10 och -35 regionerna och mellan -10 regionen och transkriptionsstart har också påvisats ha betydelse för promotoraktiviteten. Ett vanligt förekommande avstånd på 16-18 nukleotider mellan -10 och -35 regionen där 17 nukleotider är oftast förekommande och därmed anses vara det mest optimala avståndet [12, 24] (Figur 2). Mellan transkriptionsstart och -10 regionen varierar avståndet oftast mellan 2-11 nt [7] (Figur 2) där 7 nt är mest förekommande och har visats vara optimal för promotoraktiviteten. Promotorsekvensen uppströms -35 elementet som sträcker sig mellan ca -40 till -60 kallas ”Upstream Element” (UP-Element) som ytterligare ökar promotoraktiviteten [12]. Den består främst av A och T nukleotider och innehåller två säten som kan identifieras av ett RNA polymeraset. Sätena har ingen specifik sekvens utan en preferens för en ökad mängd A och T vid dessa områden är en viktig egenskap för identifiering [13].

Figur 2. Visar den typiska arkitekturen för en bakteriell promotor och konsensus-sekvenserna för faktorn hos E.coli [19].

25

Möjliga promotorer för cld-genen i I. dechloratans och FNR-reglering I. dechloratans är en mikroorganism som tillhör kloratreducerande bakterier, den har gener för Clr och Cld och kan därmed utöva klorat metabolism (Figur 3). I den här bakterien har man studerat regleringen av dessa gener där man genom att mäta mRNA-nivåer har funnit att transkriptionen är högre under anaeroba odlingsförhållanden jämfört med aeroba odlingsförhållanden [4, 11]. Under fortsatta studier på hur genregleringen utav cld fungerar har sekvensen uppströms genen undersökts för en möjlig promotorregion och möjliga inbindningssäten för transkriptionsfaktorer. Utav detta har man identifierat ett transkriptionsstart för cld lokaliserat 85 nukleotider uppströms den första nukleotiden i translation initieringskodonet [21] och även möjliga -10 och -35 element (Figur 3) [15]. Sekvenserna antogs utgöra dessa element efter att man observerat en stor och minskning och ibland total avskaffande utav uttrycket av cld när mutationer eller avkapning av elementen gjorts. Dessa sekvenser skiljer sig mycket från konsensus-sekvensen i E. coli då bara 1 av 6 respektive 4 av 6 nukleotider överensstämmer med den. Det medför en osäkerhet i huruvida detta verkligen är en promotor [15]. Ett möjligt bindningssäte tillhörande proteinet (fumarate and nitrate reduction regulatory protein) FNR har också identifierats [20] och är centrerat 19,5 nt uppströms transkriptionsstart och kan tydligt observeras överlappa med – 10 elementet (Figur 3).

Figur 3. Visar var en möjlig promotor skulle kunna vara belägen för cld i I. dechloratans. De lätt understrukna nukleotiderna i -10 och -35 elementen stämmer överens med konsensus-sekvenserna i E.coli. Den grövre understrukna sekvensen är ett möjligt FNR-säte position [15]. Ett insertionselement ISIde1, genen för kloratreduktas (clrA-D) och cld-genen visas i pilarna, där pilarnas riktning visar organiseringen av sekvenserna och transkriptionsrikitningen för clrA-D och cld.

FNR är ett av de vanligaste förekommande regleringsproteinen som kontrollerar övergången mellan aerob och anaerob metabolism hos bakterier via reglering på transkriptionsnivå [6, 14, 23]. Proteinet finns i cellens cytoplasma och fungerar som en O2 sensor. Då syre finns tillgängligt inaktiveras proteinet och i frånvaro utav syre aktiveras det. Ett E.coli FNR i aktiv form har ett [4Fe– 4S]2+ kluster per monomer som sitter bundet till fyra cystein [23]. Det förmedlar nödvändig konformationsförändring som tillåter dimerisering av monomererna. Den formen av proteinet har förmågan att sekvensspecifikt binda in till DNA och därmed reglera uttrycket [6, 14, 23]. Det är också klusteret som är känsligt för O2 och under aeroba förhållanden konverteras det till ett [2Fe– 2S]2+ kluster vilket medför att dimererna separeras till enskilda monomerer och därmed proteinets inte längre kan binda in till DNA sekvensen och reglera uttrycket [23].

26

Konsensus-sekvensen för ett E.coli FNR är TTGATNNNNATCAA och det möjliga FNR-sätet som identifierats uppströms cld-genen i I. dechloratans stämmer överens till 9 av 10 nukleotider ett sådant. Precis som för promotorregionerna -10 och -35 behöver inte FNR sekvensen vara identisk till konsensus-sekvensen för ett FNR-säte ett FNR komplex ska kunna identifiera det och binda in dit. Det finns också vissa baser som är mer eller mindre konserverade och som anses vara mer viktiga för identifiering av sätet (Figur 4).

Figur 4. Visar en positionsmatris av de förekommande baserna i FNR-sätet hos E.coli där höjden av baserna visar konservationsgraden vid respektive position, dvs de mest frekventa nukleotiderna som allmänt observeras på dessa positioner. Informationen kommer ifrån artikel [6].

Vart det är lokaliserat någonstans på promotorn bestämmer om FNR har en positiv eller negativ inverkan på transkription. I de fall där FNR har en undertryckande roll på transkription kan sätet vara placerat från -35 regionen till transkriptionsstart. För en aktiverande roll i en promotor är centrum för FNR-sätet 41,5 nukleotider uppströms transkriptionsstart och överlappar med någon nukleotid -35 regionen, dessa promotorer är kända som klass II promotorer [6, 14]. En centrering på 60,5, 71,5, 72,5, 74,5, 82,5 eller 92,5 nt från transkriptionsstart förekommer för klass I promotorer, de är betydligt mer sällsynta [6, 15]. Ett inbundet FNR komplex med en aktiverande roll tar binder till RNA polymeraset när de båda bundit till DNA:t. Det förstärker bindningen mellan RNA polymeraset och promotorn vilket leder till att transkriptionen av den specifika genen ökar. Tidigare resultat där man arbetat med ett 200 bp långt fragment innehållande den möjliga promotor regionen och muterat det möjliga FNR-sätet visar det att både basal uttrycket av cld under aeroba förhållanden såsom det anaeroba nästan totalt slås ut [15]. När man i ett annat försök istället bevarade det möjliga FNR-sätet men placerade 200 bp fragmentet i en bakteriestam, RM 101 som saknar förmågan att producera FNR visade mätningarna ändå ett basalt uttryck [15]. Detta gav upphov till en hypotes som tillsammans med FNR-sätets position i förhållande till det tidigare bestämda TSS som vanligtvis associeras med en undertryckande roll av gener, bör finnas en FNRberoende promotor längre nedströms som står för den anaeroba induktionen. För att undersöka hypotesen utförde jag i det här arbetet gjorde en teoretisk analys av sekvensen uppströms cld i förhållande till FNR pallindromet med ovanstående kunskap som verktyg. Det resulterade i att ett nytt transkriptionsstart och nya -10 och -35 element längre lokaliserades (Figur 5). Analysen gjordes genom att räkna 41.5 nt nedströms ifrån FNR-sätet centrum där typ II promotorer har sitt transkirptionsstart. Ett A lokaliserades på den positionen. Därifrån stegades det sju nukleotider uppströms som gav upphov till ett möjligt -10 element som också innehöll determinanten TG en 27

nukleotid uppströms -10 hexameren vilket tillsammans formar ett möjligt ”extended – 10 element”. Genom att till sist mäta vandra ett avstånd på sjutton nukleotider uppströms den första nukleotiden -10 hexameren identifierades ett möjligt – 35 element, överlappande med FNR-sätet, precis som konstaterats för en aktiverande roll av FNR.

Figur 5. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn för cld i I. dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en klass II promotor som allmänt har TSS 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet. Det optimala avståndet på sju nukleotider uppströms TSS gav ett möjligt extended -10 element markerat I fet stil med understrukna nukleotider som överensstämmer med E.coli konsensus-sekvens TATAAT. -35 elementet bestämdes sjutton nukleotider uppströms första nukleotiden i -10 hexameren, elementet är markerat med fet stil och överensstämmande nukleotider understrukna.

28

Metodiker Genom att använda en sekvensamplifieringsteknik kunde den möjliga promotor regionen till cld ifrån I. dechloratans DNA isoleras och amplifieras, tekniken kallas Polymerase Chain Reaction eller PCR. Metoden kräver att man känner till sekvensen som ska amplifieras för att kunna syntetisera två primrar som är komplementära till en del av ett område som sträcker sig över den önskade sekvensen som ska amplifieras. Komponenterna som ingår i reaktion är primrar, polymeras enzym, nukleotider, MgCl och templat DNA. Processen sammanfattas i tre olika steg, denaturering, annealing och extension. Dessa steg utförs flera gånger och under specifika temperaturer. Under denatueringssteget höjs temperaturen till 90 °C som separerar DNA strängarna ifrån varandra som gör sekvensen som önskas amplifieras tillgänglig. I annealingssteget sänks temperatuern till mellan 50-60 °C som medför att hybridisering av de två primrarna till det komplementära området i DNA:t som sträcker sig över målsekvensen. Därefter i extensionsteget höjs temepraturen till 74°C som tillåter polymeraset att vid optimal hastighet amplifiera den önskade sekvensen. Eftersom processen upprepas många gånger amplifieras sekvensen till ett stort antal kopior. Temperatur, tid och antal cykler för processerna skiljer sig från system till system. För att mäta om fragmenten av den möjliga FNR-beroende promotorn kunde ge upphov till transkription och därmed uttryck hade de ligerats in framför en promotorlös gen som kodar för enzymet galaktosidas i plasmiderna pBBR1MCS-4-LacZ och pBBR1MCS-2-LacZ. Det görs genom att klyva upp plasmiden som är en cirkulär DNA sekvens så att den blir linjär och efter det sammanfoga den amplifierade promotorsekvensen med den linjära plasmiden och återförsluta igen. Restriktionsenzymer används då som identifierar en specifik DNA sekvens som benämns ett restriktionssäte bestående av ett par nukleotider och klyver av DNA:t där. Plasmiden är konstruerad att innehålla ett flertal sådana sekvenser för olika restriktionsenzymer. Genom att vid primerdesignen addera restriktionssäten på primrarna som också finns i plasmiden får produkterna från amplifieringen av promotorsekvensen dessa restriktionssäten som gör det möjligt att klyva plasmid och promtorsekvens med samma restriktionsenzym. Det medför att plasmiden och promotorsekvensen får komplementära ändar och kan binda till varandra via vätebindningar. Eftersom enkelsträngarna i en DNA molekyl sitter ihop kovalent med fosfodiesterbindningar måste ett DNA-ligas enzym också tillsättas att slutföra sammanfogningen. Detta steget kallas ligering och innebär att ligaset syntetiserar nya fofsofdiesterbindningar. Under ligeringen i det här fallet återförsluts DNA:t i cirkulär form, nu innehållande den möjliga promotorsekvensen framför galaktosidas-genen. Därefter är det dags att transformera celler med plasmiden innehållande den möjliga promotorsekvensen. Transformering är en metod som tillåter introduktion av en DNA molekyl in i en cell. Två metoder användes i det här arbetet för att introducera plasmider med inligerade fragment av den möjliga FNR-beroende promotorn i celler. Den ena metoden var att arbeta med superkompetenta celler, något som beställs ifrån ett företag och transformeras väldigt lätt genom att följa ett protokoll. Den andra metoden var mer traditionell och kallas elektroporereing. Det är en teknik där cellerna först genomgår ett antal tvättar som gör dem elektrokompetenta och därefter utsätts dem för en kort elektrisk puls. Teorin bakom pulsningen hävdar att porer bildas i cellmembranet som tillåter transport av DNA in i cellen. Processen består utav uppodling av celler som sedan tvättas i en mängd centrifugeringsprocessen för att avlägsna salter som annars kan leda till kortslutning under pulsningen. Cellerna blandas i nästa steg med en godtycklig mängd DNA och pulsas vilket leder till upptag av DNA ifrån omgivningen. Parameterarna som ställs in under pulsningen är fältstyrka, motstånd och kapacitans, som beror olika faktorer som t. ex. vilken typ av celler man arbetar med.

29

Cellerna innehållande plasmiden med inligerad promotorregion odlas upp under aeroba och anaeroba förhållanden. Odlingen görs i ett lämpligt odlingsmedium med ett antibiotika som en selektivitetskontroll för att säkerställa att cellerna innehöll plasmiden eftersom den medför någon typ av antibiotikaresistens till bakterien. De skördas sedan under exponentiell fas och sedan tillsätts toluen som permeabiliserar cellerna och därefter ett substrat som - galaktosidas konverterar till en mätbar produkt. Naturligt hydrolyserar - galaktosidas galaktosider till monosakarider men används också för biokemiska mätningar. Substratet är o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG), som diffunderar in i cellen via proerna som bildats och katalyseras i närvaro av - galaktosidas. Substratet är ifrån början är färglöst men bildar en färgad produkt. Produkterna som bildas är galaktos, och den färgade produkten o-nitrophenol som är gul [22]. Mängden o-nitrophenol som bildas mätas via absorbans vid 420 nm och är, om ONPG är tillsatt i överflöd proportionell mot mängden galaktosidas och reaktionstiden för hydrolyseringsreaktionen [22]. galaktosidas aktiviteten beräknas med formeln: Beta−galaktosidas aktivitet=1000 x

OD 420−1,75 OD550 t v OD 600

Där t är reaktionstiden i [min], v är volymen cellkultur [ml], OD600 är ett mått på celldensiteten innan assayen, OD420 absorbansen vid 420 nm av o-nitrophenol [-], 1,75 OD550 en korrektionsfaktor för ljusspridningen ifrån cellskräp vid 550 nm [-].

30

Uppnådda resultat Efter försöken med 189 bp och 172 bp fragmentet under aerob och anaeroba förhållanden i XL1BLUE visade resultaten att 189 bp fragmentet, innehållande den möjliga – 10 regionen gav ett uttryck aerobt och ett större inducerat uttryck anaerobt. Den anaerob induktionen för 189 bp fragmentet bestämdes till 3,3 ggr basaluttrycket. Fragmentet med 172 bp sekvensen där möjliga -10 regionen avlägsnat gav under båda förhållanden ett uttryck nära noll och därmed inte heller någon induktion. Det jämfördes också mot uttrycket förmedlat av bakgrundsplasmiden under samma förhållanden där resultatet visade att det inte var någon skillnad mellan uttrycken. Dessa försök upprepades i RM 101 som påvisade samma sak för 189 bp fragmentet och att I. dechloratans FNR var kapabel till att inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Induktionen bestämdes till 2,8 ggr balsaluttrycket. Förutom det påvisades det också att celler med I. dechloratans FNR överlever under anaeroba förhållanden med NaNO3 respiration.

Viktigaste slutsatserna Efter att jag utgått ifrån hypotesen om att cld-genen regleras utav en FNR-beroende klass II promotor identifierades ett möjligt – 10 element. Resultaten visade att elementet behövdes för en anaerob uppreglering vilket stärker hypotesen. När elementet avlägsnades minskade uttrycken både under aeroba och anaeroba förhållanden till noll. Slutsatsen blev att transkription utav cld med stor sannolikhet startar ifrån samma promotor, som både utgör uttryck vid aeroba och anaeroba förhållanden. Den tidigare hypotesen om två skilda promotorer, en som står för basaluttrycket under aeroba förhållanden och en FNR-beroende som står för ett inducerat uttryck under anaeroba förhållanden förkastas. Den andra viktiga slutsatsen är att I. dechloratans kodar för ett FNR-protein med förmågan att inducera uttrycket av cld under anaeroba förhållanden. Det har också förmågan att ersätta ett E.coli FNR under anaeroba förhållanden med NaNO3 respiration.

31

Material och metoder Bakteriestammar, plasmider och odlingsförhållanden Bakteriearten som användes var E.coli och stammarna var XL1-BLUE och RM 101. Skillnaden mellan stammarna är att bland annat RM 101 saknar en FNR-gen som uttrycker ett funktionellt FNR-protein. Ursprungsplasmiderna var pBBR1-MCS4-LacZ [31], pBBR1-MCS2-LacZ [31], pBR322 [15]. De användes som reportervektorer för 189 bp och 172 bp fragmenten som ligerades in strax uppströms den promotorlösa lacZ genen under restriktionssätena PstI och SalI i pBBR1MCS4-LacZ och EcoRI och SalI i pBBR1-MCS2-LacZ. Där genen lacZ uttrycker b-galaktosidas. I tidigare arbeten hade en variant av plasmiden pBR322 konstruerats där FNR-genen ifrån I. dechloratans ligerats in då betecknad pBR322_IdFNR[15]. Över natt (Ö.N) kulturer sattes upp med enstaka kolonier ifrån dessa stammar som växt på LB plattor och sedan först över till Luria Bertani Broth (LB) medium (10 g tryptone, 5 g NaCl och 10 g jästextrakt per liter avjoniserat vatten, pH 7) med lämpligt eller antibiotika (100 µg/ml ampicillin och 50 µg/ml kanamycin) och odlats aerobt vid 37 ᵒC 16 tim. En del av kulturerna fördes sedan till nytt LB medium med samma antibiotika och odlades aerobt med syre som enda elektronacceptor och anaerobt med natriumnitrat (40mM) som enda elektronacceptor. Aeroba kulturer odlades i partiellt fyllda 500 ml Erlenmeyer flaskor med skumkorkar och anaeroba kulturer i helt fyllda 50 ml flaskor med gummikorkar, båda under 37 ᵒC, 200rpm. De aeroba kulturerna odlades 2 h-2 h 40 min och anaeroba i 5 h. Cellerna skördades under exponentiell fas dvs under aeroba förhållanden vid OD600 = 0,45-0,7 och för anaeroba förhållanden vid OD600 = 0,35-0,4. Där OD mäter ljusförlusten i form av en skenbar absorbans på celler som belyses vid 600 nm, eftersom celler inte absorberar ljus utan skingrar det när de belyses, och har ingen enhet.

Analys av promotorsekvens Sekvensen uppströms cld analyserade efter möjliga promotorregioner med online tjänsterna ”Softberry” BPROM Prediction of bacterial promoters [26], ”Fruitfly” Neural Network Promoter Prediction [27] och ”CBS” Promotor 2.0 Prediction Server [28]. En teoretisk analys ifrån FNRboxen som utgångsläge gjordes med antagande att det fanns en FNR-beroende klass II promotor nedströms boxen.

Plasmidpreparation Celler innehållande pBBR1-MCS4-LacZ eller pBBR1-MCS2-LacZ ifrån E.coli stammen XL-1 BLUE odlades upp på varsin agar platta, innehållande 100µg/ml ampicillin respektive 50 µg/ml kanamycin över natten i 37 °C. En koloni ifrån varje platta fick växa i 50 ml Ö.N kultur där hela mängden sedan användes för plasmidpreparationen med kittet NucleoBond® Xtra Midi Plus, Nucleic Acid and Protein Purification,( Macherey-Nagel). Preparationen utfördes enligt tillverkarens rekommendationer med en elueringsvolym på 5 ml följt av en isopropanolfällning. Därefter bestämdes renhet och koncentration genom att mäta absorbansen för provet vid 260 nm och 280 nm med Infinite® 200 PRO NanoQuant.

32

Klyvning av plasmid Av pBBR1-MCS4-LacZ klövs 1 µg med restriktionsenzymerna PstI (10U/µL) och SalI (10U/µL) (Fermentas Life Sciences) och av pBBR1-MCS2-LacZ klövs 6 µg med EcoRI (5U/µL) och SalI (5U/µL) (Fermentas Life Sciences). Processen utfördes i en 10 x BUFFER O (Thermo Scientific) enligt tillverkarens rekommendationer med en reaktionsvolym på 30 µL. Under reaktionen inkuberades provet i 37 °C under 60 min. För att ta reda på om klyvningen var lyckad blandades en del av provet med DNA Loading Dye (6x) solution (Thermo Scientific) och sterilt vatten och fördes över till en en 0,8 % TAE x 1 gel och vandra under 75 V i 90 min. Som referens fördes också okluven plasmid och en referensstege Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific) över på gelen för att verifiera om det var någon skillnad i vandringslängd mellan okluvet och kluvet DNA och om bandet storleksmässigt låg runt 8000 bp vid jämförelse med referensstegen. Gelen färgades efteråt in med etidiumbromid (10mg/ml) och en bild togs med ImageQuant 400. Därefter kördes den resterande mängden av proven ut på en likadan gel under samma villkor. De kluvna plasmiderna skars ut ur gelen och renades med QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN), enligt tillverkarens rekommendationer.

33

PCR: Tillverkning av insert För att kunna tillverka fragmenten designades primrar se (tabell II). För beräkning av deras smälttemperatur användes onlinetjensten ”BioPHP PHP for bioinformatics” [29] och för möjligheten att bilda sekundärstrukturerna, homodimer, heterodimer och hårnål användes OlgioAnalyser 3.1 (Integrated DNA Technologies®) [30]. Till uppströms- och nedströmsprimrarna adderades säten för restriktionsenzymer Pst I respektive SalI. PCR reaktionerna gjordes med KAPA2G Robust HotStart ReadyMix, (KAPABIOSYSTEMS) och utfördes enligt tillverkarens rekommendationer. Ungefär 20 ng av pBBR1MCS-4-lacZ_cldprom innehållande 200 bp av sekvensen uppströms cld från I. dechloratans användes som templat i vissa av reaktionerna och 10 ng genomiskt I. dechloratans DNA i resten, provens totalvolym blev 25 µL. Hälften av proverna gjordes med nedströms primer_172 och resten med nedströms primer_189 för att ge respektive produkter (Tabell II och Figur 6 och 7). Två negativa kontroller gjordes för att verifiera att det ingen av komponenterna var kontaminerad. De innehöll alla komponenter utom templat DNA. Kontrollerna skiljde sig i att den ena innehöll nedströms primer_189 och den andra kontrollen nedströms primer_172. Programmet som kördes under reaktionen visas i tabell I.

Tabell I: Programmet för PCR amplifiering av 172 bp och 189 bp fragmentet. De tre stegen denaturation, annaealing och extension utfördes med 35 cykler.

Steg

Temperatur [°C]

Tid [s]

Initial denaturation

95

180

Denaturation

95

15

Annealing

60

15

Extension

72

15

Final Extension

72

60

Efter PCR reaktionerna fördes proverna över på en 3 % TBE x 1 agaros gel och separerades under 75 V i 45 min för att kontrollera om produkterna hade rätt storlek. Därefter renades återstoden med GeneJet™ PCR Purification Kit (Fermentas) enligt tillverkarens protokoll och med en eluerings volym på 50 µL.

34

Klyvning av fragment Klyvningarna av restriktionsenzymssätena i ändarna av 189 bp och 172 bp fragmenten utfördes med totalvolymer på 30 µL för proven under det första klyvningstillfället och 60 µL under det andra. Under första klyvningen klövs 2.2 µg av 172 bp PCR produkt och 1.85 µg 189 bp PCR produkt och under det andra tillfället var klövs 1.3 µg 172 bp PCR produkt och 1.5 µg 189 bp produkt. Processen utfördes i en 10 x BUFFER O (Thermo Scientific) med enzymerna PstI och SalI enligt tillverkarens rekommendationer. Under reaktionen inkuberades proverna under 60 min i 37 °C. Proverna renades sedan med GeneJet™ PCR Purification Kit från Fermentas enligt tillverkarens protokoll med elueringsvolymer på 50 µL. Kvantifiering av renade produkter med absorbansmätning vid 260 nm och 280 nm gjordes med Infinite® 200 PRO NanoQuant.

Ligering Ligeringarna utfördes med kluven plasmid. Fragmenten tillsattes i ett 3:1 molärt förhållande där 3.5 ng av 189 bp fragmentet tillsattes till 50 ng utav plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ i ett prov och 3.2 ng 172 bp fragmentet till ett annat prov med lika stor mängd utav samma plasmid. Under den andra ligeringen tillsattes 3.8 ng av 189 bp fragmentet till 55 ng utav pBBR1-MCS2-LacZ i ett prov och 3.5 ng av 172 bp fragmentet i ett annat med lika stor mängd av samma plasmid. Reaktionen utfördes med 10 x T4 DNA Ligase buffer och T4 DNA Ligase (Thermo Scientific) enligt tillverkarens rekommendationer i en totalvolymen på 25 µL. Under ligeringsprocessen inkuberades proven i rumstemperatur i 10 min. Ligaset inaktiverades sedan under 10 min i 65°C.

Transformering Transformeringen gjordes med superkompetenta XL1-BLUE celler (Stratagene) och utfördes enligt tillverkarens rekommendationer. Proven som användes för transformering var tre st, ett för 189 bp fragmentet, ett för 172 bp fragmentet och en kontroll. Värdplasmiden som fragmenten var inligerade i var pBBR1-MCS4-LacZ, kontrollen innehöll en annan plasmid, pUC18 utan insert. Efter att transformanterna strukits ut på LB plattor med 100 µg/ml ampicillin odlades de övernatten i 37 °C. Nästa dag valdes sex kolonier från vardera platta och ströks ut på nya plattor som fick odlas likadant. Därefter sattes två Ö.N. kulturer av transformanter med 189 bp och 172 bp fragment inför verifiering.

Verifiering av kolonierna med 189 bp och 172 bp transformanter En koloni från vardera transformation med plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ och pBBR1-MCS2LacZ valdes ut för plasmidpreparation, som ovan, och skickades sedan till Eurofin Genomics för sekvensering.

35

- galaktosidas Assay XL1-BLUE celler med 189 bp, 172 bp fragmenten eller endast pBBR1-MCS4-LacZ odlades upp aerobt i 500 ml flaskor med skumkorkar i 25 ml LB medium och 100 µg/ml ampicillin. Anaeroba kulturer odlades upp i 50 ml flaskor med gummikorkar, helt fyllda med ca 60 ml LB medium och med 100 µg/ml ampicillin och 40 mM NaNO3. Fyra olika stammar av RM 101 celler odlades. De innehöll två plasmider: pBBR1MCS-2-LacZ med antingen 189 eller 172 bp fragmentet samt pBR322 utan insert eller med en FNR-gen från I. dechloratans (pBR322_IdFNR). Antibiotikum halten var 100 µg/ml ampicillin och 50 µg/ml kanamycin. Dessutom användes två kontrollstammar av RM101, en med de båda plasmiderna ovan utan insert och en med pBBR1MCS2-LacZ utan insert och pBR322 med FNR-genen från I. dechloratans. Kulturerna sattes på skak 225-250 rpm i 37 °C och skördades i exponentiell fas. Mätningarna gjordes i triplikat och utfördes enligt Millers protokoll [22]. Till mätningarna på 189 bp och 172 bp fragmenten användes 0,5 ml celler, och för mätning på bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ respektive bakgrundsplasmiderna pBR322 och pBBR1-MCS2-LacZ användes 0,6 ml celler.

Elektrokompetenta celler RM 101 celler gjordes elektrokompetenta inför transformering med elektroporering. Kulturer av celler med plasmiden pBR322 och pBR322_IdFNR odlades på skak 225-250 RPM och 37 °C i 16 tim. Nästa dag odlas en mängd av dessa upp i 250 ml LB + 100 µg/ml ampicillin och skördades vid exponentiell tillväxtfas. Cellerna sattes på is i 15 min och centrifugerades sedan under 10 min i 4 °C, 4500 rpm i rotor SLA-3000 (Sorvall™). Supernatanten dekanterades av och cellerna tvättades med 500 ml iskallt vatten och centrifugerades igen likadant. Vattnet dekanterades av och cellerna löstes i 8 ml 10 % glycerol och centrifugerades likadant. Glycerolen hälldes av och cellerna löstes i den återstående glycerolen på botten och fördes över i 50 µl portioner till eppendorfrör.

Elektroporering Transformeringen av RM 101 gjordes med Gene Pulser II® (Bio-Rad). 1 µL plasmid pBBR1MCS2-LacZ DNA innehållande 341 ng 189 bp respektive 287 ng 172 bp fragmentet blandades ned i 50 µL elektrokopmetenta celler. Lösningen tillsattes sedan i en kyvett (Biorad) med ett avstånd på 0.2 cm mellan elektroderna och sattes in i elektroporeringsapparaten. Därefter ställdes parametrarna in enligt: spänning 2.5 kV; resistans 200 Ohm och kapacitans 25µF. Direkt efter pulsen tillsattes 1 ml uppvärmt (42 °C) SOC-medium till kyvetten och provet överfördes sedan till ett 15 ml Falkonrör som inkuberades i 37 °C på skak 225-250 RPM under 60 min. Efteråt ströks cellerna ut på LB plattor innehållande 100µg/ml ampicillin och 50 µg/ml kanamycin som inkuberades i 37 °C.

36

Resultat: Del I Analys av promotorsekvens Hypotoesen om att FNR-boxen tillhörde en FNR-beroende promotor av klass I eller II testades genom att undersöka sekvenser ca 40, 60 och 70 nt nedströms boxen. Sekvensen uppströms cld analyserades med onlinetjänsterna ”Softberry” BPROM Prediction of bacterial promoters, ”Fruitfly” Neural Network Promoter Prediction och ”CBS” Promotor 2.0 Prediction Server. Ingen av tjänsterna gav något utslag till en möjlig promotor inom sekvensen. Den analyserades då manuellt där den sekvensen som hade mest likhet med en s70 promotor i E.coli hittades på position som stämmer med en FNR-beroende promotor av klass II. Den sekvensen utgjorde ett transkriptionsstart lokaliserat 41,5 nukleotider nedströms mitten- nukleotiden i FNR-sätet, 7 nt uppströms TSS hittades en möjlig ”extended - 10 region” TG-GAAGAT och 17 nt uppströms hexameren i -10 regionen en möjlig -35 region AACACA (Figur 6 och 7). Regionerna – 10 och -35 som identifierades stämmer överens med fem av nukleotiderna för ett ”extended – 10” område, TGTATAAT och tre av nukleotderna för ett -35 element, TTGACA i E.coli.

37

Primers Primrarna som användes för att åstadkomma de önskade fragmenten var uppströms primer, nedströms primer _172 och nedströms primer_189. Uppströms primern användes i alla PCR reaktionerna för syntetisering av både 189 bp och 172 fragmenten och hade ett klyvningssäte för PstI. Båda nedströms primrarna hade klyvningssäten för SalI, där nedströms primer_172 tillsammans med uppströms primern användes för syntetisering av 172 bp fragmentet och likadant med nedströms primer_189 för 189 bp fragmentet. Nedströms primer_172 var konstruerad att binda in en nukleotid uppströms det möjliga extended -10 elementet och ge det kortare 172 bp fragment som då inte innehåller -10 sekvensen. Nedströms primer_189 konstruerades för att binda in vid transkriptionsstart och överlappa det möjliga -10 elementet för få med hela den möjliga promotorn och ge det längre 189 bp fragmentet. I tabell II visas primrarnas sekvens och förväntad produktlängd för primerkombintationerna. Figurerna 6 och 7 visar vart primrarna binder in till den möjliga promotorn och vart sekvenserna -10, -35, ISIde1 och FNR är lokaliserade i förhållande till TSS. Tabell II. Visar primrarnas sekvens och produktlängden varje kombination förväntas ge. Den delen med grå bakgrund är komplementär sekvens till den möjliga promotorn, fet stil är restriktionssäten och sekvens med G och C för restriktionssätena är GC-klampar.

Primerkombinationer

Primersekvens

Produkt längd

5' GGGC CTGCAG GCGAGGTCGGCGTCAGT '3 Uppströms primer Nedströms primer_172 5' GGCGC GTCGAC TTTCTCCTTTTTTATGTGTTTGATT

172 bp

5' GGGC CTGCAG GCGAGGTCGGCGTCAGT '3 Uppströms primer Nedströms primer_189 5' GCGC GTCGAC TGCACGAATCTTCGCATTTCTCCT 3'

189 bp

3'

38

5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGTTGAG AAGTCAATTTCCACTGGAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAG AAACTCTTGACTTAAATCAAACACATAAAAAAGGAGAAATGCGAAGATTCG TGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACCAAGCCGCCCAGCGGATTCCGATTCTTAACAC TGGAGTACATCATG'3 Figur 6. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn uppströms cld i I. dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en klass II promotor som allmänt har TSS (vitt A i svart bakgrund) 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet (understruken sekvens). Det optimala avståndet på 7 nt uppströms TSS gav ett möjligt extended -10 element i större teckenstorlek markerat med sträck ovanför sekvensen. -35 elementet (större teckenstorlek) bestämdes 17 nt uppströms första nukleotiden i -10 hexameren. De nukleotiderna i vitt med svart ytterlinje i -10 och -35 hexameren stämmer överens med konsensus-sekvensen för E.coli. Sekvens med grå bakgrund är bindningsekvens för uppströms primer och nedströms primer_172. I fet stil markeras den möjliga promotor regionen uppströms cld. Den resterande omodifierade sekvensen t.o.m 5'-änden tillhör ISIde1 elementet. Kursiverat ATG är startkodonen för cld-genen.

5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGTTGAG AAGTCAATTTCCACTGGAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAG AAACTCTTGACTTAAATCAAACACATAAAAAAGGAGAAA(TGCGAAGAT) TCGTGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACCAAGCCGCCCAGCGGATTCCGATTCTTAA CACTGGAGTACATCATG'3 Figur 7. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn uppströms cld i I. dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en typ II promotor som allmänt har TSS (kursiverat vitt A i grå bakgrund) 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet (understruken sekvens). Det optimala avståndet på 7 nt uppströms TSS gav ett möjligt extended -10 element i större teckenstorlek markerat med parenteser. -35 elementet (större teckenstorlek) bestämdes 17 nt uppströms första nukleotiden i -10 hexameren. De nukleotiderna i vitt med svart ytterlinje i -10 och -35 hexameren stämmer överens med konsensus-sekvensen för E.coli. Sekvens med grå bakgrund är bindningsekvens för uppströms primer och nedströms primer_189. I fet stil markeras den möjliga promotor regionen uppströms cld. Den resterande omodifierade sekvensen t.o.m 5'-änden tillhör ISIde1 elementet. Kursiverat ATG är startkodonen för cld-genen.

39

Plasmidpreparation I tabell III nedan visas resultatet av plasmidpreparationen av pBBR1-MCS4-LacZ. Elueringsvolymen var 100 µL där 5,1 µg plasmid preparerades fram. Renheten som bestämdes definieras som kvoten mellan absorbansvärden vid 260 och 280 nm.

Tabell III: Visar resultatet av absorbansmätning vid 260 och 280 nm för renhet och koncentration efter preparation av plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ.

Elueringsvolym [µL] DNA

Koncentration [ng/µL]

Renhet [-]

100

51,1 ng/µL

1,9

100

51,1 ng/µL

2

40

Restriktionsklyvning För att verifiera aktiviteten hos enzymerna klövs 300 ng avDNA med varje enzym enskilt. Enzymen tillsattes i en aktivitet som motsvarade 10 U i båda fallen. En mängd på 300 ng okluvet DNA och en stege Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific) användes som referens. Figur 8 visar resultatet av testklyvningarna utkört på en 0,8 % TAE x 1 agaros gel där brunn (SalI) är DNA kluvet med SalI, brunn (PstI): DNA kluvet med PstI, brunn (OK): okluvet DNA och brunn (Stege): referensstegen. Ytterligare en testklyvning gjordes, den här gången av plasmiden pBBR1MCS4-LacZ för att verifiera att båda enzymerna var kapabla till att klyva den. Klyvningen gjordes enskilt med varje enzym likadant som den tidigare testklyvningen. Figur 9 visar resultatet av den test klyvningen på en 0,8 % TAE x 1 gel. Där brunn (SalI): innehåller kluven plasmid med SalI, brunn (PstI): plasmid kluven med PstI, brunn (Okluvet): okluven plasmid och brunn (Stege): referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och bandet under 5077 bp. Figur 10 visar klyvningen av 1 µg plasmid med båda enzymerna SalI och PstI samtidigt utkört på en 0,8 % TAE x 1 gel. Tillsammans har enzymerna klyvt bort ett 29 bp långt fragment som senare i ligeringssteget ska ersättas av 189 bp och 172 bp fragmenten som också klyvts med samma restriktionsenzymer. Brunnen (KP) till vänster innehåller plasmiden kluven med både SalI och PstI, brunn (OKP): okluven plasmid och brunn (Stege): referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och bandet under 5077 bp. Här visar resultatet att PstI klyvningen av DNA är identisk med referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24 som är DNA kluvet med PstI. SalI skulle klyva DNA:t en gång och ge två band som ligger strax under det okluvna DNA:t precis som visas på gelen.

Figur 8.Visar gelen med fyra prover från vänster till höger där DNA är kluvet med SalI i första brunnen och PstI i den andra. Den tredje brunnen (OK) innehar okluvet DNA och den fjärde brunnen (Stege) Lambda DNA/PstI Marker, 24.

41

Figur 9. Visar gelen med fyra prover från vänster till höger där plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ klyvts med SalI i första brunnen och PstI i den andra. De två resterande brunnarna innehåller okluven plasmid (Okluvet) och stegen Lambda DNA/PstI Marker, 24.

42

Här visar resultatet tydligt att banden som representerar den kluvna plasmiden med SalI och PstI ligger skilt från bandet som representerar den okluvna plasmiden. DNA kan anta olika former som medför band på olika platser i gelen beroende på varje forms rörelsemotstånd under resan genom gelen. Den kluvna plasmiden är linjär och antar en större yta än den cirkulerade som i det här fallet bollat ihop sig. Den utsätts då för ett större rörelsemotstånd i gelen och rör sig långsammare än den mindre bollformen av det cirkulära DNA:t. Vandringssträckan blir därför kortare. Den kluvna plasmidens storlek är 8040 bp som ligger mitt emellan stegens 11501 bp och 5077 bp som den linjära plasmid bör göra.

Figur 10. Visar i brunnen (KP) från vänster den resterande mängd 1 µg plasmid pBBR1-MCS4-LacZ som klyvts med både SalI och PstI, i brunnen intill okluven plasmid (OKP) och därefter stegen Lambda DNA/PstI Marker, 24.

Rening av kluven plasmid Reningen av den kluvna plasmiden gav ett totalt utbyte på 20 %, ca 200 ng kluven plasmid DNA. Elueringsvolymen var 20 µL och gav koncentrationen 9,5 ng/µL med renheten 1,8-1,9. Den kluvna plasmiden är nu redo att användas i ligeringssteget dit 189 bp och 172 bp fragmenten var för sig ska ligeras in.

43

PCR PCR reaktionerna gjordes med plasmiden pBBR1MCS-4-lacZ_cldprom innehållande den möjliga promotorn som templat DNA tillsammans med uppströms primer och nedströms primer_189 för att konstruera och amplifiera 189 bp fragmentet och med uppströms primer och nedströms primer_172 för att konstruera och amplifiera 172 bp fragmentet. Proverna fördes över på en 3 % TBE x 1 agaros gel för verifiering och visas i figur 11 och 12. En stege, GeneRuler low range DNA ladder (Thermo Scientific) användes som referens, stegens 150 bp och 200 bp är markerade i båda figurerna. PCR reaktionerna utfördes i två omgångar för att få tillräckligt med produkt. Olika mängd av reaktionslösningen fördes över och separerades ut på gelen för att få en uppfattning hur effektiv reaktionen varit. För att verifiera att ingen av komponenterna som användes i reaktionen var kontaminerad gjordes två negativa kontroller med alla komponenter utan DNA templat. Skillnaden mellan kontrollerna var att en innehöll nedströms primer_189 och den andra nedströms primer_172. I den första reaktionen vars resultat visas i figur 11 var tillsatsen till brunnarna som skulle innehålla prov 10 µL av en lösning innehållande mängden 1µL eller 3 µL löst prov i från PCR reaktionen. Ifrån den andra reaktionen var tillsatsen fortfarande 10 µL men mängden tillsatt löst prov alltid 2 µL. Anledningen till den alternerade mängden prov var att få en uppfattning om hur mycket produkt som bildats under reaktionen. Tillsatsen av de negativa kontrollerna till sina respektive brunnar var 10 µL från PCR reaktionerna under båda rektionerna.

Figur 11. Visar PCR produkternas vandring genom gelen där brunnarna 1 och 2 innehåller 189 bp produkten av mängd 3 µL respektive 1 µL prov. Brunnarna 3 – 5 i ordning innehåller 3: 172 bp produkt (3 µL), 4: GeneRuler low range DNA ladder och 5: 172 bp produkt (1µL). Brunn 6 och 7 innehåller negativa kontroller.

44

Figur 12. Verifiering av produkterna ifrån PCR reaktion 2 likadant som ovan.

Rening av PCR produkterna Proverna från PCR reaktionen renades totalt två gånger, en gång direkt efter PCR reaktionen och ytterligare en gång efter att restriktionsenzymssätena i ändarna av fragmenten klyvts. Det gav resultaten 88 ng/µL för 189 bp fragmentet och 101 ng/µL för 172 bp fragmentet efter första reningen och 21 ng/µL för 189 bp fragmentet och 24 ng/µL för 172 bp fragmentet efter den andra. Elueringsvolymerna från reningsstegen var 50 µL. Renheten var 1,9 i båda fallen.

45

Transformering Figur 13 och 14 visar transformerade XL1-BLUE bakterier med 189 bp respektive 172 bp fragment som strukits ut och vuxit på ampicillin innehållande LB plattor t.o.m. dagen efter transformeringen. Cellerna ströks ut på enskilda plattor betecknade 200 L, 100 L och 40 L respektive 200 K, 100 K och 40 K, där (L) står för bakterier transformerade med 189 bp fragmentet och (K) för de med 172 bp fragmentet. Talen betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på plattorna.

Figur 13. LB + ampicillin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS4-LacZ innehållande 189 bp fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.

Figur 14. LB + ampicillin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS4-LacZ innehållande 172 bp fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.

46

Verifiering Sekvenseringsresultatet av de inligerade fragmenten från den möjliga promotorn gav de tänkta 172 bp och 189 bp varianterna med undantaget att det fanns en nukleotid i båda fragmenten som var skild ifrån den ursprungliga sekvensen, dvs en mutation. De var i båda fallen placerade inom ISIde1 elementet men skilda ifrån varandra. Plasmidsekvensen uppströms och nedströms fragmenten var identiskt med den ifrån databasen.

47

Celltillväxt XL1-BLUE För cellerna XL1-BLUE och RM 101 bestämdes tillväxtkurvorna under anaeroba förhållanden för att få information om hur fort bakterierna fördubblades. Figur 15 visar tillväxtkurvan för transformerade XL1-BLUE celler med bakgrundsplasmiden pBBR1MCS4-LacZ utan insert och figur 16 för celler med pBBR1-MCS4-LacZ innehållande 189 bp fragmentet. Här visar figurerna att närvaron utav 189 bp fragmentet inte påverkar tillväxthastigheten.

OD600

Anaerob tillväxtkurva för XL1-BLUE 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

Bakgrundsplasmid utan insert

0

50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tid [min]

Figur 15. Visar tillväxten som funktion av tiden för anaerobt odlade XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1MCS4-LacZ.

Anaerob tillväxtkurva XL-1 BLUE 189 bp fragment 0,5

OD600

0,4 0,3

189 bp insert

0,2 0,1 0 0

50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tid [min]

Figur 16. Visar tillväxten som funktion av tiden för anaerobt odlade XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1MCS4-LacZ med 189 bp fragmentet.Celltillväxt

48

-galaktosidas assay Figur 17 visar -galaktosidas uttrycket i XL1-BLUE celler med 189bp och 172 bp fragmenten under aeroba och anaeroba förhållanden. Mätningarna gjordes för att ta reda på hur stort uttrycket var i cellerna och om en anaerob induktion kunde observeras i celler med någon av fragmenten. I mätningarna har uttrycket förmedlat av bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ, subtraherats bort för att ge det riktiga uttrycket. Figur 18 beskriver en jämförelse mellan uttrycket i celler med bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ mot likadana celler med inligerat 172 bp aerobt och anaerobt. Det gjordes för att ta reda på hur stort -galaktosidas uttryckt bakgrundsplasmiden bidrog med, om det var någon skillnad mellan det och uttrycket för 172 bp fragmentet och om det fanns en anaerob induktion. De uppmätta resultaten i figur 18 och 19 sammanfattas i tabell IV och är bestämda med 95 % konfidensintervall. Tabell IV: Visar de numeriska värdena av b-galaktosidas aktiviteten med 95 % konfidensintervall för mätningarna i figurerna 17 och 18. I kolumnen som visar mätvärdena för figur 17 har uttrycket ifrån bakgrundsplasmiden har avlägsnats.

Modell

Aktivitet [Miller units] figur 17

pBBR1-MCS4-LacZ med 189 bp fragment

Aerobt: 78,9 +/- 9,1 Anaerobt: 258,7 +/- 23,3

pBBR1-MCS4-LacZ med 172 bp fragment

Aerobt: 0,27 +/- 8,9 Aerobt: 24,5 +/- 8,9 Anaerobt: -1,57 +/- 13,6 Anaerobt: 47,7 +/- 13,6

pBBR1-MCS4-LacZ

Aktivitet [Miller units] figur 18

Aerobt: 24,2 +/- 7,6 Anaerobt: 49,3 +/- 6,9

49

Resultatet visar att 189 bp fragmentet, är – 10 elementet är bevarat, ger upphov till ett basaluttryck under aeroba förhållanden och induceras under anaeroba förhållanden. Celler med 172 bp fragmentet där – 10 elementet avlägsnats visar inget uttryck.

Beta – Galaktosidas [Miller Units]

Beta - galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler med 189 bp och 172 bp fragmenten under aeroba och anaeroba förhållanden 300 250

Aerobt (189 bp fragment)

200

Anaerobt (189 bp fragment)

150

Aerobt (172 bp fragment)

100

Anaerobt (172 bp fragment)

50 0 -50

Figur 17. Visar galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ med 189 bp fragmentet mot celler med 172 bp fragmentet efter tillväxt under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 22 st för 189 bp aerobt, 12 st för 189 bp anaerobt, 24 st för 172 bp aerobt och 18 st för 172 bp anaerobt.

50

Här visar figuren att det statistiskt sätt inte är någon skillnad mellan uttrycket från bakgrundsplasmiden mot 172 bp fragmentet som saknar det eventuella – 10 elementet. Men att uttryck induceras under anaerob förhållanden.

Beta-Galaktosidas [Miller Units]

Beta - galaktosidas aktivitet i XL1-BLUE celler med bakgrundsplasmiden mot 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden 80 70 60 50 40 30 20 10

Aerobt (172 bp fragment) Anaerobt Bakgrundsplasmid Aerobt Bakgrundsplasmid Anaerobt (172 bp fragment)

0

Figur 18. Visar galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler innehållande bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ utan fragment mot celler med 172 bp fragmentet efter tillväxt under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 26 st för bakgrundsplasmiden aerobt och 17 st anaerobt, 24 st för 172 bp aerobt och 18 st anaerobt.

51

Resultat: Del II Del II hade som syfte att ta reda om en gen i I. dechloratans som misstänks koda för ett protein tillhörande FNR familjen gör det. Genom att kotransformera E.coli celler som själva saknar ett eget FNR med I. dechloratans möjliga FNR-gen och mina fragment kan man under aerob och anaerob uppodling av cellerna följt av b-galaktosidas mätningar observera om cellerna induceras under anaeroba förhållanden. Därmed kan man avgöra om den möjliga FNR-genen kodar för ett funktionellt FNR-protein som tillåter anaerob respiration.

Plasmidpreparation Plasmidpreparationen av pBBR1-MCS2-LacZ gjordes i två omgångar där första omgången gav 13,5 µg och andra omgången gav 15,2 µg plasmid. Elueringsvolymen var 100 µL och kvantifieringen gav resultatet i tabell IV. Renheten som bestämdes definieras som kvoten mellan absorbansvärden vid 260 och 280 nm. Tabell V: Visar resultatet av absorbansmätning vid 260 och 280 nm för renhet och koncentration efter preparation av plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ.

Elueringsvolym [µL] DNA

Koncentration [ng/µL]

Renhet [-]

100

135 ng/µL

1,9

100

152 ng/µL

1,9

52

Restriktionsklyvning Innan plasmiden pBBR1MCS2-LacZ klövs med både EcoRI och SalI samtidigt inleddes med en testklyvning med varje enzym enskilt för att säkerställa att båda enzymerna var kapabla till att klyva den. Därefter klövs totalt 6 µg plasmid med båda enzymerna för att sedan användas i ligeringssteget. I figur 19 visas testklyvningen med EcoRI och SalI av plasmiden pBBR1MCS2-LacZ utkört på en 0,8 % TAE x 1 gel som verifierar att de klyver plasmiden. Där brunn (EcoRI) till vänster representerar bandet som innehåller plasmiden kluven med EcoRI, brunn (SalI): plasmid kluven med SalI, brunn (OK): okluven plasmid och brunn (Stege): referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och bandet under 5077 bp. Figur 20 visar klyvningen av 6 µg plasmid pBBR1-MCS2-LacZ med enzymerna EcoRI och SalI samtidigt utkörd på en 0,8 % TAE x 1 gel. Tillsammans har enzymerna klyvt bort ett 27 bp långt fragment som senare i ligeringsteget ska ersättas av 189 bp och 172 bp fragmenten som också klyvts med samma restriktionsenzymer. De tre brunnarna till vänster markerade (KP) visar tre vandrande band som innehåller 2 µg var kluven plasmid med både EcoRI och SalI, brunn (OK) näst intill är okluven plasmid och bredvid den (Stege) referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och bandet under 5077 bp. Här syns direkt att båda banden som representerar kluven plasmid med EcoRI och SalI ligger skilt från bandet som representerar den okluvna plasmiden. DNA kan anta olika former som medför band på olika platser i gelen beroende på varje forms rörelsemotstånd i gelen. Den okluvna plasmiden tar i den här, mer relaxerade formen upp en större yta än den kluvna linjära plasmiden och rör sig därför långsammare genom gelen. Bandet för den kluvna plasmiden hamnar därför under bandet för den. Den kluvna plasmidens storlek är 8234 bp som ligger mitt emellan stegens 11501 bp och 5077 bp som den linjära plasmid bör göra.

Figur 19. Visar gelen med fyra prover från vänster till höger där plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ är kluven med EcoRI i första brunnen (EcoRI) och i brunnen (SalI) intill kluven med SalI. Den tredje brunnen (OK) innehar okluven plasmid och den fjärde brunnen (Stege) Lambda DNA/PstI Marker, 24.

53

Figur 20. Visar gelen där de tre första brunnarna från vänster innehåller 2 µg var kluven pBBR1-MCS2-LacZ med enzymerna EcoRI och SalI. Brunnen (OK) näst intill har okluven plasmid och bredvid den, brunnen (Stege) finns det en Lambda DNA/PstI Marker, 24.

Rening av kluven plasmid Reningen av den kluvna plasmiden gav ett totalt utbyte på 18 %, ca 1 µg kluven plasmid DNA av de 6 µg som separerades ut på gelen. Elueringsvolymen var 50 µL och gav koncentrationen 22 ng/µL med renheten 1,9-2.

54

PCR PCR reaktionerna gjordes med genomiskt I. dechloratans DNA som templat och med uppströms primer och nedströms primer_189 för att konstruera och amplifiera 189 bp fragmentet och med uppströms primer och nedströms primer_172 för att konstruera och amplifiera 172 bp fragmentet. Resultatet separerades efteråt ut på en 3 % TBE x 1 agaros gel för verifiering och visas i figur 21. Fragmenten testades tillsammans med en referensstege GeneRuler low range DNA ladder (Thermo Scientific). Stegens 150 bp och 200 bp är markerade på bilden. Två negativa kontroller gjordes med alla komponenter utan templat DNA. En kontroll innehöll nedströms primer_172 men ingen nedströms primer_189 och den andra kontrollen innehöll tvärtom. Kontrollerna visade sig vara kontaminerade eftersom att produkter bildats i brunnarna 10 och 11. Jag försökte ta reda på vilken eller vilka av komponenterna som var kontaminerade genom att byta ut de olika komponenterna mot nytt av ur en annan förpackning. Alla komponenter hann jag inte byta p.g.a. att det tog för lång tid samtidigt som risken att fel produkt hade bildats i reaktionen var mycket liten. När det var dags att tillsätta produkt ifrån PCR reaktionen till brunnarna på gelen i figur 21 inför verifieringen gjordes det genom att först lösa 2 µL av provet i 8 µL sterilt vatten. Det gjordes för att få en rimlig volym att tillsätta eftersom brunnarna är ganska djupa och för att späda ut provet p.g.a. att resultatet ifrån de två tidigare PCR reaktionerna (Figur 11 och 12) visat detta är en lämplig mängd som syns bra på gelen.

Figur 21. Visar PCR produkternas vandring genom gelen. Brunnarna 1-4: innehåller 189 bp fragment, brunn 5: GeneRuler low range DNA ladder, brunnarna 6-9 har 172 bp fragmentet och 10-11 är kontaminerade blankprover.

PCR Rening Proverna renades totalt två gånger, en gång direkt efter PCR reaktionen och ytterligare en gång efter restriktionsenzymssätena i ändarna av fragmenten klyvts. Det gav resultaten 36 ng/µL för 189 bp fragmentet och 29 ng/µL för 172 bp fragmentet efter reningen och 19 ng/µL för 189 bp fragmentet och 14 ng/µL för 172 bp fragmentet efter den andra reningen. Elueringsvolymerna var 50 µL. Renheten blev 1,9 -2 respektive 1,9. 55

Transformering II Figur 22 och 23 visar transformerade XL1-BLUE bakterier med 189 bp respektive 172 bp fragment som strukits ut och vuxit på kanamycin innehållande LB plattor t.o.m. dagen efter transformeringen. Cellerna ströks ut på enskilda plattor betecknade 200 L, 100 L och 40 L respektive 200 K, 100 K och 40 K, där står för (L) bakterier transformerade med 189 bp fragmentet och (K) bakterier med 172 bp fragmentet. Talen betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på plattorna.

Figur 22. LB + kanamycin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 189 bp fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.

Figur 23. LB + 3anamycin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 172 bp fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.

56

Verifiering II Sekvenseringsresultatet av de inligerade fragmenten från den möjliga promotorn gav de tänkta 172 bp och 189 bp varianterna med undantaget att det fanns två insertionsmutationer i 189 bp fragmentet. Båda var placerade inom ISIde1 elementet (Figur 24). Plasmidsekvensen uppströms och nedströms 189 bp insertet var identiskt med den ifrån databasen. Gällande plasmiden med 172 bp insertet kunde sekvenseringsföretaget bara leverera resultatet för plasmidsekvensen nedströms insertet. Den också var identisk till databasens.

Sekvens uppströms cld i Ideonella 5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGT TGAGAAGTCAATTTCCACTGGAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAG

AACACATAAAAAAGGAGAAAT

TTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCA

GCGAAGATTCGTGCA

'3

Sekvenseringsresultat 189 bp fragment TAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCGAGGTCGGCGTCAAGTG TAGAACTAGTGGATCCCCCGGG TCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGTTGAGAAGTCAATTTCCACTG GAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACT

AACACA

TG GAAGATTCGTGCAGT

TAAATCA TAAAAAAGGAGAAA C CGACCTCGAGGGGGGGCCCAGGAGGACGTCCATG

Figur 24. Visar jämförelsen mellan den möjliga promotor sekvensen uppströms cld och 189 bp framgentet som ligerats in i plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ. Sekvens med grå bakgrund är bindningsekvens för uppströms primer och nedströms primer_189. I fet stil markeras den möjliga promotor regionen uppströms cld. Den resterande omodifierade sekvensen t.o.m 5'-änden tillhör ISIde1 elementet. Vit sekvens med svart ytterlinje är restriktionssekvenser och kursiverad sekvens med sträck över sig är plasmiden pBBR1MCS2-LacZ. Insertionsmutationerna är markerade som vit sekvens inom svart bakgrund. Extended -10 element och -35 element är markerade med större teckenstorlek. FNR-boxen är understruken.

57

Transformering III Den tredje transformeringen var en kotransformering som gjordes av redan transformerade RM 101 celler. Cellerna kom från två olika kulturer. Den ena kulturen var sedan tidigare transformerad med plasmiden pBR322 och den andra med pBR322_IdFNR. Där IdFNR betonar att plasmiden innehöll ett insert som kodar för en gen i I. dechloratans som möjligen tillhör en FNR familj. Jag behövde transformera dessa celler med mitt 189 bp och 172 bp fragment för att senare kunna utföra bgalaktosidas mätningar som gav en indiktation på om det möjliga FNR proteinet i I. dechloratans hade förmåga att förmedla en anaerob induktion genom att binda in till den möjliga promotorn. Det första bildparet (Figur 25) visar RM 101 celler innehållande plasmiden pBR322_IdFNR och transformerade med plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ innehållande mina 189 bp och 172 bp fragment. Cellerna har strukits ut och vuxit på ampicillin och kanamycin innehållande LB plattor t.o.m. dagen efter transformeringen. Det andra bildparet (Figur 26) visar RM 101 celler innehållande plasmiden pBR322 utan FNR-genen transformerade med plasmiden pBBR1-MCS2LacZ innehållande mina 189 bp och 172 bp fragment och vuxit under samma förhållanden som cellerna i figur 25. På tredje bildparet (Figur 27) visas två kontroller, på LB plattan till vänster med ampicillin har en liten del utav otransformerade RM 101 bara innehållande pBR322 strukits ut och växt på. På plattan med kanamycin till höger har den resterande mängden strukits ut på. Detta gjordes för att verifiera att cellerna endast innehöll plasmiden pBR322 med ampicillin resistens och inget annat. Det visade sig att cellerna växte på ampicillin plattan men inte på kanamycin plattan som indikerar att plasmiden pBR322 som innehåller ampicillin resistans finns i cellerna. Hade cellerna växt på kanamycin plattan hade någon form av kanamycin resistens utvecklats eller att de på något sätt tagit upp en plasmid med det. Det hade inneburit att transformeringen inte kunnat göras eftersom en selektivitetskontroll då hade saknats. För övrigt gav transformeringsförsöken gav en stor andel transformanter på ytterligare plattor än de som redovisas nedan.

Figur 25. LB + ampicillin + kanamycin plattor med RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322_IdFNR transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande fragment. IdFNR betecknar att I. dechloratans FNR-gen är inligerad i plasmiden. Talet 30 står för antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem. Bokstaven L betecknar att cellerna transformerats med 189 bp fragmentet och K med 172 bp fragmentet.

58

Figur 26. LB + ampicillin + kanamycin plattor med RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322 transformerade med pBBR1MCS2-LacZ innehållande fragment. Talet 25 står för antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem. Bokstaven L betecknar att cellerna transformerats med 189 bp fragmentet och K med 172 bp fragmentet.

59

Figur 27. Till vänster en LB + ampicillin platta med otransformerade RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322 och till höger en LB + kanamycin platta med likadana celler. Med beteckningarna (L) och (K) i menas att cellerna tillhörde den mängd var tänkta till att transformeras med 189 bp fragmentet respektive 172 bp fragmentet.

60

galaktosidas assay II Figur 28 visar -galaktosidas uttrycket i RM 101 celler transformerade med 189 bp och 172 bp fragmenten. Mätningarna är gjorda på celler transformerade med olika innehåll. Alla celler innehåller två plasmider som bas. Dessa plasmider är pBR322 och pBBR1-MCS2-LacZ. I en del av cellerna innehåller en utav plasmiderna eller båda två ett insert. Detta insert kan i plasmiden pBR322 bara vara IdFNR som betonar att genen som kodar för I. dechloratans FNR har ligerats in. I plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ kan det finnas ett utav mina insert, 189 bp eller 172 bp fragmentet. Vissa av cellerna innehåller bara dessa plasmider utan insert. Beteckningarna som införts här är följande ”189 bp/172 bp fragment med FNR” för celler innehållande 189 bp eller 172 bp fragmentet inligerat i plasmiden pBBR1MCS2-LacZ samtidigt som FNR-genen är inligerad i plasmiden pBR322. Är beteckningen ”189 bp/172 bp fragment utan FNR” är FNR-genen inte inligerad i pBR322 men fragmenten finns i pBBR1MCS2-LacZ. Om fragmenten är frånvarande men FNR-genen inligerad heter beteckningen och ”bakgrundsplasmider med FNR” respektive bakgrundsplasmider utan FNR om både fragment och FNR är frånvarande. Dessa mätningar i figur 28 gjordes enbart aeroba förhållanden. I mätningen har det förmedlade uttrycket från bakgrundsplasmiderna med eller utan FNR insertet inte subtraherats ifrån någon av de andra uttrycksmätningarna i figuren. Mätningens syfte var få en uppfattning om FNR genens innebörd under aeroba förhållanden, om den har någon påverkan på uttrycket. Figur 29 visar -galaktosidas uttrycket i celler innehållande 189bp och 172 bp fragmenten inligerat i pBBR1MCS2-LacZ med FNR-genen inligerat i pBR322 under aeroba och anaeroba förhållanden. I mätningarna har uttrycket förmedlat från bakrundsplasmiderna med FNR subtraherats bort för att ge det riktiga uttrycket. Mätningarna gjordes för att ta reda på hur stort uttrycket var i cellerna, om det fanns en anaerob induktion och om i.s.f. för vilket eller vilka fragment. Figur 30 ställer uttrycket i celler med bakgrundsplasmiderna innehållande FNR-genen utan inligerade fragment mot celler med både FNR-genen och 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden. Det gjordes för att ta reda på hur stort -galaktosidas uttryckt bakgrundsplasmiderna med FNR bidrog med, om det var någon skillnad mellan det och uttrycket i celler som också innehöll 172 bp fragmentet och om det fanns en anaerob induktion. De uppmätta resultaten i figurerna 28, 29, 30 som sammanfattas i tabell VI och är bestämda med 95 % konfidensintervall.

61

Tabell VI: Visar de numeriska värdena av b-galaktosidas aktiviteten med 95 % konfidensintervall för mätningarna i figurerna 28, 29 och 30. Den grå kolumnen representerar mätningarna i figur 28, där det förmedlade uttrycket ifrån bakgrundsplasmiderna inte subtraherats bort. Värden i kolumnen som representerar figur 29, har uttrycket ifrån bakgrundsplasmiden har avlägsnats.

Modell

Aktivitet [Miller units] Aktivitet [Miller units] Aktivitet [Miller units] figur 28 figur 29 figur 30

pBBR1MCS2-LacZ 189 Aerobt: 31,6 +/- 3,1 bp insert, pBR322 pBBR1MCS2-LacZ 189 Aerobt: 39,0 +/- 2,2 bp insert, pBR322_IdFNR

Aerobt: 30,7 +/- 2,2 Anaerobt: 86,3 +/- 11,6

pBBR1MCS2-LacZ 172 Aerobt: 10,9 +/- 1,1 bp insert, pBR322 pBBR1MCS2-LacZ 172 Aerobt: 11,3 +/- 1,1 bp insert, pBR322_IdFNR pBBR1MCS2-LacZ, pBR322

Aerobt: 9,2 +/- 1,3

pBBR1MCS2-LacZ, pBR322_IdFNR

Aerobt: 8,3 +/- 0,9

Aerobt: 3 +/- 1,1 Anaerobt: 5,6 +/- 2,3

Aerobt: 11,3 +/- 1,1 Anaerobt: 23,3 +/- 2,3

Aerobt: 8,3 +/- 0,9 Anaerobt: 17,7 +/- 2,7

62

Resultatet tyder på att på att det är liten skillnad mellan 189 bp fragmentet med och utan FNR. 172 bp fragmentet ligger lite högre än bakgrundsnivån men inte mycket.

Beta-galaktosidas [Miller units]

Beta - galaktosidas aktivitet i RM 101 celler med och utan FNR av 189 bp och 172 bp fragmenten mot bakgrundsplasmiderna under aeroba förhållanden 45 40

189 bp fragment utan FNR

35

189 bp fragment med FNR

30 25

172 bp fragment utan FNR

20

172 bp fragment med FNR

15

Bakgrundsplasmiderna utan FNR

10 5

Bakgrundsplasmiderna med FNR

0

Figur 28. Visar galaktosidas aktiviteten i RM 101 celler med och utan I. dechloratans FNR-gen innehållande fragmenten 189 bp och 172 bp mot uttryck i likadana celler med bakgrundsplasmiderna utan fragment. Bakgrundsutrycked från plasmiderna utan insert har inte subtraherats bort från uttryck förmedlade av 189 bp eller 172 bp fragmenten. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena för aktiviteten under aeroba förhållanden var 3 st.

63

Celler med 189 bp fragmentet där – 10 elementet är bevarat har för måga att utgöra ett basaluttryck under aeroba förhållanden och induceras under anaeroba förhållanden. Uttrycken i celler med 172 bp fragmentet där – 10 elementet avlägsnats har nästan avskaffats helt.

Beta - galaktosidas [Miller Units]

Beta - galaktosidas aktivitet i RM 101 med FNR av 189 bp och 172 bp fragmenten aerobt och anaerobt 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Aerob 189 bp fragment med FNR utan bakgrund Anaerob 189 bp fragment med FNR utan bakgrund Aerob 172 bp fragment med FNR utan bakgrund Anaerob 172 bp fragment med FNR utan bakgrund

Figur 29: Visar Galaktosidas aktiviteten i RM 101 celler med I. dechloratans FNR innehållande fragmenten 189 bp och 172 bp under aeroba och anaeroba förhållanden. Det bidragande uttrycket förmedlat i celler med bakgrundsplasmiderna innehållande FNR har subtraherats bort ifrån alla mätningar. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 3 för alla aeroba prov och 4 st för de anaeroba.

64

Det här resultatet visar att det statistiskt sätt är en skillnad i uttryck från bakgrundsplasmiderna mot 172 bp fragmentet, både aerobt och anaerobt. Här syns också en tydlig anaerob induktion i båda mätningarna.

Beta - galaktosidas [Miller Units]

Beta - galaktosidas aktivitet i celler med FNR: Bakgrundsplasmider mot 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden 35 30 25 20 15 10 5

Aerob bakgrundsplasmider med FNR Anaerob bakgrundsplasmider med FNR Aerob 172 bp fragment med FNR Anaerob 172 bp fragment med FNR

0

Figur 30. Visar galaktosidas aktivitet i RM 101 celler med I. dechloratans FNR transformerade med bakrundsplasmiderna utan fragment mot likadana celler med 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 3 för alla aeroba prov och 4 st för de anaeroba.

65

Celltillväxt RM 101 Figur 31 visar RM 101 celler med och utan tillgång till I. dechloratans FNR-gen. Cellerna är transformerade med pBR322 och pBBR1MCS2-LacZ som inte har någon FNR-gen respektive pBR322_IdFNR och pBBR1MCS2-LacZ där IdFNR betecknar att plasmiden bär på FNR-genen. En jämförelse mellan kurvorna visar att närvarandet av I. dechloratans FNR påverkar tillväxthastigheten.

Anaerob tillväxt kurva för RM 101 0,5

OD 600

0,4

Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider utan FNR

0,3 0,2 0,1 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Tid [min]

Figur 31. Visar tillväxten som funktion av tiden för två typer av RM 101 celler odlade under anaeroba förhållanden. Celler transformerade med plasmiderna pBBR1-MCS2-LacZ och pBR322 mot celler transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ och pBR322_IdFNR. IdFNR innebär att genen som kodar för I. dechloratans FNR-protein är inligerat i plasmiden. Antal försök var ett och OD mätningen utfördes en vid respektive tid.

66

Diskussion Val av plasmider Två olika plasmider användes under del I och II av arbetet för att testa hypotsen om den FNRberoende promotorn under och om genen i I. dechloratans kodade för ett möjligt FNR-protein. Plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ användes under del I som vektor för mina insert. Det var lämpligt eftersom -galaktosidas mätningarna som gjordes skulle kunna relateras till tidigare mätningar på andra fragment av den möjliga promotorn där samma vektor använts. Troligtvis hade användandet av en annan plasmid, föredragande pBBR1-MCS2-LacZ inte spelat någon roll men för jämförbarhetens skull valdes experimenten att utföras med samma vektor som tidigare. Av samma anledning bytte jag bytte till plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ under del II. Den hade också använts i tidigare arbeten under mätningar med RM 101 på andra konstruktioner av promotorn. Det hade annars varit lämpligare att under både del I och II arbetat med plasmiden pBBR1-MCS2LacZ eftersom den uppfyllde alla kriterier för båda delarna av arbetet. Med det menas att eftersom den hade kanamycin resistens, och bakterierna i den första delen av arbetet inte från början hade någon egen antibiotikaresistens spelade det ingen roll vilken resistens plasmiden innehöll. Alla bakterier som senare transformerades med plasmiden kunde växa på kanamycininnehållande plattor medans alla som inte tagit upp plasmiden hade dött. I del II däremot kotranformerades bakteriestammen RM 101 som då redan bar på plasmiden pBR322 innehållande ampicillin resistens. Dessa bakterier besatt förmågan att växa på ampicillininnhållande plattor från början. För att det skulle vara möjligt att avgöra om bakterierna hade tagit upp den nya plasmiden under kotransformeringen måste den ha haft en annan antibiotika resistens än ampicillin. Då skulle en kontroll utav upptaget kunna ske genom låta kotransformanterna växa i en miljö med ampicillin och den korrespondernade antibiotikan som den nya plasmiden innehåller resistens mot. Det gjorde plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ lämplig eftersom den innehåller kanamycin resistens. Därmed kunde man avgöra om kotransformanterna som tidigare bara kunde växa i en ampicillininnehållande miljö nu kunde växa i en ampicillin och kanamycininnehållande miljö. Hade istället bakterierna kotransformerats med pBBR1-MCS4-LacZ som också besitter ampicillin resistens hade ingen selektivitetsgaranti för att båda plasmiderna fanns i bakterierna kunnat ges eftersom det räcker med en utav dem för att överleva i en ampicillin innehållande miljö. Därför var jag tvungen att byta till pBBR1-MCS2-LacZ under del II.

67

Val av primrar för test om hypotes Valet av primrar berodde på en del olika faktorer, framförallt nedströms primrarna. För uppströms primern fanns det egentligen inget direkt att ta hänsyn till när den valdes. Eftersom uppströms primern fanns tillgänglig sedan tidigare arbeten och var komplementär till en DNA sekvens tillräckligt långt uppströmms cld för att bevara den möjliga promotorregionen som undersöktes i det här arbetet behövde inget mer göras med den. Den fanns dock i två varianter som skiljde sig i att den ena hade ett restriktionssäte för PstI och den andra för EcoRI. Båda sätena fans plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ och ett utav dem, EcoRI sätet, fanns i plasmiden PBR1MCS-2LAZ vilket gjorde dem lämpliga för arbetet. Nedströms primrarna var mer kritiska i förhållande till test av hypotesen eftersom de bestämde den undre gränsen för hur långa fragmenten skulle bli. För att ta reda på om sekvensen uppströms cld innehöll en FNR-beroende promotor och för att undersöka om promotorn var klass II konstruerades nedströms primer_189 som gav 189 bp fragmentet vars sista nukleotid nedströms var det förutspådda TSS för en klass II promotor. Hade fragmentet varit 20 bp längre hade den innehållit ett TSS för en FNR-beroende promotor av klass I också och man hade inte direkt kunnat avgöra om den FNR promotorn var en klass I eller II promotor. Därför konstruerades 189 bp fragmentet så kort som möjligt för att endast utgöra möjligheten för en klass II promotor att fungera. Den möjliga FNR oberoende promotorn låg en bit uppströms den FNR-beroende promotorn och täcktes därför också utav dessa primrar. Nedströms primer_172 designades med syftet att konstruera ett 172 bp fragment utan det möjliga -10 elementet tillhörande den möjliga FNR-beroende promotorn. Eftersom avlägsnadet av ett -10 elementet medför att en promotor förlorar sin identitet skulle detta kunna avgöra om 172 bp sekvensen fortfarande gav fullt uttryck, bara aerobt uttryck eller inget uttryck. Man skulle då kunna ta reda på huruvida systemet regleras utav en eller flera promotorer och därmed om sekvensen innehöll en FNR-beroende klass II promotor. Restriktionssätena som valdes till nedströms primrarna var för restriktionsenzymet SalI. Det framförallt viktigt vid inligering av det 172 bp fragmentet att det inte fanns ett möjligt -10 element strax nedströms detta restriktionssäte i plasmiderna. Det skulle innebära att när 172 bp fragmentet ligerades in skulle detta element ersätta det som avlägsnats i fragmentet och därmed skulle det troligtvis uppföra sig som om hela promotorn var bevarad vilket skulle förstöra syftet med hela arbetet. Ett sådant område fanns inte i någon av plasmiderna efter SalI sätet och därför ansågs det vara ett bra val. När längden av primrarna bestämdes var det viktigt att den skulle innebära en inbindning med hög specificitet till önskad sekvens. Vanligtvis blir detta någonstans mellan 18-25 nt men bestäms generellt med formeln 4x där x längden på primern och ger efter hur många nt den teoretiska kombinationen, dvs primer sekvensen uppkommer en gång. Det får man sedan förhålla till längden av DNA:t i fråga och därifrån bestämma vad som är rimligt. I mitt fall gjordes ingen direkt beräkning eftersom bakterie DNA är relativt kort jämfört med andra högre organismer och att de tidigare experiment inom den här studien har fungerat bra med liknande primrar.

68

Fragmenten för test om hypotes Transformeringarna gick i allmänhet bra, det som man kan nämna är att transformeringen utav E.coli XL1-BLUE med plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 189 bp och 172 bp fragmenten hade egentligen inte behövts göras utan skulle kunnat transformerats in i E.coli RM 101 direkt. Anledningen till att jag inte gjorde det var att jag bara hade en begränsad uppsättning utav plasmiden med inligerade fragment. RM 101 är inte superkompetenta celler och därmed svårare att transformera, hade den transformeringen misslyckats hade jag kunnat förlora allt mitt material och få börja om ifrån början med att klyva plasmid, tillverka insert ... igen. Därför transformerade jag först superkompetenta XL1-BLUE vilket också gav mig fördelen att jag efteråt hade ett oändligt förråd av växande celler innehållande mina fragment i. Verifieringen gav ett korrekt resultat för både 189 bp och 172 bp fragmenten i plasmiden pBBR1MCS4-LacZ med undantaget att det fanns en punktmutation i båda resultaten. Det såg nästan likadant ut för fragmenten i plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ där 189 bp hade fått två insertionsmutationer. Både punktmutationerna och insertionsmutationerna förekom inom ett område strax uppströms promotorregionen som är ett inertionselement. Elementet kallas ISIde1 och separerar generna clrA-D och cld (Figur 3 eller 5). Eftersom området inte tillhör promotor regionen anses det inte ha någon effekt på promotoraktiviteten.

69

Den FNR-beroende promotorn Den teoretiska analysen av sekvensen uppströms cld gav upphov till ett förslag om vart den FNRberoende promotorn skulle kunna finnas, med -10, -35 elementen och TSS (Figur 5, 6 och 7). Både lokaliseringen av elementen i förhållande till varandra, till TSS, till FNR-sätet och matchandet till konsensussekvenserna för s70 i E.coli gör detta till en teoretiskt sätt bättre promotor än den som tidigare spekulerats ge upphov till basaluttrycket (Figur 3 och 5). Avstånden mellan – 10 elementet och TSS i den möjliga FNR-beroende promotorn är 7 nt som är optimalt, till skillnad från den möjliga promotorn för basaluttrycket där avståndet är 15 nt. Det är ett långt avstånd mellan en -10 region och ett TSS, 2-11 nt är vanligt [7]. Avståndet mellan -10 och -35 regionen är 17 nt i båda de möjliga promotorerna som är optimalt och mest förekommande bland promotorer [12, 24]. Dock finns det fler matchningar till konsensussekvenserna bland -10 och -35 elementen i den möjliga FNR-beroende promotorn än vad som finns i den möjliga FNR oberoende promotorn (Figur 3 och 5). Den FNR-beroende promotorn har också TG determinanten som utgör ett extended – 10 område som ytterligare kan stärka promotoraktiviteten. Den besitter också två av de viktigaste nukleotiderna inom – 10 elementet, -7T och -11A, varav den FNR oberoende promotorn bara har -7T. Eftersom den möjliga FNR-beroende promotorn passar bra in på beskrivningen för vad som är karakteristiskt för en klass II promotor styrker det hypotesen om att det finns en sådan promotor i sekvensen uppströms cld. Den stämmer också teoretiskt sätt väl överens med strukturen av väl fungerande promotorer i E. coli. Hur promotorstrukturen ser ut i I. dechloratans finns det ingen direkt kunskap om just nu. Men eftersom 189 bp sekvensen gav upphov till uttryck i E.coli betyder det att den innehåller en promotor region och att den fungerar i E.coli som medför att det kan finnas en likhet mellan promotor regioner i dessa två arter. Dessutom mättes den anaeeroba induktionen i E.coli upp till 3.3 ggr basaluttrycket, nära ungefär 4 ggr basaluttrycket som tidigare observerats i I. dechloratans [4] vilket indikerar att likheten troligtvis är stor. Under assayen på XL1-BLUE gjordes två mätningar som visas i figurerna 17 och 18. Den första mätningen i figur 17 visar tydligt att celler med 189 bp fragmentet ger ett uttryck under aeroba förhållanden och induceras under anaeroba förhållanden. Resultatet för 172 bp fragmentet visar att uttrycket är helt avskaffat. I figur 18 ställdes 172 bp fragmentet mot bakgrundsplasmiden utan fragment under aeroba och anaeroba förhållanden för att ta reda på om det var någon skillnad i uttryck mellan dem. Det gjordes för att ta reda på om den del, dvs – 10 elementet som fanns med i 189 bp fragmentet men som avlägsnats i 172 bp har betydelse för den möjliga FNR-beroende promotorns funktion. Resultatet visar att det inte finns någon skillnad i uttryck mellan bakgrundsplasmiden och 172 bp fragmentet, varken under aeroba eller anaeroba förhållanden. Tillsammans med resultatet i figur 17 indikerar det att -10 elementet har betydelse för uttrycket, både aerobt och anaerobt, och styrker hypotesen om att det finns en möjlig FNR-beroende promotor och att den är av klass II, men samtidigt att den också används för basaluttrycket utav Cld. Tidigare forskning visar att klass II FNR-beroende promotorer är kapabla till att utgöra ett basaluttryck under aeroba förhållanden då FNR är inaktivt utav den gen som också induceras utav FNR under anaeroba förhållanden då det är aktivt [32]. Detta tillsammans med resultaten från det här arbetet talar emot hypotesen om att det skulle finnas två promotorer, en FNR oberoende, aktiv under aeroba förhållanden och en FNR-beroende som tog över under anaeroba förhållanden. Den hypotesen kom först upp under ett tidigare arbete med ett 200 bp fragment av sekvensen uppströms cld där mutationer utav den möjliga FNR-boxen gjorts som resulterat i att uttrycket avskaffats helt, både under aeroba och anaeroba förhållanden [15]. Samtidigt som samma sekvens med bevarad FNR-box var kapabel till att utgöra ett basaluttryck i den FNR-negativa stammen RM 101 [15]. Detta gav en indikation på att FNR-boxen kanske överlappade med ett potentiellt -10 element som kanske korresponderade till det tidigare bestämda TSS, 85 nukleotider uppströms den första nukleotiden i translation initieringskodonet [21] (Figur 3). Att det finns flera promotorer inom en sekvens framför en gen är något som ibland förekommer. I sådana fall kan en utav promotorerna t. ex. vara beroende utav någon transkriptionsfaktor eller att 70

den identifieras utav en annan s-faktor. Väldigt ofta associeras sekvenser som innehåller många promotorer med gener som överförts horisontellt till och från olika arter [7]. Det hade istället styrkt hypotesen om att det hade funnits fler promotorer inom sekvensen uppströms cld eftersom det kloratmetaboliserande klustret anses ha tilldelats I. dechloratans via horisontell genöverföring [1] [4].

71

FNR´s roll i I. dechloratans Figur 29-30 visar att den möjliga FNR-genen kodar för ett protein som inducerar uttrycket från 189 bp sekvensen till 2.8 ggr basaluttrycket under anaeroba förhållanden, och att -10 elementet behövs fullt uttryck som ytterligare styrker att det endast finns en promotor för hela systemet. Figur 31 visar att den proteinet ifrån I. dechloratans kunde ta över E.coil's FNR's roll under anaerob respiration med NaNO3. Resultatet visar tydligt att cellerna med den möjliga FNR-genen överlever under anaeroba förhållanden medans de som saknar FNR dör. Detta visar att I. dechloratans FNR mycket möjligt kan ta över E.coli's FNR's roll under dessa förhållanden. Vilket är resonligt eftersom genen genen tidigare identifierats vara en FNR homolog ifrån E.coli [15]. Inom kloratklustret finns inte någon FNR-gen. Ändå behövs det ett FNR för uppreglering utav cld och överlevnad under anaeroba förhållanden. Den möjliga FNR-genen i I. dechloratans antas nu, med dessa resultat som grund, ta rollen som anaerob inducerare utav cld och potentiellt andra gener också som är involverade i anaerob metabolism.

72

Celltillväxt Resultatet i figur 15 och 16 visar att det inte är någon skillnad i tillväxt för XL1-BLUE celler med endast bakgrundsplasmiden mot celler med inligerat 189 bp under anaeroba förhållanden. Cellerna når en stationär fas vid OD 0.43 vilket är något som skiljer sig ifrån likadana aerobt odlade celler som når stationär fas vid OD 1.2. Någon aerob tillväxtkurva gjordes inte utav den anledningen att det redan fanns en för XL1-BLUE celler. Den kurvan tyckte jag stämde ganska bra överens med hur mina XL1-BLUE celler växte när jag odlade upp dem aerobt. Det fanns också en anaerob tillväxtkurva, men den stämde betydligt sämre överens mot resultaten jag observerade för cellernas tillväxt anaerobt. Därför gjorde jag en ny. Cellerna växte både snabbare och till ett större antal enligt den gamla anaeroba tillväxtkurvan emot vad jag observerade för mina celler. Detta tror jag beror på att cellerna som jag använde under arbetet, även fast de var av samma variant XL1-BLUE, och kom från samma leverantör, så var det ett oöppnat paket med helt nylevererade celler som jag använde. Det kan ha varit så att en förändring gjorts i de nya cellerna som skiljer dem ifrån de tidigare beställda celler. Ibland görs mindre förändringar i varor över tid som inte nämns för konsumenten.

73

Klyvning av plasmid Både klyvningen av plasmid pBBR1-MCS4-LacZ i del I och pBBR1-MCS2-LacZ i del II såg ut att ha fungerat bra. Tittar man på figurerna 10 och 20 ser man tydligt en skillnad i vandringslängd mellan kluven och okluven plasmid. Anledningen till att man ser två band för okluven plasmid i figur 20 beror på att cirkulärt DNA kan befinna sig i relaxerat eller tvinnad form. Dessa former rör sig olika fort i gelen beroende på att rörelsemotståndet är olika för varje form. Det viktiga är att den linjära plasmiden inte innehåller någon av formerna i det okluvna materialet. Därför indikerar figur 20 att klyvningen är fullständig när man ser att den kluvna plasmiden inte innehåller någon av formerna som den okluvna plasmiden gör. I figur 10 syns också att klyvningen är fullständig. Stegen som använts består av linjära DNA-fragment av olika längder och kan jämföras direkt med en kluven, linjär plasmid. Man ser i båda figurerna att den kluvna plasmiden ligger mitt emellan 11501 bp och 5077 bp fragmenten i stegen vilket inte här konstigt eftersom större fragment rör sig långsammare än korta. Plasmiderna pBBR1-MCS4-LacZ i figur 10 och pBBR1-MCS2-LacZ i figur 20 är av storleken 8040 bp respektive 8234 bp och bör därför vandra snabbare än 11501 bp men långsammare än 5077 bp i stegen, vilket de gör samtidigt som de alltid vandrat lika långt i kluven form. Anledningen till att mycket av plasmiden släpade efter i figur 20 beror troligtvis på att brunnarna var överladdade med med material.

PCR PCR-reaktionerna utfördes totalt tre gånger under del I och II. Två gånger i del I för att få gott om material och en gång i större mängd under del II eftersom jag bättre visste hur mycket jag behövde då. I figur 11 syns den första reaktionen en liten skillnad i vandringslängd mellan 189 bp och 172 bp fragmentet under brunn 1 och 3 kan observeras. Båda ligger mellan 150 bp och 200 bp banden i stegen samtidigt som 172 bp bandet ligger lite lägre än 189 bp fragmentet vilket är en indikation på att produkter av förväntad längd bildats och att primrarna bundit till de avsedda sekvenserna. I figur 12 syns inte detta lika tydligt, produkterna har vandrat ungefär lika långt. Men banden ligger mellan 150 bp och 200 bp i stegen vilket ger en liten indikation på att produkterna konstruerats som önskats. Ingen kontaminering av negativa kontroller syns, varken under brunn 6 och 7 i figur 11 eller under brunn 8 och 9 i figur 12. Den tredje PCR reaktionen som gjordes i del II och syns i figur 21 ger liknande resultat som tidigare. Alla band ligger mellan 150 bp och 200 bp banden på stegen. Banden under brunnarna 1-4 till vänster om stegen är 189 bp fragmentet och brunnarna 6-9 till höger om den är 172 bp fragmenten. Det är lite variation i vandringssträckan för banden som är ungefär samma för alla och ger därför inte ett övertygande resultat på att rätt produkter konstruerats. Däremot har det negativa kontrollerna kontaminerats där kontamineringen troligtvis kommer från antingen genomiskt Ideonella DNA eller från plasmiden pBBR1MCS-4-lacZ_cldprom. I det här fallet hade inte en kontaminering med genomiskt DNA från I. dechloratans eller plasmiden pBBR1MCS4-lacZ_cldprom inte någon betydelse eftersom syftet med PCR-körningen var att amplifiera sekvenser från just detta DNA.

74

Felsökning assayer Figur 18 och 30 visar också att det möjligen finns en anaerob induktion av både bakgrundsplasmiden och 172 bp fragmentet. Det fenomen är lite svårt att förklara direkt. En orsak kan vara att cellernas form ändras under anaeroba förhållanden som påverkar OD mätningen. Den mäter ljusspridningen som medförs när ljuset träffar cellernas yta och ger mått på celltätheten i ett prov. Därför spelar cellformen roll under denna mätning. Induktionen tror jag beror på att formen ändrat sig sådant att en lägre celltäthet mäts upp än vad som egentligen fanns i proven. galaktsidas mätningen ger därför ett intryck av en induktion som istället beror på en större celltäthet som medför att en större mängd substrat bildas beroende på att det nu finns fler celler och inte att uttryck har ökat i varje cell. Figur 30 visar till skillnad ifrån figur 18 att det finns en skillnad i uttryck mellan bakgrundsplasmiderna och 172 bp fragmentet. Det beror troligtvis på att resultatet endast baseras på tre och fyra mätningar medans resultaten i figur 18 baseras på ett 20:tal mätningar. Antalet mätningar kan nog också förklara varför induktionen för 189 bp fragmentet i RM 101 bestämdes till 2.8 ggr som är lite mindre än 3.3 i XL1-BLUE. Det kan också bero på två olika celler och FNR-protein.

75

Slutsats Resultaten visar tydligt att 189 bp fragmentet stödjer uttryck på basal och inducerad nivå under aeroba respektive anaeroba förhållanden. 172 bp fragmentet ger inte upphov till något uttryck vilket leder till slutsatsen att den sekvens som avlägsnats i 172 bp fragmentet troligen är ett -10 elementet och att en komplett promotor region finns i 189 bp fragmentet. Detta motbevisar hypotesen om att en ytterligare promotor uppströms den FNR-beroende promotorn skulle stå för ett basaluttryck och att den FNR-beroende endast skulle aktiveras för att anordna en uppreglering utav uttrycket. Att FNR uppreglerar uttrycket kan konstateras då ingen uppreglering observeras i den FNR-negativa stammen RM 101 men gör det i XL1-BLUE som har FNR. Möjligheten till en anaerob uppreglering inom 189 bp fragmentet i närvaro utav FNR hävdar att promotorn är FNR-beroende och är en klass II promotor. Den möjliga FNR-genen i I. dechloratans har visat sig koda för ett protein som kan inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Proteinet har också förmågan att ersätta E.coli's FNR proteins i roll under NaNO3 respiration vilket konstaterar att proteinet troligtvis är ett funktionellt FNR.

76

Tackord Tack till Maria Rova som har varit en utmärkt handledare med väglett mig genom det här arbetet. Thomas Nilsson tackar jag för upplägget av kursen Bioteknik: Praktisk nukleinsyra och proteinbiokemi som passade mig väldigt bra. Jag lärde mig väldigt mycket som jag fick användning för i det här arbetet. Tack Miriam Hellberg för alla tips och för allt materiel som jag fick innan du slutade, det hjälpte mig mycket på vägen.

77

Referenser 1.

Nilsson T, Rova M, Smedja Bäcklund A. Microbial metabolism of oxochlorates: a bioenergetic perspective. BBA-Bioenergetics 2013; 1827: 189–97

2.

M. Zimmermann and P.R. Trumbo. Iodine American Society for Nutrition. Adv. Nutr 2013; 4: 262–64,

3.

Impact of Chlorine Dioxide on Transmission, Treatment, and Distribution System Performance. Zamir Alam, Ron Hofmann, Lisa Lachuta, Ray Cantwell. American Water Works Association, 2005. sid 105.

4.

Hellberg Lindqvist M, Johansson N, Nilsson T, et al. Expression of chlorite dismutase and chlorate reductase in the presence of oxygen and/or chlorate as the terminal electron acceptor in I. dechloratans. Appl Environ Microb 2012; 78: 4380–5

5.

Samuel P. Kounaves, Shannon T. Stroble, Rachel M. Anderson, et al. Discovery of Natural Perchlorate in the Antarctic Dry Valleys and Its Global Implications environmental science & technology 2010; 44: 2360–64

6.

Myers KS, Yan H, Ong IM, Chung D, et al. Genome-scale Analysis of Escherichia coli FNR Reveals Complex Features of Transcription Factor Binding. PLoS Genet 2013; 9

7.

Panyukov VV, Ozoline ON Promoters of Escherichia coli versus Promoter Islands: Function and Structure Comparison. PLoS ONE 2013; 8

8.

Mendoza-Vargas A, Olvera L, Olvera M, Grande R, Vega-Alvarado L, et al. Genome-Wide Identification of Transcription Start Sites, Promoters and Transcription Factor Binding Sites in E. coli. PLoS ONE 2009; 4

78

9.

Jennie E. Mitchell, Dongling Zheng, Stephen J. W. Busby and Stephen D. Minchin Identifcation and analysis of `extended -10' promoters in Escherichia coli Nucleic Acids Research, 2003; 31, 4689-95

10.

John D. Coates and Laurie A. Achenbach Microbial perchlorate reduction: Rocketfuelled metabolism. Nature Reviews Microbiology 2004; 2: 569-80

11.

Miriam Hellberg Lindqvist, Thomas Nilsson, Pontus Sundin and Maria Rova Chlorate reductase is cotranscribed with cytochrome c and other downstream genes in the gene cluster for chlorate respiration of I. dechloratans. FEMS Microbiology Letters 2015; 362

12.

Vladimir Mekler, Konstantin Severinov, RNA polymerase molecular beacon as tool for studies of RNA polymerase–promoter interactions Methods 2015; 86: 19–26

13.

Virgil A. Rhodius1, Vivek K. Mutalik and Carol A. Gross. Predicting the strength of UP-elements and full-length E. coli sE promoters. Nucleic Acids Research, 2012; 40: 2907–24

14.

Helen J. Wing, Jeff Green, John R. Guest, and Stephen J. W. Busby. Role of Activating Region 1 of Escherichia coli FNR-protein in Transcription Activation at Class II Promoters. The Journal Of Biological Chemistry 2000; 275: 29061–65

15.

Miriam Hellberg Lindqvist. 2016. Oxygen-dependent regulation of key components in microbial chlorate respiration, Doctorial thesis. Karlstad University studies, Karlstad, Sweden.

16.

Robert Nerenberg, Breathing Perchlorate, Science 2013; 340: 38

79

17.

Alex O. Schwarz, Homero Urrutia, Jose´ Miguel Vidal, Norma Pe´rez, Chlorate reduction capacity and characterisation of chlorate reducing bacteria communities in sediments of the rio Cruces wetland in southern Chile, water research 2012; 46: 3283 – 92

18.

Hongzhi He & Haishuo Gao & Guikui Chen & Huashou Li & Hai Lin & Zhenzhen Shu, Effects of perchlorate on growth of four wetland plants and its accumulation in plant tissues, Environ Sci Pollut Res 2013; 20: 7301–08,

19.

Pawel Jajesniak and Tuck Seng Wong, From genetic circuits to industrial-scale biomanufacturing: bacterial promoters as a cornerstone of biotechnology. Bioengineering 2015; 2: 277-96

20.

Danielsson Thorell H. 2004. Enzymes and Genes for Microbial Metabolism of Oxochlorates. Ph.D. thesis. Karlstad University, Karlstad, Sweden.

21.

Helena Danielsson Thorell, Jan Karlsson, Erik Portelius, Thomas Nilsson. Cloning, characterisation, and expression of a novel gene encoding chlorite dismutase from Ideonella. dechloratans. Biochimica et Biophysica Acta 2002; 1577: 445– 51.

22.

Miller JH: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.

23.

G. Unden, S. Achebach, G. Holighaus, H.-Q. Tran, B. Wackwitz and Y. Zeuner. Control of FNR Function of Escherichia coli by O2 and Reducing Conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002; 4: 263–68.

24.

Next Generation Sequencing-based Parallel Analysis of Melting Kinetics of 4096 Variants of a Bacterial Promoter. Ewa Heyduk and Tomasz Heyduk. Biochemistry. 2014; 53: 282–92.

25.

Meysman P, Collado-Vides J, Morett E, Viola R, Engelen K, et al. Structural Properties of Prokaryotic Promoter Regions Correlate with Functional Features. PLoS ONE 2014; 9 80

26.

www.softberry.com 2016-02-05 kl 1233

27.

www.fruitfly.org 2016-02-05 kl 1234

28.

www.cbs.dtu.dk 2016-02-05 kl 1235

29.

www.biophp.org 2016-02-09 kl 1156

30.

www.idtdna.com 2016-02-10 kl 1300

31.

Luitpold Fried, Jürgen Lassak 1, Kirsten J. A comprehensive toolbox for the rapid construction of lacZ fusion reporters. Journal of Microbiological Methods 2012; 91: 537–43

32.

Fiona A. Marshall, Sarah L. Messenger, Neil R. Wyborn, et al. A novel promoter architecture for microaerobic activation by the anaerobic transcription factor FNR. Molecular Microbiology 2001; 39: 747-53

81

Appendix Tabell AI: Visar b-Galaktosidas aktiviteten utryckt i Miller units under aeroba förhållanden för E.coli XL1-BLUE och RM 101 tillsammans med reaktionsparametrarna för: andel volym celler, reaktionstid, ursprunglig celldensitet, absorbansvärden vid 420 nm, absorbansvärden som korrektionsfaktor vid 550 nm.

Beta galaktosidas mätning: Aerobt förhållande Cell prov E.coli XL1-BLUE 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert

Plasmid pBBR1-MCS4-LacZ -

Volym [ml]

Tid [min] 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

OD 15 15 15 15 15 15 15 15 15 5,5 5,5 5,5 7,23 7,258 7,341 6 6 6 5 5 5 5 5 5 7 7 7 7 7 7 15 15 15 10 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5

A420 0,73 0,73 0,73 0,69 0,69 0,69 0,58 0,58 0,58 0,67 0,67 0,67 0,56 0,56 0,56 0,72 0,72 0,72 0,82 0,82 0,82 0,72 0,72 0,72 0,53 0,53 0,53 0,58 0,58 0,58 0,64 0,64 0,64 0,62 0,62 0,62 0,71 0,71 0,71 0,66 0,66 0,66 0,46 0,46 0,46 0,67

A550 0,81 1,256 1,061 1,172 1,13 1,105 0,99 1,1 0,915 0,989 0,957 0,924 0,831 0,971 0,878 0,893 0,921 0,901 1,338 1,291 1,152 1,013 1,143 1,01 0,681 0,639 0,639 0,75 0,717 0,624 0,753 0,84 0,72 0,791 0,735 0,765 0,832 0,843 0,867 0,889 1,086 0,971 0,438 0,519 0,5 0,818

Uttryck [Miller units] 0,403 0,398 0,372 0,41 0,411 0,42 0,354 0,377 0,325 0,449 0,453 0,425 0,33 0,356 0,348 0,35 0,359 0,341 0,634 0,637 0,527 0,467 0,554 0,462 0,337 0,332 0,34 0,385 0,443 0,378 0,401 0,451 0,384 0,423 0,393 0,418 0,434 0,449 0,46 0,462 0,585 0,531 0,22 0,259 0,25 0,446

19,1 102,2 74,9 87,8 79,4 71,5 85,2 101,2 79,6 110,3 89,1 97,8 125,2 171,2 130,9 129,9 135,5 140,9 111,5 86,0 112,1 108,8 96,4 111,9 49,2 31,3 23,7 37,6 -28,7 -18,5 10,7 10,6 10,0 16,4 15,2 10,8 20,4 16,1 17,5 48,8 37,7 25,3 46,1 57,2 54,3 22,4

82

172 bp insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert

-

0,5

5

0,67

0,671

0,342

43,3

-

0,5

7

0,67

0,71

0,388

13,2

-

0,5

7

0,67

0,69

0,384

7,7

-

0,5

7

0,67

0,732

0,4

13,6

-

0,5

7

0,54

0,742

0,407

15,7

-

0,5

7

0,54

0,763

0,402

31,5

-

0,5

7

0,54

0,703

0,374

25,7

-

0,5

15

0,68

0,889

0,499

3,1

-

0,5

15

0,68

0,783

0,424

8,0

-

0,5

15

0,68

0,82

0,46

2,9

-

0,5

10

0,74

0,989

0,538

12,8

-

0,5

10

0,74

0,896

0,482

14,2

-

0,5

10

0,74

1,042

0,577

8,7

-

0,6

5

0,51

0,881

0,432

81,7

-

0,6

5

0,51

0,831

0,44

39,9

-

0,6

5

0,51

0,78

0,413

37,4

-

0,6

5,25

0,53

0,836

0,432

47,9

-

0,6

5,2167

0,53

0,64

0,326

41,9

-

0,6

5,3333333

0,53

0,713

0,357

52,0

-

0,6

5

0,67

0,827

0,44

28,4

-

0,6

5

0,67

0,881

0,468

30,8

-

0,6

5

0,67

0,745

0,38

39,8

-

0,6

5

0,69

0,999

0,544

22,7

-

0,6

5

0,69

0,895

0,48

26,6

-

0,6

5

0,69

0,94

0,505

27,2

-

0,6

4

0,76

1,067

0,588

20,8

-

0,6

4

0,76

1,233 -

-

0,6

4

0,76

1,022

#VÄRDE! 0,551

31,7

83

E.coli RM 101 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 189 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR 172 bp insert utan FNR

pBBR1-MCS4-LacZ pBR322 -

0,5

20

0,92

0,469

0,053

40,9

-

0,5

20

0,92

0,507

0,067

42,4

-

0,5

20

0,92

0,498

0,057

43,3

-

0,5

32

0,56

0,383

0,035

35,9

-

0,5

32

0,56

0,439

0,051

39,0

-

0,5

32

0,56

0,435

0,044

40,0

-

0,5

36

0,46

0,35

0,033

35,3

-

0,5

36

0,46

0,395

0,048

37,6

-

0,5

36

0,46

0,369

0,036

37,0

-

0,5

28

0,91

0,17

0,022

10,3

-

0,5

28

0,91

0,198

0,044

9,5

-

0,5

28

0,91

0,173

0,019

11,0

-

0,5

32

0,65

0,207

0,053

11,0

-

0,5

32

0,65

0,229

0,067

10,7

-

0,5

32

0,65

0,227

0,066

10,7

-

0,5

36

0,47

0,18

0,035

14,0

-

0,5

36

0,47

0,14

0,025

11,4

-

0,5

36

0,47

0,171

0,033

13,4

-

0,5

23,33

0,78

0,331

0,026

31,4

-

0,5

23,33

0,78

0,357

0,034

32,7

-

0,5

23,33

0,78

0,377

0,043

33,2

-

0,5

32

0,44

0,302

0,054

29,5

-

0,5

32

0,44

0,325

0,061

31,0

-

0,5

32

0,44

0,315

0,015

41,0

-

0,5

37

0,47

0,304

0,039

27,1

-

0,5

36

0,47

0,326

0,044

29,4

-

0,5

36

0,47

0,331

0,048

29,2

-

0,5

29

0,85

0,175

0,035

9,2

-

0,5

29

0,85

0,178

0,033

9,8

-

0,5

29

0,85

0,177

0,031

10,0

-

0,5

40

0,51

0,23

0,074

9,9

-

0,5

40

0,51

0,24

0,077

10,3

-

0,5

40

0,51

0,219

0,063

10,7

-

0,5

41

0,42

0,173

0,035

13,0

-

0,5

41

0,42

0,236

0,072

12,8

84

172 bp insert utan FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR

-

0,5

41

0,42

0,186

0,046

12,3

-

0,6

29

0,8

0,198

0,054

7,4

-

0,6

29

0,8

0,208

0,056

7,9

-

0,6

29

0,8

0,201

0,053

7,8

-

0,6

40

0,61

0,258

0,087

7,2

-

0,6

40

0,61

0,196

0,05

7,4

-

0,6

40

0,61

0,215

0,06

7,5

-

0,6

41

0,49

0,176

0,034

9,7

-

0,6

41

0,49

0,214

0,054

9,9

-

0,6

41

0,49

0,198

0,045

9,9

-

0,6

29

0,86

0,187

0,047

7,0

-

0,6

29

0,86

0,178

0,038

7,5

-

0,6

29

0,86

0,175

0,036

7,5

-

0,6

40

0,5

0,209

0,053

9,7

-

0,6

40

0,5

0,216

0,058

9,5

-

0,6

40

0,5

0,222

0,067

8,7

-

0,6

41

0,43

0,206

0,051

11,0

-

0,6

41

0,43

0,199

0,045

11,4

-

0,6

41

0,43

0,199

0,049

10,7

85

Tabell AII: Visar b-Galaktosidas aktiviteten utryckt i Miller units under anaeroba förhållanden för E.coli XL1-BLUE och RM 101 tillsammans med reaktionsparametrarna för: andel volym celler, reaktionstid, ursprunglig celldensitet, absorbansvärden vid 420 nm, absorbansvärden som korrektionsfaktor vid 550 nm.

Beta galaktosidas mätning: Anaerobt förhållande Cell prov E.coli XL1-BLUE 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 189 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert 172 bp insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert

Plasmid pBBR1-MCS4-LacZ -

Volym [ml]

Tid [min]

OD

A420

A550

Uttryck [Miller units]

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

6 6 6 4 4 4 5,9167 5,9167 5,9167 4 4 4 5,25 5,25 5,25 5 5 5 14 14 14 9 9 9 8,5 8,5 8,5 5 5 5 5 5 5 4 4 4

0,4 0,4 0,4 0,33 0,33 0,33 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,38 0,38 0,38 0,36 0,36 0,36 0,35 0,35 0,35 0,33 0,33 0,33 0,35 0,35 0,35 0,34 0,34 0,34 0,35 0,35 0,35 0,38 0,38 0,38

1,012 1,041 0,908 0,958 0,87 0,741 0,885 0,741 0,744 0,66 0,649 0,603 0,878 0,895 0,917 0,757 0,85 1,085 0,542 0,575 0,583 0,579 0,566 0,616 0,564 0,549 0,567 0,722 0,721 0,751 0,551 0,54 0,533 0,634 0,572 0,552

0,415 0,424 0,442 0,271 0,29 0,297 0,281 0,281 0,252 0,243 0,248 0,215 0,341 0,334 0,345 0,299 0,324 0,305 0,296 0,318 0,345 0,306 0,301 0,328 0,285 0,279 0,288 0,375 0,375 0,39 0,279 0,274 0,271 0,337 0,295 0,287

238,1 249,2 112,1 733,0 549,2 335,2 379,8 240,7 292,6 335,4 307,1 323,9 282,0 311,3 314,0 259,7 314,4 612,5 9,8 7,6 -8,5 29,3 26,4 28,3 43,9 40,8 42,4 77,4 76,2 80,6 71,7 69,1 67,1 58,2 73,4 65,5

-

0,5

14

0,33

0,636

0,372

-6,5

-

0,5

14

0,33

0,548

0,281

24,4

-

0,5

14

0,33

0,557

0,287

23,7

-

0,5

8,5

0,35

0,566

0,281

49,9

-

0,5

8,5

0,35

0,547

0,281

37,1

-

0,5

8,5

0,35

0,589

0,305

37,1

86

Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert Bakgrundsplasmid utan insert E.coli RM 101 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR

-

0,6

5

0,39

0,726

0,377

56,6

-

0,6

5

0,39

0,722

0,389

35,3

-

0,6

5

0,39

0,744

0,387

57,1

-

0,6

4,9167

0,35

0,697

0,36

64,9

-

0,6

4,9167

0,35

0,654

0,332

70,7

-

0,6

4,9167

0,35

0,685

0,357

58,4

-

0,6 -

0,38 -

-

#VÄRDE!

-

0,6 -

0,38 -

-

#VÄRDE!

-

0,6 -

0,38 -

-

#VÄRDE!

-

0,6

5

0,31

0,609

0,319

54,6

-

0,6

5

0,31

0,559

0,289

57,3

-

0,6

5

0,31

0,55

0,284

57,0

-

0,6

5

0,33

0,651

0,345

47,7

-

0,6

5

0,33

0,58

0,3

55,6

pBBR1-MCS4-LacZ pBR322

0,6

5

0,33

0,603

0,316

50,5

-

0,5

29

0,31

0,56

0,028

113,7

-

0,5

29

0,31

0,671

0,027

138,8

-

0,5

29

0,31

0,597

0,02

125,0

-

0,5

34

0,3

0,555

0,022

101,3

-

0,5

34

0,3

0,53

0,025

95,3

-

0,5

34

0,3

0,531

0,02

97,3

-

0,5

33

0,31

0,522

0,02

95,2

-

0,5

33

0,31

0,504

0,021

91,3

-

0,5

33

0,31

0,483

0,019

87,9

-

0,5

22

0,33

0,292

0,017

72,2

87

189 bp insert med FNR 189 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR 172 bp insert med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider med FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR Bakgrundsplasmider utan FNR

-

0,5

22

0,33

0,432

0,019

109,8

-

0,5

22

0,33

0,474

0,021

120,5

-

0,5

41

0,34

0,189

0,02

22,1

-

0,5

41

0,34

0,17

0,025

18,1

-

0,5

41

0,34

0,18

0,03

18,3

-

0,5

34

0,31

0,165

0,019

25,0

-

0,5

34

0,31

0,151

0,018

22,7

-

0,5

34

0,31

0,148

0,023

20,4

-

0,5

33

0,3

0,166

0,032

22,2

-

0,5

33

0,3

0,158

0,021

24,5

-

0,5

33

0,3

0,152

0,017

24,7

-

0,5

22

0,31

0,163

0,04

27,3

-

0,5

22

0,31

0,135

0,017

30,9

-

0,5

22

0,31

0,163

0,048

23,2

-

0,6

47

0,32

0,17

0,028

13,4

-

0,6

47

0,32

0,163

0,025

13,2

-

0,6

47

0,32

0,165

0,029

12,7

-

0,6

34

0,35

0,158

0,023

16,5

-

0,6

34

0,35

0,166

0,028

16,4

-

0,6

34

0,35

0,171

0,017

19,8

-

0,6

33

0,36

0,2

0,053

15,0

-

0,6

33

0,36

0,188

0,038

17,0

-

0,6

33

0,36

0,198

0,046

16,5

-

0,6

22

0,36

0,158

0,025

24,0

-

0,6

22

0,36

0,158

0,024

24,4

-

0,6

22

0,36

0,156

0,025

23,6

-

0,6

47

0,18

0,178

0,031

24,4

-

0,6

47

0,18

0,148

0,018

23,0

-

0,6

47

0,18

0,147

0,018

22,8

-

0,6

34

0,21

0,15

0,02

26,8

-

0,6

34

0,21

0,152

0,019

27,7

-

0,6

34

0,21

0,161

0,024

27,8

0,6

33

0,19

0,161

0,018

34,4

0,6

33

0,19

0,149

0,017

31,7

0,6

33

0,19

0,151

0,018

31,8

0,6

22

0,21

0,177

0,043

36,7

0,6

22

0,21

0,153

0,018

43,8

0,6

22

0,21

0,15

0,018

42,7

88